JP6490690B2 - 高解像度スキャニング顕微鏡法 - Google Patents

Description

本発明は、試料を照明するための照明装置と、試料にわたって点スポットまたは線スポットをスキャンするため、および点スポットまたは線スポットを検出平面へ結像縮尺のもとで静止した回折限界個別画像へと結像するための結像装置と、結像縮尺を考慮した上で回折限界個別画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさの位置解像度でさまざまなスキャン位置について検出平面で個別画像を検出するための検出器装置と、検出器装置のデータからスキャン位置について個別画像の回折構造を評価するため、および回折限界を超えて高められた解像度を有する試料の画像を生成するための評価装置とを有する、試料の高解像度スキャニング顕微鏡法のための顕微鏡に関する。さらに本発明は、試料が照明され、試料にわたってスキャンをしながら導かれる点スポットまたは線スポットが個別画像へと結像される、試料の高解像度のスキャニング顕微鏡法のための方法に関するものであり、スポットは結像縮尺のもとで回折限界で個別画像へと結像され、個別画像は静止するように検出平面に位置しており、結像縮尺を考慮した上で回折限界個別画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさの位置解像度でさまざまなスキャン位置について個別画像が検出され、それにより個別画像の回折構造が検出され、各々のスキャン位置について個別画像の回折構造が評価され、回折限界を超えて高められた解像度を有する試料の画像が生成される。

このような顕微鏡ないし顕微鏡法は、たとえば非特許文献１や特許文献１から知られており、これらの文献は従来技術に関わるその他の検証についても記載している。

このような手法は、スポットが回折限界のもとで検出平面へと結像されることによって、解像度向上を実現する。回折限界の結像は点スポットをエアリーディスクとして結像する。このような回折ディスクは検出平面において、その構造を解像することができるように検出される。このように、顕微鏡の結像性能に関して検出器側でオーバーサンプリングが行われる。点スポットの結像の場合、エアリーディスクの形状が解像される。前掲の文献に記載され、それに関する開示内容が全面的に本明細書に取り入れられている回折構造の適切な評価によって、回折限界を２倍上回る解像度向上を達成することができる。

しかしその際に検出側では、そのような仕方により試料上で走査される各々の点について、従来式のレーザスキャニング顕微鏡（以下においてＬＳＭとも略称する）と比較したとき、１つの個別画像を何倍もの画像情報で記録せざるを得ないことを回避できない。たとえばスポットの個別画像の構造を１６のピクセルで検出するとき、１つのスポットごとに１６倍のデータ量が生じるばかりでなく、通常のピンホール検出の場合にＬＳＭの検出器へ入射することになる放射強度の平均１／１６しか、単一のピクセルが含んでいないことになる。放射強度は個別画像の構造、たとえばエアリーディスクにわたって、当然ながら均一に分布しているわけではないので、実際にはこのような構造の縁部では、ｎ個のピクセルのときの１／ｎの平均値よりもさらに大幅に低い放射強度しか生じない。

欧州特許出願公開第２３１７３６２Ａ１号明細書

Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ｕｎｄ Ｊ．Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０４，１９８１０１（２０１０）

すなわち、検出器側で放射量を高解像度で検出できるようにすることが課題となる。顕微鏡法で通常使用されている従来のＣＣＤアレイは十分な信号／雑音比を実現するものではないため、それ自体すでにこの用途において不都合であるが、画像記録時間を延長したとしても、改良の助けにはならない。ＡＰＤアレイには高すぎる暗雑音もつきまとうので、測定時間を延長しても不十分な信号／雑音比に帰結することになる。同様のことはＣＭＯＳ検出器にも当てはまり、しかも、検出器部材サイズに関して不都合である。スポットの回折限界個別画像が、少なすぎるピクセルに割り当てられることになるからである。ＰＭＴアレイもこれに類似する設計スペース問題をもたらすものであり、同じくピクセルが大きすぎる。したがって設計スペース問題は、特に、高解像度のための顕微鏡の具体化が、開発コストや機器の普及の面からして、既存のＬＳＭ設計への統合が可能である場合にしか実現可能でないという点にある。しかしながら、ここでは個別画像の特定のサイズが与えられている。面積的に比較的大きい検出器を組み込むことができるのは、画像をいっそう有意に、すなわち数オーダーだけ拡大する光学系が、追加的に設けられる場合に限られる。そのような光学系は、それ以上の結像収差なしに回折限界構造を得ようとするならば、非常に高いコストがかかる。

従来技術では、高解像度における上述した検出側の問題を回避する別の方法も知られている。たとえば欧州特許第１１５７２９７Ｂ１号明細書には、構造化された照明によって非線形プロセスが活用される方法が記載されている。構造化された照明は、試料上の複数の回転・位置姿勢にわたって変位し、試料はこれらの様々な状態で、上述した制約が存在しない広視野検出器に結像される。

上述した検出器制約なしに、同じく高解像度（すなわち試料画像の解像度が回折限界を超えている）が実現される方法が、国際公開第２００６１２７６９２号パンフレットおよびＤＥ１０２００６０２１３１７から公知である。ＰＡＬＭと略称されるこの方法は、光学的な活性化信号によって活性化することができるマーキング物質を利用する。マーキング物質は活性化した状態のときにのみ、励起放射で励起して特定の蛍光放射を放出させることができる。活性化していない分子は、励起放射の入射後にも蛍光放射を発しない。つまり活性化放射は、蛍光を出すように励起可能な状態へと活性化物質を切換える。したがって、一般に切換信号という用語が使われる。そして切換信号は、少なくともある程度の割合の活性化したマーキング分子が、同じく活性化した隣接するマーキング分子から隔てられていて、活性化したそれぞれのマーキング分子が顕微鏡法の光学的な解像度で計測したときに離間しているように、もしくは事後的に離間可能であるように印加される。これは活性化した分子の隔絶と呼ばれる。このような隔絶された各分子について、解像限界のもとで惹起されるそれぞれの放射分布の中心を判定し、そのようにして各分子の位置をコンピュータによって、光学的な結像が本来可能にするよりも高い精度で決定することは容易である。ＰＡＬＭ法は試料全体を結像するために、マーキング分子が切換信号によって切換信号の所与の強度のときに活性化される確率が、すべてのマーキング分子について等しいという事実を利用する。すなわち切換信号の強度は、所望の隔絶が行われるように印加される。この工程は、可能な限りすべてのマーキング分子が、励起されて蛍光を出す部分集合に含まれるようになるまで繰り返される。

本発明の枠内では、試料上で走査されるスポットは静止するように検出平面へと結像される。そして検出平面からの放射が非結像式に再分配されて、検出器アレイへと導かれる。ここで「非結像式に」という概念は、検出平面に存在する個別画像に関わるものである。それにもかかわらず、このような個別画像の個々の面領域は、当然ながら結像原理に基づいて結像することができる。その意味で、検出器アレイと再分配部材との間には完全に結像をする光学系が位置していてもよい。しかしながら検出平面に存在する個別画像は、再分配のときにそれ自体としては維持されない。

「回折限界」という概念は、アッベの理論に基づく回折限界だけに限定されるのではなく、実際上の不十分さや制約に基づいて理論上の最大値に２０％だけ不足するケースも含むものとする。その場合にも個別画像は、ここでは回折構造と呼ぶ構造を有している。この構造がオーバーサンプリングされる。

このような原理は、サイズに関して個別画像に適合していない検出器アレイを使用することを可能にする。検出器アレイの少なくとも１つの広がり（または面積）は、検出されるべき個別画像よりも大きいか、または小さいことが好ましい。様々な幾何学的な構成という概念には、検出器アレイの相違する広がりだけでなく、検出平面における個別画像の広がりの高さと幅に関して相違するアスペクト比での配置も該当する。検出器アレイのピクセルは、追加的に、必要な解像度に対して大すぎていてよい。また、検出器アレイのピクセル配置の輪郭が、検出平面で個別画像が有している輪郭と根本的に異なっていることも許容される。最終的に検出器アレイは、本発明によると、検出平面の個別画像とは異なるサイズを有している。本方法における再分配、ないし顕微鏡における再分配部材は、個別画像とそのサイズによる寸法制約やピクセルサイズ制約を顧慮することなしに、検出器アレイを選択することを可能にする。特に、検出器アレイとして検出器ラインを利用することができる。

試料の画像は、ＬＳＭで普通であるようにスポットでの試料の走査によって、それぞれ異なる走査空間すなわち異なるスキャン位置に割り当てられた多数の個別画像から生じる。

本発明のコンセプトは、レーザスキャニング顕微鏡法について知られているように、複数のスポットについて並列化された形態で同時に実施することもできる。そうすると、複数のスポットが試料上で走査され、複数のスポットの個別画像が静止するように検出平面に相並んで位置する。そしてこれらが面積的に呼応するサイズの共通の再分配部材によって、または複数の個々の再分配部材によって再分配されてから、対応するサイズの単一の検出器アレイへ、または複数の個々の検出器アレイへ導かれる。

以下の記述は、一例として単一の点スポットでの走査だけに話を絞る。しかし、このことは限定として理解されるべきではなく、説明する構成要件や原則は、複数の点スポットの並列走査にも線スポットの採用にも意味的に当てはまる。後者は当然、線の延びる方向に対して横向きにのみ回折限界であるので、この点に関わる本明細書の構成要件は１つの方向（線の延びる方向に対して横向き）にのみ妥当する。

本発明の方式により、ＩＳＭ法を満足のいく速度と是認できる装置コストとで実施することができる。本発明は高解像度の顕微鏡法原理について、これまで与えられていなかった幅広い適用分野を開くものである。

再分配または再分配部材を具体化する１つの選択肢は、光ファイバからなるバンドルを使用することにある。これらの光ファイバはマルチモード光ファイバとして製作することができるのが好ましい。バンドルは、検出平面に配置され、その輪郭に関して検出平面における回折限界個別画像の広がりを満たす入力部を有している。それに対して光ファイバは出力部では、検出器アレイによって設定され、入力部の配置とは相違する幾何学的な配置で配置される。このとき光ファイバの出力側の端部は、検出器アレイのピクセルまで直接的に導くことができる。バンドルの出力部が、たとえばＡＰＤラインやＰＭＴラインのような検出器ラインへ楽に差し込むことができるコネクタにまとめられていると、特別に好ましい。

本発明の理解のために重要なのは、検出器アレイのピクセルと、個別画像が検出平面で解像される画像ピクセルとを区別することである。各々の画像ピクセルは、通常、検出器アレイのちょうど１つのピクセルに割り当てられる。しかしそれぞれの配置に関して、両者は相違している。本発明について特徴的なのは、特に、そのサイズと配置に関して個別画像のオーバーサンプリングを惹起する画像ピクセルでの放射が検出平面で記録されることである。このようにして、回折限界個別画像の生成に基づいて回折構造である個別画像の構造が解像される。再分配部材は、当該画像ピクセルが設けられた入力側を有している。入力側は検出平面に位置している。再分配部材は各々の画像ピクセルでの放射を、検出器アレイのピクセルのうちの１つへと導く。検出器アレイのピクセルへの画像ピクセルの割り当ては画像構造を維持せず、したがって再分配は個別画像に関して非結像式である。すなわち本発明はまた、当分野に属する顕微鏡において、検出器装置が、放射が画像ピクセルで記録される検出平面に位置する入力側を有する非結像式の再分配部材を有していることも特徴としている。さらに再分配部材は、画像ピクセルで記録された放射が検出器アレイのピクセルに供給される出力側を有しており、この放射は入力側から出力側へと個別画像に関して非結像式に再分配される。これに準じて本発明による方法は、当分野の方法において、放射が検出平面において画像ピクセルで記録され、これらの画像ピクセルが個別画像に関して非結像式に検出器アレイのピクセルへ再分配されることによって特徴づけることができる。検出器アレイは、そのピクセルの配置および／またはサイズに関して、検出平面における画像ピクセルの配置および／またはサイズと相違している。さらに検出平面の画像ピクセルは、再分配部材により、回折限界に関して個別画像の回折構造がオーバーサンプリングされるように設けられる。

高感度の検出器アレイでは、放射強度の差が大きいときに、隣接するピクセルがクロストークによる障害を示すことが知られている。これを回避するために、好ましい発展例では、出力部で隣接する光ファイバが入力部でも隣接するように光ファイバが入力部から出力部へと導かれる。回折限界個別画像は急激な放射強度変化を示さないので、このような再分配部材の構成は、検出器アレイの相並んで位置するピクセルが可能な限り少ない放射強度差を得ることを自動的に保証し、それによりクロストークを最低限に抑える。

光ファイバに依拠する再分配に代えて、別様に傾いたミラー部材を有するミラーを再分配部材に装備することも可能である。このようなミラーはたとえばファセットミラー、ＤＭＤ、またはアダプティブミラーとして構成することができ、後者２態様では、相応の調整または制御によってミラー部材の傾斜が確保される。ミラー部材は放射を検出平面から、幾何学構成がミラー部材の幾何学構成と相違する検出器アレイのピクセルへと導く。

ミラー部材は、光ファイババンドルの入力部の光ファイバ端部と同じく、個別画像の回折構造の解像度に関して画像ピクセルを構成している。（もはや）検出器アレイのピクセルサイズではなく、ミラー部材のサイズがオーバーサンプリングにとって決定的に重要である。その意味で、この場合、複数の個別検出器からなるグループも検出器アレイとして理解される。これらはその配置に関して、検出平面における画像ピクセルとは常に異なっている（すなわち大きい）からである。

ＬＳＭでは、所望の解像度に応じて様々な対物レンズが使用される。対物レンズの交換は、検出平面における個別画像の広がりを変化させる。したがって、個別画像のサイズを検出器装置のサイズに合わせて適合化するためのズーム光学系を、結像方向で見て検出平面に前置するのが好ましい。このようなズーム光学系は１００％を明らかに下回るパーセント範囲で個別画像のサイズを変化させ、すなわち、冒頭で不都合であると述べた個別画像のサイズの数倍化よりもはるかに簡素に実現される。

試料の照明は、通常のＬＳＭと同じくスキャンをするように行われるのが好ましく、それが絶対に必要というわけではないが、その場合に最大の解像度向上が実現される。試料をスキャンするように照明するとき、照明装置と結像装置は、共通のスキャン装置を有しているのが好都合である。このスキャン装置は、照明スポットを試料にわたって導くと同時に、試料が結像される、照明スポットと一致するスポットを検出器に関して再びスキャンし、それにより個別画像を検出平面で静止するようにする。このような構造では、ズーム光学系を照明装置と結像装置の共通の部分にセットすることができる。その場合、ズーム光学系は、検出平面における検出器のサイズに合わせた個別画像の適合化を可能にするばかりでなく、これに加えて、対物レンズの選択とともに変わる可能性がある対物レンズひとみへ、利用可能な照明放射を周縁損失なく全面的に入力結合することも可能にする。

検出器アレイの相並んで位置するピクセルの間の放射強度依存的なクロストークは、すでに冒頭で述べたとおり、光ファイババンドルを用いた再分配の場合、バンドル内での光ファイバの適切な配置によって低減することができる。その追加または代替として、キャリブレーションを実行することも可能である。そのために各々の光ファイバに順次放射をあてて、隣接するピクセルの干渉信号を検出する。このようにしてキャリブレーションマトリクスが作製され、これを用いて以後の試料の顕微鏡法のときに、相並んで位置するピクセルの放射強度依存的なクロストークが修正される。

個別画像の回折構造の解像は、試料の走査中に変位するスポットの移動方向を判定することを追加的に可能にする。このような移動方向は基本的にはスキャナのメカニズム（たとえばスキャンミラーや可動の試料テーブル）から既知であるものの、これには機械的に生じる残留不正確性がある。検出器アレイの個々のピクセルの信号を相互相関により評価することによって、こうした残留不正確性を除去することができる。その際、相並んで位置する画像ピクセルは、試料においてスポットの回折限界の結像に基づきある程度だけ重なり合い、それぞれの中心部は相並んで位置することが利用できる。このような画像ピクセルの信号を相互相関させれば、スキャンメカニズムの不可避的な許容差に基づいて残る残留不正確性を低減、または全面的に除去することができる。

向上した解像度に加えて、個々の検出器部材の（検出平面の画像ピクセルが割り当てられた）測定系列に由来する信号の空間的および時間的な相関関係を通じて、スポットで検出される検出容積における蛍光の時間的な変化を検出することができ、たとえば時間的な相関関係から、蛍光相関分光法におけるように拡散係数を決定することもでき、また、それぞれの画像ピクセルの間の空間的な相関関係を含めることによって指向性拡散や拡散バリアを視覚化することもできる。これに加えて蛍光分子の移動経過は、トラッキング用途のために多大な関心が寄せられており、それは、照明スポットが蛍光分子の運動に追随するはずだからである。ここで説明している構造は、運動方向をすでにピクセル露光時間内で高精度に判定することを可能にする。したがって発展形として、試料で静止している点スポットまたは線スポットで回折限界個別画像の時間的変化が判定されて評価されることによって、試料における変化が検出されるのが好ましい。

さらに本発明による方式は、スキャンされる照明において、たとえば位相フィルタによって照明分布を変調することを可能にする。それにより、たとえばＧｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｔ．Ｌｅｔ．，３４，３５０８（２００９）に記載されているように、非常に簡単にこの方法を具体化することができる。

ここで方法について説明している限りにおいて、制御装置が、これらの工程を顕微鏡の作動時に実行する。

当然のことながら、以上に挙げた構成要件および以下にこれから説明する構成要件は、記載されている組合せとしてだけでなく、それ以外の組合せや単独でも、本発明の枠内から外れることなく適用可能である。

次に、本発明の要部をなす構成要件を開示する添付の図面を参照しながら、本発明を一例としてさらに詳しく説明する。図面は次のものを示している：

高解像度の顕微鏡法のためのレーザスキャニング顕微鏡を示す模式図である。 図１の顕微鏡の検出器装置を示す拡大図である。 検出平面における検出器装置１９のあり得る実施形態を示す上面図である。 検出平面における検出器装置１９のあり得る実施形態を示す上面図である。 検出器フィールドのサイズの適合化のためのズーム光学系による図１の顕微鏡の発展例である。 ズーム光学系に関わる、ならびに多色結像のための発展例に関わる、図５の顕微鏡の変形例である。 検出器装置を対象とした、図１の顕微鏡の変形例である。 図７の検出器装置１９の変形例である。 ピンホール平面における位置解像式の検出のサブエアリーと、マルチファイババンドル構造とを有する、本発明によるレーザスキャニング顕微鏡の模式図である。 フィードバック信号を用いる閉じた制御ループでの、蛍光走査の本発明に基づく最適化を示す図である。 フィードバック信号を用いる閉じた制御ループでの、蛍光走査の本発明に基づく最適化を示す図である。 解像度損失なしにデータ伝送速度を引き下げるための検出光のオーバーサンプリングおよび最善のビニングにおいて、１２８のファイバと検出部材を有する例を示す図である。 解像度損失なしにデータ伝送速度を引き下げるための検出光のオーバーサンプリングおよび最善のビニングにおいて、１エアリーが１２８本のファイバに結像され、引き続いて４倍ビニングされる様子を示す図である。 解像度損失なしにデータ伝送速度を引き下げるための検出光のオーバーサンプリングおよび最善のビニングにおいて、２エアリーが１２８本のファイバに結像され、内側の３２のチャネルだけが読み出される様子を示す図である。 解像度損失なしにデータ伝送速度を引き下げるための検出光のオーバーサンプリングおよび最善のビニングにおいて、全体ファイバアレイにおける１．５エアリーを示す図である。

図１は、試料２の顕微鏡法のために構成されたレーザスキャニング顕微鏡１を模式的に示している。レーザスキャニング顕微鏡（以下、ＬＳＭと略称する）１は制御装置Ｃによって制御され、照明光路３と結像光路４とを含んでいる。照明光路は試料２のスポットを照明し、結像光路４はこのスポットを検出のために回折限界で結像する。照明光路３と結像光路４は多数の部材を共有している。しかしこのことは、試料２のスキャンによるスポット照明と同様に、さほど強制的なことではない。試料を広視野照明することもできよう。

ＬＳＭ１では、試料２の照明は、機能的には他に必要のない方向転換ミラー６およびレンズ７を介してミラー８上に入力結合されるレーザビーム５によって行われる。ミラー８は、レーザビーム５が反射角のもとでエミッションフィルタ９にあたるように作用する。図面を見やすくするため、レーザビーム５についてはその主軸だけが図示されている。

エミッションフィルタ９で反射された後、レーザビーム５はスキャナ１０により２軸偏向され、レンズ１１および１２により対物レンズ１３を通って試料２のスポット１４へ集束される。ここで、スポットは図１の図面では点状であるが、線状のスポットも可能である。スポット１４で励起された蛍光放射は対物レンズ１３、レンズ１１および１２を介して再びスキャナ１０へと到達し、その前に結像方向で再び静止する光線が存在している。この光線は、スポット１４の蛍光放射をその波長に関して選別し、特に、たとえば励起放射として利用できるレーザビーム５の照明放射から蛍光放射を分離する機能を有するエミッションフィルタ９および１５を通過する。レンズ１６は、全体としてスポット１４が、検出平面１８に位置する回折限界画像１７へと結像されるように作用する。検出平面１８は、スポット１４が試料２に位置している平面と共役の平面である。スポット１４の画像１７は検出平面１８で、以下で図２から図４を参照して詳しく説明する検出器装置１９により記録される。ここで重要なのは、検出器装置１９がスポット１４の回折限界画像１７を検出平面１８で空間的に解像することである。

１８の検出断面上のスポットの強度分布（ガウス分布）は、１８ａとしてその下に図１に示されている。

制御装置ＣはＬＳＭ１のすべてのコンポーネントを制御し、特に、スキャナ１０や検出器装置１９を制御する。制御装置はさまざまなスキャン位置についてそれぞれ個々の画像１７のデータを記録し、その回折構造を分析して、試料２の高解像度の全体画像を生成する。

図１のＬＳＭ１は一例として、試料上で走査される単一のスポットについて示されている。しかしながら同時に、たとえば図１の紙面に対して垂直に延びる線スポットに基づく走査のためにこれを利用することもできる。また、相並んで位置する複数の点スポットが試料で走査されるように、図１のＬＳＭ１を製作することも可能である。その場合、それぞれに対応する個別画像１７が検出平面１８で同じく相並んで位置する。そして検出器装置１９は、相並んで位置する個別画像１７を検出平面１８で検出するために、相応に構成される。

検出器装置１９が図２に拡大して示されている。この検出器装置は、検出器アレイ２４に供給をする光ファイババンドル２０で構成されている。光ファイババンドル２０は個別光ファイバ２１から構成されている。光ファイバ２１の端部は、検出平面１８に位置する光ファイババンドル入力部２２を形成する。したがって、光ファイバ２１の個々の端部が、スポット１４の回折限界画像１７が記録されるピクセルとなる。スポット１４は、図１の実施形態では一例として点スポットであるので、画像１７はエアリーディスクであり、その広がりは図１および２で検出平面１８を表す円の内部に位置している。つまり光ファイババンドル入力部２２の広がりは、それによってエアリーディスクの広がりがカバーされる程度の大きさとなっている。光ファイババンドル２０の個々の光ファイバ２１は、それぞれの出力部のところで、光ファイババンドル入力部２２とは別の幾何学的な配置へと移っており、すなわち、光ファイバ２１の出力側の端部が相並んで位置する長尺状のコネクタ２３の形状へと移っている。コネクタ２３は検出器ライン２４の幾何学的な配置に適合するように構成されており、すなわち、光ファイバ２１の各々の出力側の端部が、検出器ライン２４のピクセル２５のちょうど前に位置している。

再分配部材の幾何学的な広がりはきわめて基本的に、すなわち図４ではファイババンドルによって行われているその具体化の如何に関わりなく、入力側で個別画像の（あるいは複数の点スポットの場合には相並んで位置する個別画像の）の広がりに適合化されている。再分配部材は、個別画像１７の強度分布が走査理論に照らして、回折限界に関してオーバーサンプリングされるように放射を検出平面１８から受け取る機能を有している。すなわち再分配部材は、検出平面１８での結像縮尺を考慮した上で回折限界から生じる最小の解像可能な構造より少なくとも２分の１倍小さいピクセルであって、検出平面１８に位置するピクセル（図３の設計形態では光ファイバの入力端部によって形成される）を有している。

当然ながらコネクタ２３の利用は、光ファイバ２１の出力側の端部をピクセル２５の前に配置するための数多くの選択肢のうちの１つにすぎない。これ以外の接続部を使用することも同様に可能である。個々のピクセル２５を光ファイバ２１と直接的に融合させることもできる。検出器ライン２４の使用さえ必須ではない。その代わりに、各々のピクセル２５について単一の検出器を使用することができる。

図３および４は、光ファイババンドル入力部２２の考えられる実施形態を示している。光ファイバ２１は、光ファイババンドル入力部２２で相互に融着されている。それによっていっそう高い充填係数が実現され、すなわち、個々の光ファイバ２１の間の隙間が光ファイババンドル入力部２２のところで最低限に抑えられる。その一方で融着は、隣接する光ファイバの間のある程度のクロストークをもたらす。これを回避したければ、光ファイバを接着すればよい。図４に示すように、光ファイバ２１の端部を正方形に配置することも可能である。

個々の光ファイバ２１は、光ファイババンドル入力部２２のところで相並んで位置する光ファイバ２１が検出器アレイ２４のところでも相並んで位置するように、検出器アレイ２４の個々のピクセル２５に割り当てられるのが好ましい。このような手法により、たとえば散乱放射によって、あるいは個々のピクセル２５の信号処理で発生し得る、隣接するピクセル２５の間のクロストークが最低限に抑えられる。検出器アレイ２４がラインであるとき、検出器ラインにおける個別光ファイバの順序が、検出平面１８の上面から見て個別光ファイバを順次接続する螺旋により規定されることによって、相応の配置を実現することができる。

図３は、さらに、光ファイバ２１の配置の各コーナーで光ファイババンドル入力部２２に位置するブラインドファイバ２６を示している。これらのブラインドファイバは、検出器アレイのピクセル２５へは通じていない。ブラインドファイバの位置では、信号の評価にとって必要な信号強度が存在しないことになる。それにより、検出器ライン２４または検出器アレイにおける光ファイバ２１の本数、およびこれに伴うピクセル２５の個数を、たとえば３２個のピクセルで処理が行えるように減らすことができる。このような検出器ライン２４は、すでに別の形でレーザスキャニング顕微鏡において採用されており、これによる利点は、信号評価エレクトロニクスをこのようなレーザスキャニング顕微鏡へいったん装備するだけでよく、既存の検出器ライン２４と、検出器装置１９により追加されるべきその他の検出器ライン２４との間で切換が行われることである。

図４では、正方形の基本形状をもつ光ファイバがバンドルに使用される。これらも同じく高いカバー率を検出平面で有しており、すなわち放射を効率的に集める。

図５は、図１のＬＳＭ１の発展例を示しており、検出平面１８にズーム光学系２７が前置されている。図１の設計形態では検出平面１８が配置されていた共役平面は、ここでは中間画像平面２８を形成しており、ここからズーム光学系２７が放射を受け取って検出平面１８へと導く。ズーム光学系２７は、検出器装置１９の入力部の広がりに合わせて画像１７を最善に適合させることができる。

図６は、図１のレーザスキャニング顕微鏡１のさらに別の変形例を示している。まず、ここではズーム光学系はズーム光学系２９として、照明光路３も結像光路４も通過する光路の部分に位置するように配置されている。それにより、検出器装置１９の入力側での画像１７のサイズを適合化できるばかりでなく、結像光路４に関して対物レンズ１３のひとみ充填およびこれに伴うレーザビーム５の活用も適合化できるという利点が得られる。

これに追加して図６では、放射を２つの分離した色チャネルに分割するビームスプリッタがエミッションフィルタ９に後置されることにより、ＬＳＭ１がさらに２チャネルで構成されている。色チャネルの相応の部材は、図１のＬＳＭ１において結像方向でエミッションフィルタ９に後置されている部材にそれぞれ対応する。色チャネルは図６の図面では符号の末尾の”ａ”または”ｂ”によって区別されている。

もちろん、２つの色チャネルを用いての具体化する方式は、ズーム光学系２９の使用に依存するものではない。しかしながらこの組合せは、両方の色チャネルでそれぞれ独立して設ける必要があったなら、２倍になるはずだったズーム光学系２７が、１つしか必要ないという利点がある。しかしながら、ズーム光学系２７を図１に示す設計形態で適用することもできるのは言うまでもなく、図６のＬＳＭ１をズーム光学系２９なしで具体化することもできる。

図７は、検出器装置１９に関わる図１のＬＳＭ１の変形例を示している。

ここでは検出器装置１９は、個々のファセット３１を担持するファセットミラー３０を有している。ファセット３１は、画像１７の解像度に関して、光ファイババンドル入力部２２における光ファイバ２１の端部に相当する。個々のファセット３１は、放射入射の光軸に対する傾きに関してそれぞれ異なっている。レンズ３２およびミニレンズアレイ３３ならびにビームの折り曲げのみに用いられる方向転換ミラー３４とともに、各々のファセット３１は、検出器アレイ２４のピクセル２５に個別画像１７の１つの面フィールドを結像する。この際、ファセット３１の向きに応じて、検出器アレイ２４は２Ｄアレイであるのが好ましいが、検出器ラインとすることも可能である。

図８は、放射を格別に良好に検出器ラインに分配する反射素子３５がレンズ３２にさらに前置された、図７の検出器装置１９の発展例を示している。

検出器アレイ２４は、すでに述べたとおり、その幾何学的形状に関して他の制約なしに選択することができる。その場合に当然ながら、検出器装置１９の再分配部材は対応する検出器アレイに適合化させなければならない。画像１７が解像される個々のピクセルは、究極的には、そのサイズに関してもはや検出器アレイ２４によって規定されるのではなく、検出平面１８からの放射の再分配を惹起する部材によって規定される。エアリーディスクの場合、ディスクの直径は回折限界結像において式「１．２２・λ／ＮＡ」に基づいて求められ、ここでλは結像される放射の平均波長であり、ＮＡは対物レンズ１３の開口数である。そして半値幅は０．１５・λ／ＮＡとなる。高解像度を実現するには、検出のときの位置解像度を半値幅の２倍の大きさに構成すれば足り、すなわち半値幅を２回走査すれば足りる。したがってファセット素子３１は、あるいは光ファイババンドル入力部２２の光ファイバ２１の端部は、回折限界個別画像の半値幅の、最大で半分の大きさであればよい。これは、もちろん、光学系が対物レンズ１３の後で惹起する結像縮尺を考慮した上で適用させる。つまりもっとも単純なケースでは、半値幅ごとに検出平面１８で４×４アレイのピクセルがあれば十分すぎるほどである。

図５および６を参照して説明したズーム光学系は、スポット１４の回折限界画像１７の回折分布が検出器装置１９の入力面を最善に充填するような適合化に加えて、さらに別の動作モードも可能にし、すなわちそれは、２つ以上のエアリーディスクが検出平面１８に結像される場合である。２つ以上のエアリーディスクが検出器装置１９へ結像される測定では、試料２の別の奥行き平面からの光が検出器装置１９の外側のピクセルで検出される。このとき画像が処理される過程で、ＬＳＭ１の奥行き解像度に悪影響を及ぼすことなく、追加の信号強度が得られる。このようにズーム光学系２７または２９は、画像の信号／雑音比と奥行き解像度との間の妥協を図ることを可能にする。
上述した手法を用いて解像度向上を成功させるための前提条件は、ピンホール平面（検出平面）での蛍光・光フィールド分布の自由な走査にある。データ伝送速度とデータ処理速度を低く抑えるために、最小限必要な数の検出器（ファイバ）部材によって処理がなされる。このような事実関係は、対物レンズひとみ直径および蛍光の波長に対する、検出平面におけるフィールド分布の広がりの依存性との組合せにおいて、サブ・エアリー・フィールド分布の対物レンズ固有の広がりを最善の走査のためにファイババンドルに合わせて、サイズの広がりに関して相対的に適合化できることを必要とする。

そのために以下の発明は重要な貢献を果たす。

本発明は、独立請求項の構成要件によって特徴づけられる。
好ましい発展例は従属請求項の対象である。
以下において、本発明についての以後の説明は図９〜図１２の図面を参照しながら行う。

ピンホール平面でのフィールド分布をその広がりに関してコントロールできるようにするためにたびたび採用されてきた従来の取組みは、ひとみ平面でズーム系を利用することにある。その別案として、可変の焦点距離と一定の焦点位置とを有する集束光学系を利用することができる（図１１も参照）。この態様は、一般に、ひとみズーム系で必要であるよりも少ないレンズで構成される。すなわち、複雑性もコストも集束光学系のケースのほうが低い。ファイババンドルが必要になるだけであり、蛍光の広がりが一定に保たれる。

ズーム系または調整可能な集束光学系を、任意選択で、または全面的に省略し、それにもかかわらず所要の対物レンズおよび／または波長のフレキシビリティを確保したいというときには、本発明により、それぞれ直径の異なる複数のファイババンドルを相並んで配置し、バンドルの個別ファイバを検出器アレイのそれぞれ好ましくは同じ検出器部材で終わらせることが提案される（図９，１０）。適当なサンプリングを有するファイババンドルが光軸の上で移動し、または、主カラースプリッタが照明光路で適切な仕方により傾けられ（ＨＦＴを用いたピンホールの調節に準ずる）、それにより、選択されたファイババンドルが照明され、その光だけが検出されて、最終的に相殺される。
このような適当なファイババンドルを選択する方法は、非常に迅速に切替えることができるので（ズーム系によるファイババンドルでのエアリーディスクのサイズ変化と比較したとき）、この解決法は、特にマルチスペクトル測定の場合に特別に好ましい。

集束光学系（図１１）の最適な調整または最適なファイババンドル（図１０）が見出されると、Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．［２］に基づくデータのリソーティングの後、画像コントラストが高められる（特に、実現される解像度向上および／またはＳＮＲの改善による高い空間周波数について）。解像度改善のためにもっとも適した走査のこのような最適化は、閉じた制御ループで実施することができる（ｃｌｏｓｅｄ ｌｏｏｐ）（図１１、最適な調整または最適なファイババンドルを見出すための目安として、コントラストと信号対雑音比との組合せが特別に適している。これら両方の条件によって、最善の焦点が一義的に定義されるからである）。
高い割合の焦点外の光を伴う厚い試料の場合、制御量ＳＮＲは集束光学系調整またはファイババンドルを優先し、複数のエアリーディスクがファイババンドルに結像される。その一方、再構成された画像におけるコントラスト（たとえばＳｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｏｐｔｉｋ８０，Ｎｏ．２，５３（１９８２）に基づく再構成）は、最善の解像度のために好ましくは１つのエアリーディスクだけをファイババンドルへ結像する検出光走査を優先する。規則パラメータを用いてシステムを解像度とＳＮＲの間で最適化することができ、規則では使用する試料の特性が考慮される。
規則のために、たとえば画像が記録される開始時のデータを利用することができ、それにより画像内部でパラメータ（集束光学系調整）を最適化する（画像がすでに縁部のところに代表的な情報を有している場合）。別案として、まずスナップショットによって、低減されたレーザ照明および／または増大したスキャン速度のもとで、画像中の選択された区域について最適化のための関連する情報が取得される。

検出光の最善の（サブ）エアリー走査のための上述したオプトメカニカル式の実施形態の１つの別案は、原理的に必要であるよりも明らかに多い数の、たとえば２×２×３２＝１２８個の光ファイバと検出器部材を最初から使用することにある。その場合、光学系は可変になっていなくてよい。
この態様では、現時点でリアルタイムコンピュータでは処理することができない高いデータレートが発生する。この理由により、たとえば１２８チャネルのデータを３２チャネルまで減らすのが好ましい。ちょうど１つのエアリーがファイババンドルに割り当てられるケースについては、検出器に近いエレクトロニクス（ＦＰＧＡまたはマイクロコントローラ）でそれぞれたとえば４チャネルがまとめられ、それにより、まとめられた各チャネルが既知の配置を有するようにする。ちょうど２つのエアリーがファイババンドルにあるケースについては、内側の３２のチャネルだけが読み出される。中間値については、ファイババンドルにおけるエアリーディスクのサイズに応じて、各々の横方向への解像度向上を実現するためにファイバを１つのチャネルにまとめる適切なコンフィギュレーションを見出さなければならない。たとえば３２チャネルになるようにＦＰＧＡで補間をすることも同じく可能である。

次に、図９〜１２の模式図を参照しながら本発明についてさらに説明する。

個々の符号（先行する図面の符号に追加）は次の意味である：
４０，４１，４２：ファイババンドル
４３，４４，４５：光導波路
４６：マルチチャネル検出器
４７：旋回可能な主カラースプリッタ
４８：スライダ
Ｒ 制御ループ
４９：コントロールユニット／コンピュータ
５０：調整可能な集束光学系
５１：信号割り当て
５２：信号割り当て
５３：ファイバ入力部
５４，５５，５６：ファイバ入力部へのエアリー直径の配分

図９は、ピンホール平面における位置解像式の検出のサブエアリーと、マルチファイババンドル構造とを有する、図１〜８の図面を参照してすでに記述したレーザスキャニング顕微鏡を模式図として示している。
ここでは、ＰＭＴアレイまたはＡＰＤアレイまたはＰＭＴラインまたはＡＰＤラインであってよい同一のマルチチャネル検出器に、複数のファイババンドルから負荷が与えられる（光があてられる）。

ここではファイババンドル４０，４１，４２に由来する光導波路４３，４４，４５は、それぞれ個々のファイバ端部に関して、個々の検出器部材の上で相上下して位置しているのが好ましく、それにより、それぞれ光学的に有効なファイババンドルのファイバ端部からの光の検出を問題なく行うことができる。

別案として、それぞれ２つのファイバ端部だけがそれぞれの検出器部材の上で相上下して位置することもでき、および／または検出器の相並んで位置している区域をそれぞれ異なるファイババンドルのために利用することができる。

検出器部材の負荷は、個々のファイババンドル４０，４１，４２によって順次与えられるのが好ましく、それは、ファイババンドルのうちそのつど１つが、試料光によりファイババンドルの入力面に形成される光スポットに向かう位置へと移され、すでに以前に説明したように結像されることによる。

ここで符号４０〜４２は、それぞれ異なるファイバ直径および／またはファイバ間隔を有するファイババンドルであり得る。

ファイババンドルの取替による適合化は、たとえば対物レンズＯの対物レンズ取替のとき、および／または照明波長の転換のときに行うことができる。

図１０には、ファイババンドル４０〜４２を収容し、光軸に対して垂直にスライド可能であり、それによりファイババンドルを順次光軸に入れることができるスライダ４８が示されている。スライダ４８が絞り開口部だけを適当なファイババンドルの上にスライドさせ、柔軟なＨＦＴが検出光をこの適当なファイババンドルに向かって偏向させることも可能である。

可変の傾きによってそれぞれ異なるファイババンドル４０〜４２に光学的に負荷を与えるために、光軸に対して旋回可能な主カラースプリッタ４７が別案として図示されている。

図１１は、フィードバック信号を用いる閉じた制御ループでの、蛍光走査の本発明に基づく最適化を示している。

図１１には、図１２も参照してさらに説明する好ましい制御ループＲが示されている。

図１１では、コントロールユニット／コンピュータ４９を通じて、画像コントラストのような画像情報の評価を参照した上で、たとえば（改善された解像度をすでに有する）Ｓｈｅｐｐａｒｄ合計が形成された後に、または信号／雑音比後もしくは画像解像度が形成された後に、たとえば調整可能な集束光学系５０の調整が行われ、ならびにファイババンドルの取替が図１０ですでに説明したように行われる。

集束光学系５０ならびにファイババンドル４０〜４２が最適に調整されれば、解像度向上および／または信号／雑音比の改善がなされるので、特に比較的高い空間周波数について画像コントラストが高くなる。

このように、上に説明した個々の調節および調整を通じて、そのつどの条件を参照しながら、記録された信号の最適化を行うことができるという利点がある。

この場合、制御量としてのコントラストと信号／雑音比の組合せが特別に適している。両方の条件によって最善の焦点が明確に定義されるからである。

複数の検出ファイバ４３〜４５がまとめて読み出されることによる、検出光の最善の評価プロセスもそのために貢献できるのが好ましい。

図１２：解像度損失なしにデータ伝送速度を引き下げるための検出光のオーバーサンプリングおよび最善のビニング。ａ）１２８のファイバと検出部材を有する例。ｂ）１エアリーが１２８本のファイバに結像され、引き続いて４倍ビニングされる。ｃ）２エアリーが１２８本のファイバに結像され、内側の３２のチャネルだけが読み出される。ｄ）全体ファイバアレイにおける１．５エアリー。
ちょうど１つのエアリーがファイババンドルにあたるケースについては、検出器近傍のエレクトロニクス（ＦＰＧＡまたはマイクロコントローラ）でそれぞれたとえば４つのチャネルがまとめられ、それにより、まとめられたチャネルが既知の構造を有するようにされる（図１２ｂ）。ちょうど２つのエアリーがファイババンドル上にあるケースについては、内側の３２のチャネルだけが読み出される（図１２ｃ）。中間値については、ファイババンドルにおけるエアリーディスクのサイズに応じて、各々の横方向への解像度向上を実現するためにファイバを１つのチャネルにまとめる適切なコンフィギュレーションを見出さなければならない。たとえば３２チャネルになるようにＦＰＧＡで補間をすることも、同じく可能である。図１２ｄ）は、上記の状況についての例を示している。
各々のファイバがそれぞれちょうど１つのチャネルに割り当てられる、測定信号を再分配する別案として、図１２ｄ）のように、たとえば画像のスケーリングの際に専門的に通常用いられるアルゴリズムによって、１つのファイバのＤ信号をＦＰＧＤで複数のチャネルに分配することも可能である。

図１２ａ）では一例としてファイバ入力部５３が示されており、これらのファイバ入力部５３の実質的に各々に、検出器アレイの検出器部材１〜１２８が割り当てられている。

図１２ｂ）では、３２のセグメントにまとめられたファイバ入力部５４を取り上げて、生成される３２の検出信号について個別ファイバに割り当てられた、複数の検出器部材の信号をまとめる様子が示されている。このことは、光スポットＡＲの図示したエアリー直径について検出チャネルの低減を可能にする。

それにより、伝送損失なしにデータ伝送速度を下げることができるという利点がある。

図１２ｃ）では（図１１参照）、エアリー直径ＡＲが２分の１とされて小さくなっており、それに伴って少ない数のファイバ入力端部により走査される。

ここでは検出された内側のチャネルだけが読み出され、本例では図１２ａの内側の３２のチャネルだけが読み出される。

図１２ｄ）では、ＡＲがファイババンドルよりも１．５分の１倍だけ小さくなっている。

ここでは、さまざまに異なる大きさの個別セグメントＳＧを取り上げて、読み出された検出信号のそれぞれ異なるビニングを行うこともできることが示されており、それは、それぞれ異なる数のファイバがそれぞれ異なる大きさのセグメントＳＧにまとめられることによる。

図１２ｂ）〜ｄ）のように光ファイバを通じて検出器アレイ５６の付属の個別検出器の検出チャネルをそれぞれ別様にまとめることは、光スポットのエアリー直径の適合化と同時またはその前または後に、可変の光学系５０を通じての調整によって行えるのが好ましく、記録された信号または生成された試料画像を参照して、上で説明した基準（コントラスト等）を用いて、図１１を参照して説明したように最適化プロセスが制御ループを通じて実行される。

検出チャネルをまとめることは、可変の光学系５０を用いた適合化の好ましい代替案ともなる。

その場合には、ファイババンドル交換が図９、１０に示すように追加的に行われ、そのためにも信号記録ないし画像記録の最適化が行われる。

このことは、たとえば異なる条件のもとで記録された試料もしくは検査用試料の複数の画像がそのつど比較されることによって行われる。

４０，４１，４２ ファイババンドル
４３，４４，４５ 光導波路
４６ マルチチャネル検出器
４７ 旋回可能な主カラースプリッタ
４８ スライダ
Ｒ 制御ループ
４９ コントロールユニット／コンピュータ
５０ 調整可能な集束光学系
５１ 信号割り当て
５２ 信号割り当て
５３ ファイバ入力部
５４，５５，５６ ファイバ入力部へのエアリー直径の配分

Claims (23)

1. 試料（２）の高解像度スキャニング顕微鏡法のための顕微鏡において、
   試料（２）を照明するための照明装置（３）と、
   試料（２）にわたって少なくとも１つの点スポットまたは線スポット（１４）をスキャンするため、および、点スポットまたは線スポット（１４）を検出平面（１８）において静止した回折限界の個別画像（１７）へと結像させるための結像装置（４）と、
   回折限界の個別画像（１７）の半値幅の少なくとも２倍の大きさの空間分解能でさまざまなスキャン位置について前記検出平面（１８）における前記個別画像（１７）を検出するための検出器装置（１９）と、
   前記検出器装置（１９）のデータから前記スキャン位置の前記個別画像（１７）の回折構造を評価するため、および、回折限界を超えて高められた解像度を有する試料（１７）の画像を生成するための評価装置（Ｃ）とを有しており、
   前記検出器装置（１９）は、
   ピクセル（２５）を有し、前記個別画像（１７）よりも大きい検出器アレイ（２４）と、
   前記検出器アレイ（２４）に前置され、検出平面（１８）からの放射を非結像式に前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へ分配する非結像式の再分配部材（２０〜２１；３０〜３４；３０〜３５）とを有しており、
   前記顕微鏡はさらに、以下の１）から５）の構成のうち１つまたは複数を有しており、すなわち、
   １） 少なくとも１つのさらなる再分配部材が設けられており、前記再分配部材と前記さらなる再分配部材とは、ファイバの数および／またはファイバの配置および／またはファイバ直径および／またはファイバ断面の形状に関して、互いに相違するファイババンドルであること、
   ２） 前記再分配部材として試料光を検出するために光軸へ入るように旋回挿入可能またはスライド挿入可能に配置される複数の再分配部材が設けられていること、
   ３） 制御装置をさらに有し、前記制御装置は、前記再分配部材の取替および／または画像サイズを適合化するためのズーム光学系／集束光学系の調整および／または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行うように構成されていること、
   ４） 制御装置をさらに有し、前記制御装置は、再分配部材の取替および／または画像サイズを適合化するためのズーム光学系／集束光学系の調整および／または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行うように構成されており、前記調整は制御量として画像コントラストおよび／または画像鮮明度および／または信号／雑音比を含むこと、
   ５） 検出器アレイに後置された評価回路が設けられており、前記評価回路は前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルを選択的に読み出すように構成されているか、および／または、前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルが以後の処理のためにまとめられている、
   顕微鏡。
2. 前記再分配部材は、光ファイバ（２１）からなるバンドル（２０）を含んでおり、検出平面（１８）に配置された入力部（２２）および出力部（２３）を有し、前記光ファイバ（２１）は、前記出力部において前記入力部（２２）とは幾何学的に相違するように配置され、前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）のところで終わる
   ことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記光ファイバはマルチモード光ファイバである、請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記光ファイバ（２１）は、前記出力部（２３）で隣接する光ファイバ（２１）が前記入力部（２２）でも隣接し、それにより相並んで位置するピクセル（２５）の放射強度依存的なクロストークを最低限に抑えるように、前記入力部（２２）から前記出力部（２３）へ延びていることを特徴とする、請求項２または３に記載の顕微鏡。
5. 前記再分配部材は、検出平面（１８）からの放射を前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へと導く、それぞれ異なって傾いたミラー部材（３１）を備えるミラー（３０）を含んでおり、前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）は前記ミラー部材（３１）の幾何学配置とは相違する幾何学配置を有していることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡。
6. 前記結像装置（４）は前記検出器装置（１９）に個別画像（１７）のサイズを適合化させるために結像方向において検出平面（１８）に前置されたズーム光学系（２７）を有していることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
7. 前記照明装置（３）と前記結像装置（４）は１つのスキャン装置（１０）を共有しており、それにより前記照明装置（３）は前記結像装置により結像されるスポット（１４）と一致する回折限界の点スポットまたは線スポットで試料（２）を照明し、前記ズーム光学系も前記照明装置（３）の構成要素となるように配置されることを特徴とする、請求項６に記載の顕微鏡。
8. 前記検出器アレイ（２４）は検出器ラインであることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の顕微鏡。
9. 前記検出器ラインはＡＰＤラインまたはＰＭＴラインであることを特徴とする、請求項８に記載の顕微鏡。
10. 試料（２）の高解像度のスキャニング顕微鏡法のための方法であって、
    試料（２）が照明され、
    試料（２）上をスキャンしながら導かれる少なくとも１つの点スポットまたは線スポット（１４）が個別画像（１７）へと結像され、前記スポット（１４）は回折限界で個別画像（１７）へと結像され、個別画像（１７）は静止するように検出平面（１８）に位置しており、
    回折限界の個別画像（１７）の半値幅の少なくとも２倍の大きさの空間分解能でさまざまなスキャン位置について個別画像（１７）が検出され、それにより個別画像（１７）の回折構造が検出され、
    各々のスキャン位置について個別画像（１７）の回折構造が評価され、回折限界を超えて高められた解像度を有する試料（２）の画像が生成され、
    ピクセル（２５）を有し、個別画像（１７）よりも大きい検出器アレイ（２４）が提供され、
    検出平面（１８）からの個別画像の放射が非結像式に前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へ再分配され、
    当該方法はさらに、以下の１）から５）の態様のうち１つまたは複数を有しており、すなわち、
    １） 前記の再分配のために、少なくとも１つのさらなる再分配部材を設け、前記複数の再分配部材として、ファイバの数および／またはファイバの配置および／またはファイバ直径および／またはファイバ断面の形状に関して互いに相違するファイババンドルをそれぞれ用いる、
    ２） 前記の再分配のための再分配部材を、試料光を検出するために光軸へ入るように旋回挿入可能またはスライド挿入可能に配置する、
    ３） 前記の再分配のための再分配部材の取替および／または画像サイズを適合化するためのズーム光学系／集束光学系の調整および／または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行う、
    ４） 前記の再分配のための再分配部材の取替および／または画像サイズを適合化するためのズーム光学系／集束光学系の調整および／または制御信号を用いた前記検出器アレイの個別ピクセルの統合による調整を制御ループで行い、前記調整は制御量として画像コントラストおよび／または画像鮮明度および／または信号／雑音比を含んでいる、
    ５） 前記検出器アレイに後置された評価回路は、前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルを選択的に読み出し、および／または、前記検出器アレイの複数のチャネルのうちの一部のチャネルを以後の処理のためにまとめる、
    方法。
11. 個別画像（１７）の放射は、光ファイバ（２１）からなるバンドル（２０）によって再分配され、前記バンドルは、検出平面（１８）に配置された入力部（２２）および出力部（２３）を有し、前記光ファイバ（２１）が、前記出力部において前記入力部（２２）とは幾何学的に相違するように配置され、前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）のところで終わることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記光ファイバはマルチモード光ファイバである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記光ファイバ（２１）は、前記出力部（２３）で隣接する光ファイバ（２１）が前記入力部（２２）でも隣接し、それにより相並んで位置するピクセル（２５）の放射強度依存的なクロストークを最低限に抑えるように、前記入力部（２２）から前記出力部（２３）へ導かれることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 各々の光ファイバ（２１）には放射によって個々に照射され、前記出力部（２３）で隣接する光ファイバ（２１）に割り当てられたピクセル（２５）の干渉信号が検出され、キャリブレーションマトリクスが作製され、これを用いて試料（２）の顕微鏡法において相並んで位置するピクセル（２５）の放射強度依存的なクロストークが修正されることによって、前記光ファイバ（２１）からなるバンドル（２０）と前記検出器アレイ（２４）がキャリブレーションされることを特徴とする、請求項１０，１１または１２に記載の方法。
15. 個別画像（１７）の放射はそれぞれ異なって傾いたミラー部材（３１）を備えるミラー（３０）によって再分配され、前記ミラー（３０）によって検出平面（１８）からの放射が前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）へと導かれ、前記検出器アレイ（２４）のピクセル（２５）は前記ミラー部材（３１）の幾何学配置とは相違する幾何学配置を有していることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
16. 検出器アレイ（２４）として検出器ラインが使用されることを特徴とする、請求項１０乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記検出器ラインはＡＰＤラインまたはＰＭＴラインであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 前記検出器アレイ（２４）の個々のピクセル（２５）の信号が相互相関により評価されることによって、点スポットまたは線スポット（１４）のスキャンの移動方向が判定されることを特徴とする、請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
19. 試料（２）で静止している点スポットまたは線スポット（１４）で、回折限界の前記個別画像（１７）の時間的変化が判定されて評価されることによって、前記試料（２）における変化が検出されることを特徴とする、請求項１０乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記評価回路はＦＰＧＡまたはマイクロコントローラである、請求項１に記載の顕微鏡。
21. 前記評価回路はＦＰＧＡまたはマイクロコントローラである、請求項１０に記載の方法。
22. 前記顕微鏡はさらに、以下の１）から５）の構成のうち１つまたは複数を有しており、
    １） 前記検出器アレイに前置された複数の再分配部材がさらに設けられていること、
    ２） 前記検出器アレイのピクセルの少なくとも一部について個々のピクセルにそれぞれ少なくとも２つの再分配部材からの放射が割り当てられていること、
    ３） 個々のピクセルのところでそれぞれ異なる再分配部材からの少なくとも２つの光ファイバが終わっていること、
    ４） 信号評価にあたって個別ピクセルの統合により前記検出器アレイの個別信号の数が減少していること、
    ５） 検出器ピクセルの読出しは、少なくとも部分的に試料光が照射される領域でのみ行われること、
    請求項１に記載の顕微鏡。
23. 前記方法は、さらに、以下の１）から５）の形態のうち１つまたは複数を有しており、
    １） 前記検出器アレイに前置して複数の再分配部材がさらに設け、
    ２） 前記検出器アレイのピクセルの少なくとも一部について個々のピクセルにそれぞれ少なくとも２つの再分配部材からの放射を割り当て、
    ３） 個々のピクセルのところでそれぞれ異なる再分配部材からの少なくとも２つの光ファイバが終わり、
    ４） 信号評価にあたって個別ピクセルの統合により前記検出器アレイの個別信号の数が減少し、
    ５） 検出器ピクセルの読出しを、少なくとも部分的に試料光が照射される領域でのみ行う、
    請求項１０に記載の方法。
    

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