CN105556370B - 高分辨率扫描显微术 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于对样本(2)进行高分辨率扫描显微术的显微镜和方法，所述显微镜具有‑用于对样本(2)进行照明的照明装置(3)，‑成像装置(4)，用于在样本(2)上扫描至少一个点光斑或线光斑(14)并且用于在考虑成像比例的条件下在探测层面(18)内将点光斑或线光斑(14)成像为衍射受限的、静止的单个图像(17)，‑探测器装置(19)，用于对于不同的扫描位置以位置分辨率采集探测层面(18)内的单个图像(17)，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下在至少一个延伸/维度上至少是衍射受限的单个图像(17)的半值宽度的两倍，‑分析装置(C)，用于根据探测器装置(19)的数据对于扫描位置分析单个图像(17)的衍射结构并且用于产生样本(17)的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限，其中，‑探测器装置(19)具有：‑探测器阵列(24)，所述探测器阵列具有像素(25)并且大于单个图像(17)，和‑不成像的再分配元件(20‑21；30‑34；30‑35)，其布置在探测器阵列(24)上游并且将来自探测层面(18)的射线以不成像的方式分配到探测器阵列(24)的像素(25)上，‑其中，在调整回路中，通过根据调整信号切换再分配元件和/或调节用于适配图像尺寸的变焦光学器件/聚焦光学器件和/或联合探测器阵列的单个像素来进行调整，‑其中，该调整包含了图像对比度和/或图像清晰度和/或信噪比来作为调整参量。

Description

高分辨率扫描显微术
技术领域
本发明涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有：用于对样本进行照明的照明装置；成像装置，用于在样本上扫描至少一个点光斑或线光斑并且用于在考虑成像比例的条件下在探测层面内将点光斑或线光斑成像为衍射受限的、静止的单个图像；探测器装置，用于对于不同的扫描位置以位置分辨率采集探测层面内的单个图像，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的单个图像的半值宽度的两倍；分析装置，用于根据探测器装置的数据对于扫描位置分析单个图像的衍射结构并且用于产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。本发明还涉及一种用于对样本进行高分辨率扫描显微术的方法，其中：对样本进行照明；将在样本上以扫描方式导引的至少一个点光斑或线光斑成像为单个图像，其中，点光斑或线光斑在考虑成像比例的条件下衍射受限地成像为单个图像并且单个图像静止地处于探测层面内；对于不同的扫描位置以位置分辨率采集单个图像，所述位置分辨率在考虑成像比例的情况下至少是衍射受限的单个图像的半值宽度的两倍，从而采集单个图像的衍射结构；对于每个扫描位置分析单个图像的衍射结构并且产生样本的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限。
背景技术
这种显微镜或显微术方法例如由C.Müller和J.Enderlein的公开出版物PhysicalReview Letters,104,198101(2010)，或者由专利文献EP 2317362 A1已知，其也提及了关于现有技术的其它说明。
这种方式实现了分辨率的提高，方法是将光斑衍射受限地成像在探测层面上。衍射受限的成像将点光斑成像为艾里斑(Airy-Scheibe)。在探测层面内这样采集衍射斑，使得能够分辨出其结构。因此，在显微镜的成像效率方面，探测器进行过采样。在成像点光斑时，分辨出艾里斑的形状。通过适当的衍射结构分析，实现了将分辨率提高为衍射极限的2倍，这种分析在所述文献中进行了描述并且其与之相关的公开内容在此完全包含在本发明中。
然而在此在探测方面不可避免的是，对于每个在样本上以这种方式被扫描的点来说，与传统的激光扫描显微镜(以下也称为LSM)相比，必须记录具有多倍图像信息的单个图像。如果例如以16像素采集光斑的单个图像的结构，则不只是每个光斑包含16倍的数据量，而且单个像素平均只包含在通常的针孔探测中照射到LSM探测器上的射线强度的1/16。因为射线强度必然不均匀地分布在单个图像的结构、例如艾里斑上，所以在结构边缘上的射线强度实际上甚至还明显小于在n个像素时为1/n的平均值。
所要解决的问题是，能够在探测器侧以高分辨率采集射线量。通常在显微镜中使用的传统的CCD阵列不能实现足够的信噪比，因此即使延长图像记录时长也无济于事，而延长图像记录时长本身在应用中已经被视为是不利的。APD阵列也与过高的暗噪声相关，因此即使延长测量时长所得到的信噪比也不够。对于CMOS探测器同理，其还在探测器元件的尺寸方面是不利的，因为光斑的衍射受限的单个图像会落在过少的像素上。PMT阵列带来了类似的结构空间问题；在该处的像素同样过大。因此，结构空间问题尤其在于，用于高分辨率的显微镜在诸如准备设备的研发开销方面只在能够集成到现有的LSM结构中的情况下是可能的。然而在此预先给出了单个图像的特定尺寸。只在附加地设有再次将图像显著地、也就是以多个量级扩展的光学器件时，才能安装面积较大的探测器。这种光学器件使得想在没有其它成像误差的情况下得到衍射受限的结构是非常耗费的。
在现有技术中已知其它方法，它们避免所描绘的在高分辨率情况下探测方面的问题。例如在EP 1157297 B1中提到一种方法，其中借助结构化的照明充分利用非线性过程。结构化的照明在多个旋转和地点位置中在样本上推移并且在这些不同的状态下将样本成像在广视场探测器上，对于这些探测器不存在所述的限制。
在没有所述探测器限制的情况下同样达到高分辨率(也就是超过衍射极限的样本图像分辨率)的方法由WO 2006127692和DE 102006021317已知。简称为PALM的方法使用标记物质，其可以借助光学激活信号被激活。标记物质只能在激活状态下被激励辐射激励以发出某种荧光辐射；未激活的分子即使在有激励辐射入射的情况下也不会发出荧光辐射。激活射线使激活物质进入一种状态，在该状态下其能够被激励以发光。因此其通常称为变换信号。这样施加所述变换信号，使得至少一定比例的被激活的标记分子与相邻的同样被激活的标记分子相间隔为使得在被激活的标记分子在被以显微术的光学分辨率测量的情况下是分隔开的或者可事后分隔开。这称为激活的分子的隔离。对于这些被隔离的分子，能够简单地确定其在分辨率受限的情况下得到的射线分布的中心并且因此通过计算以比光学成像本来允许的精度更高的精度确定分子的位置。为了使整个样本成像，PALM方法利用了这个事实，即标记分子在给定的变化信号强度下通过变换信号被激活的概率对于所有标记分子来说是相同的。将变换信号的强度施加为使得实现期望的隔离。一直重复这些方法步骤，直至以一次一个子集被激励为发荧光的方式包含了尽可能所有的标记分子。
在本发明中，在样本上被扫描的光斑静止地在探测层面内成像。来自探测层面的射线以不成像的方式被再分配并且被引到探测器阵列上。在此，术语“以不成像的方式”是相对于探测层面内现有的单个图像而言的。单个图像的各个面区域当然仍可以按照成像定理成像。因此在探测器阵列与再分配元件之间完全可以存在成像的光学器件。然而，处于探测层面内的单个图像在再分配时不是保持不变的。
术语“衍射受限”不局限于按照阿贝原理的衍射极限，而是也包括这些情况，其中理论最大值由于实际的不可实现性或限制而变小20％。单个图像在这时也具有在此称为衍射结构的结构。该结构被过采样。
这种原理实现了应用一种尺寸不与单个图像匹配的探测器阵列。探测器阵列优选在至少一个延伸上大于或小于待采集的单个图像。不同几何设计的概念既包括探测器阵列的不同延伸也包括相对于探测层面内的单个图像的延伸的高度和宽度而言纵横比不同的布置。探测器阵列的像素还可以对于所需要的分辨率是过大的。这也允许了，探测器阵列的像素布置的轮廓与探测层面内的单个图像的轮廓是不同的。最后，按照本发明，探测器阵列具有与探测层面中的单个图像不同的大小。所述方法中的再分配或显微镜中的再分配元件实现了选择探测器阵列，而不需要考虑由于单个图像和其大小形成的整体尺寸限制和像素尺寸限制。尤其是可以将探测器排用作探测器阵列。
在LSM中样本的图像通常通过以光斑扫描样本的方式由大量的单个图像形成，所述单个图像分别对应于不同的扫描位置。
按照本发明的方案也能以并行化的形式对于多个光斑同时进行，如对于激光扫描显微镜已知的那样。由此多个光斑在样本上扫描式地被探测，并且多个光斑的单个图像静止地并排处于探测层面内。它们随即由面积上大小对应的共同的再分配元件或者由多个单个再分配元件进行再分配并且随即被引到相应更大的单独的或者多个单个探测器阵列上。
以下示例性地重点描述以一个单独点光斑进行的扫描。然而这不应理解为限制，并且所阐述的特征和原理实质上也适用于多个点光斑的并行扫描并且也适用于应用线光斑的情况。后者当然只是横向于线延伸地受到衍射限制，因此本说明书的与之相关的特征只适用于一个方向(横向于线延伸)。
通过按照本发明的方式，可以在令人满意的速度下并且以可忍受的设备耗费实施ISM方法。本发明为高分辨率显微术原理开启了广阔的、迄今未形成的应用领域。
实现再分配或再分配元件的可能性在于，使用由光导纤维组成的束。所述光导纤维优选可以设计为多模式的光导纤维。所述束具有入口，其布置在探测层面内并且在其轮廓中满足衍射受限的单个图像在探测层面内的延伸。而光导纤维在出口处以由探测器阵列预先给出的几何布局布置，并且这种布局与入口的布局不同。在此，光导纤维的出口侧端部可以直接导引到探测器阵列的像素上。特别有利的是，将束的出口联合在插头中，所述插头可以方便地插在探测器排、例如APD或PMT排上。
对于理解本发明重要的是，区分探测器阵列的像素和探测层面内的单个图像的用以被分辨的图像像素。每个图像像素通常正好对应于一个探测器阵列像素，但是两者在其布局方面是不同的。本发明的主要特征在于，在探测层面内记录在其尺寸和布局方面引起单个图像的过采样的图像像素的射线。以此方式分辨单个图像的结构，其由于单个图像的衍射受限的产生而是衍射结构。再分配元件具有入口侧，该图像像素设置在入口侧。入口侧处于探测层面内。再分配元件将每个图像像素上的射线导引至探测器阵列的像素之一。图像像素与探测器阵列的像素的对应并不保持图像结构，因此再分配相对于单个图像而言是不成像的。本发明的特征也可以在于，在按照本发明所述类型的显微镜中，探测器装置具有不成像的再分配元件，其具有处于探测层面内的入口侧，在所述入口侧以图像像素记录射线。再分配元件还有出口侧，在出口侧将在图像像素处记录的射线输入探测器阵列的像素，其中，射线从入口侧向出口侧相对于单个图像以不成像的方式再分配。类似地，按照本发明的方法的特征可以在于，在按照本发明所述类型的方法中，在探测层面内以图像像素记录射线，所述射线相对于单个图像以不成像的方式再分配到探测器阵列的像素上。探测器阵列在其像素的布局和/或尺寸方面与探测层面内的图像像素的布局和/或尺寸不同。此外，探测层面内的图像像素由再分配元件这样提供，使得相对于衍射极限，单个图像的衍射结构被过采样。
对于高度敏感的探测器阵列已知的是，相邻的像素在射线强度差较大的情况下显示出由于串扰造成的干扰。为了避免这种情况，优选采用一种扩展设计，其中光导纤维以在出口处相邻的光导纤维也在入口处相邻的方式从入口导引至出口。因为衍射受限的单个图像不显示跳跃状的射线强度变化，所以再分配元件的这种设计方案自动地确保了探测器阵列的并排像素具有尽可能小的射线强度差，这使串扰最小化。
取代基于光导纤维的再分配，也可行的是，为再分配元件配设镜子，其具有倾斜程度不同的镜元件。这种镜子例如可以设计为分段镜(Facettenspiegel)、DMD或者自适应镜，其中，对于后两种变型方案，确保了相应地调节或控制镜元件的斜率。镜元件将来自探测层面的射线导引至探测器阵列的像素，探测器阵列的像素具有与镜元件不同的几何构造。
镜元件与光导纤维束的入口内的光导纤维端部一样，在单个图像的衍射结构的分辨率方面示出了图像像素。图像像素的尺寸，而非(还有)探测器阵列的像素尺寸，对于过采样是决定性的。在此也将由多个单独探测器组成的组理解为探测器阵列，因为它们的布局总是不同于(也就是大于)探测层面内的图像像素。
对于LSM，根据期望的分辨率使用不同的物镜。物镜的更换改变了单个图像在探测层面内的延伸。因此优选的是，沿成像方向在探测层面上游布置变焦光学器件，用于使单个图像的尺寸与探测器装置的尺寸适配。这种变焦光学器件在明显小于100％的百分比范围内改变单个图像的尺寸，也就是比开头作为不利之处阐述的使单个图像尺寸增倍的过程容易实现的多。
对样本的照明优选与在普通的LSM中一样同样以扫描方式进行，即使其并不是必须的。然而这样达到了最大分辨率提升。如果以扫描方式照明样本，则相宜的是，照明装置和成像装置具有共同的扫描装置，它们导引照明光斑经过样本并且同时关于探测器再扫描(descannt)与照明光斑重合的、在其上成像样本的光斑，从而单个图像在探测层面内静止。在这种结构中，可以将变焦光学器件置入照明和成像装置的共同部分中。这不仅允许将单个图像与探测层面内的探测器的尺寸适配，而且也附加地允许可使用的照明射线完全入射到物镜光圈(Objektivpupille)内，而不产生边缘损失，根据物镜的选择，物镜光圈可能改变。
在探测器阵列的并排像素之间的与射线强度有关的串扰可以如本文开头已经提到的那样，在再分配时借助光导纤维束通过光导纤维在束中的适当布局减少。附加地或替选地还可能的是执行校准。为此，每个光导纤维依次被施加射线并且采集相邻像素中的干扰信号。以此方式建立了校准矩阵，通过其在以后的样本显微术中校正并排像素的与射线强度有关的串扰。
单个图像的衍射结构的分辨率附加地允许确定光斑的运动方向，在扫描样本时沿着所述运动方向移动光斑。尽管运动方向原则上由扫描仪的机械机构(例如扫描镜或可运动的样本台)已知，然而在此出现机械上造成的剩余不准确度。该剩余不准确度可以被消除，方法是借助交叉关联分析探测器阵列的各个像素的信号。在此利用这一点，即样本内的并排的图像像素由于光斑的衍射受限的成像在一定程度上重叠，但是它们的中心是并排的。如果用交叉关联分析这些图像像素的信号，则可以减少或完全消除由于扫描机械机构不可避免的公差而保留下来的剩余不准确度。
除了提高分辨率，通过使来自(对应于探测层面内的图像像素的)各个探测器元件的测量序列的信号在空间和时间上相关来检测由光斑采集到的探测容积内的荧光随时间的变化，例如可由时间相关性如在荧光相关性光谱分析中那样确定漫射系数，以及可视化通过考虑图像像素之间的空间相关性而调节过的漫射和漫射屏障。荧光分子的运动过程也对于示踪应用而受到关注，因为在该处，照明光斑应追随荧光分子的运动。在此描述的布局允许了高度准确地在像素照明时间(Pixelbeichtungszeit)内确定运动方向。因此作为扩展设计优选的是，采集样本内的变化，方法是在样本中静止的点光斑或线光斑内确定和分析衍射受限的单个图像随时间的变化。
按照本发明的方法还能够在扫描式照明中修改照明分布，例如借助相位滤波器。由此可以非常简单地实现所述方法，如在Gong等人的Opt.Let.,34,3508(2009)中描述的那样。
至此在此描述了方法，控制设备在显微镜的运行中实现这些方法步骤。
不言而喻的是，上文所述的和下文还将阐述的特征不只可以在所说明的组合中，而且也可以在其它组合中或者单独地使用，只要不超出本发明的保护范围即可。
附图说明
以下例如借助也公开了本发明的重要特征的附图进一步阐述本发明。在附图中：
图1示出用于高分辨率显微术的激光扫描显微镜的示意图；
图2示出图1的显微镜的探测器装置的放大视图；
图3和图4示出探测器装置19的可能实施形式在探测层面内的俯视图；
图5示出通过用于使探测器场尺寸适配的变焦光学器件对图1的显微镜进行的扩展设计；
图6示出图5的显微镜在变焦光学器件方面以及在用于多色成像的扩展设计方面的变型方案；
图7示出图1的显微镜的变型方案，其中，所述变型方案涉及探测器装置；并且
图8示出图7的探测器装置19的变型方案。
具体实施方式
图1示意性地示出激光扫描显微镜1，其设计用于显微观察样本2。激光扫描显微镜(以下简称为LSM)1由控制设备C进行控制并且包括照明光路3以及成像光路4。照明光路照亮样本2中的光斑，并且成像光路4为了探测而衍射受限地成像该光斑。照明光路3和成像光路4分享多个元件。但这和对样本2的扫描式照明一样是不太必要的。也可以对样本进行宽场照明。
对样本2的照明在LSM1中借助所提供的激光束5进行，其通过不需要具有其它功能的转向镜6和透镜7耦合输入到镜子8上。镜子8用于使激光束5以反射角入射到发射滤波器9上。为了更直观地显示，对于激光束5只画出了其主轴。
当在发射滤波器9上反射之后，激光束5由扫描仪10双轴地向下转向并且借助透镜11和12通过物镜13聚焦在样本2中的光斑14内。在此，光斑在图1的视图中显示为点状，但也可以是线形的光斑。在光斑14中被激励的荧光辐射又通过物镜13、透镜11和12到达扫描仪10，之后沿成像方向又呈现静止的光束。所述光束经过发射滤波器9和15，它们的功能是在波长方面选择光斑14中的荧光辐射并且尤其将其与激光束5的例如可以用作激励辐射的激光束5分开。透镜16用于在整体上将光斑14成像为衍射受限的图像17，其处于探测层面18中。所述探测层面18是与光斑14在样本2中所处的层面共轭的层面。光斑14的图像17在探测层面18内被探测器装置19记录，其在以下根据图2至图4进一步阐述。在此重要的是，探测器装置19在空间上分辨探测层面18内的光斑14的衍射受限的图像17。
光斑在探测横截面上在18中的强度分布(高斯分布)在图1中显示为18a。
控制设备C控制LSM1的所有部件，尤其是扫描仪10和探测器装置19。控制设备对于不同的扫描位置记录每个单个图像17的数据，分析其衍射结构并且产生样本2的高分辨率的整体图像。
图1中的LSM1示例性地对于在样本上被扫描的唯一的光斑示出。然而LSM1也可以同时用于按照线光斑进行扫描，所述线光斑例如垂直于图1的附图平面延伸。也可行的是，这样设计图1的LSM1，从而扫描样本中的多个并排的点光斑。所述点光斑的相应的单个图像17在探测层面18内同样是并排的。探测器装置19相应地设计用于在探测层面18内采集并排的单个图像17。
在图2中放大地显示探测器装置19。所述探测器装置19由光导纤维束20组成，其馈向探测器阵列24。光导纤维束20由多个单光导纤维21构成。光导纤维21的端部构成光导纤维束入口22，其处于探测层面18内。因此，光导纤维21的各个端部示出了像素，通过这些像素记录光斑14的衍射受限的图像17。因为光斑14在图1的实施形式中示例性地是点光斑，所以图像17是艾里斑，其延伸处于在图1和图2中代表探测层面18的圆形内部。光导纤维束入口22的延伸的尺寸使得艾里斑的延伸被遮盖。光导纤维束20中的各个光导纤维21在其出口处在几何上布置得与在光导纤维束入口22处不同，也就是布置为长条形插头23的形式，光导纤维21的出口侧端部在该长条形插头23中并排地设置。插头23与探测器排24的几何布局适配地设计，也就是光导纤维21的每个出口侧端部正好处于探测器排24的一个像素25前方。
再分配元件的几何延伸是非常基本地，也就是与其实现形式(在图4中其通过纤维束实现)无关地在入口侧与单个图像的延伸(以及在并排的单个图像的多个点光斑的情况下)适配。再分配元件的功能是，由探测层面18这样记录射线，使得按照扫描定理测量，单个图像17的强度分布相对于衍射极限被过采样，也就是再分配元件具有处于探测层面18内的像素(按照图3的构造方式通过光导纤维的入口端部构成)，它们至少比最小的可分辨结构小2倍，所述最小的可分辨结构是在考虑探测层面18内的成像比例的情况下从衍射极限中得出的。
当然，使用插头23只是将光导纤维21的出口侧端部布置在像素25前方的多个可能性中的一种。同样可行的是使用其它连接。各个像素25也可以直接与光导纤维21熔合。不需要使用探测器排24；取而代之，可以对于每个像素25使用单独的探测器。
图3和图4示出光导纤维束入口22的可能实施形式。光导纤维21可以在光导纤维束入口22处相互熔合。由此达到更高的充填系数，也就是光导纤维束入口22处的单光导纤维21之间的空隙被最小化。熔合另一方面导致相邻的光导纤维之间在一定程度上的串扰。如果想要避免这一点，可以粘接光导纤维。也可以将光导纤维21的端部设置为正方形，如图4所示。
优选地，将各个光导纤维21与探测器阵列24的各个像素25对应为使得并排地处于光导纤维束入口22处的光导纤维21也在探测器阵列24处也是并排的。通过这种方式将相邻像素25之间的串扰减至最小，所示串扰例如可能由于散射射线或者在单个像素25的信号处理中出现。如果探测器阵列24是一排，则可以通过以下方式实现相应的布局，即，通过螺旋线确定单个光导纤维在探测器排上的顺序，所述螺旋线在探测层面18的俯视图中将单个光导纤维依次地连接。
图3还示出了无效纤维(Blindfasern)26，其处于光导纤维21在光导纤维束入口22上的布局的角部。这些无效纤维不导引至探测器阵列的像素25。在无效纤维的位置上不再存在分析信号所需的信号强度。由此可以将光导纤维21的数量并且因此将探测器排24或探测器阵列中的像素25的数量减小至使得例如可以通过32个像素进行工作。这些探测器排24已经在激光扫描显微镜的其它方面使用，这具有的优点是，只需在这些激光扫描显微镜中设置一个信号分析电子器件，并且其在已经存在的探测器排24与通过探测器装置19增添的其它探测器排24之间转换。
按照图4，将具有正方形的基本形状的光导纤维用于束。所述光导纤维同样在探测层面内具有高覆盖率，也就是有效地收集射线。
图5示出图1的LSM1的一种扩展设计，其中，在探测层面18上游布置有变焦光学器件27。在图1的构造方式中探测层面18所处的共轭平面形成中间像层面28，变焦光学器件27从中间像层面接收射线并且将其导引至探测层面18。变焦光学器件27允许使图像17最佳地与探测器装置19的入口的延伸适配。
图6示出图1的激光扫描显微镜1的另一种变型方案。一方面，变焦光学器件在此作为变焦光学器件29布置为，使得其处于光路的不仅被照明光路3而且被成像光路4穿过的部分中。由此得到的优点是，不只图像17的尺寸能够与探测器装置19的入口侧适配，也可以相对于成像光路4使物镜13的光圈填充度并且因此使激光束5的利用度适配。
附加地在图6中，LSM1还通过以下方式设计为双通道式，即在发射滤波器9下游布置有分束器，所述分束器将射线分为两个单独的颜色通道。颜色通道的相应元件分别相当于在图1的LSM1中沿成像方向布置在发射滤波器9下游的元件。颜色通道在图6的视图中通过附图标记后缀“a”和“b”进行区分。
当然，实现两个颜色通道与使用变焦光学器件29无关。然而组合的优点在于，必须单独地设置在两个颜色通道内并且因此重复存在的变焦光学器件27只需要一次。然而，变焦光学器件27当然也可以使用在按照图1的构造方式中并且图6的LSM1也可以在不具有变焦光学器件29的情况下实现。
图7示出图1的LSM1在探测器装置19方面的变型方案。
探测器装置19具有分段镜30，其具有各个小面31。所述小面31在图像17的分辨率方面相当于光导纤维21在光导纤维束入口22处的端部。各个小面31在其相对于射线入射的光轴的斜率方面有所不同。与透镜32和小型透镜阵列33以及只用于射线折叠的转向镜34一起，每个小面31将单个图像17的一个面区段成像在探测器阵列24的像素25上。根据小面31的定向，探测器阵列24在此优选可以是2D阵列，但也可以使探测器排。
图8示出图7的探测器装置19的扩展设计，其中在透镜32上游还布置有折射元件35，所述折射元件将射线特别好地分配到探测器排上。
如已经提到的那样，探测器阵列24在其几何形状方面可以无其它限制地选择。当然，探测器装置19中的再分配元件必须与相应的探测器阵列适配。最后，用以分辨图像17的各个像素在其尺寸方面不再通过探测器阵列24规定，而是通过对来自探测层面18的射线进行再分配的元件规定。在艾里斑中，斑的直径在衍射受限的成像中按照公式1.22·λ/NA得出，其中，λ是所成像的射线的平均波长，并且NA是物镜13的数值孔径。半值宽度是0.15·λ/NA。为了达到高分辨率，将探测时的位置分辨率设计为半值宽度的两倍就足够了，也就是两次扫描半值宽度。因此，小面元件31或者光导纤维21在光导纤维束入口22处的端部最大允许是衍射受限的单个图像的半值宽度的一半。这当然是在考虑处于物镜13下游的光学器件形成的成像比例的情况下适用的。在最简单的情况下，对于每个半值宽度而言探测层面18内的4x4像素阵列就足够了。
根据图5和图6阐述的变焦光学器件除了允许这样适配，使得光斑14的衍射受限的单个图像17的衍射分布最佳地填充探测器装置19的入口面积，还在将多于一个的艾里斑成像在探测层面18内时允许其它运行方式。在将多于一个的艾里斑成像在探测器装置19上的测量中，在探测器装置19的更靠外部的像素上探测来自样本2的更深平面的光。在处理图像的过程中，得到附加的信号强度，而不会影响LSM1的深度分辨率。因此，变焦光学器件27或29允许了在深度分辨率和图像的信噪比之间形成妥协。
通过前述方法实现分辨率提高的前提条件是在针孔层面(探测层面)内对荧光光场分布进行细致地扫描。为了将数据传递和数据处理速率保持较小，以必须的最小探测器(纤维)元件数量进行工作。这种情况与场分布在探测层面内的延伸与物镜-光圈直径和荧光波长的相关性的结合使得子艾里场(Sub-Airy-Feldverteilung)分布的特定于物镜的延伸必须能够与纤维束相对地在尺寸延伸上适配，以便最佳地扫描。
为此，本发明在以下作出了重要贡献。
本发明的特征在于独立权利要求的特征。
优选的扩展设计是从属权利要求的内容。
关于本发明的其它阐述在以下根据图9至图12进行。
经典的多次使用的、能够控制孔平面内的场分布的延伸的方法在于在针光圈层面内使用变焦***。替选地，可以使用具有可变焦距和固定焦点位置的聚焦光学器件(也可参见图11)。所述变型方案由比光圈变焦***中所需的透镜更少的透镜组成。也就是说在使用聚焦光学器件的情况下，复杂度和成本均较小。只需要纤维束就能将荧光光线的延伸保持恒定。
如果想要可选地或者完全地放弃变焦***或可调节的聚焦光学器件但尽管如此仍确保必须的物镜和/或波长灵活性，则按照本发明建议，并排地布置多个具有不同直径的纤维束并且使束的单个纤维分别优选在探测器阵列的相同探测器元件上终结(参见图9和图10)。具有最适当的采样的纤维束沿光轴伸展，或者照明光路中的主分色器以匹配的方式倾斜(类似于借助HFT(主分色器)对针孔进行调节)为使得选出的纤维束被照亮并且只有该光被探测到并且最后用于计算。
所述用于选择适当纤维束的方法能够非常快地切换(与纤维束上的艾里斑借助变焦***的尺寸改变相比)，因此这种解决方案尤其在多光谱测量中特别有利。
如果找到了聚焦光学器件(图11)的最佳设置或者最好的纤维束(图10)，则在按照Sheppard等人的[2]对数据进行再分类之后，图像对比度得到提高(尤其对于较高的空间频率而言因为所实现的分辨率提高和/或SNR改善而引起的图像对比度提高)。对于改善分辨率最适当的采样的这种优化可以在闭环调整回路中进行(closed loop)(图11)。对比度与信噪比的组合特别适合作为找到最佳设置或最佳纤维束的量度，因为最佳的焦点通过这两个条件明确地定义。
对于具有较大比例的焦点外光线的较厚样本，控制参数SNR会优选聚焦光学器件设置或纤维束，其中将多个艾里斑成像在纤维束上。另一方面，重建图像(例如按照Sheppard等人的著作In Optik 80,No.2,53(1982)进行重建)中的对比度会优选探测光扫描，其为了实现最佳分辨率优选只将一个艾里斑成像在纤维束上。借助调节参数能够优化分辨率与SNR之间的***，其中，在调节时考虑所使用的样本的特性。
对于调节例如可以使用在开始记录图像时的数据，以便在图像内部优化(如果图像已经在边缘处具有有代表性的信息)参数(聚焦光学器件设置)。替选地，在激光照明减小和/或扫描速度提高时首先借助快照获取对于优化图像中的所选区域重要的信息。
作为对所述用于探测光的最佳(次)艾里扫描的光-机械的实施形式的替选，可以从一开始就使用明显更多数量的光导纤维和探测器元件，例如2x 2x 32＝128，在原则上是必须的。这样光学器件就不需要是可改变的。
在这种变型方案中形成较高的数据速率，它们在当前还不能由实时计算机进行处理。由于此原因有利的是，将例如128个通道的数据降低为32个通道。对于正好有1个艾里斑落到纤维束上的情况，在靠近探测器的电子器件(FPGA即现场可编程门阵列，或者微控制器)中分别联合例如4个通道，因此所联合的通道具有已知的布局。对于正好有2个艾里斑处于纤维束上的情况，只读取内部的32个通道。对于中间值，必须根据纤维束上的艾里斑的尺寸找到关于将哪些纤维联合在一个通道内的合适配置，以便沿每个横向均实现分辨率提高。在例如32个通道上在FPGA中进行插值同样是可行的。
以下根据图9至图12中的示意性视图进一步阐述本发明。
各个附图标记(作为对以上示图中的附图标记的补充)表示：
40、41、42：纤维束
43、44、45：光导体
46：多通道探测器
47：可摆动的主分色器
48：滑块
R：调整回路
49：控制单元/计算机
50：可设置的聚焦光学器件
51：信号对应
52：信号对应
53：纤维入口
54、55、56：艾里直径在纤维入口上的分布
图9以示意图示出如已经根据图1至图8中的示图描述的激光扫描显微镜，具有处于针孔层面内的位置分辨的探测的子艾里斑，和多纤维束布置。
在此，可以是PMT或APD阵列或者PMT或APD排的同一个多通道探测器被多个纤维束加载。
在此，来自纤维束40、41、42的光导体43、44、45有利地相对于其各纤维端部重叠地处于各探测器元件上，因此能够毫无问题地探测到来自各个光学有效的纤维束的纤维端部的光。
替选地，也可以分别只将两个纤维端部叠置在相应的探测器元件上和/或将探测器的相邻区段用于不同纤维束中的纤维束。
优选依次通过各纤维束40、41、42加载探测器元件，方法是分别将纤维束之一置入朝向光斑的位置中，所述光斑由样本光构成地成像在纤维束的入射面上，如在上文已经描述的那样。
在此，40-42可以是具有不同的纤维直径和/或纤维间距的纤维束。
对纤维束的切换的适配可以例如在更换物镜O的物镜和/或变更照明波长的条件下实现。
在图10中示出滑块48，其容纳纤维束40-42并且可垂直于光轴移动，以便能够将纤维束依次置入光轴。也可行的是，滑块48只将光阑开口移动到更适当的纤维束上并且灵活的HFT使探测光转向至这个更适当的纤维束上。
替选地显示了能够朝光轴摆动的主分色器47，以便通过其可变的斜率光学地加载不同的纤维束40-42。
图11示出在具有反馈信号的闭环调整回路中对荧光采样进行按照本发明的优化。
图11示出有利的调整回路R，其也将根据图12进一步阐释。
在图11中，通过控制单元/计算机49根据对图像特性、如形成Sheppard之和(其已经具有改善的分辨率)之后的图像对比度或者信噪比或者图像分辨率的分析对例如可调节的聚焦光学器件50进行调节或者如在图10中已经描述的那样切换纤维束。
在聚焦光学器件50以及纤维束40-42得到最佳的调节或设置时，由于分辨率提高和/或信噪比的改善而尤其对于更高的空间频率提高了图像对比度。
有利地，可以通过在之上单独描述的调节和设置根据相应的条件对所接收的信号进行优化。
在此，将对比度和信噪比的结合作为调整参量是特别有利的，因为通过这两个条件明确地定义最佳的焦点。
为此，通过联合读取多个探测纤维43-45而对探测光进行的最佳分析过程也可以有利地做出贡献。
图12示出探测光束的过采样和最佳的装仓(Binning)，以便在不损失分辨率的情况下减小数据传输速率。a)具有128个纤维和探测器元件的例子。b)1个艾里斑成像在128个纤维上并且接着四倍地装仓。c)2个艾里斑成像在128个纤维上，只读取32个内部通道。d)1.5个艾里斑成像在整个纤维阵列上。
对于正好有一个艾里斑处于纤维束上的情况，在探测器附近的电子器件(FPGA或者微控制器)中分别联合例如4个通道，因此所联合的通道具有已知的布局(图12b)。对于正好有2个艾里斑处于纤维束上的情况，只读取内部的32个通道(图12c)。对于中间值，必须根据纤维束上的艾里斑的尺寸找到关于将哪些纤维联合在一个通道内的合适配置，以便沿每个横向均实现分辨率提高。在例如32个通道上在FPGA中进行插值同样是可行的。
图12d)示出了对于所述情况的例子。
在如图12d所示的测量信号再分配中，每个纤维分别正好对应于一个通道，作为对其的替选可行的是，将FPGD中的纤维的D信号分配到多个通道上，例如借助在图像标度领域公知的算法进行。
在图12a)中示例性地示出纤维入口53，其中，基本上每个这样的纤维入口53均对应于一个处于探测器阵列上的探测器元件1-128。
在图12b)中根据联合为32个部段的纤维入口54显示了对多个探测器元件的信号的联合，其对应于用于32个所产生的探测信号的单纤维。这对于所示的光斑艾里直径AR实现了探测通道的减少。
由此可以有利地在无传输损耗的情况下减小数据传输速率。
在图12c)中(参见图11)艾里直径AR减小1/2并且因此由更小数量的纤维入口端部采样。
在此也只读取所采集的内部通道，在此是图12a中的内部32个通道。
在图12d)中，AR比纤维束小1.5倍。
在此根据不同大小的单独部段SG显示，也可以对所读取的探测信号进行不同的装仓，方法是将不同数量的纤维联合为不同大小的部段SG。
如在图12b)-d)中所示的通过光导纤维对探测器阵列56的对应的单探测器的探测通道的不同联合可以有利地与通过可变光学器件50进行调节而适配光斑的艾里直径同时进行，或者在其之前或之后进行，并且，借助所接收的信号或者所产生的样本图像根据上述标准(对比度等)通过调整回路如根据图11描述的那样进行优化过程。
对探测通道的联合也是对于通过可变光学器件50进行适配的一种有利替选方案。
在此，可以附加地如图9和图10所示地更换纤维束并且也为此进行信号接收或图像记录的优化。
这通过例如相应比较多个在不同条件下记录的样本或测试样本的图像进行。

Claims (25)

1.一种用于对样本(2)进行高分辨率扫描显微术的显微镜，具有
-用于对样本(2)进行照明的照明装置(3)，
-成像装置(4)，用于在样本(2)上扫描至少一个点光斑或线光斑(14)并且用于在探测层面(18)内将所述点光斑或线光斑(14)成像为衍射受限的、静止的单个图像(17)，
-探测器装置(19)，用于对于不同的扫描位置以位置分辨率采集探测层面(18)内的单个图像(17)，
-分析装置(C)，用于根据探测器装置(19)的数据对于扫描位置分析单个图像(17)的衍射结构并且用于产生样本(2)的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限，其中，
-探测器装置(19)具有：
-探测器阵列(24)，所述探测器阵列具有像素(25)并且大于单个图像(17)，和
-多个不成像的再分配元件(20-21；30-34；30-35)，所述再分配元件布置在探测器阵列(24)上游并且将来自探测层面(18)的射线以不成像的方式分配到探测器阵列(24)的像素(25)上，
其中，所述多个再分配元件是纤维束，它们在纤维数量和/或纤维布局和/或纤维直径和/或纤维横截面的形状方面不同，
其中，至少两个来自不同再分配元件的光导纤维终结于相同的像素，并且
其中，将再分配元件布置为能摆动到或能推移到用于探测样本光的光轴中。
2.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述再分配元件包括由光导纤维(21)组成的束(20)，其具有布置在探测层面(18)内的入口(22)和出口(23)，光导纤维(21)在出口(23)处以不同于入口(22)的几何布局终结于探测器阵列(24)的像素(25)处。
3.按权利要求2所述的显微镜，其中，所述光导纤维是多模式的光导纤维。
4.按权利要求2或3所述的显微镜，其特征在于，所述光导纤维(21)以使得在出口(23)处相邻的光导纤维(21)也在入口(22)处相邻的方式从入口(22)延伸至出口(23)，以便将并排的像素(25)的与射线强度有关的串扰减至最小。
5.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述再分配元件包括具有倾斜程度不同的镜元件(31)的镜子(30)，其将来自探测层面(18)的射线转向至探测器阵列(24)的像素(25)上，其中，探测器阵列(24)的像素(25)具有与镜元件(31)不同的几何布局。
6.按权利要求5所述的显微镜，其特征在于，所述镜子(30)是分段镜、DMD或者自适应镜。
7.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述成像装置(4)具有沿成像方向布置在探测层面(18)上游的变焦光学器件(27)，用于使单个图像(17)的尺寸与探测器装置(19)的尺寸适配。
8.按权利要求7所述的显微镜，其特征在于，所述照明装置(3)和成像装置(4)分享扫描装置(10)，使得照明装置(3)对样本(2)进行照明而在其上形成衍射受限的点光斑或线光斑，而所述点光斑或线光斑与由成像装置成像的光斑(14)重合，其中，这样布置变焦光学器件(27)，使得其也是照明装置(3)的组成部分。
9.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于，所述探测器阵列(24)是探测器排。
10.按权利要求9所述的显微镜，其特征在于，所述探测器排是APD或PMT排。
11.按权利要求1所述的显微镜，其中，所述分析电路是FPGA或者微控制器。
12.按权利要求1所述的显微镜，其特征在于一个或多个以下设计：
-其中，对于探测器阵列的至少一部分像素，分别为单个像素配置来自至少两个再分配元件的射线，
-其中，通过在信号分析时联合单个像素，减小探测器阵列的单个信号的数量，
-其中，对探测器像素的读取只在至少部分由样本光加载的区域内进行，
-其中，在调整回路中，通过根据调整信号切换再分配元件和/或调节用于适配图像尺寸的变焦光学器件/聚焦光学器件和/或联合探测器阵列的单个像素来进行调整，
-其中，该调整包括作为调整参量的图像对比度和/或图像清晰度和/或信噪比，
-其中，在连接于探测器阵列下游的分析电路中，选择性地读取通道和/或选择性地联合通道以用于进一步处理。
13.一种用于对样本(2)进行高分辨率扫描显微术的方法，其中，
-照亮样本(2)，
-将在样本(2)上以扫描方式导引的至少一个点光斑或线光斑(14)成像为单个图像(17)，其中，点光斑或线光斑(14)衍射受限地成像为单个图像(17)，并且单个图像(17)在探测层面(18)内静止，
-对于不同的扫描位置以位置分辨率采集单个图像(17)，从而采集单个图像(17)的衍射结构，
-对于每个扫描位置分析单个图像(17)的衍射结构并且产生样本(2)的图像，所述图像的分辨率超过衍射极限，其中，
-提供探测器阵列(24)，所述探测器阵列具有像素(25)并且大于单个图像(17)，
-来自探测层面(18)的单个图像的射线以不成像的方式再分配到探测器阵列(24)的像素(25)上，方式为设有多个布置在探测器阵列上游的再分配元件，所述再分配元件布置为能摆动到或能推移到用于探测样本光的光轴中，并且
-所述多个再分配元件是纤维束，它们在纤维数量和/或纤维布局和/或纤维直径和/或纤维横截面的形状方面不同，至少两个来自不同再分配元件的光导纤维终结于相同的像素。
14.按权利要求13所述的方法，其特征在于，借助由光导纤维(21)组成的束(20)对单个图像(17)的射线进行再分配，所述束具有布置在探测层面(18)内的入口(22)和出口(23)，光导纤维(21)在出口(23)处以不同于入口(22)的几何布局终结于探测器阵列(24)的像素(25)处。
15.按权利要求14所述的方法，其中，所述光导纤维是多模式的光导纤维。
16.按权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述光导纤维(21)以使得在出口(23)处相邻的光导纤维(21)也在入口(22)处相邻的方式从入口(22)导引至出口(23)，以便将并排的像素(25)的与射线强度有关的串扰减至最小。
17.按权利要求13所述的方法，其特征在于，由光导纤维(21)组成的束(20)和探测器阵列(24)通过以下方式进行校准，即，单独地为每个光导纤维(21)加载射线，采集与在出口(23)处相邻的光导纤维(21)对应的像素(25)内的干扰信号并且建立校准矩阵，通过所述校准矩阵在样本(2)的显微术中校正并排的像素(25)的与射线强度有关的串扰。
18.按权利要求13所述的方法，其特征在于，借助具有倾斜程度不同的镜元件(31)的镜子(30)对单个图像(17)的射线进行再分配，其中，通过镜子(30)将来自探测层面(18)的射线导向探测器阵列(24)的像素(25)，并且探测器阵列(24)的像素(25)具有与镜元件(31)不同的几何布局。
19.按权利要求18所述的方法，其特征在于，所述镜子(30)是分段镜、DMD或者自适应镜。
20.按权利要求13所述的方法，其特征在于，所述探测器阵列(24)是探测器排。
21.按权利要求20所述的方法，其特征在于，所述探测器排是APD或者PMT排。
22.按权利要求13所述的方法，其特征在于，以借助交叉关联分析探测器阵列(24)的单个像素(25)的信号的方式来确定点光斑或线光斑(14)的扫描的运动方向。
23.按权利要求13所述的方法，其特征在于，通过以下方式采集样本(2)内的变化，即，在点光斑或线光斑(14)在样本(2)内静止的情况下得出并且分析衍射受限的单个图像(17)随时间的变化。
24.按权利要求13所述的方法，其中，所述分析电路是FPGA或者微控制器。
25.按权利要求13所述的方法，其特征在于一个或多个以下设计：
-其中，对于探测器阵列的至少一部分像素，分别为单个像素配置来自至少两个再分配元件的射线，
-其中，通过在信号分析时联合单个像素，减小探测器阵列的单个信号的数量，
-其中，对探测器像素的读取只在至少部分由样本光加载的区域内进行，
-其中，在调整回路中，通过根据调整信号切换再分配元件和/或调节用于适配图像尺寸的变焦光学器件/聚焦光学器件和/或联合探测器阵列的单个像素来进行调整，
-其中，该调整包括作为调整参量的图像对比度和/或图像清晰度和/或信噪比，
-其中，在连接于探测器阵列下游的分析电路中，选择性地读取通道和/或选择性地联合通道以用于进一步处理。
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