CN105543133A - 一株对植物病原细菌有显著拮抗作用的假单胞菌的分离与应用 - Google Patents
一株对植物病原细菌有显著拮抗作用的假单胞菌的分离与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物领域,涉及一株对植物病原细菌有显著拮抗作用的假单胞菌的分离与应用;该菌株XQ10分离自烟草根际。API?20?NE非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定结果表明XQ10属于假单胞菌属;16S?rRNA和基于gyrB,rpoB和rpoD的多位点序列分型分析表明,菌株XQ10属于假单胞菌,但是与属内已报道的菌株存在较大差异,认为菌株XQ10为尚未报道过的新种,因此将该菌命名为Pseudomonas?shandongensis?XQ10。拮抗实验表明,该菌对多种植物病原细菌具有显著的抑制效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,涉及一株对植物病原细菌有显著拮抗作用的假单胞菌的分离与应用,特别是涉及一种拮抗烟草和花生等作物青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、大白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovora)和番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)等植物病原细菌的假单胞菌的分离、鉴定及应用。
背景技术
烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种典型的***性维管束病害,主要为害烟草根、茎、叶各部分维管束组织,是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一,在我国长江流域及其以南烟区普遍发生。近年来,该病发生危害逐渐向北方烟区扩展,在山东、河南及辽宁等省均有发生,且为害较重,是威胁我国烟草生产的一大毁灭性病害。烟草青枯病菌寄主范围广泛,可侵染50多个科200多种作物,是番茄、马铃薯、烟草、花生、茄子、生姜等作物上的重要病害(Genin等,2004;Hayward1991)。病菌主要在土壤、堆肥中越冬,也可以附着在种子、植物根际及植物的病残组织中越冬。病原菌可随雨水,灌溉及农事操作机械进行远距离传播。染病植株初期一侧叶片呈青绿色萎蔫,茎上出现黑色条斑。随着病情扩展症状可延及植株顶部,维管束浅褐色至黑褐色,侧根变黑腐烂,另一侧茎、叶和根生长正常。病情发展后全部叶片青枯、萎蔫,茎上黑色条斑增多,维管束及根变黑,整株枯死。
另外,由大白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovora)和番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)引起的大白菜软腐病和番茄细菌性溃疡病是蔬菜生产中常见且危害严重的病害。由于蔬菜生产周期短,传统的化学农药在防治该类病害时存在污染环境、降解周期长以及农药残留等问题,对人和其他动植物安全存在危害。因此,寻求低(无)毒、高效、无残留且对人畜无害的治疗方案成为当务之急,其中生物防治是行之有效的方法之一。
假单胞菌(Pseudomonasspp.)是活跃在植物根际和叶面的一类微生物,属内许多菌株属于植物根围促生细菌,能防治植物病害、促进植物生长。这些具有生防促生作用的菌株尤以荧光性假单胞菌(Fluorescentpseudomonasspp.)为主,另外还包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、绿针假单胞菌(P.chloraphis)(刘邮洲等,2015)等。大量研究表明,生防细菌在其生长代谢过程中,会产生和分泌多种拮抗或竞争性的代谢产物,通过直接或间接的作用杀死或抑制病原菌的生长(陈晓斌等,2000;胡江春等,2004;杨海莲等,2000;于晓庆等,2007)。目前研究的比较透彻的有,2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol)(Combes-Meynet等,2011)、吩嗪(phenazine)(Thomashow等,1988)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)(Arima等,1964)、藤黄绿菌素(pyoluteorin)(Schnider-Keel等,2000)以及环状脂肽(Cycliclipopeptide)(Raaijmakers等,2006)等化合物,在植物病害的生物防治中起着关键的作用。
植物根际有益微生物对环境友好,抑菌谱广泛,而且对动植物安全,在防治植物病害等方面效果显著,已引起研究人员的广泛关注并成为当前研究的热点,展现出良好的应用前景。
发明内容
本发明涉及一株对植物病原细菌有显著拮抗作用的假单胞菌的分离与应用;目的是提供一株对烟草和花生等作物青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、大白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovora)、番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)等植物病原细菌有显著拮抗效果的菌株XQ10。通过API20NE非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定***,16SrRNA和基于gyrB,rpoB和rpoD的多位点序列分型分析,证明该菌株为假单胞菌。
本发明是采用如下技术方案实现的:
本发明涉及的菌株XQ10分离自烟草根际。通过测定发现该菌株对烟草和花生青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum),梨火疫病菌(Erwiniaamylovora),番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovora)等植物病原细菌均有较好的抑制效果。利用API20NE非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定***对XQ10进行标准化常规测试和同化试验,测定16SrRNA,gyrB,rpoB和rpoD等基因序列,构建***进化树,明确该菌株的分类地位。
本发明所述的假单胞菌(PseudomonasshandongnesisXQ10)已于2015年8月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏单位简称:CGMCC,保藏编号为CGMCCNO.11279,分类命名为:荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,邮政编码:100101。
附图说明
图1假单胞菌PseudomonasshandongnesisXQ10拮抗细菌能力测定。其中:
A,青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum);B,梨火疫病菌(Erwiniaamylovora);C,番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis);D,白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovora)
图2假单胞菌PseudomonasshandongnesisXQ1016SrRNA***进化树
图3假单胞菌PseudomonasshandongnesisXQ10基于rpoB,rpoD和gyrB基因的***进化树
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未经说明,均购买自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
本发明涉及的分子生物学实验,如没有特殊注明,均参考自《分子克隆》一书(MICHAELR.GREEN,JOSEPHSAMBROOK著,2013,科学技术出版社)。
实施例1:拮抗菌的分离和初筛
根际促生菌的分离采用方中达(1979)的方法。取采集到的烟草根际土壤10g,加入到盛有90mL无菌水的三角瓶中,将三角瓶置摇床上,180rpm振荡20min,制成土壤悬液。将制备好的土壤悬液静置5min,取上清液,采用10倍系列稀释法,依次稀释到10-2、10-3、10-4和10-5,每个浓度吸取100μL于NBY平板上,涂布均匀,每个浓度重复三次。然后将涂好的NBY平板于28℃恒温培养箱中培养24h。待NBY平板出现细菌菌落时,将青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)细菌悬液(2.0×108cfumL-1)均匀的喷施于已经长出菌落的NBY平板上,28℃恒温培养箱中培养24h。
选取周围出现明显抑菌圈的菌落,挑取单菌落转移至NBY平板,将平板放入28℃生化培养箱中培养12h。待长出单菌落后再次挑取菌落划线,重复三次,得到纯的拮抗细菌,将对青枯菌拮抗效果最显著的细菌分离物命名为XQ10。
实施例2:拮抗菌抑菌谱测定
挑取拮抗菌XQ10单菌落至5mlNBY液体培养基中28℃,200rpm震荡培养16-24h。离心收集菌体,用无菌水调整细菌浓度为OD420=0.3(约2.0×108cfumL-1)。吸取10μL上述菌悬液至直径为90mm的NBY平板中央,待培养基表面水分充分吸收后,转移平板至28℃生化培养箱中培养72h。喷施OD420=0.3的指示菌菌悬液,24h后统计抑菌情况。细菌拮抗实验结果显示,拮抗菌XQ10对常见的细菌病原菌青枯劳尔氏菌(R.solanacearum)、梨火疫病菌(E.amylovora)、番茄细菌性溃疡病菌(C.michiganensis)和白菜软腐病菌(P.carotovora)均具有显著的拮抗活性,其中对青枯劳尔氏菌的抑菌圈大小为25.67±0.27mm。
实施例3:拮抗菌生理生化鉴定
准备一个培养盒,在盒子中加入5mL无菌水,建立一个湿润的环境,将试剂条放入盒子中。挑取单菌落,用无菌生理盐水重悬制备菌悬液,调整菌悬液浓度为OD420=0.3。用无菌注射器吸取生理盐水菌液到NO3至PNPG的试验管中(杯部分不需加)。加矿物油到GLU,ADH和URE试验管中,直至呈凸出的新月形。打开AUX培养基安瓿瓶,加入200μL(4-8滴)剩余的生理盐水菌液,混合均匀并避免形成气泡。从GLU至PAC试验管要注满AUX菌液,管的表面呈平的或稍凸,但不能凹下去或呈凸出的新月形。盖上盖子在28℃下培养24小时。24小时后,参照生化反应表读数,并记录所有自然发生的反应。
NO3实验:加一滴NIT1和NIT2试剂至NO3管中,5分钟后,呈现红色为阳性反应。如果是阴性反应,则在NO3的管中加入2-3mg的锌粉,如果5分钟后仍是无色,则N2为阳性反应。如果产生粉红色,则为阴性反应。
TRP实验:加一滴JAMES试剂,反应立即发生,产生粉红色为阳性。
同化试验:观察GLU至PAC试验管中细菌生长情况,不透明杯为阳性反应。
表1菌株XQ10API20NE鉴定结果
通过与数据库比对分析,菌株XQ10对反应底物的利用情况与数据库中假单胞菌属(Pseudomonas)一致率最高,表明XQ10属于假单胞菌属细菌。
实施例4:拮抗菌分子鉴定
Pseudomonassp.XQ10基因组DNA提取参照CTAB方法。16SrRNA,rpoB,rpoD和gyrB基因扩增参照Mulet,Tayeb和Yamamoto等人所述的方法(Mulet等,2009;Mulet等,2008;Tayeb等,2005;Yamamoto等,2000)。PCR反应体系为,25μL的PCR混合反应体系中包含5.0μLPCRbuffer(5x),2.5μLMgCl2(25mM),0.75μLdNTPs(各10mM),0.75μL正向和反向引物(10μM),0.25μLTaqpolymerase(5UμL-1Promega)和0.5μL(100ngμL-1)DNA。PCR产物纯化回收采用PromegaWizardSVGelandPCR回收试剂盒。
PCR回收产物连接至pGEM-T载体,转化大肠杆菌EscherichiacoliJM109,提取质粒并测序。XQ1016SrRNA长1409bp,序列如SEQIDNO.1所示。rpoB、rpoD和gyrB基因分别长808bp、709bp和713bp,序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。序列比对结果显示,菌株XQ10与已报道的47个假单胞菌模式菌株16SrRNA序列的一致率均大于93.4%,与Pseudomonasjessenii(AF068259)和Pseudomonasagarici(NR115608)的序列一致率分别为98.9%和97.4%,应该属于假单胞菌属。在利用MEGA6.06软件构建的16SrRNA***进化树中,菌株XQ10与Pseudomonasjessenii(AF068259)和Pseudomonasagarici(NR115608)聚类到一起,但属于独立的分枝(图2)。在利用rpoB(808bp),rpoD(709bp)和gyrB(713bp)构建的***进化树中,菌株XQ10与Pseudomonaskoreensis(LMG21318)、Pseudomonasmoraviensis(DSM16007)、PseudomonasbaeticaCECT7720和PseudomonashelmanticensisOHA11聚类到一起,分别形成独立的分枝(图3)。基于rpoB,rpoD和gyrB基因的多位点序列分析(MLSA)结果表明,XQ10与序列Pseudomonaskoreensis(LMG21318)、Pseudomonasmoraviensis(DSM16007)、PseudomonasbaeticaCECT7720和PseudomonashelmanticensisOHA11的一致率分别为95.0%、93.8%、93.8%和92.3%;而Pseudomonaskoreensis(LMG21318)和Pseudomonasmoraviensis(DSM16007)的一致率为95.2%,PseudomonasbaeticaCECT7720和PseudomonashelmanticensisOHA11的一致率为93.8%。这些结果表明,菌株XQ10为尚未报道过的新种,我们将该菌命名为PseudomonasshandongnesisXQ10。
以上所述,仅是本发明的个别实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
参考文献
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Claims (4)
- 一株假单胞菌PseudomonasshandongensisXQ10,分离自烟草根际土壤,对多种病原细菌有显著的抗菌活性,其特征主要有以下几点:1.对烟草和花生青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)、大白菜软腐病菌(Pectobacteriumcarotovora)、番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)等具有显著的拮抗效果。
- 2.依据API20NE非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定结果表明XQ10属于假单胞菌属;16SrRNA和基于gyrB,rpoB和rpoD的多位点序列分型分析表明,菌株XQ10属于假单胞菌,但是与属内已报道的菌株存在较大差异,认为菌株XQ10为尚未报道过的新种,因此将该菌命名为PseudomonasshandongensisXQ10。
- 3.菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏,保藏号为CGMCCNo.11279。
- 4.权利要求1,2,3所描述的假单胞菌株PseudomonasshandongensisXQ10防治植物病害方面的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160504 |