CN109321535A

CN109321535A - 一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株

Info

Publication number: CN109321535A
Application number: CN201811244135.7A
Authority: CN
Inventors: 曹永忠; 吴艳涛; 张小荣; 刘倩
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2019-02-12

Abstract

本发明涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学技术，公开了一株热稳定的新城疫病毒新型(基因Ⅷ型)弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09及其构建方法。所述的热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株的保藏号为CCTCC NO:V201739。研究表明，NDV/rAHR09株具有良好的热稳定性，56℃、60min仍保持血凝活性和感染能力，免疫试验证明对新城疫强毒株有良好的免疫保护效果，与常用疫苗株LaSota和耐热的V4株分别接种1日龄SPF鸡，每周检测鸡的抗体效价，试验结果证明，本发明毒株免疫鸡的抗体效价显著高于LaSota株和V4株，对流行强毒株攻毒保护率为100％。

Description

一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株

技术领域

本发明涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学领域，具体涉及一株新基因型、耐热的新城疫病毒弱毒疫苗候选株。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)对世界家禽养殖业危害巨大，它可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失[Alexander,D.J.2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease.Br Poult Sci 42:5-22.]。该病毒在分类学上属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo,M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.Arch Virol 147:1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(Mesogenic)和弱毒(Lentogen)三种类型。已有大量的研究已经阐明了病毒致病性的分子决定因素[Huang Z,Krishnamurthy S,Panda A,Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated with viralpathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist.Journal ofvirology 2003Aug；77(16):8676-85.]，其中大部分是关于F和HN蛋白对病毒毒力的作用，特别是一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[SealBS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the fusionprotein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle diseasevirus isolates.Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based onattachment glycoprotein sequences.FunctIntegr Genomics 2004Oct；4(4):246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点两端有成对的碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²R/K-R-Q-K/R-R-F¹¹⁷；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²-E/G-R/K-Q-E/G-R-L¹¹⁷。

生产上需要疫苗进行预防接种控制NDV的感染与传播。常规的弱毒活疫苗对热敏感，在储存运输过程中需要冷链维持。澳大利亚早期分离鉴定了一些天然耐热的弱毒株，如V4、I-2等，这类毒株在基因型分类上属于基因I型，曾在非洲、东南亚等热带国家和地区作为疫苗毒株使用，减少了冷链的依赖，产生了很好的经济和社会效益(Spradbrow P B,Copland J W.Production of thermostable Newcastle disease virus in developingcountries.Preventive Veterinary Medicine[J],1996,29:157–159.)。我国1990年代曾引进了V4等毒株，由于是国外的专利保护毒株，只能用于科研，不能进行商品化开发使用，因此我国南方热带农村地区(缺乏很好的冷链***)缺乏可以使用的自主耐热疫苗株。另外，我国新城疫的流行情况复杂，传统的基因I型疫苗毒株对我国当前的流行毒株免疫保护效果并不理想，筛选、开发具有自主产权、耐热的新型新城疫弱毒疫苗株具有重要意义。

NDV对热的耐受性不高，50～55℃、30min即可使其失去活性(失去感染宿主的能力)。早期的研究结果显示，在NDV不同毒力类型的毒株中，存在着对温度耐受性较高的毒株，主要表现为经56℃、30min处理后依然具有感染宿主的能力，或虽然丧失感染性，但仍具有HA活性。[Lomniczi B.Thermostability of Newcastle disease virus strains ofdifferent virulence.Arch of Virol.1975,(47):249-255.]现在一般认为，经过56℃、30min热处理后仍具有感染能力的NDV毒株即为耐热性毒株。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热的新基因型(Ⅷ型)新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09及其反向遗传构建***，通过毒株自身具有的耐热性，解决弱毒活疫苗在储存、运输过程中对冷链的依赖，为热带地区和偏远的乡村地区(通常缺乏冷链***)提供可靠的防控候选疫苗。

本发明提供的一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株，是新城疫病毒基因Ⅷ型NDV/rAHR09，它的保藏号为CCTCC NO：V201739。

本发明还公开了所述热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09基因组序列，如SEQ ID No.47所示。

本发明还公开了含有所述热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09的基因组cDNA的全长转录载体。

本发明中的耐热弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09是从耐热强毒株NDV/HR09经过反向遗传操作***对病毒F基因进行突变改造而来。NDV/HR09株是发明人所在实验室从送检病料中分离并经耐热性鉴定而获得，该毒株经56℃、60min仍具有血凝活性和感染细胞的能力，最小致死量鸡胚平均致死时间(MDT)为57.6h，1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.8，6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)为1.56，F基因片段构建的***进化树证明毒株属于基因Ⅷ型，与马来西亚早期分离鉴定的耐热强毒株NDV/AF2240(GenBank号：JX012096)有较高的同源性，同源性为94.0％。本发明首先建立了HR09株的反向遗传操作***，成功拯救获得了保留病毒原有生物学特性的感染性克隆。利用该操作***，对病毒F基因裂解位点碱基序列进行突变，设计1对引物经Overlap PCR方法，对病毒HR09的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，使相应编码的氨基酸由¹¹²R-R-Q-K¹¹⁵-R-F¹¹⁷突变为具有典型弱毒株特征的氨基酸序列¹¹²G-R-Q-G¹¹⁵-R-L¹¹⁷，拯救获得的NDV/rAHR09株保留了原母系强毒株的耐热性，56℃处理60min仍然具有HA活性，但MDT值>120h，ICPI值为0.057，符合弱毒株的标准。经与传统疫苗株LaSota株、国外引进的耐热株V4株进行免疫保护试验，每组12只1日龄SPF鸡肌肉注射接种10⁶EID₅₀剂量，3周后以10⁵EID₅₀剂量基因VII型ZJ1毒株进行点眼、滴鼻攻毒，结果表明，免疫鸡抗体HI效价以本发明的毒株组最高，3周龄时平均达到6.0±0.6，显著高于LaSota株和V4株，攻毒保护率为100％。

本发明NDV/rAHR09的构建方法如下：

(1)耐热强毒株HR09的鉴定

对本室保存的数十个NDV分离株与V4、LaSota等参考毒株共同进行耐热性试验，以56℃耐热处理30min时仍具有HA活性作为筛选标准，获得耐热株HR09经蚀斑纯化后进行生物学特性鉴定，包括毒株的鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种指数(IVPI)等。测定毒株的全基因组序列，鉴定了毒株的分子生物学特性。

(2)耐热株HR09反向遗传操作***构建与弱毒株的拯救

构建HR09株基因组cDNA的全长克隆以及含有该毒株NP、P和L基因的3个真核表达载体，经共转染BSR-T7/5细胞，拯救获得感染性克隆NDV/rHR09株，获救病毒的耐热性测定结果显示，56℃处理60min仍有血凝活性，证明NDV/rHR09株保留了亲本株的耐热性。测定NDV/rHR09株的MDT值、ICPI值，证明其仍为NDV强毒株。设计两对引物，经Overlap PCR的方法将NDV/rHR09毒株F蛋白裂解位点第112、115和117位的碱性氨基酸突变成与弱毒株相关的非碱性氨基酸，构建全长cDNA转录载体prNDV/HR09，将转录载体prNDV/HR09与3个辅助表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，拯救出病毒NDV/rAHR09。经56℃、45min处理，NDV/rAHR09株仍具有血凝性，MDT值>120h，ICPI值为0.057。结果表明，NDV/rAHR09株具有耐热性，且毒力已明显致弱，可以作为耐热NDV弱毒疫苗候选毒株。

(3)耐热弱毒NDV/rAHR09株连续传代试验与免疫保护试验

将获得的耐热弱毒株通过鸡胚进行连续耐热传代试验，每隔5代测定病毒MDT值及耐热性，并测定F基因序列裂解位点附件序列片段，检验病毒遗传稳定性、耐热的稳定性和毒力变异。经过连续15代鸡胚传代，病毒的MDT值一直大于120h，耐热性能没有下降，病毒F基因裂解位点附近的碱基序列片段没有发生导致蛋白氨基酸序列变化的突变，证明病毒遗传性能稳定。

将本发明毒株与传统疫苗株LaSota、V4进行免疫对比较试验，包括对照组共设4组，每组12只SPF鸡，1日龄进行10⁶EID₅₀剂量免疫肌注接种，免疫3周后以流行的基因VII型ZJ1毒株按10⁵EID₅₀剂量进行攻毒，每周分别测定各组鸡的HI抗体效价，统计各组攻毒后鸡的病死率，结果证明本发明毒株抗体产生比对照组水平高，并具有完全的免疫保护(保护率100％)。

本发明获得的耐热NDV/rAHR09基因Ⅷ型毒株，具有稳定的耐热性，经过连续传代试验证明，鸡胚连续传15代，其耐热性能稳定，F基因序列测定没有发现毒力增强的突变。

与耐热的V4株、传统不耐热的LaSota株共同进行免疫保护对比试验，本发明的毒株免疫原性好，试验鸡全部获得对强毒攻击的保护，抗体产生的水平高。

附图说明

图1是NDV/HR09株全基因组引物分布。

图2是RT-PCR分段扩增全基因组10个片段电泳图。M:200bp；1～10分别顺序为表1中10对引物扩增片段。

图3是基于F基因片段构建的NDV/HR09***发生树。

图4是HR09株全基因组cDNA转录载体的构建示意图。

图5是RT-PCR分段扩增的全基因组6个片段电泳图。M：200bp；1-6分别为V1，R1，R2，R3，L1，V2片段

图6是NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体酶切鉴定结果图。M:DL15000 1.质粒pNDV/HR09；2、3经HpaI酶切后的pNDV/HR09。

图7是辅助质粒共转染后GFP表达效果图。

图8是病毒感染性克隆PCR鉴定结果图。M:200bp Marker；1、2:引物9扩增片段。

本发明的NDV/rAHR09耐热疫苗候选株于2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学；分类命名为：新城疫病毒基因Ⅷ型NDV/rAHR09；保藏编号为CCTCC NO:V201739。

具体实施方式

本发明所涉及的生物材料：

LaSota株购自中国兽医药品监察所(CVCCNo:AV615)，

ZJ1株(Liu X F,Wan H Q,Ni X X,et al.Pathotypical and genotypicalcharacterization of strain of Newcastle disease virusisolated from out breaksin chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001.ArchVirol,2003,148(7):1387-1403.)。NDV/HR09株(Cao Y,Liu Q,Zhang X,Hu H,WuY.2017.Complete genome sequence of heatresistantNewcastle disease virusstrain HR09.Genome Announc 5:e01149-17.)。

步骤一：耐热毒株NDV/HR09的鉴定

对扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室早期分离保存的毒株与LaSota株进行耐热性评价(表1)，以56℃处理30min后仍有HA活性作为判定标准，获得1耐热毒株，命名为NDV/HR09株。

表1.LaSota株、ZJ1株和HR09株耐热血凝活性

NDV/HR09株经蚀斑纯化后进行生物学特性鉴定。

最小致死量鸡胚平均死亡时间(MDT)的测定、1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定均参照文献的方法进行。结果显示，NDV/HR09株的MDT为57.6h，ICPI为1.8，IVPI为1.56，符合NDV强毒株特征。

设计了10对引物(图1，表2)，对NDV/HR09株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析。扩增结果见图2。序列测定结果(GenBank登录号：MF285077)显示，该毒株基因组全长为15192nt，推导的F蛋白裂解位点氨基酸序列为¹¹²RRQKRF¹¹⁷，HN蛋白长度为571个氨基酸残基，符合NDV强毒株特征；基因组GC含量为46.27％，与耐热的弱毒株V4株、I-2株和耐热的强毒株AF2240株全基因组(GenBank登录号：V4株为JX524203，I-2为AY935499，AF2240株为JX012096)核苷酸序列同源性为86.7％、85.4％、94.0％，相应的6个结构蛋白编码基因的核苷酸序列同源性介于83.1％～95.6％之间，而6个结构蛋白的氨基酸序列同源性介于81.6％～98.0％之间(表3、4)；基于F基因全长所构建的进化树显示，NDV/HR09株属于基因Ⅷ型毒株(图3)。说明HR09株与已经发表的毒株在分子生物学特性上存在不同。

表2.扩增NDV/HR09株全基因组引物

表3 NDV/HR09株与不同毒株全基因组和6个基因核酸序列同源性(％)

表4 NDV/HR09株与不同毒株结构蛋白氨基酸序列同源性(％)

步骤二：耐热毒株NDV/HR09反向遗传操作***的构建

试验涉及的主要试验材料与方法如下：

细胞及鸡胚：能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞和微基因组TVT-LGT由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠，TVT7R(0.0)转录载体由本实验室保存，SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

实验试剂：细胞培养基DMEM购自上海源培生物科技有限公司，新生胎牛血清购自GIMINI公司，Easytaq DNA聚合酶、pEASYTM-Blunt克隆载体、pCR2.1克隆载体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、高保真DNA聚合酶、dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，Q5、限制性内切酶(ApaⅠ、BsmBⅠ、MluⅠ、BbsⅠ、SpeⅠ、NotⅠ、XbaⅠ)等购自NEB公司，T4DNA Ligase、限制性内切酶FspAⅠ购自Thermo Fisher公司。EndoFree Plasmid Midi Kit购于北京康为世纪生物科技有限公司。其它普通生化试剂均为国产分析纯试剂。

引物设计与合成：根据前述获得的NDV/HR09的全基因序列，运用PrimerPremier5.0软件设计6对引物对其全基因进行分段扩增，构建示意图见图4。将基因组13048位碱基作为拯救病毒的分子标记。引物序列见表5，辅助质粒构建引物见表6，引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

表5.NDV/HR09株全长cDNA分段扩增引物

表6构建NDV/HR09辅助质粒所用引物

1.HR09株全基因组cDNA各片段的克隆与测序

按照文献的方法提取病毒RNA并进行反转录。以获得的cDNA为模板，目的片段L1用高保真DNA聚合酶扩增，其余目的片段均用Q5酶进行扩增。

PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，对扩增的目的片段进行回收，按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书进行，将回收的产物与pEASY TM-Blunt克隆载体放置于1.5mL的指形管中连接(片段L1的胶回收产物与pCR2.1载体连接)，每管加入30μL Trans-T1感受态细胞，轻轻混匀，立即放入冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激30s，放置冰上冷却5min；加入600μL LB培养基，37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h，取出后5000r/min离心5min；剩余约100μL上清，将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃温箱倒置培养12～16h；次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜。按照pEASY TM-Blunt Cloning Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)说明书提供的方法，用通用引物M13F和M13R通过PCR方法进行鉴定。PCR鉴定阳性的克隆送至安徽通用公司测序。测序正确的克隆分别命名为T-R1、T-R2、T-R3、T-V1、T-V2、T-NP、T-P、T-L1、T-L2、T-L3。

对NDV/HR09全长基因组进行分段扩增，获得共6个DNA片段，经鉴定，片段大小与预期一致(如图5)。

2.NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体的构建

NDV/HR09全基因组各片段重组质粒的提取：将含有各目的片段克隆的母液分别接种含氨苄青霉素的LB培养基进行培养，利用EndoFree Plasmid Midi Kit，按照使用说明书提取质粒，并进行浓度和纯度的测定。

NDV/HR09基因组5’端及3’端的连接：质粒T-V1和T-V2经NotⅠ和MluⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别回收2300bp和6100bp左右的目的片段，T4连接酶连接后，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为T-V。质粒T-V用BsmBI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收4500bp片段，转录载体TVT7R(0.0)用BbsI酶切电泳后回收3100bp片段，利用T4连接酶连接，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为TVT-V。

NDV/HR09基因组TM(2296nt～13048nt)的连接：以质粒T-R1和T-R2为模板，R1-F/R2-R为引物，Overlap PCR扩增R12片段，预期片段大小为4519bp。扩增片段连接pCR2.1克隆载体，转化感受态细胞，挑取载体SpeⅠ位点位于R12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为T-R12。

用限制性内切酶BsmBⅠ和SpeⅠ分别对质粒T-R12和T-R3进行双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别回收8500bp和2800bp左右的目的片段，T4连接酶连接后，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为TR123。

质粒TR123与TL2经SpeⅠ和FspAⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收12300bp和3500bp左右的片段，T4连接酶进行连接，转化感受态细胞，菌液PCR以及酶切鉴定阳性克隆，命名为TM。

含NDV/HR09株全基因组cDNA的转录载体的获取：质粒TM与TVT-V分别经ApaⅠ和MluⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收10kb和9kb左右的条带，T4连接酶连接后，转化感受态细胞。从而构建了含有NDV基因组cDNA全长的转录载体pNDV/HR09。

NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体的鉴定：对转录载体通过酶切鉴定。经分析转录载体上的酶切位点分布，利用限制性内切酶HpaⅠ酶切鉴定，电泳检测酶切条带是否与预期条带大小一致。酶切体系为：灭菌超纯水12μL、HpaⅠ1μL、cutsmart2μL、质粒DNA5μL(1μg)。

构建好的NDV/HR09全基因组cDNA转录载体经酶切鉴定，HpaⅠ酶切后获得2个条带，即4949bp和13348bp，电泳结果和预期一致(图6)。

3.辅助质粒的构建与鉴定

辅助质粒pCI-NP构建：在基因组103nt-1643nt位设计引物，扩增NP基因，该片段5’端添加XbaⅠ酶切位点，连接pEASYTM-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)。测序结果正确的克隆经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收1500bp左右的条带，用T4连接酶连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体(购自北京全式金生物技术有限公司)中，转化感受态细胞，PCR以及酶切鉴定阳性克隆，命名为pCI-NP。

辅助质粒pCI-P构建：在基因组1874nt-3096nt位设计引物，扩增P基因，该片段5’端添加XbaⅠ酶切位点，连接pEASYTM-Blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收1200bp左右的条带，用T4连接酶连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中，转化感受态细胞，PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆，命名为pCI-P。

辅助质粒pCI-L构建：质粒T-L2经FspAI和NotⅠ酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收3500bp左右的条带，用T4连接酶连接到同样经FspAI和NotⅠ酶切后线性T-L1中，转化感受态细胞后，鉴定到的阳性克隆命名为T-L12。

质粒T-L12与T-L3经MluⅠ和NotⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收8500bp和2000bp左右的片段，T4连接酶进行连接，转化感受态细胞，PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆，命名为T-L123。

质粒T-L123经SpeⅠ和NotⅠ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收6600bp左右的条带，连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中，T4连接酶进行连接，转化感受态细胞，PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆，从而构建成辅助质粒pCI-L。

辅助质粒的鉴定：pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与微型基因组TVT-LGT共转染BSR-T7/5细胞48h后，在倒置荧光显微镜下观察是否能看到GFP基因的表达。细胞转染方法参考X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent说明书。

pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与微型基因组TVT-LGT共转染BSR-T7/5细胞48h后，在倒置荧光显微镜下能看到GFP基因的表达(图7)，说明pCI-NP、pCI-P和pCI-L在BSR-T7/5细胞中均能得到表达，能与微型基因组形成RNPs结构，从而启动微型基因组的复制和转录。

4病毒感染性克隆的获得与鉴定

细胞和转染用质粒的准备：转染用的BSR-T7/5细胞用1mg/mL的G418进行预筛选培养，于转染前一天将5×10⁵的细胞接种于35mm dish中，约60％～80％铺满时用于转染。转染时用到的所有质粒(TVT/LGT、pNDV/HR09、pCI-NP、pCI-P、pCI-L)均用EndoFree PlasmidMidi Kit提取，提取完测定其浓度和纯度，浓度在0.1μg/μL以上并且纯度在1.8～2.0(OD260/280)，＞2(OD260/230)的质粒用于转染，质粒提取方法按照EndoFree PlasmidMidi Kit说明书进行。

共转染：将NDV基因组cDNA全长的转录载体pNDV/HR09和三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染准备好的BSR-T7/5细胞，转染60h后将转染样品用封口膜封好，转移到-70度冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.4mL/枚，37℃培养。定时观察鸡胚状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，收集鸡胚尿囊液。

获救病毒的鉴定：HA的测定：收集接胚尿囊液，用新鲜制备的1％鸡红细胞按照OIE标准进行HA测定。将HA检测阳性的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚上连传2代，收集尿囊液提取病毒的RNA，配置反转录体系进行反转录并灭活后，以其作为模板，用测序的特异性引物9(ND-9)，扩增NDV部分L基因区域长度约1892bp(12362nt～14253nt)，根据突变出的MluI(13048nt)的碱基变化，以确定是否拯救出病毒。获救病毒的耐热性、生物特性参照前述的方法进行。

转染样品接胚后，第一代鸡胚在80h左右死亡，进行血凝试验有血凝性，获救病毒命名为NDV/rHR09，并在SPF鸡胚上继续传2代。收取第3代的鸡胚尿囊液，采用RT-PCR的方法进行检测，根据基因组标志的标记分子，进行最终确定。测序结果表明，基因组序列与NDV/HR09株序列(GenBank登录号：MF285077)相同；第13048位的碱基由G变成了A(图8)，证明病毒的基因组源于转录载体NDV/rHR09。

取获救病毒接种9～11日龄鸡胚后收集到的尿囊液分时间点进行56℃耐热试验，结果显示其在56℃试验60min时仍具有血凝活性，与野生型病毒耐热时长相同。

将获救病毒NDV/rHR09按照OIE标准稀释后，分别测定MDT和ICPI，结果显示，MDT值为60h，ICPI值为1.625。表明获救病毒的毒力与野生型病毒(MDT值为57.6h，ICPI值为1.8)相比并未发生明显的变化。

步骤三：F基因突变与耐热弱毒株NDV/rAHR09的拯救及鉴定

1.引物设计与合成

通过引物经Overlap PCR方法，将重组病毒pNDV/HR09的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，从而使相应编码的氨基酸由R¹¹²-R-Q-K¹¹⁵-R-F¹¹⁷变为弱毒特征的氨基酸序列：G¹¹²-R-Q-G¹¹⁵-R-L¹¹⁷，突变后的质粒命名为prNDV/HR09，引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物序列如下：

Rr1-R:5’-AAGGCGCCCCTGTCCCCCCCCACCAGATGTAG-3’(SEQ ID No.45)

Rr2-F:5’-GGGGGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCCGTTATTG-3’(SEQ ID No.46)

2.片段Rr1和片段Rr2的克隆与测序

以步骤二获得的重组质粒TR-12为模板，以R1-F(见表6)/Rr1-R，Rr2-F/R2-R(见表6)为引物，扩增获得片段Rr1和片段Rr2。25μL PCR反应体系为：灭菌超纯水15.75μL，5×Q5Buffer5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，上游引物(10μmol/μL)0.5μL，下游引物(10μmol/μL)0.5μL，模板1μL，Q5 0.25μL。

PCR反应循环参数为：98℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸2min。

PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，对扩增的目的片段进行回收，按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书将回收产物与pEASY TM-Blunt克隆载体放置于1.5mL的指形管中连接(片段L1的胶回收产物与pCR2.1载体连接)，每管加入30μLTrans-T1感受态细胞，轻轻混匀，立即放入冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激30s，放置冰上冷却5min；加入600μL LB培养基，37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h，取出后5000r/min离心5min；剩余约100μL上清，将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃温箱倒置培养12～16h；次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜。按照pEASY TM-Blunt Cloning Kit说明书方法，用引物M13F和M13R通过PCR方法进行鉴定。PCR鉴定阳性的克隆送公司测序。测序正确的克隆分别命名为T-Rr1和T-Rr2。

3.全基因组cDNA转录载体pNDV/rAHR09的构建

以T-Rr1和T-Rr2扩增片段为模板，分别用R1-F/Rr1-R，Rr2-F/R2-R为引物，Overlap PCR扩增Rr12片段，预期片段大小为4519bp。反应体系为50μL Overlap PCR体系：灭菌超纯水36.5μL，10×TransTaq HiFi Buffer5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，T-Rr1扩增片段1μL，T-Rr2扩增片段1μL，TransTaqHiFi DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。PCR反应循环参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。

扩增片段连接pCR2.1克隆载体，转化DH5α感受态细胞，挑取载体SpeⅠ位点位于R12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为T-Rr12。

其余构建过程参考步骤二，最终构建获得了病毒基因组cDNA全长转录载体pNDV/rAHR09。

4.耐热弱毒株NDV/rAHR09的拯救和鉴定

将含有基因组cDNA全长的转录载体pNDV/rAHR09(基因组cDNA全长序列如SEQ IDNo.47所示)和三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染准备好的BSR-T7/5细胞，转染方法同步骤二。

转染12h后，每个dish中加入10％的无菌尿囊液。转染60h后将转染样品用封口膜封好，转移到-70度冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.4mL/枚，37℃培养。定时观察鸡胚的状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，检测血凝(HA)效价并收集尿囊液，继续传代。

将HA检测阳性的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚上传2代，收集尿囊液并提取病毒的RNA，反转录后，以其作为模板，用测序的特异性引物4(ND-4)，扩增病毒L基因区域部分序列长度约1755bp(4098nt～5872nt)，根据F基因裂解区域碱基的变化，以确定是否拯救出病毒。

获得的致弱毒株命名为NDV/rAHR09，进行耐热性评价和生物学特性鉴定(方法同步骤二)。并含毒尿囊液滴度稀释至10^-3后，接种CEF细胞，48h后在显微镜下观察细胞病变情况，同时设母本毒株作为对照。

获救病毒采用RT-PCR的方法检测F基因裂解位点序列变化情况。经测序表明，F基因裂解区域碱基均发生了改变，基因组cDNA全长序列如SEQ ID No.47所示，证明病毒的基因组源于转录本pNDV/rAHR09。

获救病毒NDV/rAHR09稀释后，分别测定MDT和ICPI，结果显示，MDT值>120h；ICPI值为0.057。综合判定标准说明获救病毒的毒力符合弱毒株的标准。

将母本病毒HR09与致弱病毒NDV/rAHR09同时感染CEF细胞48h后观察细胞病变发现，接种致弱病毒的CEF细胞未出现细胞病变，而接种母本病毒的细胞则出现拉网和脱落现象，形成明显的空斑。说明拯救出的病毒的F蛋白在CEF上不能有效裂解，从而说明其毒力已经发生明显减弱。

步骤四：NDV/rAHR09毒株免疫保护试验

48只1日龄SPF鸡分成4组，每组12只饲养于生物安全3级隔离器中，将NDV/rAHR09毒株与常规疫苗毒株LaSota、V4进行免疫对比试验，对照组用PBS，每鸡按10⁶EID₅₀/0.1mL(PBS稀释)的剂量肌注免疫接种，免疫3周后以流行的基因VII型ZJ1毒株按10⁶EID₅₀/0.1mL剂量进行攻毒，每周分别测定各组鸡的HI抗体效价，统计各组攻毒后鸡的病死率，结果证明本发明毒株对试验鸡产生的抗体效价显著高于其它对照毒株，对流行强毒株攻击具有完全的免疫保护效果(保护率100％)。具体的试验分组与HI检测、强保护率情况见表7、表8。

表7免疫试验方案

表9试验组HI抗体效价和攻毒存活率情况

。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株

<130>

<160> 47

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accaaacaga gaatctgtga g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttcatccg atayaarcgc at 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caatacgaca ggtgggagct c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcataggga tggaggatgt ctg 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggcagagc caaracarta c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcrgtttgr ctccagagta t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcgggctcag tgaygtgctc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcraattcc ccactgagcc t 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtcyccwgg yatttattcc tg 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatrgatarg atrgcytgct g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcggaagtcy tgcagtgtga gt 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgcrgacctt gtyctwgctg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggtttcact caaaatggtc c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagtattgct ccrtcyttra a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggattmtgyc agaagctatg 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ataggcgrac cacatctga 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cactcttycc aatgacraca ac 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taacactcca tatcccctct aca 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aacttgtcyc tgattgccat g 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccaaacaaag atttggtgaa tgac 24

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gattacgcca agctttcctc agatactcgt tgggcagcag ct 42

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gattacgcca agcttcgaat gagatgaacc ccccacagcg 40

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

catgctcgac aagctgagca at 22

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gaaaggtgcc aacagcttag tcc 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aagctgttgg cacctttctt ct 22

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tcaggtgttc ctggtatgca gat 23

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gctagcgttg cttaacactg aatct 25

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

catctttggt gcgcacatct g 21

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atgtgcgcac caaagatggt agac 24

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgacgcgtcg agtgcaagag actaatagt 29

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cgtctcgtat agggaccaaa cagagaatct gtgaggtac 39

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

agacgcgtcc gttgtccatg atatgctgt 29

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tcgacgcgtg gtttcaggtt tatatg 26

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgtctctacc caccaaacaa agatttggtg aatgac 36

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agactagtag gataatacgg gtaggacatg gc 32

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttggtgcgca catctggct 19

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

atgtgcgcac caaagatggt agac 24

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgacgcgtcg agtgcaagag actaatagt 29

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cgacgcgtgg tttcaggttt at 22

<210> 40

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ttaatgagag tacaatcagc taagaagata g 31

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tatctagaga gggagccttc taccaacat 29

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

gtcagacgga ggatttggga t 21

<210> 43

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

agtctagacc agtggattag ggcgaagat 29

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gggggcagga acctgttgt 19

<210> 45

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

aaggcgcccc tgtccccccc caccagatgt ag 32

<210> 46

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gggggacagg ggcgccttat aggtgccgtt attg 34

<210> 47

<211> 15192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

accaaacaga gaatctgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgga atcgtacggg 60

tagaaggtgt gaacctcgag tgcgaggccg aagctcaaac tagagggagc cttctaccaa 120

catgtcgtcc gtattcgatg aatacgagca gctcctcgct gctcagactc gtcctaatgg 180

agctcacgga gggggagaga gagggagcac tttaaaagtt gaggtcccag tattcactct 240

taacagtgac gatccagaag atagatggaa ttttgcggta ttctgtcttc ggattgctgt 300

tagcgaggat gccaacaaac cgctcaggca aggtgctctc atatcccttt tatgctccca 360

ttcccaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcaggaaaa cagaatgagg ccacactggc 420

tgttcttgaa atcgatggtt ttaccaacag cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480

gtctgaggag agagcacaga gattcatggt aatagcaggg tccctccctc gggcatgcag 540

taacggtact ccattcgtca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600

tactctggaa agaatcttat ctatccaggc tcaagtatgg gtcacagtag caaaggctat 660

gaccgcgtat gagacagcag atgagtcgga aacaagaaga atcaataagt atatgcagca 720

aggcagggtc cagaagaagt gcatcctcca ccccgtatgt aggagtgcga ttcaactcac 780

aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cttagtcagc gaacttaaga ggggccgcaa 840

tacggcaggt gggagctcca catattacaa cttagtaggg gatgtagact catacatcag 900

gaacactggg cttactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ctaagacatc 960

agccctagca ctcagcagcc tcacaggcga tatccaaaaa atgaagcagc tcatgcgttt 1020

atatcggatg aagggagaaa atgcgccgta catgacattg ctaggtgaca gtgatcagat 1080

gagctttgca ccagctgagt atgcacagct ttactctttt gccatgggca tggcgtcagt 1140

cttggataaa ggaactggta aataccaatt tgccagagat tttatgagca catcattctg 1200

gagactcgga gtggagtatg ctcaggcgca ggggagtagc atcaatgagg acatggctgc 1260

tgagctaaaa ttaaccccgg cagcaaggag gggcctggca gctgctgccc aacgagtgtc 1320

tgaggaagct ggcagcgtgg atattcctac tcaacaagcc agagtcctca ctgggctcag 1380

cgacggaagc ccccgagcct cacaaggcag atcgaacgag ccgcaagggc aaccagacgt 1440

cggagatgga gagacccaat tcttggactt gatgagagca gtgacgaata gcatgcgaga 1500

agcaccaaac tcctcacaga gcaccaccca tccggagcct cccccaactc ctgggccatc 1560

acaagacaac gacactgact gggggtactg atcgatcaca cccagtccac ctccacaggg 1620

ctatcccaaa tcctccgtct gacccccccc cccaccccct gacccacagc cccgcacggc 1680

cgaaccaacg aaagcactcc tccatcctcc ttcccacccc cagccgcacg atccaaccca 1740

cccgagacaa cacgggcaca actcaatcca ccaataatcc atacggagcc aaagacatta 1800

gaaaaaaata cgggtagaag agagacaccc ggagatcaag gccaatcact aaggtctccg 1860

tcctcccttc tacccagtgg attagggcga agatggccac ctttacagat gcagagatag 1920

atgatatatt tgagaccagt ggaactgtca ttgacagcat aattacggcc cagggcaaat 1980

cagcagagac tgtcggaagg agcgcaatcc cacaaggcaa gaccaaagcg ctgagcacag 2040

catgggagaa gcacgggagc atccaaccat ccgccagtca ggacaacccc gaccggcagg 2100

atggaccaga caaacagcca tccacgcctg atcaggcaac cccgcacgac ggctcgccga 2160

tcacatccgc cgaaccgctc tctgcccagg ccgcaggcgc agccggcgat acacagctca 2220

aaactggagc aagcaactct cttttgtcca tgctcgacaa gctgagcaat aagtcatcca 2280

atgctaaaaa gggcccacgg tcgagcccac aggaaggata tcatcaacct ccgacccaac 2340

aacaggggaa tcagctgagc cgcggaagca accaggaaag atcgcagtac caagccaagg 2400

ccgtccctgg aagccggggc acagacgcga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt 2460

cacaaccatc agctggtgca acccctcatg tgctccaatc aggacggagc ccagacaata 2520

ctcctgtacc tgtggatcat gtccagccac ctgtcgactt tgtgcaggcg atgatgacta 2580

tgatggaggc gttatcacag aaagtaagta aagttgacta tcagctagac ttagtcttaa 2640

agcagacatc ctccatccct atgatgcggt ctgaaatcca acagcttaag acatctgtcg 2700

cagtaatgga agctaattta ggcatgatga aaattctgga ccctggttgt gctaacattt 2760

catctttaag tgacctgcgg gcagttgccc gatcccaccc ggttttagtt tcaggccccg 2820

gagatccgtc cccctacgtg acacaagggg gtgagatgac actcaataaa ctctcgcaac 2880

caatacaaca cccttctgag ttgattaaat ctgccacggc gggtgggcct gatatgggag 2940

tggagaagga cactgtccgt gcattgatca cctcgcgccc gatgcatcca agttcctcag 3000

ctaagctcct gagtaagctg gatgcagccg ggtcgattga cgagatcaga aagattaaac 3060

gccttgcgct gaatggttga tcatcaccgc aacccacaac aggttcctgc cccctgagtg 3120

ccaaaaagaa tccaccccga gccccccttc cccgacccgt gctccaacac tctaagcaat 3180

agccctctcc cacccctctt gcccccttga atgattgcac aaccacggtt aatctagcag 3240

cttcaaaaat taagaaaaaa tacgggtaga atcgaagtgc cccgactgtg ccaaaatgga 3300

ctcatccagg acaatcgggc tgtattttga ttctgccctc ccctccagca gcctactagc 3360

attcccgatc gtcctacaag acacagggga cgggaagaag caaatcaccc cacaatacag 3420

gatccagcgt cttgactcgt ggacagacag taaagaagat tcagtattca ttaccactta 3480

tggattcatc ttccaagttg ggaatgaaga agtcactgtt ggcatgatca atggtaatcc 3540

caggcacgaa ttactctctt ctgcaatgct ttgcctaggg agtgtcccga acgacagtga 3600

tcttgttgag ctggcgaggg cctgcctcac tatggtgata acatgcaaga agagtgcaac 3660

taatactgag agaatagtct tctcagtagt gcaggcaccc cgtgtgctgc aaagctgtat 3720

ggttgtggca aacaggtact cgtcagtgaa tgcagtgaag catgtgaaag caccagagaa 3780

gatccctggg tgcggaaccc tagagtataa ggtgaacttt gtctccttga ctgtggtgcc 3840

aaaaaaggat gtctacagga tcccagcggc agctttgaaa gtatctggct cgagcctgta 3900

taatcttgca cttaacgtca ctattgatgt ggaggtggac ccgaagagcc cattggtcaa 3960

atccctttct aggtccgata atggatacta tgctaatctt ttcttgcata tcgggcttat 4020

gtccactgta gataagcggg gaaagaaagt gacatttgac aagctagagg agaagataag 4080

gagactcaat ctatctgtcg ggctcagtga tgtgctcgga ccctccgtgc ttgtgaaggc 4140

gagaggtgca cggactaagc tgttggcacc tttcttctct agcagtggga cagcctgcta 4200

tcctatagca aatgcctctc cccaggttgc taaaatactc tggagtcaaa ctgcacatct 4260

gcggagtgtg aaagtcgtca tccaagcagg cacccaacgt gctgtcgcag tgaccgccga 4320

tcatgaggtt acttctacca agatagagaa gaagtatatc attgctaaat acaatccttt 4380

caaaaaatag gttgcatttc tgagactgtg atctgcctgc tttcttgaat catcacaaca 4440

ctatataatg atccgtcttg attgcttaca gttagttcac ctgtttatct agttagaaaa 4500

aacacgggta gaagagtccg gatcctagtt ggcacatcca aggcacaata tgggttccaa 4560

atcttctacc aggttcttaa caccctcgat gttgatcacc cggattatgc tgatactgag 4620

ttgtatctgt ccgacaggct ctttagacgg caggcctctt gcagctgcag ggattgtggt 4680

aacaggggat aaagcagtca acatatacac ctcatctcag acggggtcaa tcatagtcaa 4740

gttgctccca aatatgccca aggataaaga ggcgtgtgca agaactccgt tggaggcata 4800

caacagaaca ctgactactt tactcacccc ccttggtgat tccatccgca ggatacaagg 4860

gtctgtgact acatctggtg gggggagaca ggggcgcctt ataggtgccg ttattggtag 4920

tgtagccctt ggagttgcaa cagctgcaca gataacagca gccgcggctc tgatacaggc 4980

caaccagaat gccgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcaa ccaatgaagc 5040

tgtgcacgag gtcactgacg gattatcaca actagcagtg gcagttggga agatgcagca 5100

gtttgttaac gaccaattta ataataccgc acgagaattg gactgtataa agattgcgca 5160

gcaggttggt gtagaactca acttgtacct aactgaattg actacagtat tcgggccaca 5220

aatcacttcc cctgccttaa ctcagctgac tgtccaggca ctttataatt tagctggtgg 5280

caacatggat tacttgttga ctaaattagg tgtagggaac aatcagctca gctcattaat 5340

tggtagtggc ttgatcaccg gcaaccctat actatatgac tcacagactc aacttttagg 5400

catacaggta actttaccct cagtcgggaa cctaaataat atgcgtgcca cctacctgga 5460

gaccttatct gtaagcacaa ccaaagggtt tgcctcagca cttgtcccga aggtagtgac 5520

acaagtcggt tccgtgatag aagaacttga cacctcatac tgtatagagt ctgatctgga 5580

tttatactgt acaaggatag tgacattccc catgtctcca ggtatttatt cctgtctgag 5640

tggtaataca tcagcttgca tgtattcaaa gactgaaggt gcactcacca ctccatatat 5700

ggccctcaaa ggctcagtca tcgccaactg caagatgaca acatgtagat gtgcagaccc 5760

tccgggtatc atctcgcaaa actatggaga agctgtatct ctaatagata aacattcatg 5820

caatgtcttg tctttagacg ggataactct gaggctcagt ggggaatttg atgcaactta 5880

tcaaaagaat atctcaatcc tagactctca agtcatcgtg acaggcaatc tcgatatatc 5940

aacagagctt gggaatgtca acaactcaat aagcaatgcc ctggataagt tatcagaaag 6000

taacagcaaa ctagacaaag tcaatgtcaa gctaactagc acatctgctc tcattatcta 6060

tattgtctta attgtcatat ctcttgtttc cggtgtactt agcctggttc taacatgtta 6120

tctgatgtac aaacaaaagg cacagcaaaa gaccttatta tggcttggga ataataccct 6180

cgatcagatg agagccacca caagaacatg aatacggacg agaggtggat atgtccttaa 6240

tagcaactca tgtgtcaatt ctgacagcct gttaattaga aggattaaga aaaaactgtt 6300

ggatataagt gccaaaaggg caatacacgg gtagaacggt cggagaaacc ccctttcaac 6360

cgggaaccag gcctcacaac gtccgttcta ccgcatcact aatagcagac tccagtcatg 6420

gaccgcgcag tcaacagagt tgtgctagag aatgaagaaa gagaagcaaa gaatacgtgg 6480

cgcttagttt tccggatcgc agttttattc ttaatagtaa cgactttagc catctctgca 6540

gctgccctga tatatagcat gggggctagc acaccgagca accttgcagg catacctact 6600

gcaatctcta aggcagagga tcggattacg tccttactca gctcaaatca agatgtcgta 6660

gataggatat ataagcaggt ggcccttgag tctccgctag cgttgcttaa cactgaatct 6720

ataattatga atgcaataac gtctctctct tatcaaatta atggggctgc aaataatagt 6780

gggtgtgggg cacctgttca tgatccagat tatatcgggg ggataggcaa agaacttata 6840

gtagacgacg ttagtgacgt cacatcattc tatccatctg cataccagga acacctgaat 6900

tttatcccag cacctactac aggatcaggt tgcacacgga taccctcatt cgacatgagt 6960

gctacccact actgttatac ccacaacgta atattgtctg gttgcagaga tcactcacac 7020

tcatatcagt acttagcact cggcgtgctt cggacatctg caacggggag ggtattcttt 7080

tctactctgc gttccatcaa tttggatgat actcaaaatc ggaagtcctg cagtgtgagt 7140

gccactcctt taggttgtga tatgctatgc tctaaggtca cggagactga ggaagaggat 7200

tataagtcag tcaccccaac gtcaatggta catggaaggt tagggtttga cggtcaatat 7260

catgaggagg atttagacat cacagtctta ttcaaggatt gggtggcaaa ttacccagga 7320

gtgggaggtg ggtccttcat tgacgaccgt gtatggttcc cagtttatgg agggctcgac 7380

cccaactcac ctagcgacac tgcacaagaa gggagatacg taatctacaa gcgctataat 7440

aacacatgcc ccgatgaaca ggattaccag attcgaatgg ctaaatcttc gtataagcct 7500

aggcgattcg gtggaaagcg tgtacagcaa gctatcttgt ctatcaaagt gtcaacatct 7560

ctaggtgagg acccagtgct gactgtaccg cccaatacag ttacactcat gggggccgaa 7620

ggcagagtcc tcaccgtagg gacatctcat ttcctgtacc aacgagggtc ttcatacttc 7680

tctcctgcct tattataccc tatgacagta aacaataaaa cagctactct tcatagtcct 7740

tatacattta atgctttcac ccggccaggt agtgtccctt gtcaggcatc agcaagatgt 7800

cctaactcat gtatcactgg agtctatact gatccgtatc ccttaatctt ccataggaac 7860

cacaccttgc gaggggtgtt cgggacaatg cttgatgatg aacaagcaag actcaacccc 7920

gtatctgcag tatttgataa catatctcgc agtcgcatga ctcgggtaag ttcaagcagc 7980

actaaggcag catacacgac gtcgacatgc tttaaggtcg tcaagaccaa taaagtttat 8040

tgtcttagca ttgccgaaat atccaacacc ttattcgggg aattcagaat tgtcccttta 8100

ctggttgaga ttctcaaaga tgatagggtt taggaaatta gatctggctg gctgagtcac 8160

ccatgggagg tttgagaaga cgatattgta ccacctatct tctgcaatgc taaggatcga 8220

gccgaatacc gatgcatgct cgaatcctac gctgccggtc agctataacc ggataatgct 8280

gacgtgatca gtctgaatct tgtcgatagt cactttattt agaaaaaata tgaaaggtag 8340

tgaggtataa gaaaaaacaa cccaaagagg ataatacggg taggacatgg cgagctccgg 8400

tcccgaaagg gcagagcatc agatcatcct accagagtca catctatctt ctccattggt 8460

caagcacaaa ttgctctatt actggaaatt aactgggcta ccacttcctg atgaatgtga 8520

ctttgaccat cttattatca gcagacaatg gaagaaaata cttgagtcag ccaccccgga 8580

cactgagagg atgataaaac tcggacgagc agtacaccag actctcaacc acaacttcaa 8640

gataaccgga gtactccatc ccaggtgtct cgaagaactg gctagtattg aggtccctga 8700

ctcaaccaac aaatttcgga agatcgaaaa gaaaatccag atccacaaca caaggtacgg 8760

agaactgttc acaaggttgt gcacgaacgt tgaaagtaaa ttgctagggt catcttggtc 8820

tagcaatgtc ccacggtcag aggaatttaa cagcatccgt acagatccgg cattttggtt 8880

tcactcaaaa tggtctagag ccaagtttgc atggctccat ataaaacagg tccaaaggca 8940

tttgatcgtg gcagcaagaa cgaggtctgc agtcaacaaa ttggtgacgc tgactcataa 9000

ggcaggccaa gtctttgtta ctcctgagct tgtcattgtg acacatacag atgagaacag 9060

gttcacatgc ctcacccagg agcttgtttt gatgtatgcg gatatgatgg agggcaggga 9120

tatggtcaac ataatatcct ccactgcaac acatctcaga agcttatcag agaaaattga 9180

tgatattcta cggttagtag atgctctggc aaaagatttg ggcaatcaag tctatgatgt 9240

tgtagcactg atggaagggt tcgcatacgg tgccgttcag ctgcttgagc cgtcgggtac 9300

gtttgcagga gatttctttg cattcaacct acaggagctc aaagatactc taatcgaact 9360

tctcccaaat gatatcgcag aattagtgac tcatacaatc gctatcatat tctctggctt 9420

agagcagaat caagcagctg agatgttatg cctgcttcgt ttgtggggtc acccactgct 9480

tgagtcccgt atcgcagcaa aagcagtcag gagccagatg tgcgcaccaa agatggtaga 9540

cttcgatatg atcctccagg tattatcctt ctttaaggga acaatcataa atggatatag 9600

gaagaagaac tcgggtgtgt ggccacgtgt caaaatggat acgatatacg ggaaggtcat 9660

agggcagcta cacgctgatt cggcagagat ttcacatgat gtcatgttga gggagtacaa 9720

gagtctatct gcacttgaat tcgagccatg tatagaatat gaccctgtca ccaatctaag 9780

catgttctta aaagacaaag caatcgcaca tccgagggat aactggctcg cctcatttag 9840

gcgaaacctt ctctctgagg aacagaaaag acacataaag gaggcgacct caactaaccg 9900

cctcctgata gagttcttag aatcaaacga ttttgatccg tataaggaga tggaatattt 9960

gactaccctt gagtacctaa gagatgacaa tgtggcagtg tcatactcac tcaaagaaaa 10020

ggaagtgaaa gttaatggac gaattttcgc taagttaaca aagaaattaa ggaactgcca 10080

ggtaatggca gagggaattc tagctgacca gatcgcacct tttttccagg gaaatggagt 10140

cattcaagat agcatatctt tgactaagag tatgttggcg atgagtcaac tgtccttcaa 10200

cagcaataag aaacgtatca ctgactgcaa agaaagggtt tcctcaaccc gcaatcacga 10260

tccaaaaagc aagaatcgcc gaagagttgc cacttttatc acgacggatc tgcaaaagta 10320

ttgtcttaac tggagatatc agacagtcaa gctatttgcc catgccatca atcagctgat 10380

gggcctacct cacttcttcg agtggattca tcttagacta atggacacta cgatgtttgt 10440

aggagatcct ttcaatcctc cgagtgaccc taccgattgt gatctatcaa gagtcccaaa 10500

tgatgacata tacattgtca gtgctagggg gggcattgag ggattatgcc agaagctatg 10560

gacaatgatc tcaattgccg caatccaact tgctgcggca agatcgcact gtcgagttgc 10620

ctgcatggta caaggtgaca atcaagtaat agctgtaacg agagaggtaa gatcagatga 10680

ctctccggat atggtgttgg cacagttgca tcaagccagt gataatttct tcaaagagtt 10740

gattcacgtc aatcatctga ttggccacaa cctgaaagat cgtgaaacca tcaggtcaga 10800

cacattcttc atatacagta agcgaatatt taaagatgga gcaatactca gtcaggtcct 10860

caaaaactca tccaaattgg tgctaatatc aggtgatctc agtgaaaaca ctgtaatgtc 10920

ttgtgccaac attgcatcca ctatagcacg gctgtgtgag aacgggcttc ctaaggattt 10980

ctgttattat ttaaactacc taatgagttg cgtgcagaca tactttgatt ctgagttttc 11040

tattactcac aactcacaat cagactccaa ccagtcttgg attgaggata tctctttcgt 11100

acactcatac gtcttaaccc ctgcccagct agggggactg agtaaccttc aatactcaag 11160

gctctacaca aggaacatcg gtgacccggg gactactgct tttgcagagg tcaagcgact 11220

agaagcagtg gggttgttga gtcctagcat catgactaac attctaacta ggccacctgg 11280

caatggagat tgggccagtc tgtgcaatga tccatactcc tttaattttg agactgtcgc 11340

aagcccaaat attgtcctta agaaacacac acagaaagtc ttatttgaaa cttgctcaaa 11400

ccccttatta tccggagtac atacagagga taatgaggca gaagagaagg cattggctga 11460

attcttactc aatcaggaag tggttcaccc gcgtgtcgcg catgctatca tggaatcaag 11520

ctctgtaggt aggagaaaac aaattcaagg acttgttgac acaacaaaca ctgtgatcaa 11580

gattgcgttg actagaaggc ccctcggtat caagaggctg atgcggataa tcaattattc 11640

gagcatgcat gcaatgttat tcagagatga tgtcttctta tccaacaggc ccaaccaccc 11700

cttagtctct tctagtatgt gctcgctaac gctagcagat tacgcacgga acagaagctg 11760

gtcacctctg acaggaggca gaaaaatact gggtgtatct aatcccgata ccatagaact 11820

tgtcgagggt gagattctta gtgtcagcgg agggtgcaca aagtgtgata gcggagatga 11880

gcagttcact tggtttcatc ttccaagcaa tatagagttg actgatgaca ccagcaagaa 11940

tcccccgatg agagtgccat atcttgggtc aaagactcag gagaggaggg ccgcttcgct 12000

tgcgaaaata gcccatatgt caccacatgt gaaggcagca ctaagggcat catctgtgtt 12060

aatctgggct tatggagaca acgaaataaa ctggactgct gctcttaata ttgcaaggtc 12120

tcgatgcaac ataagctcag agtacctccg actattgtca cccctgccta cagctgggaa 12180

tctccaacat agactggatg atggcataac ccagatgaca tttacccctg cgtctcttta 12240

cagggtgtca ccttacattc acatatctaa tgattctcaa aggctattta ccgaggaagg 12300

aataaaggag gggaatgtgg tttatcagca gattatgctc ttgggcttat cactaattga 12360

atcacttttc ccaatgacaa caactaagac atatgatgaa atcacattac acctccacag 12420

taaatttagc tgctgtatca gggaagcacc tgttgcggtt cctttcgagc tattagggtt 12480

ggcaccagaa ttaaggacag taacctcaaa taagttcatg tatgatccta gccctgtatc 12540

agagagagac tttgcgagac ttgacctagc tatcttcaaa agttacgagc tcaatttaga 12600

gtcatattcc acaatggagc taatgaacat tctctcaata tctagtggga agttgattgg 12660

ccagtccatg gtttcttacg atgaagatac ctctataaag aatgacgcta taatagtgta 12720

tgacaacaca cgaaattgga tcagtgaagc ccagaattca gatgtggtcc gcttattcga 12780

gtatgcagca ctcgaagtgc ttctcgactg ttcgtatcaa ctctactatc tgagagtgag 12840

gggcttaaat aacatcgtcc tgtacatgag tgatttatac aagaatatgc caggaattct 12900

actctctaat attgcggcaa caatatctca ccccatcatt cattcaaggt taaatgcagt 12960

aggtctagtc aaccatgacg ggtcacacca gcttgcagac acagatttca tcgaaatgtc 13020

tgcaaaacta ttagtctctt gcactcgacg cgtggtttca ggtttatatg cagggaataa 13080

gtacgatcta ttgttcccgt ctgtcttgga tgataacctg agtgaaaaga tgcttcagct 13140

aatttcccga ttatgttgtc tgtacacagt gctctttgcg acaacaagag aaattcctaa 13200

aataagaggc ctatcagcgg aagaaaaatg ctcagtactc actgagtacc tactgtcaga 13260

tgttgtgaaa ccattgctta agtctgagca agtgagctct atcatgtctc ccaacataat 13320

cacgttccca gccaatttat attacatgtc taggaagagc cttaatttga tcagggaaag 13380

agaggacagg gataccatct tagcattgtt gttccctcag gaaccactgc ttgagttttg 13440

tccagtgcag gatattggtg ctcgagtgaa agatccattt actcgacaac ctgcagcgtt 13500

catacaagag ttagatttga gtgctccagc gaggtatgac gcatttacac ttagtgaggt 13560

tcactccgag catacattgc caaattcaga ggaagattat ttagtacgat acatgtttag 13620

aggaataggg actgcgtcat cttcttggta taaggcatct catcttcttt ctgtacctga 13680

ggtcaggtgt gcaagacatg ggaactccct atatttggcg gagggaagtg gagccattat 13740

gagtcttctt gaattgcata taccacacga gaccatctac tataatacgc ttttctcgaa 13800

tgagatgaac cccccacagc gacacttcgg accgacccca acacagtttc taaattcagt 13860

agtttatagg aatctacagg cagaagtgcc gtgtaaagat ggatttgtcc aggaattccg 13920

cccattgtgg agagagaatg cagaagagag tgacctgacc tcagataaag cggtgggata 13980

catcacatct gcagtgccct acagatctgt atcattacta cattgcgaca tcgaaattcc 14040

accgggatct aatcaaagct tactagatca actggctacc aatttatcgc tgattgccat 14100

gcattctgta agggagggcg gagttgtgat catcaaagta ctgtatgcaa tgggatatta 14160

cttccatcta ctcatgaatt tattcactcc atgttccaca aaaggataca ttctctctaa 14220

tggctatgct tgcagagggg atatggagtg ttacctgata tttgtcatgg gctatttagg 14280

cgggcctaca ttcgtgcacg aggtggtgag gatggcaaaa actttagtgc agcggcatgg 14340

cacacttctg tctaaatcag acgaaattac attgactagg ttatttacct cacagcggca 14400

tcatgtaaca gacatcctat ccagcccttt gccgagacta atgaaattct tgagagagaa 14460

cattgatgct gcactgattg aagctggggg acagcccgtc cgtccgttct gtgcagagag 14520

tttagtgagc acactaacag atgtgactca gatgacccag atcatcgcca gccacattga 14580

cacagtcatt cgatccgtaa tctacatgga agccgagggt gaccttgctg atacagtgtt 14640

cttattcact ccttacaatc tctctacaga cggtaagaag agaacatcac ttaaacagtg 14700

cacaagacag atcttagagg tcacaatact aggtctcaga gtcaaagatc tcaataaagt 14760

aggtgatgta attggcttaa tactcaaagg tatggtttct ctagaggacc tcatcccgct 14820

gaggacatac ttgaagcgta gtacctgccc taaatacttg aaggcagtcc taggtattac 14880

taagctcaaa gaaatgttca cagacacctc tttattatac ttgactcgtg ctcaacaaaa 14940

attctatatg aaaaccatag gcaatgcagc caagggatat tacagtaaca atgactcttg 15000

aaggcaatca catatcaata gactatcttc ttagctgatt gtactctcat taacctggtt 15060

atgccatatt agaaaaaagt tgaattccga ccctttgaaa ctcgtattcg gattcgaata 15120

attatctcaa aacaggagtg cgcgtagtta tccttgattg cagccctgtc attcaccaaa 15180

tctttgtttg gt 15192

Claims

1.一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株，是新城疫病毒基因Ⅷ型NDV/rAHR09(Newcastle DiseaseVirus，NDV/rAHR09)，它的保藏号为CCTCC NO：V201739。

2.权利要求1所述热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09基因组序列，如SEQID No.47所示。

3.含有权利要求1所述热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株NDV/rAHR09的基因组cDNA的全长转录载体。