CN108872578A - 一种诊断和监测口腔癌的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种监测口腔白斑向口腔癌转化以及诊断口腔癌的新方法，包括监测口腔白斑受试者口腔外泌体的浓度变化，从而对疾病所处病理状态以及癌变的风险做出判断。

Description

一种诊断和监测口腔癌的新方法
技术领域
本发明涉及一种无痛、简便的监测口腔白斑向口腔癌转化的新方法，包括监测受试者唾液外泌体的浓度的变化，从而确定口腔白斑所处病理阶段，实现在癌变之前发现癌变高风险患者，及时对其实施治疗措施，实现口腔癌的早期、有效防治。
背景技术
口腔癌是世界上最常见的10种癌症之一，占头颈部恶性肿瘤的80％，全球范围内约有5百万口腔癌患者，其中以口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)多见，其五年生存率约为35-57％，每年约有13万口腔癌患者死亡[1-2]。口腔癌主要发生于中老年人。尽管近年来在诊断技术、外科手术以及化疗、放疗方面取得了进步，但不幸的是患者的5年存活率仍然徘徊在50％左右。有效防治口腔癌的关键在于正确识别具有恶变潜能的口腔疾病，也称癌前病变。如果能够做到早期正确诊断、持续监测、及时干预，则对于口腔癌的预防和治疗具有重要意义。
口腔癌前病变是指口腔颌面部的某些临床即组织学有改变，并具有癌变倾向的病变，包括白斑、红斑、扁平苔藓、盘状红斑狼疮、黏膜下纤维性变、***状瘤、慢性溃疡、黏膜黑斑及色素痣等，其中口腔白斑被公认为口腔斑纹疾病中最典型的癌前病变之一，其癌变率高达10-36％。
口腔白斑(Oral leukoplakia，OLK)也称为口腔黏膜白斑，是由匈牙利皮肤科医生Er no Sohuimmer于1887年首先命名，是指发生于口腔黏膜上的白色或灰白色角化异常性病变。口腔黏膜白斑常见于中老年人群,好发于唇、颊、舌、腭等黏膜上,一般无自觉症状,初起时呈乳白色斑块,表面光滑、平或稍高出正常黏膜。白斑从癌前病变到发展为口腔癌可以经历几年到十几年,其癌变的过程也是一个多阶段、多步骤的过程,都要经历增生→鳞状上皮化生→轻度、中度、重度异常增生→原位癌→***的演变[3-4],而且大部分口腔白斑可长期处于良性状态不发生癌变，只有少部分经历癌前病变、癌前状态发展成癌。近年来，口腔癌发病率有增高及明显年轻化的趋势。尽管对口腔癌的外科手术、放疗及化疗技术在不断进步，但患者的5年存活率仍然不到50％。其中肿瘤局限者5年生存率大约为80％，而发生转移者则下降到20％[5]。
口腔癌总体生存率较低的原因是多方面的，患者就诊过晚是一个很重要的因素，多数口腔癌发现时已到中晚期。早期发现口腔癌的关键是对具有恶变潜能的口腔癌前病变做到正确诊断、持续监测和早期发现。如果口腔癌患者能够早期诊断并得到及时治疗，其预后会大大改善。因此如何争取早期发现口腔癌变的蛛丝马迹就成为众多学者研究的热点。
目前，用于检测口腔癌方法主要有临床检查、组织病理学检查、脱落细胞学检查、活体组织染色、光学检查、肿瘤细胞分子标志物的检测等。
临床检查是目前最为简便的方法，医生采用视诊、扪诊检查可以发现口腔内的病损。如果医生的临床经验不足和患者的依从性较差，不能定期随访，都会影响到临床观察效果。仅凭临床检查是不能判断是否有癌变倾向的，还需要组织病理学检查进一步确诊。
脱落细胞学检查是一种比较简便的检测方法，应用辅助检查手段包括DNA图像定量分析、微核分析等可以判断病损组织是否发生癌变。但是该项技术应用的成功与否取决于操作者的经验以及刷取细胞的数量、部位等。
活体组织染色是一种非损伤性对早期口腔癌进行诊断的方法。其原理是利用癌变组织对染色剂的染色程度不同而显示病变组织部位。染色剂有甲苯胺蓝、卢戈液、美兰等。目前口腔科常用的是甲苯胺蓝，但其假阳性率高，容易出现误诊。
光学检查方法是一类基于组织光学特性的检查技术，目前在肿瘤筛查领域内研究较多，这类技术包括组织光谱学检查技术、自体荧光成像技术及VELscope等。目前在口腔中应用的主要是VELscope技术，VELscope发射出一种蓝色激光，波长在400-460nm之间，它可以激发口腔组织自体荧光团中的绿色荧光。这种光学上的改变，可以揭露黏膜细胞的新陈代谢、生物化学和结构信息，并且可以定位区域癌变。目前这项技术的应用都是基于已经在病理活检确定存在口腔黏膜的异常增生或癌变的条件下，所以还需要进一步的临床验证。
近来肿瘤细胞分子标志物检测等受到人们的关注。用于检测口腔癌前病变恶性变的生物标记物可以大致分为四类：1.与细胞增殖相关的标志物，如增殖细胞核抗原、核仁组成区嗜银蛋白、Ki 67 Mi b－1、端粒酶等；2.与细胞凋亡相关的标志物，如Bcl－2/Bax，Survivin，环氧化物酶2等。；3.特异性基因，如p53基因及其表达产物；4.染色体畸变，如微卫星标志及杂合性缺失、DNA含量等[6]。Mendez等发现，与正常组织相比，口腔癌中有314个基因表达有差异，其中239个基因表达上调，75个基因表达下调[7]。越来越多的研究显示唾液中的生物标记物与口腔癌的发生和发展以及预后相关，然而口腔癌的生物标志物目前还没有一个或一组的指标能获得公认的可靠效果。
尽管存在上述诸多的口腔癌检测方法，但组织病理学检查仍然是口腔白斑和口腔癌诊断的金标准。手术者根据病变大小、部位、边界的清晰度综合考虑后，决定切除活检还是切取活检。病变的高危相不一定均匀分布，须观察可疑点，必要时多位点活检。
由于该检查操作本身对病变有创伤性和刺激性，术后瘢痕还可能影响观察，进一步限制了该检查的可重复性。对于处在单纯增生或异常增生阶段的白斑向口腔癌转化的监测而言，组织病理学检查因其需要反复获取活体组织而难以用作常规的监测手段。
白斑癌变的监测需要对病变进行定期检查，记录其变化，从而对其癌变风险做出适当评估，力争在白斑转化成口腔癌前发现高风险患者，及时对其采取适当治疗，因为患者一旦由口腔黏膜白斑转变为口腔鳞状细胞癌，其5年的生存率不到50％[8]。因此，需要寻找一种能准确及时监测白斑向口腔癌转化的方法，这种方法不仅需要反映病变转化的动态过程，而且要易于实施，患者能够接受。
本申请的发明人发现，单纯增生的口腔黏膜白斑向白斑伴异常增生、口腔癌的转化，患者唾液外泌体的浓度发生显著的变化，即白斑处于单纯增生状态时，唾液外泌体的浓度相对于正常人差异不显著；但白斑进展到异常增生阶段时，唾液外泌体的浓度相对于正常人明显升高，差异显著；一旦异常增生转化为口腔癌，唾液外泌体的浓度相对于正常人反而明显下降，并且差异显著。伴随白斑从单纯增生、异常增生到癌变的病理变化，患者唾液外泌体的浓度发生先升高后降低的动态变化过程。这一发现提示可以通过测定患者唾液外泌体的浓度监测白斑的不同病理阶段的转化，同样，可以通过定期监测患者唾液外泌体的浓度来监测白斑向口腔癌转化的病理过程。唾液外泌体的浓度有望成为诊断白斑和口腔癌、以及预测白斑癌变风险、监测白斑癌变过程等的新方法。
发明内容
本发明提供了一种可重复实施的、简便易行的白斑和口腔癌的辅助诊断方法。同时，本发明还提供了一种监测口腔白斑向口腔癌转化的方法，包括定期监测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，判断出病变所处的状态(阶段)，做出相适应的随访计划和治疗方案。同时，通过监测受试者唾液外泌体的浓度，对口腔白斑的癌变趋势做出判断，及时发现口腔癌高风险患者，并对其进行适宜的治疗。
因此，本发明一方面涉及：
1.一种口腔癌的辅助诊断方法，包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
2.项1的辅助诊断方法，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著升高，提示所述受试者口腔白斑伴有异常增生，需要严密监视其发展。
3.一种监测口腔白斑向口腔癌转化的方法，包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生，需要严密监视，但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降，提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌转化。
4.一种预测口腔白斑向口腔癌转化风险的方法，包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的风险增大。
5.项4的方法，其中唾液外泌体的浓度由相对于正常人显著升高转变为相对于正常人显著下降提示口腔白斑已从异常增生转化为口腔癌的可能。
6.一种口腔癌的筛查方法，包括检测受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者罹患口腔癌的可能。
7.项1-6任一项的方法，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
8.一种辅助诊断口腔白斑所处的病理阶段的方法，包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异，提示口腔白斑处于单纯增生阶段，所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高，提示口腔白斑伴有异常增生，所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
9.项8的方法，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
10.疑似口腔白斑的辅助鉴别方法，包括测定唾液外泌体中miRNA185的水平，其中该水平比正常人显著下降提示受试者罹患口腔白斑的可能。
11.项10的方法，包括对测定结果为miRNA185水平显著下降的受试者进一步测定所述受试者唾液外泌体的浓度来确定口腔白斑所处的病理阶段，其中外泌体的浓度与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段，唾液外泌体浓度相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生，唾液外泌体的浓度相对于正常人显著降低，提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
12.项11的方法，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
另一方面，本发明涉及：
1.检测唾液外泌体的试剂或仪器在制备口腔癌辅助诊断方法中使用的试剂或试剂盒、或者仪器中的用途，所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
2.项1的辅助用途，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著升高，提示所述受试者口腔白斑伴有异常增生，需要严密监视其发展。
3.检测唾液外泌体的试剂或仪器在制备监测口腔白斑向口腔癌转化的方法中使用的试剂或试剂盒、或者仪器中的用途，所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生，需要严密监视，但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降，提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌转化。
4.检测唾液外泌体的试剂或仪器在制备预测口腔白斑向口腔癌转化风险的方法中使用的试剂或试剂盒、或者仪器中的用途，所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的风险增大。
5.项4的用途，其中唾液外泌体的浓度由相对于正常人显著升高转变为相对于正常人显著下降提示口腔白斑已从异常增生转化为口腔癌的可能。
6.检测唾液外泌体的试剂或仪器在制备口腔癌的筛查方法中使用的试剂或试剂盒、或者仪器中的用途，所述方法包括检测受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者罹患口腔癌的可能。
7.项1-6任一项的用途，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
8.检测唾液外泌体的试剂或仪器在制备辅助诊断口腔白斑所处的病理阶段的方法中使用的试剂或试剂盒、或者仪器中的用途，所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异，提示口腔白斑处于单纯增生阶段，所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高，提示口腔白斑伴有异常增生，所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
9.项8的用途，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
10.检测唾液外泌体中miRNA185水平的试剂在制备辅助鉴别疑似口腔白斑的方法中使用的试剂或试剂盒中的用途，所述方法包括测定唾液外泌体中miRNA185的水平，其中该水平比正常人显著下降提示受试者罹患口腔白斑的可能。
11.项10的用途，所述方法包括对测定结果为miRNA185水平显著下降的受试者进一步测定所述受试者唾液外泌体的浓度来确定口腔白斑所处的病理阶段，其中外泌体的浓度与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段，唾液外泌体浓度相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生，唾液外泌体的浓度相对于正常人显著降低，提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
12.项11的用途，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
另一方面，本发明还涉及：
1.一种通过检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度辅助诊断口腔癌的方法在制备该辅助诊断口腔癌的方法中使用的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒带有包装插页，所述包装插页上带有通过检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度辅助诊断口腔癌的方法的说明，所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
2.项1的辅助诊断用途，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著升高，提示所述受试者口腔白斑伴有异常增生，需要严密监视其发展。
3.一种通过监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度监测口腔白斑向口腔癌转化的方法在制备该方法中使用的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒带有包装插页，所述包装插页上带有通过监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度监测口腔白斑向口腔癌转化的方法的说明，所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生，需要严密监视，但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降，提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌转化。
4.一种通过监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度预测口腔白斑向口腔癌转化风险的方法在制备该方法中使用的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒带有包装插页，所述包装插页上带有通过监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度预测口腔白斑向口腔癌转化风险的方法的说明，所述方法包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的风险增大。
5.项4的用途，其中唾液外泌体的浓度由相对于正常人显著升高转变为相对于正常人显著下降提示口腔白斑已从异常增生转化为口腔癌的可能。
6.一种通过检测受试者唾液外泌体的浓度筛查口腔癌的方法在制备该方法中使用的试剂或试剂盒中用途，所述试剂或试剂盒带有包装插页，所述包装插页上带有通过检测受试者唾液外泌体的浓度筛查口腔癌的方法的说明，所述方法包括检测受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者罹患口腔癌的可能。
7.项1-6任一项的用途，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
8.一种通过检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度辅助诊断口腔白斑所处病理阶段的方法在制备该方法中使用的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒带有包装插页，所述包装插页上带有通过检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度辅助诊断口腔白斑所处病理阶段的方法的说明，所述方法包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异，提示口腔白斑处于单纯增生阶段，所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高，提示口腔白斑伴有异常增生，所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
9.项8的用途，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
10.一种通过测定唾液外泌体中miRNA185的水平辅助鉴别疑似口腔白斑的方法在制备该方法中使用的试剂或试剂盒中的用途，所述试剂或试剂盒带有包装插页，所述包装插页上带有通过测定唾液外泌体中miRNA185的水平辅助鉴别疑似口腔白斑的方法的说明，所述方法包括测定唾液外泌体中miRNA185的水平，其中该水平比正常人显著下降提示受试者罹患口腔白斑的可能。
11.项10的用途，所述方法包括对测定结果为miRNA185水平显著下降的受试者进一步测定所述受试者唾液外泌体的浓度来确定口腔白斑所处病理阶段，其中外泌体的浓度与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段，唾液外泌体浓度相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生，唾液外泌体的浓度相对于正常人显著降低，提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
12.项11的用途，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
定义
本发明所述的“癌前病变(precancerous lesion)”是指本身不是癌，但更易转变为癌的一类病损。其中，“口腔癌前病变”(oral precancerous/premalignant lesion,OPL)是指有形态学变化并具有癌变潜在可能性的口腔病变，临床上多见为口腔上皮性癌前病变，例如临床常见的白斑、红斑、扁平苔藓、盘状红斑狼疮、黏膜下纤维性变、***状瘤、慢性溃疡、黏膜黑斑及色素痣等。
本发明所述的“口腔白斑”是发生于口腔黏膜上以白色为主的损害，不能擦去，也不能以临床和组织病理学的方法诊断为其他可定义的损害，属于癌前病变或潜在的恶性疾患(Potentially Malignant Disorders,PMD)范畴，不包括吸烟、局部摩擦等局部因素去除后可以消退的单纯性过角化病。本发明的口腔白斑也简称为白斑。
口腔白斑依据其组织病理学表现可分为单纯增生状态的白斑和白斑伴(有)异常增生，前者在本发明中称为白斑(单纯增生)、单纯增生的白斑或白斑的单纯增生阶段，病理表现为：上皮增生，有过度正角化或过度不全角化，或者两者同时出现为混合角化；上皮单纯性增生为良性病变，表现为上皮过度正角化，粒层明显和棘层增厚，没有非典型细胞。上皮钉突可伸长且***，但仍整齐且基底膜清晰。固有层和黏膜下层中有淋巴细胞、浆细胞浸润。白斑伴异常增生或称为白斑的异常增生阶段，恶变潜能随上皮异常增生程度的增加而增加。上皮异常增生的组织病理变化为：上皮基底细胞极性消失；出现一层以上基底样细胞；核浆比例增加；上皮钉突呈滴状；上皮层次紊乱；有丝***象增加，可见少数异常有丝***；上皮浅表1/2出现有丝***；细胞多形性；细胞核浓染；核仁增大；细胞黏着力下降；在棘细胞层中单个或成团细胞角化；根据上述项目出现的数目分为轻、中、重度上皮异常增生。
口腔癌前病变，例如口腔白斑，不是癌，但如果没有及时治疗，又受到各种不良刺激，便可能发展成口腔癌。口腔癌的组织病理变化为：分化好的鳞状细胞癌中，细胞间可见细胞间桥，在癌巢的中央可出现层状角化物，为角化珠或癌珠。分化较差的鳞状细胞癌无角化珠形成，甚至也无细胞间桥，瘤细胞呈明显的异型性并见较多的核***象。
“外泌体(exosome)”是由细胞经过“内吞－融合－外排”等一系列调控过程而形成，并可分泌至胞外的分子直径为40～100nm的亚细胞双层膜囊泡，其内含有与细胞来源相关的蛋白质、miRNA及mRNA等物质。外泌体既可以通过质膜受体直接激活受体细胞，也可以转运蛋白质、mRNA、miRNA甚至细胞器进入受体细胞内，同时也可以携带处于不同病理状态下的细胞所含有的特殊“信息”，进入体液(包括唾液，血液等)，从而在生理学和病理学上都发挥着重要作用。
从体液中分离和提取外泌体的方法是本领域已知的[9]，多采用超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀或过滤的方法，对外泌体进行前期的分离。之后利用电镜来分析其大小和形态，利用流式细胞仪来分析细胞表面标记，通过蛋白免疫印迹(Western blot)和ELISA等方法对蛋白进行分析，或通过qPCR和新一代测序(NGS)来分析RNA，包括检测miRNA及mRNA等物质[10]。
“显著升高”或“显著降低(下降)”指升高或降低(下降)的程度与正常人相比具有统计学显著性。
附图说明
图1显示H&E染色白斑不同阶段的典型病理所见。
图2显示正常人群，白斑单纯增生、白斑伴异常增生、以及口腔癌患者病理组织中E-钙粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平。该图可见，口腔癌组织中发现E-钙粘蛋白以及波形蛋白表达出现异常，统计分析发现，正常口腔黏膜，口腔白斑单纯增生，白斑伴异常增生以及口腔癌组织(早期浸润)中E-钙粘蛋白表达水平明显降低，相反波形蛋白表达水平逐渐增加，其染色强度随着正常黏膜转移至癌症的发展而逐渐增强，组间差异有统计学意义(P<0.01)。
图3显示正常人群、白斑单纯增生、白斑伴异常增生、以及口腔癌患者病理组织中PI3K/AKT通路以及EMT相关蛋白的表达。由正常黏膜癌变的进展过程中，PI3K的磷酸化程度明显增加，而且AKT表达水平逐渐升高为正常黏膜组的500％。文献报道PI3K/AKT信号通路活化诱导EMT的发生。此实验结果证实，E-钙粘蛋白表达水平随着正常黏膜转移至口腔癌的发展而逐渐降低，相反波形蛋白表达量明显升高(P<0.001)。
图4显示口腔黏膜组织miRNA185原位杂交结果。如实施例1所示，实验分析了miR-185在口腔黏膜组织中的表达水平及表达部位。结果发现，在正常口腔黏膜中，可见大量上皮细胞核和包浆中出现强棕紫色反应，miR-185表达呈现强阳性；在口腔黏膜白斑单纯增生、白斑伴异常增生以及口腔癌病例中，miR-185表达显著减弱；在口腔癌病例中，miR-185在癌上皮组织中表达消失。
图5A-C显示唾液外泌体鉴定结果。透射电镜下可见，从上述正常组、白斑组、增生组、口腔癌组收集、纯化的样品颗粒大小均匀、形态一致，呈圆形或椭圆形膜性小囊泡形态，染色后可见囊泡有完整的包膜，其内有低电子致密物，其直径大小约在100纳米左右(图5A)。通过动态光散射发现收集、纯化的样品大小为108nm且通过ζ电位分析发现其具有高净负电荷(图5B)。通过蛋白免疫印迹检测发现这些颗粒表达外泌体特异性结构蛋白CD81、CD63或Foltillin-1(图5C)。
图6A-B显示唾液外泌体携带小分子微小RNA矩阵分析结果。图6A结果显示，口腔黏膜白斑唾液的外泌体所具有的微小RNA含量明显不同于来自健康人的外泌体。图6B显示来自口腔黏膜白斑单纯增生、白斑伴异常增生、口腔癌患者唾液外泌体的miR-185相对正常人显著减少。
图7A显示nanosight分析结果，显示口腔唾液外泌体高频率出现在直径约为100纳米的颗粒区间，说明外泌体大小约为直径100纳米。图7B显示口腔唾液外泌体浓度在口腔癌转化过程中的动态变化。
图8显示白斑不同发展阶段唾液外泌体浓度的比较结果。
实施例
实施例1口腔癌前病变癌变过程中重要信号通路的改变
方法
选取临床和病理诊断为口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴异常增生以及白斑癌变(口腔鳞状细胞癌)患者的组织标本作为研究对象。所述组织标本的例示性H&E染色病理所见如图1所示。
根据病理诊断结果进行分组：分为白斑单纯增生组(N＝15)；白斑伴异常增生组(N＝10)、癌变组，也称为口腔癌组(N＝15)。
正常对照组(N＝5)组织标本选自排除口腔黏膜病、因手术治疗需要切除部分正常组织并且愿意提供该组织用于研究的患者。
1.免疫组化检测
将正常组、白斑组、异常增生组、口腔癌组的组织样本固定在缓冲的***溶液中，切片，切片厚度为4μm，按下述步骤在组织切片上针对E-钙粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)实施免疫组化检测：加入抗E-钙粘蛋白抗体(5μg/ml,Abcam,Cambridge,MA)或抗-波形蛋白抗体(1:500,Abcam,Cambridge,MA)，4℃条件反应过夜，随后在室温下，与Alexa 568山羊抗兔IgG(1:1000,Invitrogen,Carlsbad,CA)和Alexa 488山羊抗小鼠IgG(1:1000,Invitrogen,Carlsbad,CA)温育1小时。接下来，将细胞封固于含有DAPI的Vectashield封固溶液(Vector Laboratories,Burlingame,CA)中，并通过共焦激光显微镜(LSM510,Carl Zeiss Co.Ltd,Jena,Germany)进行检查。
2.蛋白免疫印迹(Western blot)
从组织切片分离蛋白免疫印迹的样品裂解物(10μg)并在10-12％SDS-PAGE胶上进行免疫沉淀，随后使用抗E-钙粘蛋白(1:500；Abcam,Cambridge,MA)抗体、抗波形蛋白(1:500；Abcam)抗体、抗磷酸化AKT(1:5000；Abcam)抗体或抗磷酸化PI3K(1:500；Abcam)抗体进行免疫印迹，干燥后暴露至X射线胶片(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)。剥离上述印迹并与抗β-肌动蛋白(1:2,000；Abcam)温育以确认各实验中所装载的样品量相同。
3.原位杂交定位miR-185表达
在1X原位杂交(ISH)缓冲液(Exiqon Inc.,Woburn,MA USA)中将miR-185或对照序列探针(Exiqon Inc.)与固定的组织切片在55℃杂交60分钟，随后使用不同浓度的SSC缓冲液在55℃洗涤。如下述检测探针：使用单克隆抗地高辛碱性磷酸酶抗体(1:800)(Roche,Indianapolis,IN USA)温育60分钟，随后在30℃条件下，使用硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3'-多聚磷酸盐底物(Roche)温育2小时。最终，使用Nuclear Fast RedTM复染色切片，使用培养基(VWR,Radnor,PA)封固，并通过共聚焦显微镜检查。
结果
1.免疫组化检测结果显示，从正常组、白斑单纯增生组、白斑伴异常增生组到口腔癌组，样品组织中E-钙粘蛋白的染色强度逐渐减低，波形蛋白的染色强度逐渐增强，组间差异有统计学意义(P<0.05)，参见图2。
口腔白斑是最常见的口腔黏膜恶化前病变。口腔白斑在向口腔癌转化的过程中经历黏膜异常增生的过程，病理表现为上皮组织形态向间质组织形态的过渡(EMT)。在该过程中上皮细胞获得间充质、成纤维细胞样特征，并且细胞间粘附下降，运动增强。
EMT的重要分子事件是E-钙粘蛋白的下调和波形蛋白的上调。实验发现从白斑组、异常增生组到口腔癌组，样品组织中E-钙粘蛋白的染色强度逐渐减低，波形蛋白的染色强度逐渐增强，从分子水平上证明从白斑向口腔癌转化的过程中伴有EMT事件的发生。这些实验样品的分子水平上的发现和这样实验样品来源的患者的临床和病理诊断相吻合。
2.蛋白免疫印迹(Western blot)实验发现，从正常组、白斑组、异常增生组到口腔癌组，PI3K的磷酸化程度明显增加，而且AKT磷酸化水平逐渐升高为正常黏膜组的500％(P<0.01)，E-钙粘蛋白表达水平逐渐降低，相反波形蛋白表达量明显升高(P<0.001)，见图3。
口腔癌组织中发现E-钙粘蛋白以及波形蛋白表达出现异常，统计分析发现，正常口腔黏膜，口腔白斑单纯增生，白斑伴异常增生以及口腔癌组织(早期浸润)中E-钙粘蛋白表达水平明显降低，相反波形蛋白表达水平逐渐增加，其染色强度随着正常黏膜转移至癌症的发展而逐渐增强，组间差异有统计学意义(P<0.01)。
在EMT信号通路中，PI3K/AKT轴的活化是其主要特征。蛋白印记实验证实从白斑向口腔癌的进展过程中，PI3K和AKT的磷酸化程度明显增加，PI3K/AKT轴被活化，E-钙粘蛋白下调，波形蛋白上调，伴随EMT发生。这些实验样品的分子水平上的发现和这样实验样品来源的患者的临床和病理诊断相吻合。
3.原位杂交定位miR-185表达实验发现正常组样品中miR-185表达呈现强阳性(紫色)；在白斑组样品中，miR-185表达明显减弱，而在异常增生组和口腔癌组样品中可见少部分上皮细胞核和包浆中出现轻微棕紫色反应，miR-185表达呈现轻微阳性，或者miR-185表达几乎消失，见图4。
近来，已报道了多种直接靶向EMT转录因子和细胞结构组分的miRNA。上述实验结果发现，白斑单纯增生组，白斑伴异常增生组和口腔癌组患者样品中miR-185的水平相比正常对照显著下降。
综上所述，实验发现从口腔白斑单纯增生向口腔黏膜白斑伴异常增生、口腔癌转化过程中，3K/AKT-mTOR通路激活，EMT发生，同时miR-185表达下降甚至缺失。
实施例2口腔唾液外泌体携带miR-185，一致性地反应口腔癌前病变过程
方法
外泌体：从上述实施例1的临床和病理诊断患有口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴(有)异常增生、口腔癌(口腔鳞状细胞癌)的患者以及正常人口腔唾液中按如下方法收集、纯化口腔唾液外泌体。
上述患者或正常人在取唾液前不漱口，禁食水1小时。取唾液时坐位，头自然低下，口内唾液自然吐出至一次性托盘中，约2毫升左右，不要咳嗽。将收集的唾液立即放入小离心管中，4℃保存。
将样品4℃，410,000×g离心20分钟除去微囊泡(microvesicle)，上清液通过0.22μm的滤膜过滤二次，用Ti70固定角度超速离心机(Beckman Coulter,Brea,CA,US)以100,000×g离心得到外泌体集合团，并用PBS洗涤一次，再以100,000×g,4℃离心1小时，然后即时用于实验或-80℃保存备用。
1.唾液外泌体鉴定
(1)外泌体的形态特征观察
取外泌体悬液20μl滴于孔径2nm的载样铜网上，室温下静置10分钟，用滤纸从滤网侧边吸干液体，滴加3％磷钨酸溶液30μl，室温环境下复染5分钟，用滤纸吸干复染液，并在室温下干燥后，将此铜网置于透射电镜的样品室内，观察外泌体形态并拍摄电镜照片。
(2)唾液外泌体性状鉴定
通过动态光散射和电动电势分析仪对外泌体的大小和膜电位进行测量。
(3)外泌体特异性结构蛋白的分析
配制15％分离胶和5％浓缩胶，取外泌体悬液40μl与5XSDS上样缓冲液10μl混合煮沸5分钟，加于凝胶上样孔内，浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V，200mA恒流1.5小时。将凝胶中的蛋白质通过湿转法转移至硝酸纤维素膜上，室温下用含5％脱脂牛奶的封闭液封闭处理1h，经1XTBST缓冲液洗脱后，加入CD81、CD63以及Flottilin 1单克隆抗体于4℃条件下反应过夜，再次洗脱后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，于室温下平缓摇动1h。经1XTBST缓冲液洗膜3次后，用化学发光底物(ECL,Thermo Fisher Scientific.)进行检测。
2.唾液外泌体携带小分子微小RNA矩阵分析
使用microRNeasy Plus试剂盒(Qiagen,Valencia,CA USA)从唾液外泌体提取总RNA，并根据制造商的说明书使用miScript II RT试剂盒(Qiagen)进行逆转录。根据制造商的说明书通过微小RNA矩阵分析获得的转录物并通过qRT-PCR进行验证。将qRT-PCR标准化至U6snRNA引物。
结果
1.透射电镜下可见，从上述正常组、白斑组、异常增生组以及口腔癌组收集、纯化的样品颗粒大小均匀、形态一致，呈圆形或椭圆形双脂膜性小囊泡形态，染色后可见囊泡有完整的双层脂质膜结构，其内有低电子致密物，其直径大小约在100纳米左右，参见图5A。
通过动态光散射发现收集、纯化的样品大小为108纳米，并且通过ζ电位分析发现其具有高净负电荷，参见图5B。
通过蛋白免疫印迹检测发现这些颗粒表达外泌体特异性结构蛋白CD81、CD63或Foltillin-1，参见图5C。
2.通过微小RNA矩阵，我们首次发现来自口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生、口腔癌患者唾液的外泌体所具有的微小RNA含量明显不同于来自正常人的外泌体，参见图6A。来自口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生、口腔癌患者唾液外泌体的miR185(核苷酸序列：5’uggagagaaaggcaguuccuga 3’)相对正常人显著下降，参见图6B。此发现表明外泌体携带miR-185疾病信息，存在于唾液中，从而检测唾液外泌体携带的miR-185可以用来区分正常和患有口腔疾病患者，所述患有口腔疾病患者例如患有口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生、口腔癌患者。
实施例3口腔唾液外泌体在口腔癌转化过程中的动态变化
方法
对上述实施例2中收集、纯化的唾液外泌体通过如下方法进行定量分析。
纯化的唾液外泌体样品通过NanoSight纳米颗粒追踪分析(MalvernInstruments,Westborough,MA)评估外泌体的大小和频率。
通过使用NanoSight NS300仪器(NanoSight NTA 2.3 Nanoparticle Trackingand Analysis Release Version Build 0025)实施纳米颗粒追踪分析。通过使用配备了快速视频拍摄和颗粒追踪软件的NanoSight LM10***(NanoSight,Wiltshire,UnitedKingdom)测量布朗运动的速率进而分析外泌体制备物的大小分布并对其定量。在400μl的1×PBS/5mM EDTA溶液中稀释经纯化的外泌体，之后将样品注射入NanoSight样品室，确定外泌体的平均值±SD大小分布。
结果
研究证实，携带微小RNAs的外泌体释放到唾液中，并伴随疾病的发生、发展出现含量的动态变化，如图7所示。白斑(单纯增生)患者相对于正常人，其唾液中携带外泌体含量没有显著性差异；而疾病发展至白斑伴有异常增生阶段，唾液中携带的外泌体含量显著升高，和正常人相比呈现显著差异；而一旦发生恶变，转化为口腔癌后，唾液中携带外泌体含量反而下降，其下降程度和正常人相比差异显著，具有统计学意义。唾液中携带外泌体含量随着白斑(单纯增生)向异常增生、癌变的发展总体呈现一个先升高后下降的动态变化过程，参见图7。唾液外泌体的含量随白斑的单纯增生向异常增生和癌变的变化而变化，无疑可用来指示疾病的病理发展和变化，辅助口腔黏膜白斑(单纯增生)、白斑伴有异常增生和口腔癌的诊断。
另外，由于唾液外泌体的含量随口腔黏膜白斑疾病病理的变化而变化，从而可用来动态监测该疾病的病理发展过程，早期发现口腔癌变的患者。
另一方面，由于唾液中携带外泌体含量随着白斑单纯增生向异常增生、癌变的发展呈现先升高(参见图8A)后下降(参见图8B)的动态变化过程，通过监测，记录患者的唾液外泌体的含量也可以预测口腔癌发生的风险，如果外泌体含量持续升高预示着口腔癌变的风险逐渐增大(图8A)，如果外泌体的含量从升高转为下降(图8B)，提示白斑病变已发生癌变的可能性。
唾液外泌体的含量也可以结合上述miR-185的检测应用于临床诊断鉴别诊断。如上所述，释放到唾液中的外泌体携带miRNAs，而通过研究发现，白斑(单纯增生)的患者、白斑伴有异常增生的患者和口腔癌患者中唾液外泌体携带的miR-185比正常人显著下降，有统计学意义。这一发现可用来将正常人与患有白斑、异常增生或口腔癌的患者分开。例如，在体检或口腔疾病筛查过程中，在无法判断受试者黏膜为正常或患有白斑时，可以检测受试者唾液外泌体中miR-185水平，如果受试者唾液外泌体中miR-185水平比正常人显著下降，提示受试者患有白斑，从而对白斑疑似患者有辅助诊断意义。
如果受试者唾液外泌体中miR-185水平比正常人显著下降，需要进一步确定所述白斑所处的病理阶段、并对其进行癌变风险评估时，可进一步如上所述测定受试者唾液外泌体含量。如果唾液外泌体含量相对于正常人无显著差异，提示患者患有白斑(单纯增生)；如果唾液外泌体含量相对于正常人显著升高，表明白斑伴有异常增生，而相对于正常人显著降低，提示白斑发生癌变。
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Claims (10)

1.一种口腔癌的辅助诊断方法，包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
2.权利要求1的辅助诊断方法，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著升高，提示所述受试者口腔白斑伴有异常增生，需要严密监视其发展。
3.一种监测口腔白斑向口腔癌转化的方法，包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示白斑伴有异常增生，需要严密监视，但唾液外泌体的浓度相对于正常人显著下降，提示口腔白斑已从异常增生向口腔癌转化。
4.一种预测口腔白斑向口腔癌转化风险的方法，包括监测口腔白斑受试者的唾液外泌体的浓度，其中唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高提示口腔白斑向口腔癌转化的风险增大。
5.权利要求4的方法，其中唾液外泌体的浓度由相对于正常人显著升高转变为相对于正常人显著下降提示口腔白斑已从异常增生转化为口腔癌的可能。
6.一种口腔癌的筛查方法，包括检测受试者唾液外泌体的浓度，其中所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者罹患口腔癌的可能。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述口腔癌为口腔鳞状细胞癌。
8.一种辅助诊断口腔白斑所处病理阶段的方法，包括检测口腔白斑受试者唾液外泌体的浓度，其中所述唾液外泌体的浓度相对于正常人无显著差异，提示口腔白斑处于单纯增生阶段，所述唾液外泌体的浓度相对于正常人显著升高，提示口腔白斑伴有异常增生，所述受试者唾液外泌体的浓度相比正常人显著下降提示受试者口腔白斑转化为口腔癌。
9.疑似口腔白斑的辅助鉴别方法，包括测定唾液外泌体中miRNA185的水平，其中该水平比正常人显著下降提示受试者罹患口腔白斑的可能。
10.权利要求9的方法，包括对测定结果为miRNA185水平显著下降的受试者进一步测定所述受试者唾液外泌体的浓度来确定口腔白斑所处病理阶段，其中外泌体的浓度与正常人相比无显著差异提示所述受试者的口腔白斑处于单纯增生阶段，唾液外泌体浓度相对于正常人显著升高提示受试者的口腔白斑伴有异常增生，唾液外泌体的浓度相对于正常人显著降低，提示受试者的口腔白斑已转化为口腔癌的可能。
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