CN105256057A

CN105256057A - 基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒

Info

Publication number: CN105256057A
Application number: CN201510800155.8A
Authority: CN
Inventors: 涂超峰; 贺毅憬; 刘杨; 虞健; 肖飞; 彭艳
Original assignee: Hunan Hoomya Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Hunan Hoomya Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2016-01-20

Abstract

基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，包括4.5－6.5μl的引物panel溶液，引物panel溶液中各溶质的浓度均为45－55mmol/L；所述引物panel包括10个微卫星位点的引物；所述试剂盒中，还包括8－10μl的Master？Mix以及1.3－1.7ml无酶水；所述Master？Mix包括3~7μl　10*LA？Taq？Buffer和？3~5μl　2~4？mmol/L的dNTPs，以及0.5~1μl？LA？Taq？enzyme。使用本发明之试剂盒，通过一次测序即可同时检测多个样本的所有MSI位点，减少人为操作带来的影响，能提高检测结果的可靠性。

Description

基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，尤其是涉及一种基于二代测序平台对结肠癌患者微卫星不稳定性进行检测的检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌发病率在我国高居各类癌症发病率的第3位，占癌症死因的第5位，其根治性切除后5年生存率为50％左右，术后复发和转移是其死亡的重要原因。早期结肠癌患者通常可借手术切除，一旦转移，其治疗的方法并不多，患者五年生存率也不理想。研究发现，基因组的不稳定性与结直肠癌的发病机理密切相关，基因组的不稳定性包括染色体不稳定性(chromosomalinstability，CI)和微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。

微卫星是指基因上含有重复的DNA短小序列或单核苷酸区域。在肿瘤细胞中，当DNA发生甲基化或基因突变致错配修复基因缺失时,可导致微卫星重复序列错配(微卫星突变)，导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。根据MSI不稳定性的程度，可分为高不稳定性(MSI-H)和低不稳定性(MSI-L),正常情况下称为微卫星稳定(microsatellitestability，MSS)。

大量研究表明，MSI参与恶性肿瘤的发生发展过程，与结肠癌、胃癌、子宫内膜癌等等发生密切相关。约15％的结直肠癌患者存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolerectalcancer,HNPCC)患者90％以上为MSI瘤，表明MSI可作为检测是否为HNPCC患者的重要标志物；与MSS(即微卫星稳定)的结肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌患者其预后更好，并且二者药物反应也不一样，提示MSI可作为结直肠癌预后的独立预测因子，因此，MSI检测对结直肠癌患者意义重大。

美国国家肿瘤研究所(NationalCancerInstitute，NCI)曾经通过一个针对肿瘤的微卫星不稳定及复制错误表型检测的国际专题会议制定了MSI检测的统一标准(即BethesdaGuidelines)，作为涉及检测MSI的参考Panel(即NCIPanel)，它包含2个单核苷酸重复的位点(BAT-25、BAT-26)和3个2核苷酸重复的位点(D2S123、D5S346、D17S250)。据此对肿瘤MSI状态进行检测时，5个STR位点如果检测出2个或2个以上的位点有MSI，则为MSI-H，MSI-H肿瘤表现出特有的临床及病理学表型；若只检测出1个位点有MSI，则为MSI-L，无任何位点变化者为MSS。然而，MSI-L与MSS的肿瘤表型差异不大，要区别MSI-L与MSS的肿瘤表型，需要选用更多位点来进行检测时才能实现。

在2002年的第二次相关专题会议上，针对之前采纳的检测MSI的参考Panel来检测MSI出现了争议，因为NCIPanel使用的3个2核苷酸重复的位点具有高多态性的特征，在检测时必须用与肿瘤组织相匹配的正常组织来作比较才能得出结果，使其在检测存在错配修复缺陷的肿瘤时表现出较低的特异性和灵敏度。因此采用NCIPanel来检测MSI存在一定的局限性，大会建议增加单核苷酸重复位点来检测MSI以提高检测的灵敏度。

2015年最新发布的药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)中明确规定，MSI的检测可用于氟尿嘧啶类药物的辅助疗效预测。近期研究发现，MSI-H较MSI-L和MSS的结肠癌患者在接受PD-1抗体〔即FDA批准的两种免疫检查点抑制药物(Nivolumab(MDX1106)和Pembrolizumab)〕治疗后具有更好的临床反应性，表明结直肠癌患者的MSI水平可作为一个对PD-1/PD-L1抗体响应的独立预测因子来预测筛选从PD-1抗体免疫治疗获益的结肠癌患者群体。对检测结直肠癌患者的MSI水平，可用于免疫检查点抑制剂类药物的辅助疗效预测。

因此，建立MSI检测体系以寻找高度灵敏性及特异性的用来检测MSI的相关位点已成为近年来研究MSI检测领域的热点。

现有检测MSI的方法主要为：

1)免疫组化方法，该方法仅用于肿瘤细胞中的MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白结合，如果没有结合任何的蛋白，则证明发生了MSI；该方法的灵敏度虽然接近90％，但特异性和可重复性较低，操作比较复杂；

2)毛细管电泳法，该方法主要针对MSI相关的基因序列上简单的重复结构，通过片段分析可以判断重复碱基的重复数目，从而进行MSI基因分型；该方法使用相对成熟，进样量少、分辨率和自动化程度较高，然而由于进样量少，因而制备能力差；而毛细管直径小导致光路太短，用一些检测方法(如紫外吸收光谱法)时，灵敏度较低；此外，电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性；

3)PCR法，该方法通过选定特异的引物，以自身正常组织为对照，在体外对微卫星位点进行PCR扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影等分析有无迁移率的改变；该方法是目前常用的检测方法且已经被证实为最有效的初筛手段，但PCR法只检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷；

4)多重荧光PCR，该方法主要针对NCI建议的位点进行扩增，以确定MSI状态；采用该方法检测微卫星，其引物间的竞争与干扰因素较为复杂，扩增产物不容易错开，会直接导致检测结果的不确定性，因此该方法对引物特异性和引物浓度都有很高的要求；

5)直接测序法，该方法针对MMR基因各区域(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2等)的扩增产物进行sanger法测序来确定其MSI状态；该方法的检测周期较长，成本相对较高。

因此急需开发更多位点和更好灵敏度的MSI检测***势以满足市场和医疗的迫切需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，使用该试剂盒对结肠癌微卫星不稳定性进行检测，检测通量高，灵敏度强，特异性强，能够一次性检测所有位点。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，包括4.5－6.5μl(优选5μl)的引物panel溶液，所述引物panel溶液中各溶质的浓度均为45－55mmol/L(优选50mmol/L)。

所述引物panel包括10个微卫星位点的引物，其正向引物与反向引物序列如下：

位点	正向引物	反向引物
			NR-21	TCGCTGGCACAGTTCTATTT	TGTTTGTAAACGCGAGTGAC
NR-22	TAATCGAGGCTTGTCAAGGA	GTCTGGAAGTTTTGTCTTGG
			NR-24	TGCTGAATTTTACCTCCTGA	AGGTTGGAATGCAATGGCAC
NR-27	CCATGCTTGCAAACCACTGG	TTGGTCATTGCTAGTATTAT
			BAT-25	TCGAACTGTCACCTCGGCTTT	ACTTCAAAATGACATTCTG
BAT-26	TGACACTTTTGACTTCAGCC	AACCATTCAACATTTTTAACC
			MONO-27	GATTGCAGTGAGCTGAG	TAGCCTTAGAATGTTAGC
D2S123	AAACAGGATGCCTGCCTTTA	GGACCTTCCACCTATGGGAC
			D5S346	CGTGAACAGGAGCTTCATCG	ATCTGCAGTCTCTTTGGCCT
D17S250	AGCTTCCAAACTAGTAGAGG	TAAATATATATATGGCCAGCT

所述试剂盒中，还包括8－10μl(优选9.5μl)的MasterMix以及1.3－1.7mL(优选1.5mL)无酶水；

所述MasterMix包括3～7μl(优选5μl)10*LATaqBuffer和3～5μl(优选4μl)2～4mmol/L的dNTPs，以及0.5～1μlLATaqenzyme。

所述基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的多重PCR反应条件为：93℃～98℃预变性2～3min，然后进入聚合酶链式反应扩增阶段：93℃～96℃变性20～30s，55℃～65℃退火20～30s，70℃～75℃延伸20～45s；最后70℃～74℃延伸10min，并进行10～12个循环，4℃静置。

多重PCR过程同时进行阴性对照实验，所用对照样本为正常人基因组DNA。

所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的检测基因包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27，D2S123，D5S346和D17S250。

二代测序反应体系的组成为：DNA样本多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准备和富集反应、上机测序反应和测试数据处理分析。

本发明之基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对结肠癌患者微卫星不稳定性的检测试剂盒的使用方法，包括进行MSI相关的10个标记基因的多重PCR反应、模板文库构建、上机测序以及基于测序结果对微卫星状态的结果判定。具体内容如下：

(1)挑选MSI相关的10个标记基因并进行多重PCR反应：

①根据Besthestaguideline，调取敏感性和特异性最好的10个MSI标记基因位点序列(其中包括7个单核苷酸重复位点和3个双核苷酸重复位点)，见表1：

表110个微卫星位点信息

表2微卫星位点测序引物

位点	正向引物(F)	反向引物(R)
			NR-21	TCGCTGGCACAGTTCTATTT	TGTTTGTAAACGCGAGTGAC
NR-22	TAATCGAGGCTTGTCAAGGA	GTCTGGAAGTTTTGTCTTGG
			NR-24	TGCTGAATTTTACCTCCTGA	AGGTTGGAATGCAATGGCAC
NR-27	CCATGCTTGCAAACCACTGG	TTGGTCATTGCTAGTATTAT
			BAT-25	TCGAACTGTCACCTCGGCTTT	ACTTCAAAATGACATTCTG
BAT-26	TGACACTTTTGACTTCAGCC	AACCATTCAACATTTTTAACC
			MONO-27	GATTGCAGTGAGCTGAG	TAGCCTTAGAATGTTAGC
D2S123	AAACAGGATGCCTGCCTTTA	GGACCTTCCACCTATGGGAC
			D5S346	CGTGAACAGGAGCTTCATCG	ATCTGCAGTCTCTTTGGCCT
D17S250	AGCTTCCAAACTAGTAGAGG	TAAATATATATATGGCCAGCT

②对这10个MSI相关的基因位点通过设计引物进行多重PCR扩增反应，所述的扩增引物见表2。

(2)进行文库构建和测序反应

模板文库构建过程包括DNA随机打断、末端补平修复及纯化、末端连接测序接头、模板扩增和纯化、纯化后富集，所述反应体系中包含末端补平酶混合物20μl、0.4-1U连接酶、0.4-1U扩增Taq酶、5-10mM测序接头A和P1、5-10mM测序接头A和P1通用引物、10-15×Buffer和2-5×Ampure纯化磁珠等试剂。

上述测序反应包括MiSeq测序反应过程，其原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头构建文库，文库加载到测序芯片Flowcell上，文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序反应，即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。上机反应获得的数据结果通过序列筛选、拼接和比对等方法以及生物信息学分析，最终获得测试样本的SNP位点信息。

本发明采用二代测序技术来检测MSI基因位点，即，首先进行MSI相关的10个标记基因的多重PCR反应，接着构建模板文库、通过一系列上机模板准备和富集反应后获得测序文库，然后基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对含MSI相关标记基因位点进行测序，能够一次性获得所有微卫星位点的变异信息，检测结果具有通量高，灵敏度强、特异性好等优点。这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备。此外，用此试剂盒检测结直肠癌患者的MSI水平后，还可应用于筛选适合PD-L1抗体治疗的结直肠癌患者人群。

本发明之基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对国内外发病率较高的结肠癌患者的微卫星不稳定性位点(包括NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27，D2S123，D5S346和D17S250)进行检测的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测所有MSI位点，其结果比5位点检测更为准确，特异性更好，人为干扰因素小，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，能大大提高肿瘤相关的微卫星不稳定性的检测水平。此外，用此试剂盒检测结直肠癌患者的MSI水平后，还可应用于筛选适合PD‐L1抗体治疗的结直肠癌患者人群。

本发明是一种基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对结肠癌患者微卫星不稳定性进行检测使用的一种检测试剂盒。系根据现有的或已获得的肿瘤微卫星不稳定性相关位点的序列信息，设计这些位点的引物，并制作成引物panel，进行多重PCR反应获取目标序列，接着构建模板文库、通过一系列上机模板准备和富集反应后获得测序文库，然后基于Illumina公司的MiSeq二代测序平台对含MSI相关标记基因位点进行测序。通过对捕获得到的片段进行高通量测序，并基于Besthestaguideline建议的微卫星不稳定性相关位点的已知信息，利用生物信息学方法进行数据分析，获取待测样本中与结直肠癌患者微卫星不稳定性位点的核酸序列的遗传变异信息，最终判断患者的微卫星状态，从而对结直肠癌患者的诊疗做出预判。

本发明试剂盒对结肠癌患者微卫星不稳定性进行检测的一大优点是，通过一次测序即可同时检测多个样本的所有MSI位点，减少人为操作带来的影响，能提高检测结果的可靠性，用此试剂盒检测结直肠癌患者的MSI水平后，还可应用于筛选适合PD-L1抗体治疗的结直肠癌患者人群；操作便捷，适合批量操作；随着新一代测序技术的不断进步及测序成本的大大降低，基于DNA的高通量基因组技术可以极大地加快基因检测的过程，在提高核酸测序速度的同时，还能够降低误差率及单碱基测序成本；而且能够一次性检测所有MSI相关位点的所有基因序列，特异性强，能够很好地满足目前检测样本数量大，检测位点多、分布广、检测准确性高等检测要求。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，包括5μl的引物panel溶液，引物panel溶液的浓度均为50mmol/L。

所述试剂盒中，还包括9.5μl的MasterMix以及1.5ml无酶水；

所述MasterMix包括5μl10*LATaqBuffer和4μl3mmol/L的dNTPs，以及1μlLATaqenzyme。

通过设计MSI相关的10位点的引物panel(保护点)，进行多重PCR获取所需的目的片段，然后经过文库构建和上机测序，最后通过生物信息学分析获取微卫星的变异结构，使用这种基于二代测序检测结肠癌微卫星不稳定性的试剂盒检测结直肠癌患者的MSI水平后，还可应用于筛选适合PD-L1抗体治疗的结直肠癌患者人群。

本实施例具体包括以下步骤：

1、本实验中涉及的30例临床血液样本均来自××医院。样本采集后，立即于2700xg，10min，收集上层血清于干净的tube管中，-80℃保存备用，采用QIAGENDNeasyBlood&TissueKit(QIAGEN,Hilden,Germany)抽提外周血DNA，QIAampCirculatingNucleicAcidKit抽提循环肿瘤DNA。

2、进行多重PCR扩增反应

(1)按照下面的多重PCR反应体系：MasterMix9.5μl，5μl的引物panel，待测DNA样本4μl，5μlddH₂O。其中MasterMix包括5μl10*LATaqBuffer，4μl2.5mMdNTPs，0.5μlLATaqenzyme。

(2)根据以上反应体系进行多重PCR扩增反应程序：PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min，4℃静置。实验完成后，进行文库构建和上机测试。

3、文库构建〔文库的制备方法为本领域技术人员所熟知(IIIuminaHiseq或Miseq官方产品说明书))，包括但不限于以下步骤：

①采用CovarisE-210(Covaris,Inc.,Woburn,MA)将步骤2中的DNA随机打断后；

②末端补平修复及纯化步骤：末端补平酶混合物20μl和DNA模板50μl混合后20℃孵育30min；加入120μlAmpure纯化磁珠吸附DNA片段，80％乙醇洗两次后晾干加水溶解；

③测序接头连接步骤：测序接头A和P1各10μl与20μl补平后的产物混合，20℃孵育15min，随后65℃孵育5min；

④模板扩增：进行10～12个循环的PCR并使用2％的凝胶电泳跑胶并胶回收。使用Bioanalyzer2100(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)进行DNA文库的浓缩。(在体系中加入纯化后的产物20μl，扩增Taq酶混合物25μl，通用引物5μl进行PCR扩增。反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min，4℃静置。)；

⑤扩增后纯化：由于步骤④中杂交捕获后的样品可能包含杂质，需进一步洗脱纯化，具体方法可参考RocheNimbleGen公司的商业化kit说明书进行。碱性洗脱液回收后用一定浓度的醋酸(18％)中和，得到的中和液可利用Qiagen的PCRpurification试剂盒进行纯化，最终获得溶于纯水中的DNA样本；

⑥纯化后的序列富集：纯化下来的片段进行10个循环的PCR扩增并生成测序用的文库。反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min，4℃静置。

4、上机测序：将上述得到的DNA采用IlluminaMiSeq测序仪按照操作步骤进行测序。

5、结果分析：上机反应获得的数据结果通过序列筛选、拼接和比对等方法以及生物信息学分析，最终获得测试样本的位点变异信息，并根据位点变异信息确定微卫星状态。

6、验证二代测序结果：为进一步确定与评估探针的序列捕获效果以及高通量测序情况，采用经典的一代测序平台(ABI3730Sanger测序仪)进行测序，对上述所获得的变异检测结果通过PCR扩增后进行Sanger法测序验证，测序引物见表2。两者的测序结果一致，表明基于二代测序对MSI检测的结果真实可靠。

对获得的测序数据进行生物信息学分析，根据软件分析的结果，分别筛选出正常外周血DNA和肿瘤DNA微卫星标记位点与参考基因组hg19进行比对，从而获得肿瘤DNA和对照DNA中的微卫星标记基因的突变信息，进一步将肿瘤DNA的10个微卫星标记位点的突变信息与正常DNA微卫星标记位点进行比对，获取待测样本的MSI基因位点的变异信息。根据Besthestaguideline，如果10个位点中有超过20％的位点有重复序列长度变化者其肿瘤状态判定为MSI-H,至少1个位点但少于20％的位点存在MSI时则为MSI-L，无任何位点变化者为MSS,具体结果见(表3)。

表3MSI结果判读

MSI	不稳定性标记比例	阳性标记数	检测结果
				MSI-H	≥20％	≥2	2(n＝11),3(n＝5)，3(n＝2)，4(n＝1)
MSI-L	0～20％	1	1(n＝7)
				MSS	0	0	0(n＝4)

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>湖南宏雅基因技术有限公司

<120>基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒

<160>20

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

TCGCTGGCAC　AGTTCTATTT　20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

TGTTTGTAAA　CGCGAGTGAC　20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

TAATCGAGGC　TTGTCAAGGA　20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

GTCTGGAAGT　TTTGTCTTGG　20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

TGCTGAATTT　TACCTCCTGA　20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

AGGTTGGAAT　GCAATGGCAC　20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

CCATGCTTGC　AAACCACTGG　20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

TTGGTCATTG　CTAGTATTAT　20

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

TCGAACTGTC　ACCTCGGCTT　T　21

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

ACTTCAAAAT　GACATTCTG　19

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

TGACACTTTT　GACTTCAGCC　20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

AACCATTCAA　CATTTTTAAC　C　21

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

GATTGCAGTGAGCTGAG17

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

TAGCCTTAGAATGTTAGC18

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

AAACAGGATGCCTGCCTTTA20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

GGACCTTCCACCTATGGGAC20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

CGTGAACAGGAGCTTCATCG20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

ATCTGCAGTCTCTTTGGCCT20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

AGCTTCCAAACTAGTAGAGG20

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

TAAATATATATATGGCCAGCT21

Claims

1.基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，包括4.5－6.5μl的引物panel溶液，引物panel溶液中各溶质的浓度均为45－55mmol/L；

。

2.根据权利要求1所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，还包括8－10μl的MasterMix以及1.3－1.7mL无酶水；所述MasterMix包括3~7μl　10*LATaqBuffer和3~5μl　2~4mmol/L的dNTPs，以及0.5~1μlLATaqenzyme。

3.根据权利要求1或2所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，所述引物panel溶液的数量为5μl。

4.根据权利要求1或2所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，所述引物panel溶液中各溶质的浓度均为50mmol/L。

5.根据权利要求1或2所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，MasterMix的数量为9.5μl。

6.根据权利要求3所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，MasterMix的数量为9.5μl。

7.根据权利要求1或2所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，所述MasterMix包括5μl　10*LATaqBuffer和4μl　2~4mmol/L的dNTPs，以及0.5~1μlLATaqenzyme。

8.根据权利要求3所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，所述MasterMix包括5μl　10*LATaqBuffer和4μl　2~4mmol/L的dNTPs，以及0.5~1μlLATaqenzyme。

9.根据权利要求4所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，所述MasterMix包括5μl　10*LATaqBuffer和4μl　2~4mmol/L的dNTPs，以及0.5~1μlLATaqenzyme。

10.根据权利要求1或2所述的基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，其特征在于，所述基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒的多重PCR反应条件为：93℃~98℃预变性2~3min，然后进入聚合酶链式反应扩增阶段：93℃~96℃变性20~30s，55℃~65℃退火20~30s，70℃~75℃延伸20~45s；最后70℃~74℃延伸10min，并进行10～12个循环，4℃静置。