CN105660706A - 蜡样芽孢杆菌bcjb01在防治根结线虫方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用。蜡样芽孢杆菌BCJB01的上清液和菌悬液对番茄根结线虫二龄幼虫和即将孵化出二龄幼虫的卵均有完全致死作用。本发明提供了一种新的防治根结线虫的菌株，其效果不低于市面上现有化学药剂，在防治根结线虫方面有着极大的进步。

Description

蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用

技术领域

本发明涉及菌株的应用领域，特别是涉及蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用。

背景技术

根结线虫病是一种严重的植物线虫寄生性病害，常造成严重的经济损失。根结线虫病害的防治是目前农业生产上亟待解决的难题。传统的防治措施主要包括化学防治、轮作和使用抗病品种等，但这些防治措施都有其局限性。利用微生物防治根结线虫，具有可持续发展的优势，是根结线虫病害可持续治理的理想途径之一。

利用生防细菌防治根结线虫的研究报道，主要有根围促生细菌、穿刺巴氏杆菌、假单胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、类芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，它们在线虫生物防治中有着巨大的开发潜力，其价值也逐渐被人们认知。但是现有的生防细菌防治根结线虫的效果仍需改善加强,新的生防细菌也需要继续开发。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用。本发明提供了一种新的防治根结线虫的菌株，其效果不低于市面上现有化学药剂，在防治根结线虫方面有着极大的进步。

本发明的蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用技术方案为，蜡样芽孢杆菌BCJB01的上清液和菌悬液对番茄根结线虫二龄幼虫和即将孵化出二龄幼虫的卵均有完全致死作用。

本发明所述蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）BCJB01，其保藏号为CGMCCNO.10477，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2015年1月30日。

将蜡样芽孢杆菌BCJB01发酵液制备成生防菌剂进行蔬菜根结线虫病的防治。

蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01发酵液的制备具体为：培养温度30℃，转速110RPM，发酵时间为36～44h，发酵液pH维持在7.0，溶氧量20％，通气量8～12m³/小时，罐压0.05～0.1KPa，产孢率为80%以上，活菌计数7×10⁹CFU·mL^-1；发酵培养基配方：玉米粉2%，豆粕粉1%，酵母粉0.3%，CaCl₂0.1%，MgSO₄·7H₂O0.035%，Na₂HPO₄·12H₂O0.3%，NaH₂PO₄·2H₂O0.15%，pH7.0～7.2。

所述的生防菌剂为悬浮剂，将蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01发酵液与表面活性剂、防腐剂、悬浮助剂和增稠剂等混合制备悬浮剂，其中悬浮助剂是氯化钾。本发明的悬浮剂的悬浮助剂选择氯化钾替代现在常用的氯化钠，在实际应用中即可减少土壤环境中氯化钠的含量，防止土壤盐碱化，同时氯化钾可作为钾肥能被作物吸收利用。优选的，本发明悬浮助剂是氯化钾，防腐剂是双乙酸钠，表面活性剂是有机硅BD-3077，增稠剂是黄原胶。

所述的悬浮剂具体制备方法为：在蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01发酵液中，按质量百分比加入氯化钾5％～8％，双乙酸钠0.1％～0.5％，有机硅BD-30770.1％～0.3％，黄原胶0.2％～0.3％制得悬浮剂，所得悬浮剂中BCJB01活菌计数5×10⁹cfu·mL^-1。以上各组份的用量均以BCJB01菌的发酵液的质量为基数。

所述的生防菌剂为粉剂，将蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01与保护剂混合，然后喷雾干燥制备母粉，继而以草炭土为载体，壳聚糖为增效剂，脂肪醇聚氧乙烯醚为润湿剂，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐为分散剂，荧光增白剂CBS为紫外保护剂，将BCJB01母粉制成粉剂，其中喷雾保护剂为白炭黑、甘油和吐温80的混合物，保护剂浓度为14～20％，母粉中活菌得率平均在60%以上，活菌数在150亿个/g以上。

所述粉剂由按重量比的以下成分组成：

母粉5～10重量份

草炭土55～77重量份

壳聚糖1～2.5重量份

2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐3～5重量份

脂肪醇聚氧乙烯醚3～5重量份

荧光增白剂CBS0.2～0.5重量份。

本发明的蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用有益效果为：BCJB01发酵上清液及其菌悬液对番茄根结线虫二龄幼虫均有致死作用，致死作用随着稀释液浓度的降低而减小，随着处理时间的延长而加大。本发明中的BCJB01悬浮剂在每亩用量4L时的防治效果最好，防效为91.59%。BCJB01粉剂在每亩用量8kg时的防治效果为90.40%。本发明中的BCJB01悬浮剂和粉剂对番茄根结线虫的防治效果均好于已商品化的B418菌株制剂。其中，在相同使用剂量下，BCJB01悬浮剂防治效果较B418悬浮剂提高1.37倍，BCJB01粉剂防治效果较B418粉剂提高1.11倍。本发明中的BCJB01悬浮剂亩用量2L时的防效为76.64%，BCJB01粉剂亩用量4kg时的防效为78.12%，均与当前市场上防治效果最好的化学药剂10%噻唑膦颗粒剂相近。表明本发明中的BCJB01悬浮剂和粉剂是效果很好的微生物杀线剂。

附图说明

图1所示为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）BCJB01对根结线虫二龄幼虫卵的致死过程。

图2所示为BCJB01致死的二龄幼虫。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

本发明所述蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）BCJB01，其保藏号为CGMCCNO.10477，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）。

实施例1

BCJB01菌株分离及鉴定

1、本发明涉及番茄根结线虫二龄幼虫和即将孵化出二龄幼虫的卵均有致死作用的BCJB01菌株，分离于山东省聊城市高唐县白菜田土壤中。菌种保藏号为CGMCCNO.10477。

2、菌株鉴定

采用采用生理生化特征测定和16SrDNA序列比对分析结合的方法将菌株BCJB01鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）。同时，将分离纯化的单菌落同时进行V．P试验、菌膜形成试验、卵磷脂酶试验、淀粉水解试验、酪蛋白水解试验、七叶灵、纤维二糖等七个重要特征的鉴定，测定依据均参照东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌***鉴定手册》。

实施例2

BCJB01对番茄根结线虫二龄幼虫的致死作用

1.BCJB01发酵液的制备，按以下步骤进行：

（1）斜面菌种：采用固体LB培养基，将蜡样芽孢杆菌BCJB01接种在试管培养基上，30℃培养24小时。

（2）摇瓶菌种：采用液体LB培养基，将试管菌种接种在液体LB培养基中，置摇床上30℃，振荡培养15小时。

（3）液体发酵：采用培养基，玉米粉2%，豆粕粉1%，酵母粉0.3%，CaCl₂0.1%，MgSO₄·7H₂O0.035%，Na₂HPO₄·12H₂O0.3%，NaH₂PO₄·2H₂O0.15%，pH7.0～7.2。121℃灭菌20分钟，将（2）的种子接种于10升的发酵罐内（接种量为5％wt），30℃培养，溶氧量20％，通气量8～12m3/小时，罐压0.05～0.1KPa，搅拌速度为110RPM，培养时间为36~44小时；在芽孢脱落80％时终止发酵。

2.根结线虫二龄幼虫的制备

根结线虫采自常年发病的实验田，取番茄病根，流水洗净，置解剖镜下挑取新鲜卵囊，放入直径９ｃｍ的灭菌培养皿内，用0.5%次氯酸钠表面消毒3分钟，无菌水洗3次后放入24孔培养板中。放于25℃培养箱黑暗培养，待2龄幼虫孵化，每隔24小时换水1次，确保每次选用的2龄幼虫活力一致。将线虫悬浮液稀释为300条·mL^-1，4℃保存，备用。

3.BCJB01对番茄根结线虫二龄幼虫的致死率测定

分别将LB液体培养基培养的BCJB01的发酵液，离心，制得上清液原液和菌体。将菌体用灭菌水配成含有10⁹CFU·mL^-1的菌悬液，菌悬液和上清液原液稀释成5和10倍液，各吸取50微升，加入24孔盘（含100微升线虫悬浮液），以清水作对照，重复9次。分别在12、24和36h观察线虫活力。试验结果见表1。

表1BCJB01对番茄根结线虫二龄幼虫的致死率测定

。

由表1可知，BCJB01发酵上清液及其菌悬液对番茄根结线虫二龄幼虫均有致死作用，致死作用随着稀释液浓度的降低而减小，随着处理时间的延长而加大。

BCJB01对根结线虫二龄幼虫卵的致死过程请见说明书附图图1所示。BCJB01致死的二龄幼虫请见说明书附图图2所示。

实施例3

BCJB01制剂研究与应用

本发明以氯化钾或硫酸铵为悬浮助剂，双乙酸钠为防腐剂，有机硅BD-3077为表面活性剂，黄原胶为增稠剂，将BCJB01制成悬浮剂，有效菌体数量为5×10⁹cfu·mL^-1。

本发明以白炭黑、甘油和脂肪醇聚氧乙烯醚的混合物为喷雾保护剂，将BCJB01制成母粉，继而以草炭土为载体，壳聚糖为增效剂，脂肪醇聚氧乙烯醚为润湿剂，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐为分散剂，荧光增白剂CBS为紫外保护剂，将BCJB01母粉制成粉剂，有效菌体数量为7.0×10⁸cfu·g^-1。

本发明中BCJB01悬浮剂及粉剂对番茄根结线虫的防治

供试线虫为南方根结线虫(Meloidogyneincongnita)

供试作物为番茄（改良毛粉802F₁）

供试药剂为本发明中BCJB01悬浮剂、粉剂、B418悬浮剂、粉剂及10%噻唑膦颗粒剂。

灌根处理：试验前25~30d，在育苗盘中经消毒处理的土壤中培育番茄苗，至2~3叶期，挑选长势一致的番茄苗，移栽至带有线虫的土壤（常年发病的田间土壤）中，每盆5株，同时浇灌供试药剂。设B418菌剂和10%噻唑膦颗粒剂为对照药剂，清水为空白对照，每处理设10次重复，自移栽时隔周施药1次，连施3次，末次药后60d，清洗番茄根，调查记录根结数量，统计防治效果。

按下述标准进行病情分级；按公式计算病情指数及相对防效。

0级为根系完整，无根结。

1级为有少量根结，根坏死少于25%。

2级为根结数占根系数的26%~50%。

3级为根结数占根系数的51%~75%。

4级为根结特多且较大，占根系数的76%~100%。

病级指数=∑(各级植株数×该级数值)/(总株数×4)×100。

防治效果(%)=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100

数据统计分析：统计分析用EXCEL2003和SPSS19.0软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。试验结果详见表2

表2本发明中BCJB01悬浮剂和粉剂对番茄根结线虫的防治效果

。

由表2可知，本发明中的BCJB01悬浮剂在每亩用量4L时的防治效果最好，防效为91.59%。BCJB01粉剂在每亩用量8kg时的防治效果为90.40%。本发明中的BCJB01悬浮剂和粉剂对番茄根结线虫的防治效果均好于已商品化的B418菌株制剂。其中，在相同使用剂量下，BCJB01悬浮剂防治效果较B418悬浮剂提高1.37倍，BCJB01粉剂防治效果较B418粉剂提高1.11倍。本发明中的BCJB01悬浮剂亩用量2L时的防效为76.64%，BCJB01粉剂亩用量4kg时的防效为78.12%，均与当前市场上防治效果最好的化学药剂10%噻唑膦颗粒剂相近。表明本发明中的BCJB01悬浮剂和粉剂是效果很好的微生物杀线剂。

Claims (9)

1.蜡样芽孢杆菌BCJB01在防治根结线虫方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蜡样芽孢杆菌BCJB01的上清液和菌悬液对番茄根结线虫二龄幼虫和即将孵化出二龄幼虫的卵均有完全致死作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCJB01，其保藏号为CGMCCNO.10477。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将蜡样芽孢杆菌BCJB01发酵液制备成生防菌剂进行蔬菜根结线虫病的防治。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01发酵液的制备具体为：培养温度30℃，转速110RPM，发酵时间为36～44h，发酵液pH维持在7.0，溶氧量20％，通气量8～12m³/小时，罐压0.05～0.1KPa，产孢率为80％以上，活菌计数7×10⁹CFU·mL^-1；发酵培养基配方：玉米粉2％，豆粕粉1％，酵母粉0.3％，CaCl₂0.1％，MgSO₄·7H₂O0.035％，Na₂HPO₄·12H₂O0.3％，NaH₂PO₄·2H₂O0.15％，pH7.0～7.2。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生防菌剂为悬浮剂，将蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01发酵液与表面活性剂、防腐剂、悬浮助剂和增稠剂等混合制备悬浮剂，其中悬浮助剂是氯化钾。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的悬浮剂具体制备方法为：在蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01发酵液中，按质量百分比加入氯化钾5％～8％，双乙酸钠0.1％～0.5％，有机硅BD-30770.1％～0.3％，黄原胶0.2％～0.3％制得悬浮剂，所得悬浮剂中BCJB01活菌计数5×10⁹cfu·mL^-1。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生防菌剂为粉剂，将蜡样芽孢杆菌BacilluscereusBCJB01与保护剂混合，然后喷雾干燥制备母粉，继而以草炭土为载体，壳聚糖为增效剂，脂肪醇聚氧乙烯醚为润湿剂，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐为分散剂，荧光增白剂CBS为紫外保护剂，将BCJB01母粉制成粉剂，其中喷雾保护剂为白炭黑、甘油和吐温80的混合物，保护剂浓度为14～20％，母粉中活菌得率平均在60％以上，活菌数在150亿个/g以上。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述粉剂由按重量比的以下成分组成：

母粉5～10重量份

草炭土55～77重量份

壳聚糖1～2.5重量份

2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐3～5重量份

脂肪醇聚氧乙烯醚3～5重量份

荧光增白剂CBS0.2～0.5重量份。