CN105541836A - 激酶抑制剂的前药形式及其在治疗中的用途 - Google Patents

激酶抑制剂的前药形式及其在治疗中的用途 Download PDF

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CN105541836A CN201610031117.5A CN201610031117A CN105541836A CN 105541836 A CN105541836 A CN 105541836A CN 201610031117 A CN201610031117 A CN 201610031117A CN 105541836 A CN105541836 A CN 105541836A
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Abstract

本发明涉及激酶抑制剂的前药形式及其在治疗中的用途。具体而言，本发明提供了新的前药化合物，其包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂的芳族硝基杂环或芳族硝基碳环触发剂，其中所述化合物携带正电荷。在优选的实施方案中，所述化合物为式I：其中，X是任何负电荷的平衡离子；R1是式–(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；R2、R3和R4各自独立的选自叔胺激酶抑制剂(R2)(R3)(R4)N的脂肪族和芳族基团，或R2、R3和R4中的两者可形成激酶抑制剂的脂肪族或芳族杂环胺环，或R2、R3和R4中的一个可不存在，R2、R3和R4中的两个可形成激酶抑制剂的芳族杂环胺环。本发明的化合物可用于治疗增殖性疾病例如癌症。

Description

激酶抑制剂的前药形式及其在治疗中的用途
本申请为2010年3月11日提交的发明名称为“激酶抑制剂的前药形式及其在治疗中的用途”的PCT申请PCT/NZ2010/000040的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段日期为2011年9月13日，申请号为201080011450.0。
技术领域
本发明涉及激酶抑制剂，尤其是其前药形式、含有它们的组合物和药物，以及制备方法和这些抑制剂、组合物和药物的用途。
背景技术
激酶代表一大类酶家族，其催化蛋白、脂类和代谢产物的磷酸化，在多种细胞过程的调节中起重要作用。异常的激酶活性与包括癌症在内的多种障碍有关。这导致了激酶抑制剂作为治疗剂的开发，包括作为抗癌剂。
本发明总体涉及具有激酶抑制剂活性的化合物，包括其前药形式，以及所述化合物在治疗中的应用。
发明内容
第一方面，本发明提供了包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂芳族硝基杂环或芳族硝基碳环触发剂(trigger)的化合物，所述化合物携带正电荷。
在优选的实施方案中，所述触发剂在单电子还原水平断裂。
在优选的实施方案中，所述激酶抑制剂具有可季铵化的氮，且触发剂直接或间接地连接该氮，形成四价氮。直接连接的还原性触发剂被认为是最希望的。
在另一方面，本发明提供了包含激酶抑制剂和芳族硝基杂环或芳族硝基碳环的可断裂触发剂的化合物，所述触发剂在单电子还原水平断裂，所述激酶抑制剂具有可季铵化的氮，且触发剂直接或间接地连接该氮，形成四价氮。
在优选的实施方案中，所述化合物为在触发剂断裂后，含有可季铵化的氮的激酶抑制剂被完整释放。
在优选的实施方案中，释放后所述激酶抑制剂含有叔胺部分，叔胺部分的氮是连接触发剂的氮。
在某些实施方案中，所述化合物的E(1)为-0.6V至-0.2V，例如-0.5V至-0.3V，例如-0.35V至-0.45V，例如-0.4V至-0.45V，相对于NHE(标准氢电极)而言。
在某些实施方案中，所述化合物在单电子还原后的断裂速率常数为1至4000s-1，例如1至3000s-1，例如1至1500s-1，例如2至500s-1，例如2至300s-1，例如2至60s-1，例如20至60s-1。
优选的化合物的E(1)为-0.2V至-0.6V并且单电子还原后的断裂速率常数为1至4000s-1，E(1)为-0.3V至-0.5V并且单电子还原后的断裂速率常数为1至3000s-1(更优选1至1500s-1)，E(1)为-0.35V至-0.45V并且单电子还原后的断裂速率常数为2至500s-1，更优选10至300s-1，进一步优选20至60s-1，以及E(1)为-0.4V至-0.45V并且单电子还原后的断裂速率常数为20至60s-1(优选40至55s-1)。
在优选的实施方案中，本发明的化合物包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂触发剂，其中所述激酶抑制剂具有直接或间接地连接触发剂的可季铵化的氮，其中所述触发剂具有式IIId的结构：
其中＊是连接点；
R8选自H和C1-C3烷基；并且
R9选自H和C1-C6烷基。
在优选的实施方案中，R8是H。在其他优选的实施方案中，R9是C1-C3烷基，优选甲基。在特别优选的实施方案中，R8是H，R9是甲基。
所述激酶抑制剂可以是可逆的激酶抑制剂或不可逆的激酶抑制剂，例如不可逆的erbB1、2、4酪氨酸激酶抑制剂。优选不可逆的。
在某些实施方案中，所述激酶抑制剂是不可逆的erbB1、2、4酪氨酸激酶抑制剂，其具有与捕获半胱氨酸的官能团连接的碱性叔胺部分。
在某些实施方案中，捕获半胱氨酸的官能团与所述叔胺通过接头部分(CH2)n连接，其中n是0-6的整数。
在某些实施方案中，捕获半胱氨酸的官能团是迈克尔受体，例如含双键或三键的酰胺类迈克尔受体。
特别合适的是不可逆的erbB1、2、4酪氨酸激酶抑制剂，例如喹唑啉、7-烷氧基喹唑啉、7-烷氧基喹啉甲腈、4-苯胺基-[1,7]二氮杂萘-3-甲腈、4-苯胺基-5,7-二氢-6H-吡咯并[3',4':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶和4-苯胺基-吡啶并[3,4-d]嘧啶激酶抑制剂，其中捕获半胱氨酸的官能团是6位含双键或三键的酰胺类迈克尔受体。
在另一方面，本发明提供了式I的四价氮盐：
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
R1是式–(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；
R2、R3和R4可各自独立的选自叔胺激酶抑制剂(R2)(R3)(R4)N的脂肪族或芳族基团，或R2、R3和R4中的两个可形成激酶抑制剂的脂肪族或芳族杂环胺环，或R2、R3和R4中的一个可以不存在且R2、R3和R4中的两个形成激酶抑制剂的芳族杂环胺环。
另一方面，本发明提供了式II的季铵盐：
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
Y是N或C-R7，其中R7选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和式VI的基团
其中＊是连接点，并且其中
T选自O、NH、N(C1-C6烷基)和直键；
m选自0-6的整数；
U选自OR44、CF3、OCF3、CN、NR45R46、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N1-甲基哌嗪基、吗啉基、CON(R47)(R48)、SO2N(R49)(R50)、N(R51)COR52、N(R53)SO2R54、COR55、SOR56、SO2R57以及COOR58；并且
R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50、R51、R52、R53、R54、R55、R56、R57、R58独立的选自H和C1-C6烷基；
Z是N或C-CN；
n是0-6的整数；
R1是式(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、CH2CH2OH、CH2CH2O(C1-C6烷基)，或R2和R3可以一起构成非芳族碳环或含有至少一个杂原子的非芳族杂环；
R5选自苯胺、吲哚、二氢吲哚、胺、氨基吲哚和氨基吲唑，其各自可任选被一个或多个选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、CONH2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2和SO2(C1-C6烷基)的取代基所取代；并且
R6选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和式V的基团
其中
＊是连接点；
V选自(CH2)k(其中k是0-6的整数)、O、NH和N(C1-C6烷基)；并且
R41选自H和C1-C6烷基。
在优选的实施方案中，X选自卤化物(氟化物、氯化物、溴化物、碘化物)、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、甲苯磺酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐和甲酸盐。
在某些优选的实施方案中，X是卤化物，优选溴化物或氯化物。
在其他优选的实施方案中，X是甲酸盐或三氟乙酸盐。
在优选的实施方案中，R1选自式III的基团。
其中
＊是式II化合物的四价氮的连接点；
R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、F、Cl、Br、I、NO2、CN、COOH、COO(C1-C6烷基)、CONH2、CONH(C1-C6烷基)、CON(C1-C6烷基)2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2、SO2NH(C1-C6烷基)、SO2N(C1-C6烷基)2、SO2(C1-C6烷基)以及如前文定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；
R9选自H、C1-C6烷基和前文定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；并且
R10选自H和C1-C6烷基。
在某些优选的实施方案中，R1选自式IIIc的基团，其中R8是H并且R9是CH3。
在其他优选的实施方案中，R1选自式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基)、C1-C6烷氧基(例如OCH3)、C2-C6炔基(例如乙炔基)、CONH2、CONHMe、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN。
在其他优选的实施方案中，R1选自式IIId的基团
其中＊是连接点，R8选自H和C1-C3烷基，并且R9选自H和C1-C6烷基。
在优选的实施方案中，R8是H。R9优选是C1-C3烷基，最优选甲基。在特别优选的实施方案中，R8是H，并且R9是甲基。
在其他优选的实施方案中，R1选自式IIId的基团，其中R8是-1丙炔基，R9是CH3。
在其他优选的实施方案中，R1选自式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基或乙基)和C1-C6烷氧基(例如OCH3)，并且
R9是CH3。
在某些实施方案中，R2和R3形成环，其选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉。
在优选的实施方案中，R5选自式IV的基团：
其中
＊是连接点；
R11、R18、R19、R21、R26、R31和R36独立的选自H和C1-C6烷基；
R12、R13、R14、R15、R16、R17、R20、R22、R23、R24、R25、R27、R28、R29、R30、R32、R33、R34、R35、R37、R38、R39和R40独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、CONH2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2和SO2(C1-C6烷基)；并且
W是N或C-H。
在某些优选的实施方案中，Y是N，Z是N或C-CN，
R1选自下列基团：
(a)式IIIc的基团，其中R8是H，R9是CH3；
(b)式IIId的基团，其中(i)R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基)、C1-C6烷氧基(例如OCH3)、C2-C6炔基(例如乙炔基)、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，并且R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN；或(ii)R8是1-丙炔基，R9是CH3；
(c)式IIIf的基团，其中R8是H并且R9是CH3；以及
(d)式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基或乙基)和C1-C6烷氧基(例如OCH3)，R9是CH3；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基，或者一起构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
＊是连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
(b)式IVd的基团，其中
＊是连接点；
R21是H；并且
R22和R23独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R24和R25独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
W是N或C-H；以及
(c)式IVf的基团，其中
＊是连接点；
R31是H；并且
R32和R33独立的选自H或F；
R34和R35独立的选自H、C1-C6烷基、F、Cl、Br、I、CH2F、CHF2、CF3；
W是N或C-H；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
在其他优选的实施方案中，Y是C-H或C-(C1-C6烷氧基)，Z是N或C-CN；
R1选自下列基团：
(a)式IIIc的基团，其中R8是H，R9是CH3；
(b)式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，并且R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN；或R8是1-丙炔基，R9是CH3；
(c)式IIIf的基团，其中R8是H并且R9是CH3；以及
(d)式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基或乙基)和C1-C6烷氧基(例如OCH3)，R9是CH3；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基，或者一起构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
＊是连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
(b)式IVd的基团，其中
＊是连接点；
R21是H；并且
R22和R23独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R24和R25独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
W是N或C-H；以及
(c)式IVf的基团，其中
＊是连接点；
R31是H；并且
R32和R33独立的选自H或F；
R34和R35独立的选自H、C1-C6烷基、F、Cl、Br、I、CH2F、CHF2、CF3；
W是N或C-H；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
在其他优选的实施方案中，Y是C-R7，其中R7是式VIb的基团；
Z是N或C-CN；
R1选自下列基团：
(a)式IIIc的基团，其中R8是H，R9是CH3；
(b)式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，并且R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN；或R8是1-丙炔基，R9是CH3；
(c)式IIIf的基团，其中R8是H并且R9是CH3；以及
(d)式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基或乙基)和C1-C6烷氧基(例如OCH3)，R9是CH3；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基，或者一起构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
＊是与式II化合物的连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
(b)式IVd的基团，其中
＊是与式II化合物的连接点；
R21是H；并且
R22和R23独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R24和R25独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
W是N或C-H；以及
(c)式IVf的基团，其中
＊是与式II化合物的连接点；
R31是H；并且
R32和R33独立的选自H或F；
R34和R35独立的选自H、C1-C6烷基、F、Cl、Br、I、CH2F、CHF2、CF3；
W是N或C-H；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
优选的式II化合物包括下述：
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-(4-硝基苄基)-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(17)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-(2-硝基苄基)-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(18)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-5-硝基-1H-吡咯-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(19)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(20)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(21)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-吡唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(22)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(3-硝基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(22A)
1-((2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-4-氧代-2-丁烯基)-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(23)
4-((2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-4-氧代-2-丁烯基)-4-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化吗啉-4-(24)
(2E)-4-{[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(25)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(27A)
(2E)-4-{[4-(4-氟-3-甲氧基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(27B)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(42)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(43)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(44)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙炔基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(45)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(46)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(47)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(48)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(48TF)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(49)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(50)
(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(51)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(52)
(2E)-N-[(2-乙炔基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(53)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(54)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(55)
(2E)-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(56)
(2E)-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(57)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(58)
(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(59)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(60)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙炔基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(61)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(62)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(63)
(2E)-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(64)
(2E)-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(65)
(2E)-4-({4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3S)-四氢-3-呋喃氧基]-6-喹唑啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(82)
(2E)-4-({4-[3-氯-4-(2-吡啶基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(83)
(2E)-4-{[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(84)
2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N,N-二乙基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化乙铵(140)
2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基溴化乙铵(141)
4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化吡啶(142)
1-[2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)乙基]-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(143)
N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]三氟乙酸乙铵(144)
N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]溴化乙铵(145)
4-({[4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-喹唑啉基]氧基}甲基)-1-甲基-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]三氟乙酸哌啶(146)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(172)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(1-丙炔基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(173)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(174)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(4-乙基-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(175)，和
(2E)-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(176)。
上述化合物的结构示于图4-9、图17和图18中。
在本发明某些优选的实施方案中，还原性活化的可断裂部分(式I和II的化合物中的R1)选自下列基团：
其中＊是四价氮的连接点。
在本发明某些优选的实施方案中，激酶抑制剂选自衍生自下列化合物的基团：
另一方面，本发明提供了用于治疗的前文所定义的本发明化合物，包括式I和II的化合物。
另一方面，本发明提供了包含前文所定义的本发明化合物、例如式I或式II的化合物以及一种或多种可药用的赋形剂或稀释剂的药物组合物。
本发明还提供了包含前文所定义的本发明化合物、例如式I或式II的化合物以及一种或多种可药用的赋形剂或稀释剂的药物组合物，其用于治疗哺乳动物(包括人)的增殖性疾病(包括癌症)。
在另一方面，本发明提供了治疗哺乳动物(包括人)的增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的前文所定义的本发明化合物、例如式I或式II的化合物。
另一方面，本发明提供了前文所定义的本发明化合物、例如式I或式II的化合物在制备治疗诸如癌症的增殖性疾病的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了激酶抑制剂在制备用于治疗诸如癌症的增殖性疾病的前文所定义的本发明化合物、例如式I或式II的化合物中的用途。
在一个实施方案中，所述激酶抑制剂选自上文所列的激酶抑制剂。
在特定的实施方案中，激酶抑制剂选自：
(2E)-N-[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁酰胺(11)
(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁酰胺(161)
2E)-4-(二甲基氨基)-N-{4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}-2-丁酰胺(170)和
(2E)-4-(二甲基氨基)-N-[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-丁酰胺(171)。
在另一个实施方案中，本发明提供了激酶抑制剂，包括用于制备前文所定义的本发明化合物的激酶抑制剂，其选自：
(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁酰胺(161)
2E)-4-(二甲基氨基)-N-{4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}-2-丁酰胺(170)和
(2E)-4-(二甲基氨基)-N-[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-丁酰胺(171)。
另一方面，本发明提供了还原性活化的可断裂芳族硝基杂环或芳族硝基碳环在制备用于治疗诸如癌症的增殖性疾病的前文所定义的本发明化合物、例如式I或式II的化合物中的用途。
在一个实施方案中，硝基杂环或硝基碳环是前文所定义的式IIId的基团。
附图说明
图1显示了化合物11、16(激酶抑制剂)和20(本发明的前药化合物)的A431细胞内自身磷酸化抑制。
图2显示了化合物19、20和21(本发明的前药化合物)针对A431异种移植物的效果。
图3A显示了化合物11和20针对A431异种移植物的效果。
图3B显示了用化合物11和20处理的具有A431的小鼠的平均体重变化。
图4-9、17和18显示了本发明某些化合物的结构。
图10显示了化合物11和16-22的A431细胞内自身磷酸化抑制(化合物11和16是激酶抑制剂；化合物17-22是本发明的前药化合物)。
图11显示了化合物11和20在含氧和低氧条件下在A431、BT474、SKBR3、SKOV3和SW620细胞中的细胞增殖抑制(IC50)。
图12显示了相对于无细胞的对照，当A431和SKOV3细胞在含氧和低氧条件下用10uM前药20处理时，抑制剂11的时间依赖性的释放。使用LCMS检测。
图13显示了当具有NIHIII的雌性A431肿瘤小鼠以q4dx3MTD(分别为133和75umol/kg)施用单剂量(ip)的各试验化合物时，作为时间的函数的血浆和A431肿瘤中化合物20和化合物11的浓度(来自施用化合物20和直接施用时)。
图14显示了化合物11和20针对SKOV3异种移植物的效果。
图15显示了用化合物11和20处理的SKOV3小鼠平均体重变化。
图16显示了前药20和效应物11在体外对A431细胞的细胞内HER1(erbB1,EGFR)和Erk1/2磷酸化的剂量依赖性的抑制。
图19显示了本发明的化合物161和42分别相对于已知的可逆和不可逆的erbB1抑制剂厄洛替尼和BIBW-2992的A431细胞erbB1自身磷酸化抑制。
图20显示了当按照q3dx4分别以其MTD进行测试时，本发明的化合物42、50和58针对H1975异种移植物的效果。
图21显示了本发明的化合物161和42针对SKOV3异种移植物的效果。
图22显示了化合物42和161针对NIHIII裸鼠中生长的H1975异种移植物的效果。
图23显示了前药42针对NIHIII裸鼠中生长的大H1975异种移植物的效果。
图24显示了前药42针对NIHIII裸鼠中生长的大A431异种移植物的效果。
图25显示了当具有NIHIII的雌性A431小鼠以约75％的q4dx3MTD(分别为100和31.6umol/kg)施用单剂量(ip)的各试验化合物时，作为时间的函数的血浆和A431肿瘤中化合物42和化合物161的浓度(来自施用化合物42和直接施用时)。
发明详述
定义
如本文所用，除非另外说明，术语“烷基”、“链烯基”、“炔基”和“烷氧基”包括直链和支链的基团，以及未取代与取代的基团。任选的取代基可包括但不限于，卤素、C1-C6烷氧基、CN、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、CONH2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2和SO2(C1-C6烷基)。
如本文所用，除非另外说明，术语“可季铵化的氮”表示具有足够碱性(或亲核性)的完全取代的氮，其与诸如α-甲基卤化物/甲磺酸盐/甲苯磺酸盐或三氟甲磺酸盐的亲电基团反应，形成所述氮的季铵盐。
如本文所用，术语“芳族硝基杂环”表示在环的任何位置被一个或多个硝基(NO2)取代的芳族杂环基团。所述芳族杂环基团可以是含有4-12个原子的单环或双环，其中至少一个原子选自氮、硫或氧。芳族杂环基团可以是碳或氮连接的。所述芳族杂环基团还可在任何可能的环碳或杂原子上被一个或多个额外的取代基取代。所述取代基可包括但不限于式III中定义R8的那些。
如本文所用，术语“芳族硝基碳环”表示在任何位置被一个或多个硝基(NO2)取代的苯基。此外，两个邻近的环碳原子可任选连接形成稠合的碳环或杂环。苯基(和任选的稠环)可在任何可能的碳或杂原子处被一个或多个额外的取代基所取代。所述取代基可包括但不限于式III中定义R8的那些。
如本文所用，术语“捕获半胱氨酸的官能团”表示具有足够反应性与蛋白质的未配对半胱氨酸残基共价反应的亲电基团。
详述
如上文所定义，本发明在广义上涉及作为激酶活性抑制剂的化合物，尤其是所述抑制用于治疗目的的化合物。激酶抑制例如在治疗增殖性疾病或障碍中能够是有效的。这使得本发明的化合物可用作抗癌剂，尤其是靶向的抗癌剂。
在一种形式中，本发明的化合物包含激酶抑制剂和还原时断裂的芳族硝基杂环或硝基碳环(还原性触发剂)，所述化合物带有正电荷。化合物的正电荷具有重要作用，尤其是在癌症的治疗中，在下文将详细描述。
还原所述触发剂所需要的还原性等价物可通过酶、辐射诱导的基团或化学还原剂提供。辐射例如在还原触发剂和将激酶抑制剂靶向释放至肿瘤存在的区域释放中尤其有效。然而，目前优选所述触发剂通过肿瘤内存在的内源性酶还原(尤其是内源性单电子还原酶)，以至于所述还原在氧存在下被抑制。该优选的通过单电子还原酶的还原有效地使激酶抑制剂靶向至肿瘤内低氧区域释放。在此情况下，所述化合物是前药，其在肿瘤相关的环境中还原后(本文中也称为“还原性活化”)，释放激酶抑制剂而产生抗癌效应。
激酶抑制剂可以是任何一旦从还原性触发剂释放出来后具有激酶抑制剂活性的分子或结构。通常，所述抑制剂是触发剂连接或功能性连接的完整或基本完整的激酶抑制剂，在还原后释放出所述完整的激酶抑制剂。
激酶抑制剂可以是可逆或不可逆的。然而本文中的化合物优选不可逆的抑制剂与还原性触发剂的组合。最优选不可逆的erbB1、2、4激酶抑制剂，尤其是ATP竞争性的不可逆的erbB1、2、4激酶抑制剂，其抑制与肿瘤细胞生存、增殖、转移和治疗抗性相关的信号转导途径。这些抑制剂需要碱性的叔胺部分。叔胺部分与捕获半胱氨酸的官能团非常接近。其可以是环氧化物，例如erbB-抑制剂B(Carmi,C等人，J.Med.Chem.2010,ASAPOnline,DOI:10:1021/jm901558p)。更优选地，所述捕获半胱氨酸的官能团是迈克尔受体。在所述实施方案中，迈克尔受体可含有双键或三键。胺提供了对erbB1、2、4的ATP结合区域口处的半胱氨酸残基和迈克尔受体间反应的碱性催化，导致激酶靶标的不可逆的抑制。通过所述化合物抑制其异源二聚化伴侣，可以抑制通过激酶-失活erbB3的细胞信号转导，从而使通过整个erbB家族(erbB1-4)的细胞信号转导被这些化合物抑制。
如前所述，前药的还原性触发剂是芳族硝基杂环或硝基碳环，其在还原后可断裂。硝基杂环或硝基碳环单元优选通过可季铵化的氮与激酶抑制剂连接，例如通过环外亚甲基接头连接形成四价氮盐，从而产生正电荷。还原条件下触发剂的断裂释放了活性的激酶抑制剂，而触发剂所连接的氮依然是释放的抑制剂的一部分。
对于内源性还原酶的活化，需要还原性触发剂的断裂被氧有效抑制是关键的。通过内源性单电子还原酶，触发剂在单电子还原水平断裂。可通过氧重新氧化单电子基团，或使还原前药所需要的还原性中间体氧化，对断裂进行有效抑制。后者包括，例如通过氧清除辐射诱导的还原基团，例如水合电子，或使还原酶催化循环中的还原性中间体氧化。但不论机制如何，结果都是氧抑制效应。
所述抑制对于前药的选择性靶向是重要的。肿瘤相关的环境通常是含氧量低的。不受任何理论的限制的情况下，认为限制抑制剂释放到含氧量低的组织和随后所述抑制剂返扩散至肿瘤的含氧区域是内源性酶的肿瘤选择性的主要基础。激酶抑制剂靶向释放到肿瘤中对于拓展所述抑制剂的治疗机会也是有利的，尤其是具有广谱激酶受体结合靶标的不可逆的erbB1、2、4抑制剂。
优选的触发剂包括式III的那些:
其中
＊是连接点；
R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、F、Cl、Br、I、NO2、CN、COOH、COO(C1-C6烷基)、CONH2、CONH(C1-C6烷基)、CON(C1-C6烷基)2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2、SO2NH(C1-C6烷基)、SO2N(C1-C6烷基)2、SO2(C1-C6烷基)和前文所定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；
R9选自H、C1-C6烷基和前文所定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；并且
R10选自H和C1-C6烷基。
本发明最优选的触发剂如下式所示：
其中＊是连接点，R8选自H和C1-C3烷基，R9选自H和C1-C6烷基、优选C1-C3烷基。
许多这些触发剂包括在下列基团中：
除了具有正电荷和上述选定的触发剂外，所述前药优选具有相对于NHE的单电子还原电位(E(1))为-0.2V至-0.6V。该E(1)值能辅助优化本发明的化合物在缺氧条件下还原。更优选的，所述E(1)值相对于NHE为-0.3V和-0.5V之间，更优选在-0.35至-0.45V，最优选-0.4V至-0.45V。化合物的E(1)可按照Meisel和Czapski的描述测定(J.Phys.Chem.,1975,79,1503-1509)。
本发明的前药还优选符合关于在单电子还原下前药断裂释放激酶抑制剂速率的某些标准。这些速率(表达为断裂速率常数)为1-4000s-1、1-3000s-1、1-1500s-1、2-500s-1、2-300s-1、2-60s-1和20-60s-1，其示范性的依赖于是否需要更快或更慢的前药断裂。
单电子还原的前药的断裂速率常数kfrag可使用脉冲辐射分解观察苄基类基团吸收谱的形成而进行测定[Anderson,R.F.等人，J.Phys.ChemA,101:9704-9769,1997]。
在特别优选的实施方案中，可选择构成前药的触发剂/激酶抑制剂组合以符合特定的组合标准。例如，可选择触发剂/激酶抑制剂组合，使之E(1)值为-0.2V至-0.6V且单电子还原的断裂速率常数为1-4000s-1，E(1)值为-0.3V至-0.5V且单电子还原的断裂速率常数为1-3000s-1(优选1-1500s-1)，E(1)值为-0.35V至-0.45V且单电子还原的断裂速率常数为2-500s-1、10-300s-1或20-60s-1，以及E(1)值为-0.4V至-0.45V且单电子还原的断裂速率常数为20-60s-1(优选40-55s-1)。
总体而言，申请人发现通过组合可断裂的还原性活化触发剂和激酶抑制剂构成的前药具有多种令人惊讶的性质，使其尤其适合作为靶向的抗癌剂。这些性质中其靶向效果尤为显著。申请人发现，与在众多本领域已知的还原性触发剂，例如硝基苄基氨基甲酸酯(Hay等人，JMedChem,2003,46,2456-2466；Sykes等人，JChemSocPerkTrans1,2000,10,1601-1608；Hay等人，JChemSocPerkTrans1,1999,2759-2770)，硝基芳基甲基氨基甲酸酯(Hay等人，Tetrahedron,2000,56,645-657；Hay等人，BioorgMedChemLett,1999,9,2237-2242；Davis等人，PCT国际申请WO2006032921)，5-硝基呋喃-2-基亚甲基醚(Mahmud等人，AnticancerDrugDes,1998,13,655-662)，硝基苄基硫醚(Thomson等人，BioorgMedChemLett,2007,17,4320-4322)，硝基噻吩基丙-2-基醚(Thomson等人，MolCancerTher,2006,5(11),2886-2894)和2-芳基-6-甲基-5-硝基喹啉醚(Couch等人，Tetrahedron,2008,64,2816-2823)不同，特别是前文所定义的触发剂和优选的四价盐首次使前药安全递送至靶肿瘤的附近区域，随后在普通肿瘤相关条件下有效断裂释放细胞毒效应物，从而具有治疗性的抗肿瘤效应。而其他还原性触发剂则缺乏稳定性，在递送至肿瘤区域前就活化，或者不能充分释放效应物，对肿瘤的细胞毒影响要低的多。这是支持本发明的令人惊讶的效果。
本发明前药的效果在优选的情况下尤其令人惊讶，即所述还原性触发剂与四价氮盐的激酶抑制剂偶联时。Tercel,M.等人，J.Med.Chem2001,44,3511-3522报道了一系列硝基芳基甲基四价盐作为烷化剂氮芥的还原性前药的合成和评价。作者报道了一系列所述前药化合物的毒性变化很大。即使对于最有希望的肿瘤选择性细胞毒活性形式的化合物，也报道所述活性伴随着不可预测的宿主毒性。结论是硝基芳基甲基四价盐“对于氮芥的非特异性释放以用作生物还原剂而言太不稳定”(参见第3517页)。
具有限定的E(1)和限定的断裂速率常数的优选前药在缺氧条件下帮助有效的单电子还原和在肿瘤内短暂、移动的缺氧靶向都提供了优势，如下文所述。
本发明四价氮盐前药的制备
本发明式I和式II的前药化合物包含与硝基杂环还原性触发剂连接的效应物部分。
效应物部分可以是可逆或不可逆的激酶抑制剂。其可以通过在ATP结合区域、激酶-底物结合区域或变构结合位点结合来抑制激酶。优选不可逆的抑制剂，尤其是不可逆的erbB1、2、4激酶抑制剂。
其他种类的激酶抑制剂的实例包括PDGFRα、PDGFRβ、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、ABL、KIT、AKT1、AKT2、AKT3、p70S6K、MEK、c-MET、JAK2、JAK3、SRC、LCK、p38MAPK、CHK1、CHK2、FGFR、DNA-PK、ATM、ATR、AuroraA、AuroraB、P13K家族亚型p110α、β、δ、γ和mTOR的抑制剂。
可用于本发明的激酶抑制剂的具体实例包括AST-487、CHIR-258、伊马替尼、VX-680、LY-333531、MLN-518、SU-14813、舒尼替尼、PI-103、ZD6474、索拉非尼、达沙替尼(Dasatinib)、PD166285、PD166285类似物A、PD166285类似物B、AEE788、N-甲基星状孢子素、BIBW2992、HKI272、EKB569、吉非替尼、Vargatef、Cediranib、Bosutinib、AZD0530、BIRB796、PHA-665752、10-DEBC、GDC-0941、MK-2206类似物、Masitinib、SU11274、XL880、XL184、ZM39923、AZD1152、Danusertib、ZM447439和PKI-587。
最优选的不可逆erbB1、2、4激酶抑制剂在6位具有酰胺迈克尔受体，以提供捕获半胱氨酸的官能团。这些抑制剂中，迈克尔受体特征可为双键或三键，其在β碳位置被可变长度的亚甲基链所取代，末端为叔胺，如下式所示。
应当理解，效应物剩余部分未在式VII中显示，其具有式II中定义的双环芳族环结构。
通常情况下，优选的式I和式II前药化合物可通过使脂肪族叔胺或芳族杂环胺效应物部分用硝基杂环还原性触发剂部分季铵化。制备式I和式II的化合物的方法在下文中进一步详细描述。
不可逆erbB1、2、4激酶抑制剂的制备
前文所述的式VII的效应物化合物(其中Y和Z不同时为N，迈克尔受体含有双键)是已知的，可根据本领域所述的方法制备。例如，所述化合物及其制备方法描述于Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734,Wissner等人，JMedChem,2003,46,49-63,Wissner等人，BioorgMedChemLett,2004,14,1411-1416,Tsou等人，JMedChem,2005,48,1107-1131,Klutchko等人，JMedChem,2006,49,1475-1485,U.S.专利号6,251,912(Wissner等),U.S.专利申请2002/0173509(Himmelsbach等),U.S.专利号7,019,012(Himmelsbach等),U.S.专利申请2005/0250761(Fakhoury等),U.S.专利号6,288,082(Wissner等),U.S.专利号6,297,258(Wissner等),U.S.专利号7,399,865(Wissner等),U.S.专利号6,355,636(Wissner等),U.S.专利号6,602,863(Bridges等)。
同样，例如下述化合物11,12和13可按照Tsou等，JMedChem2001；44:2719-34公开的方法制备。
以下方案1说明了适用于本发明的喹唑啉效应物化合物的制备，其基于Tsou等的方法(JMedChem,2001,44,2719-2734)从6-硝基-4(3H)-喹唑啉酮(66)(Morley等,JChemSoc,1948,360-366)制备。
方案1
以下方案2说明了适用于本发明的7-烷氧基喹唑啉效应物化合物的制备，其基于Tsou等的方法(JMedChem,2001,44,2719-2734)和Smaill等的方法(JMedChem,2000,43,1380-1397)从7-氟-6-硝基-4(3H)-喹唑啉酮(72)(Rewcastle等人，JMedChem,1996,39,918-928)制备。
方案2
以下方案3说明了适用于本发明的7-烷氧基喹啉甲腈效应物化合物的制备，其基于Wissner等的方法(JMedChem,2003,46,49-63)从7-烷氧基-4-氯-6-硝基-3-喹啉甲腈(78)制备。
方案3
以下方案4说明了适用于本发明的4-苯胺基-[1,7]二氮杂萘-3-甲腈效应物化合物的制备，其基于Wissner等的方法(BioorgMedChemLett,2004,14,1411-1416)从4-氯-6-氟[1,7]二氮杂萘-3-甲腈(83)制备。
方案4
以下方案5说明了适用于本发明的4-苯胺基吡啶并[3,4-d]嘧啶效应物化合物的制备，其使用Rewcastle等人，JChemSoc,PerkinsTrans1,1996,2221-2226；Smaill等人，JMedChem,1999,42,1803-1815；Klutchko等人，JMedChem,2006,49,1475-1485；Soyka等人，US2005/0085495A1和Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734等的方法从可商业获得的6-氟-3-吡啶胺(89)经过已知的中间体6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶酮(93)(Rewcastle等人，JChemSoc,PerkinsTrans1,1996,2221-2226)制备。
方案5
上述方案1-5描述了R5为式IVa时的合成途径的实例。应当理解，上述途径在R5选自式IVb至IVg时也可同样应用，如Tsou等人所述的喹啉甲腈效应物，JMedChem,2005,48,1107-1131所证明。
以下方案6说明了适用于本发明的两种特定的效应物化合物的制备，化合物14和16可使用已知的6-氨基衍生物8(Bridges等人，JMedChem,1996,39,267-276)和10(Rewcastle等人，JMedChem,1995,38,3482-3487)与(2E)-4-溴-2-丁烯酰氯或4-氯丁酰氯反应，随后将所得烷基卤化物与二甲胺水溶液反应制备。
方案6
化合物161,170和171可通过下述方案7制备：
方案7
前药的制备
式I的前药化合物一般可如下制备：通过使带有脂肪族叔胺或芳族杂环胺的激酶抑制剂与适当的硝基杂环或硝基碳环α-甲基卤化物/甲磺酸酯/甲苯磺酸酯在适当的溶剂中反应适当的时间(例如在四氢呋喃中约24小时)，产生式I的四价氮盐。
式II的前药化合物一般可如下制备：通过上文定义的式VII效应物化合物与适当的硝基杂环或硝基碳环α-甲基卤化物/甲磺酸酯/甲苯磺酸酯在适当的溶剂中反应适当的时间(例如在四氢呋喃中约24小时)，产生式II的季铵盐。
适用于本发明前药的优选的还原性触发剂部分是下列式III的那些：
其中＊、R8、R9和R10如前文所定义。
尤其优选的触发剂是：
上述式IIIc-1和IIId-1的α-甲基卤化物是已知的(溴化物；Stribbling等人，PCT国际专利公开号WO2008/039087)；(氯化物；Tercel等人，JMedChem,2001,44,3511-3522；Jentzer等人，EurJMedChem1991；26,687-697)，其是上述IIIq-1和IIIq-2的α-甲基溴化物(分别为Everett等人，BioorgMedChemLett,1999,9,1267-1272和Jiao等人，WO2008151253A1)。
以下方案8描述了从商购原料制备已知的α-甲基溴化物(105)的三种可选途径。
方案8
以下方案9描述了从商购原料制备新的α-甲基溴化物115和116的两种可选途径。
方案9
以下方案10描述了从商购原料制备新的α-甲基溴化物122的途径。
方案10
以下方案11描述了从商购原料制备新的α-甲基溴化物125的途径，以及从2-溴咪唑153制备新的α-甲基溴化物127和130的途径(如下文所述)。
方案11
以下方案12描述了从商购原料或从2-溴咪唑衍生物123或154制备新的α-甲基溴化物136的途径(如下文所述)。
方案12
以下方案13描述了分别从2-溴咪唑中间体123和149制备触发剂178、180、183、185和188的途径。
方案13
以下方案14描述了通过使具有脂肪族叔胺或芳族杂环胺的激酶抑制剂与适当的硝基杂环α-甲基卤化物/甲磺酸酯/甲苯磺酸酯在适当的溶剂中反应适当的时间(例如在四氢呋喃中约24小时)来制备式I和II的四价氮盐化合物的途径。
方案14
以下方案15描述了根据本发明的多种式II的前药化合物的制备。
本发明季铵盐前药的合成如方案15所示进行。将(2E)-N-[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(11)(Tsou等人，JMedChem2001；44:2719-34)与适当的硝基杂环α-甲基卤化物反应，通常在四氢呋喃中反应24小时，产生季铵盐(17-22)的精制沉淀，过滤收集并使用四氢呋喃和***洗涤。类似的，将化合物12-14和16与5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(Stribbling等，PCT国际专利公开号WO2008/039087)反应分别获得季铵盐前药23-25和27。所需的硝基杂环α-甲基卤化物、2-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑和5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-吡唑分别通过LiBr介导的已知的氯甲基咪唑(Jentzer等人，EurJMedChem1991；26:687-697)和氯甲基咪唑(Tercel等人，JMedChem2001；44:3511-22)前体的溴交换制备。有空间位阻的、反应较慢的哌啶和含吗啉衍生物(12和13)的季胺化反应在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中进行，分别获得化合物23和24。
方案15
以下方案16-19描述了本发明多种前药化合物的制备。
方案16
方案17
方案18
方案19
具体实施方式
本发明通过参考下述非限制性的试验部分A和B而更好的理解。
试验部分A
A.1.合成
A.1.1化学合成
由Dunedin,NZ的Otago大学的微量化学实验室进行燃烧分析。使用电热模型9200测定熔点并读数。在BrukerAvance-400光谱仪上测定1HNMR谱，参照Me4Si。在VarianVG-70SE光谱仪上以额定的5000分辨率记录高分辨质谱。在ThermoFinniganMSQ单四极杆质谱仪上记录质谱。使用APCI源进行质量检测，同时使用阳离子和阴离子采集。除非另外说明，化合物通过硅胶60基质快速柱色谱(Scharlau,230-400目ASTM)纯化，使用所说明的洗脱液。
A.1.1.1一般程序A:激酶抑制剂效应物的合成
在氮气下向N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-4,6-喹唑啉二胺(8)(4.0g,12.5mmol)在无水四氢呋喃中的搅拌溶液(150mL)中加入三乙胺(19mmol)，随后加入新制的(2E)-4-溴-2-丁烯酰氯(15mmol)在无水四氢呋喃中的溶液(50mL)。所得溶液在室温下搅拌2小时，减压浓缩。二氯甲烷研磨获得粗制(2E)-4-溴-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]-2-丁烯酰胺(4.6g)，直接使用。
在0℃下向上述粗制(2E)-4-溴-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]-2-丁烯酰胺(1.0g,2.15mmol)在二甲基乙酰胺(35mL)的搅拌溶液中加入过量的二甲胺水溶液(40％,5mL)。3小时后反应液用盐水稀释，乙酸乙酯萃取(3x)。合并的有机相用盐水洗涤，无水Na2SO4干燥并减压浓缩。用二氯甲烷/甲醇(5:95到15:85)进行硅胶色谱洗脱，获得白色固体状的(2E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(14)(0.74g,80％)，熔点(MeOH)179-181℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ9.78(s,1H),9.64(s,1H),8.93(s,1H),8.53(s,1H),8.13(dd,J＝2.6,6.9Hz,1H),7.83-7.79(m,1H),7.42(dd,J＝9.1Hz,JH-F＝9.1Hz,1H),7.29(s,1H),6.80(td,J＝6.0,15.4Hz,1H),6.58(d,J＝15.4Hz,1H),4.01(s,3H),3.08(d,J＝6.0Hz,2H),2.19(s,6H)。分析结果:C,56.32；H,5.14；N,15.73.C21H21ClFN5O2.H2O计算值：C,56.32；H,5.18；N,15.64.
N4-(3-溴苯基)-4,6-喹唑啉二胺(10)(1.76g,5.58mmol)与4-氯丁酰氯(0.75mL,6.70mmol)反应，随后按一般性方法A加入二甲胺水溶液，区别是第一步是在二烷中进行，第二是在50℃反应24小时，获得白色固体状的N-[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)丁酰胺(16)(36％)，熔点(MeOH)180-182℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.23(s,1H),9.87(s,1H),8.72(d,J＝2.0Hz,1H),8.57(s,1H),8.17(dd,J＝1.9,1.9Hz,1H),7.88-7.84(m,2H),7.77(d,J＝8.9Hz,1H),7.37-7.27(m,2H),2.43(t,J＝7.2Hz,2H),2.29(t,J＝7.2Hz,2H),2.16(s,6H),1.78(五重峰,J＝7.2Hz,2H)。分析结果:C,55.46；H,5.33；N,15.96.C20H22BrN5O.1/4H2O计算值：C,55.50；H,5.24；N,16.18.
A.1.1.2一般程序B:LiBr介导的卤化物交换(如方案8，途径2)。
将2-(氯甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(485mg,2.76mmol)和LiBr(4.80g,55.2mmol)在丙酮中的混合物加热回流5小时后减压除去所有的溶剂。残余物用乙酸乙酯和水分层。水相用乙酸乙酯萃取2次。合并的有机相用盐水洗涤，Na2SO4干燥并真空浓缩。粗制产品从DCM/己烷中重结晶，获得灰白色固体状的2-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(576mg,95％)，熔点130-132℃。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ7.74(s,1H),4.50(s,2H),3.83(s,3H)。分析实测值：C,27.81；H,3.27；N,19.05.C5H6BrN3O2.0.04己烷，计算值：C,28.16；H,2.96；N,18.80.HRMS(FAB+)结果:219.97220,221.97018(M+1),计算值C5H7 79/81BrN3O2:219.97216,221.97012。
根据一般程序B，5-(氯甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-吡唑(80mg,0.54mmol)和LiBr反应获得白色晶状固体的5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-吡唑(70mg,70％)，熔点71-73℃。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ8.08(s,1H),4.82(s,2H),3.95(s,3H)。分析结果:C,27.76；H,3.08；N,18.99.C5H6BrN3O2.0.02己烷，计算值：C,27.73；H,2.86；N,18.95.HRMS(FAB+)结果:219.97223,221.97012(M+1),计算值C5H7 79/81BrN3O2:219.97216,221.97012。
A.1.1.3一般程序C:季铵盐前药的制备.
在氮气下向(2E)-N-[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(11)(150mg,0.35mmol)在无水四氢呋喃中的搅拌溶液(15mL)中加入4-硝基苄基溴化物(84mg,1.1摩尔当量,0.39mmol)。所得溶液在室温下搅拌24小时获得白色沉淀，其通过过滤收集，用无水四氢呋喃和***洗涤获得(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-(4-硝基苄基)-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(17)(101mg,45％)，熔点178-181℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.75(s,1H),9.93(s,1H),8.77(s,1H),8.61(s,1H),8.39(d,J＝8.7Hz,2H),8.18(brs,1H),8.04(d,J＝9.0Hz,1H),7.93-7.83(m,4H),7.38-7.29(m,2H),7.04(td,J＝7.3,15.2Hz,1H),6.68(d,J＝15.2Hz,1H),4.78(s,2H),4.30(d,J＝7.3Hz,2H),3.07(s,6H)。分析结果:C,50.02；H,4.30；N,12.75.C27H26Br2N6O3.1/4H2O计算值：C,50.14；H,4.13；N,12.99。
根据一般程序C，11(200mg,0.47mmol)和2-硝基苄基溴化物(111mg,0.52mmol)的反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-(2-硝基苄基)-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(18)(221mg,73％),熔点166-169℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.76(s,1H),9.94(s,1H),8.80(s,1H),8.61(s,1H),8.22-8.17(m,2H),8.04(d,J＝9.0Hz,1H),7.95-7.82(m,5H),7.37-7.28(m,2H),7.01(td,J＝7.3,15.2Hz,1H),6.71(d,J＝15.2Hz,1H),5.01(s,2H),4.38(d,J＝7.3Hz,2H),3.04(s,6H)。分析结果:C,50.66；H,4.29；N,12.88.C27H26Br2N6O3计算值：C,50.49；H,4.08；N,13.08。
根据一般程序C，11(200mg,0.47mmol)和2-(溴甲基)-1-甲基-5-硝基-1H-吡咯(123mg,0.56mmol)反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-5-硝基-1H-吡咯-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(19)(207mg,68％)，熔点164-168℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.74(s,1H),9.93(s,1H),8.77(s,1H),8.61(s,1H),8.18(brs,1H),8.03(d,J＝8.9Hz,1H),7.88-7.82(m,2H),7.37-7.28(m,3H),6.99(td,J＝7.3,15.2Hz,1H),6.71-6.65(m,2H),4.84(s,2H),4.33(d,J＝7.3Hz,2H),4.01(s,3H),3.08(s,6H)。分析结果：C,48.34；H,4.68；N,14.19.C26H27Br2N7O3.1/4THF.1/2H2O计算值：C,48.23；H,4.50；N,14.58。
根据一般程序C，11(129mg,0.30mmol)和5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(70mg,0.32mmol)反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(20)(139mg,72％)，熔点163-167℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.75(s,1H),9.96(s,1H),8.81(s,1H),8.61(s,1H),8.17(brs,1H),8.15(s,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.88-7.83(m,2H),7.38-7.29(m,2H),7.02(td,J＝7.3,15.2Hz,1H),6.71(d,J＝15.2Hz,1H),5.08(brs,2H),4.48(d,J＝7.3Hz,2H),3.89(s,3H),3.13(s,6H)。分析结果:C,45.23；H,4.36；N,16.34.C25H26Br2N8O3.1/10THF.11/4H2O计算值：C,45.13；H,4.37；N,16.57.
A.1.1.4一般程序D:在N-甲基-2-吡咯烷酮中季铵盐前药的制备。
在氮气下向(2E)-N-[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(11)(150mg,0.35mmol)在无水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(1mL)中的搅拌溶液中加入2-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(52mg,0.66摩尔当量,0.23mmol)，5小时内分批加入。所得溶液在室温下搅拌20小时，加入***。过滤所得沉淀，用二氯甲烷彻底清洗。粗产物通过加入二烷从乙腈(含有痕量的三乙胺)中分批沉淀进行纯化。从母液中离心分离沉淀，用THF和DCM(1:1)的混合物洗涤3次，真空干燥获得(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(21)(127mg,84％),熔点184-187℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.69(s,1H),9.91(s,1H),8.76(s,1H),8.61(s,2H),8.17(t,J＝1.9Hz,1H),7.99(d,J＝9.0Hz,1H),7.88-7.83(m,2H),7.37-7.29(m,2H),7.00(td,J＝7.3,15.2Hz,1H),6.64(d,J＝15.2Hz,1H),4.79(s,2H),4.36(d,J＝7.2Hz,2H),3.88(s,3H),3.19(s,6H)。分析实测值：C,46.11；H,4.33；N,16.78.C25H26Br2N8O3.1/2H2O计算值：C,45.82；H,4.15；N,17.10.HRMS(FAB+)结果:565.13144,567.12820(M-Br),计算值C25H26 79/81BrN8O3 +:565.13112,567.12908。
根据一般程序D，11(150mg,0.35mmol)和5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-吡唑(52mg,0.23mmol)反应23小时获得(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-吡唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(22)(94mg,62％),熔点178-182℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.71(s,1H),9.93(s,1H),8.79(s,1H),8.61(s,1H),8.56(s,1H),8.17(brs,1H),7.98(d,J＝8.8Hz,1H),7.88-7.83(m,2H),7.37-7.29(m,2H),7.00(td,J＝7.3,15.2Hz,1H),6.69(d,J＝15.2Hz,1H),5.11(s,2H),4.47(d,J＝7.1Hz,2H),4.11(s,3H),3.15(s,6H)。分析实测值：C,45.54；H,4.50；N,16.30.C25H26Br2N8O3.H2O.1/4二烷，计算值：45.50；H,4.41；N,16.33.HRMS(FAB+)结果:565.13015,567.13016(M-Br),计算值C25H26 79/81BrN8O3 +:565.13112,567.12908。
根据一般程序D，(E)-N-(4-(3-溴苯基氨基)喹唑啉-6-基)-4-(哌啶-1-基)丁-2-烯胺(12)(1.0g,2.14mmol)在NMP中的溶液(4mL)与5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(315mg,1.43mmol)反应3.5天获得1-((2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-4-氧代-2-丁烯基)-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(23)(600mg,61％),熔点188℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.73(s,1H),9.94(s,1H),8.82(s,1H),8.61(s,1H),8.17(t,J＝1.8Hz,1H),8.14(s,1H),7.98(d,J＝8.8Hz,1H),7.88-7.83(m,2H),7.37-7.29(m,2H),7.08(td,J＝7.3,15.1Hz,1H),6.80(d,J＝15.1Hz,1H),5.02(brs,2H),4.62(brs,2H),3.87(s,3H),3.58-3.55(m,2H),2.04-1.99(m,2H),1.78-1.75(m,2H),1.64-1.61(m,1H),1.46-1.36(m,1H)。分析实测值：C,48.24；H,4.58；N,15.89.C28H30Br2N8O3.1/2H2O计算值：C,48.36；H,4.49；N,16.11.HRMS(FAB+)结果:605.16226,607.15997(M-Br),计算值C28H30 79/81BrN8O3 +:605.16242,607.16038。
根据一般程序D，(E)-N-(4-(3-溴苯基氨基)喹唑啉-6-基)-4-吗啉丁-2-烯胺(13)(1.0g,2.14mmol)在NMP中的溶液(4mL)与5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(313mg,1.42mmol)反应3.5天，随后使用MeOH/甲酸/水作为流动相通过制备HPLC获得4-((2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-4-氧代-2-丁烯基)-4-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]吗啉-4-甲酸盐(24)(110mg,12％),熔点125-129℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.69(s,1H),10.17(s,1H),9.28(s,1H),8.65(br,1H),8.61(s,1H),8.44-8.40(m,2H),8.14(s,1H),8.07(d,J＝8.1Hz,1H),7.34(t,J＝8.1Hz,1H),7.27(d,J＝8.5Hz,1H),7.17-7.10(m,2H),6.82(d,J＝14.6Hz,1H),5.12(brs,2H),4.81(brs,2H),4.16(t,J＝12.0Hz,2H),3.91(m,2H),3.88(s,3H),3.70-3.60(m,2H),3.46(t,J＝12.0Hz,2H)。HRMS(FAB+)结果:607.14189,609.14034(M-HCOO),计算值C27H28 79/81BrN8O4 +:607.14169,609.13964。
根据一般程序D，(2E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(14)(990mg,2.30mmol)在NMP中的溶液(6mL)与5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(422mg,1.92mmol)反应24小时，获得(2E)-4-{[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(25)(1076mg,86％),熔点192℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ9.99(s,1H),9.82(s,1H),8.91(s,1H),8.56(s,1H),8.14-8.11(m,2H),7.83-7.78(m,1H),7.42(t,J＝9.1Hz,1H),7.33(s,1H),7.00-6.95(m,1H),6.90-6.86(d,J＝15.3Hz,1H),5.06(brs,2H),4.43(d,J＝6.8Hz,2H),4.03(s,3H),3.88(s,3H),3.12(s,6H)。分析实测值：C,47.04；H,4.32；N,16.18.C26H27BrClFN8O4.H2O.1/4THF计算值：C,47.28；H,4.56；N,16.34.HR-MS(FAB+,35/37Cl)结果:m/z569.18207/571.18086(M-Br),计算值C26H27 35/37ClFN8O4 +:569.182782/571.17983。
根据一般程序D，N-(4-(3-溴苯基氨基)喹唑啉-6-基)-4-(二甲基氨基)丁酰胺(16)(1.0g,2.34mmol)在NMP中的溶液(5mL)与5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(342mg,1.56mmol)反应15小时获得4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-1-溴化丁铵(27)(710mg,70％),熔点177℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.39(s,1H),9.99(s,1H),8.69(d,J＝1.6Hz,1H),8.59(s,1H),8.17(t,J＝1.9Hz,1H),8.12(s,1H),7.93-7.84(m,2H),7.80(d,J＝9.0Hz,1H),7.35(t,J＝8.0Hz,1H),7.29(td,J＝1.4,8.4Hz,1H),5.02(brs,2H),3.86(s,3H),3.62-3.58(m,2H),3.10(s,6H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),2.20-2.12(m,2H)。分析实测值：C,45.69；H,4.95；N,15.57.C25H28Br2N8O3.H2O.1/2二烷，计算值：C,45.65；H,4.82；N,15.77.HRMS(FAB+)结果:567.14724,569.14564(M-Br),计算值C25H28 79/81BrN8O3 +:567.14677,569.14473。
A.1.1.5触发剂溴化物200的制备
将溴化物149(500mg,1.80mmol)(方案20)、三丁基(1-丙炔基)锡(1.64mL,5.39mmol)和四(三苯膦)钯(416mg,0.36mmol)在NMP中的混合物(15mL)在80℃加热过夜(14小时)，随后进行标准的乙酸乙酯水溶液后处理。获得的粗产物使用MeCN/DCM(梯度为1:20-1:5)通过快速柱色谱洗脱纯化，获得白色固体状化合物150(147mg,34％)，1HNMR(CDCl3,400MHz)δ5.47(s,2H),3.77(s,3H),2.14(s,3H),2.10(s,3H)。LR-MS(+):m/e238.5(M+1)；随后获得白色固体状的化合物151(105mg,30％)，1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.96(d,J＝7.0Hz,2H),3.79(s,3H),2.60(t,J＝7.0Hz,1H),2.14(s,3H)。LR-MS(+):m/e196.5(M+1)。通过用K2CO3在MeOH中的溶液处理化合物150定量获得化合物151。
通过与N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)在乙腈中反应，可从中间体化合物123(方案11)获得溴亚甲基衍生物153，随后在二甲基甲酰胺(DMF)中进行乙酸钠介导的溴化物置换(方案20)获得溴化物149。
方案20
在0℃下向化合物151(110mg,0.56mmol)在DCM中的溶液(10mL)中加入三乙胺(0.118mL,0.84mmol)，随后滴加MsCl(0.052mL,0.68mmol)。在0℃和室温下各保持30分钟后，混合物用饱和的氯化铵水溶液和盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，硅藻土过滤。减压浓缩获得灰白色固体状的化合物152(145mg,～94％)，其通过1HNMR发现为甲磺酸盐和氯化物的混合物(3.6:1)，不经进一步纯化即使用。甲磺酸盐的1HNMR(CDCl3,400MHz):δ5.62(s,2H),3.81(s,3H),3.13(s,3H),2.15(s,3H)；氯化物:δ5.02(s,2H),3.79(s,3H),2.14(s,3H)。LR-MS(+):274.5(M+1甲磺酸盐)；214.4/216.4(3:1,M+1氯化物)。
将混合物152(145mg,～0.53mmol)用LiBr(922mg,10.61mmol)在回流的THF(10mL)中处理30分钟，真空除去THF，所得残余物用水和乙酸乙酯分层。有机相用水和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅藻土过滤，真空浓缩。所得的粗产物用快速柱色谱纯化，使用乙酸乙酯/己烷(1:1)洗脱获得白色固体状的5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-2-(1-丙炔基)-1H-咪唑(200)(95mg,69％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.86(s,2H),3.76(s,3H),2.14(s,3H)。LR-MS(+):m/e258.5/260.5(1:1,M+1)。
A.1.1.6α-甲基溴化物127的制备(方案11)
向含有数滴水的溴化物153(方案14)(1.40g,4.68mmol)在DMA中的溶液(14mL)加入K2CO3(647mg,4.68mmol)。所得溶液搅拌过夜后用标准的EtOAc处理，随后通过硅胶柱色谱纯化，用MeCN/DCM(5:95-15:85)洗脱获得灰白色固体状的醇154(330mg,30％)。1HNMR(6d-DMSO,400MHz)δ5.56(t,J＝5.8Hz,1H),4.86(d,J＝5.8Hz,2H),3.70(s,3H)。LR-MS(+):m/e236.5/238.5(1:1,M+1)。
将醇154(300mg,1.27mmol)、Zn(CN)2(90mg,0.76mmol)、锌粉(10mg,0.15mmol)、Pd2(dba)3(23mg,0.025mmol)和dppf(28mg,0.051mmol)在DMA(3mL)中的混合物在氮气下在120℃搅拌3.5小时。随后进行标准的NH4Cl/EtOAc水溶液处理，使用EtOAc/己烷(1:1至2:1)洗脱，通过硅胶柱色谱获得灰白色固体状的氰基咪唑126(180mg)，通过1HNMR发现其含有少量的未反应的原料154，直接用于下一步骤。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ5.09(d,J＝6.7Hz,2H),4.00(s,3H),2.49(t,J＝6.7Hz,1H)。
0℃下向氰基咪唑126(173mg,约0.93mmol)的THF溶液(10mL)中加入MsCl(0.088mL,1.14mmol)，随后滴加DIPEA(0.182mL,1.04mmol)。搅拌1小时后，反应混合物用标准的NH4Cl/EtOAc水溶液处理获得黄色油(237mg；1HNMR表明为甲磺酸盐和α-甲基氯化物的混合物)，可直接使用。向该油(235mg,约0.90mmol)在THF中的溶液(10mL)中加入LiBr(1.57g,18.06mmol)。0.5小时回流加热后真空除去溶剂，残余物用标准NH4Cl/EtOAc水溶液处理。粗产物进一步用硅胶柱色谱纯化，用EtOAc/己烷(1:4-1:2)洗脱获得粉色油状的α-甲基溴化物127(65mg,3步21％)。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.86(s,2H),3.95(s,3H)。LR-MS(+):m/e277.6/279.6(1:1,M+1+MeOH)。
A.1.1.7α-甲基溴化物触发剂201的制备
将溴咪唑149(1.90g,6.83mmol)(方案14)、四乙基锡(5.42mL,27.34mmol)和四(三苯基膦)钯(790mg,0.68mmol)在NMP(20mL)中的混合物在110-120℃加热5小时，随后进行标准的乙酸乙酯水溶液处理。获得的粗产物用快速柱色谱纯化，MeCN/DCM(1:5)洗脱，加入己烷，从DCM沉淀获得白色固体状的乙基咪唑156(1.04g,67％)。熔点71-73℃。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ5.48(s,2H),3.64(s,3H),2.76(q,J＝7.43Hz,2H),2.10(s,3H),1.37(t,J＝7.43Hz,3H)。分析实测值：C,48.11；H,5.90；N,18.23％.C9H13N3O4·0.04己烷，计算值：C,48.11；H,5.92；N,18.22％.LR-MS(+):m/e228.5(M+1)。
向乙基咪唑156(1.25g,5.50mmol)在MeOH中的溶液(10mL)中加入无水K2CO3(1.52g,11.0mmol)。搅拌20分钟后减压除去溶剂，残余物溶于DCM，硅胶层过滤，用乙酸乙酯洗涤。浓缩滤液获得白色晶体。过滤收集，用乙酸乙酯/己烷混合物(1:1)洗涤获得白色晶状固体的醇157(949mg,93％)，熔点153-155℃。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.96(d,J＝6.80Hz,2H),3.67(s,3H),2.79(t,J＝6.80Hz,1H),2.74(q,J＝7.50Hz,2H),1.36(t,J＝7.50Hz,3H)。分析实测值：C,45.71；H,6.07；N,22.87％.C7H11N3O3计算值：C,45.40；H,5.99；N,22.68％.LR-MS(+):m/e186.5(M+1)。
0℃下向醇157(685mg,3.70mmol)在DCM的溶液(30mL)中加入三乙胺(0.773mL,5.55mmol)，随后滴加MsCl(0.344mL,4.44mmol)。搅拌45分钟后，混合物用饱和的氯化铵水溶液洗涤2次，用盐水洗涤1次，无水硫酸钠干燥，硅藻土过滤。真空浓缩滤液获得白色固体(971mg)。1HNMR发现其为甲磺酸盐和α-甲基氯化物的混合物(3:1)，直接用于下一步骤。该固体(968mg)在THF中的溶液(50mL)用LiBr(6.39g,86.85mmol)回流处理0.5小时。减压除去溶剂，所得残余物用水和乙酸乙酯分层。有机相用水洗涤2次，盐水1次，无水硫酸钠干燥，硅藻土过滤。真空除去溶剂获得白色固体状的α-甲基溴化物IIId-10(851mg,93％)，熔点91-93℃。1HNMR(CDCl3,400MHz)δ4.88(s,2H),3.65(s,3H),2.76(q,J＝7.60Hz,2H),1.37(t,J＝7.60Hz,3H)。分析实测值：C,34.41；H,4.07；N,16.96％.C7H10BrN3O2·0.04EtOAc计算值：C,34.18；H,4.13；N,16.70％.LR-MS(+):m/e248.4/250.4(1:1,M+1)。
A.1.1.8其他激酶抑制剂前药的制备
根据一般程序C，向(2E)-N-{4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3S)-四氢-3-呋喃氧基]-6-喹唑啉基}-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(BIBW2992；Himmelsbach等人，US07019012B2)(1500mg,3.09mmol)在NMP中的溶液(4mL)中加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(747mg,3.40mmol)，获得(2E)-4-({4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3S)-四氢-3-呋喃氧基]-6-喹唑啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(1210mg,56％)，其通过制备HPLC进一步纯化，使用CH3CN/H2O/TFA洗脱获得(2E)-4-({4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3S)-四氢-3-呋喃氧基]-6-喹唑啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(82)(730mg,32％)，熔点149-152℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.80(s,1H),9.93(s,1H),9.07(s,1H),8.78(s,1H),8.14(s,1H),8.03-8.01(dd,J＝6.8,2.5Hz,1H),7.73-7.69(m,1H),7.50(t,J＝9.1Hz,1H),7.38(s,1H),7.04-6.96(m,1H),6.88(d,J＝15.2Hz,1H),5.32-5.31(m,1H),5.05(br,2H),4.42(d,J＝6.9Hz,2H),4.02-3.91(m,3H),3.87(s,3H),3.82-3.77(m,1H),3.12(s,6H),2.43-2.34(m,1H),2.18-2.08(m,1H)。分析实测值：C,44.42；H,3.88；N,12.21％.C31H31ClF4N8O7·1.2CF3COOH·1.5H2O计算值：C,44.43；H,3.93；N,12.41％。
根据一般程序C，向(2E)-N-{4-[3-氯-4-(2-吡啶基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基}-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(HKI272；Tsou等人，JMedChem,2005,48,1107-1131)(700mg,1.26mmol)在NMP中的溶液(4mL)中加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(304mg,1.38mmol)，使用MeCN/EtOAc(1:3)代替MeCN，获得(2E)-4-({4-[3-氯-4-(2-吡啶基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(703mg,72％)，其通过制备HPLC进一步纯化，使用CH3CN/H2O/TFA洗脱获得(2E)-4-({4-[3-氯-4-(2-吡啶基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(83)(410mg,40％)，熔点147-149℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ9.93(br,1H),9.84(s,1H),8.97(s,1H),8.62-8.59(m,1H),8.14(s,1H),7.90-7.86(dt,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H)7.44(s,2H),7.40-7.36(m,1H),7.29-7.22(m,2H),6.99-6.84(m,2H),5.30(s,2H),5.04(br,2H),4.40(d,J＝6.7Hz,2H),4.36-4.31(q,J＝7.0Hz,2H),3.86(s,3H),3.11(s,6H),1.47(t,J＝7.0Hz,3H)。分析实测值：C,49.42；H,4.57；N,13.90％.C37H35ClF3N9O7·0.5CF3COOH·3H2O计算值：C,49.54；H,4.54；N,13.68％。
根据一般程序C，向N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基-4-哌啶基)甲氧基]-4-喹唑啉胺(ZD6474；Hennequin等人，JMedChem,2002,45,1300-1312)(250mg,0.53mmol)在NMP中的溶液(1mL)中加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(139mg,0.63mmol)，除了该反应物被搅拌48小时，以及使用EtOAc代替MeCN做后处理，获得4-({[4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-喹唑啉基]氧基}甲基)-1-甲基-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(392mg)，其通过制备HPLC进一步纯化，使用CH3CN/H2O/TFA洗脱获得4-({[4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-喹唑啉基]氧基}甲基)-1-甲基-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]哌啶三氟乙酸盐(146)(246mg,64％)，1HNMR表明其为反/顺异构体混合物，比例约为2:5，下文称A为次要异构体，B为主要异构体。熔点185-188℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.42(br,1H),8.60(s,1H),8.114&8.110(sx2,A&B异构体,1H),7.74-7.71(m,1H),7.56-7.53(m,1H),7.34&7.27(sx2,A&B异构体,1H),5.07(br,2H),4.29&4.14(dx2,A&B异构体,J＝6.6Hz,2H),3.99&3.97(sx2,A&B异构体,3H),3.88(s,3H),3.75-3.60(m,4H),3.15&3.01(sx2,A&B异构体,3H),2.33-1.82(m,5H)。
在6-(2,6-二氯苯基)-2-{4-[2-(二乙基氨基)乙氧基]苯胺基}-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD166285；Klutchko等人，JMedChem,1998,41(17),3276-3292)(200mg,0.39mmol)在无水NMP的搅拌溶液中(2mL)加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(103mg,0.47mmol)。所得溶液在室温下搅拌72小时，加入Et2O。过滤所得沉淀，用Et2O和CH2Cl2洗涤。粗产物用CH3CN/Et2O沉淀进行纯化。过滤沉淀，用CH2Cl2洗涤，真空干燥获得淡黄色粉末状的2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N,N-二乙基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化乙铵(140)(170mg,59％)，熔点142-145℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.12(s,1H),8.82(s,1H),8.13(s,1H),7.88(s,1H),7.78(d,J＝8.9Hz,2H),7.59(dd,J＝8.1,0.7Hz,2H),7.46(dd,J＝8.8,7.4Hz,1H),7.05(d,J＝9.1Hz,2H),5.15(s,2H),4.48(t,J＝4.4Hz,2H),3.89(s,3H),3.86(t,J＝4.5Hz,2H),3.65(s,3H),3.58(q,J＝6.8Hz,4H),1.31(t,J＝7.0Hz,6H)。分析实测值：C,47.13；H,4.26；N,13.76.C31H33BrCl2N8O4.CH2Cl2计算值：C,47.02；H,4.32；N,13.71。
向6-(2,6-二氯苯基)-2-{4-[2-(二乙基氨基)乙氧基]苯胺基}-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD166285；Klutchko等人，JMedChem,1998,41(17),3276-3292)(200mg,0.39mmol)在无水NMP的搅拌溶液中(1.5mL)加入5-(溴甲基)-1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑(122)(110mg,0.47mmol)。所得溶液在室温下搅拌120小时，加入Et2O。过滤所得沉淀，用Et2O和CH2Cl2洗涤。真空干燥获得淡黄色粉末状的2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基溴化乙铵(141)(210mg,72％)，熔点163-166℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.13(s,1H),8.82(s,1H),7.89(s,1H),7.78(d,J＝8.8Hz,2H),7.59(dd,J＝8.0,0.6Hz,2H),7.45(dd,J＝8.8,7.4Hz,1H),7.05(d,J＝9.1Hz,2H),5.15(s,2H),4.47(t,J＝4.4Hz,2H),3.85(t,J＝4.2Hz,2H),3.75(s,3H),3.65(s,3H),3.58(q,J＝7.2Hz,4H),2.44(s,3H),1.31(t,J＝7.0Hz,6H)。分析实测值：C,51.74；H,4.79；N,14.86.C32H35BrCl2N8O4计算值：C,51.49；H,4.73；N,15.01。
向6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-(4-吡啶基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD166285类似物A；Klutchko等人，JMedChem,1998,41(17),3276-3292)(200mg,0.50mmol)在无水NMP(3mL)/THF(200mL)的搅拌溶液中加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(133mg,0.60mmol)。所得溶液在室温下搅拌25天，随后除去THF。所得溶液用EtOAc/水分层。水层进行冻干，所得胶体用Et2O/EtOAc/CH2Cl2研磨获得淡黄色粉末状的4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化吡啶(142)(200mg,65％)，熔点252℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.83(bs,1H),9.08(s,1H),8.68(d,J＝7.0Hz,2H),8.21(bs,2H),8.09(s,1H),8.05(s,1H),7.61(dd,J＝8.1,0.6Hz,2H),7.5(dd,J＝8.9,7.4Hz,1H),6.00(s,2H),3.84(s,3H),3.73(s,3H)。分析实测值：C,44.33；H,3.42；N,17.00.C24H19BrCl2N8O3.2H2O计算值：C,44.06；H,3.54；N,17.13。
向6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-2-{4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯胺基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PD166285类似物B；Klutchko等人，JMedChem,1998,41(17),3276-3292)(230mg,0.44mmol)在无水NMP中的搅拌溶液(5mL)加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(122)(116mg,0.53mmol)。所得溶液在室温下搅拌12天，加入Et2O。过滤所得沉淀，用EtOAc和CH2Cl2洗涤，粗产物从NMP/EtOAc(x2)沉淀进行纯化。过滤沉淀，真空干燥获得淡黄色粉末状的1-[2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)乙基]-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(143)(100mg,31％)，熔点176-178℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.14(s,1H),8.82(s,1H),8.14(s,1H),7.89(s,1H),7.80(d,J＝8.9Hz,2H),7.59(dd,J＝8.1,0.7Hz,2H),7.46(dd,J＝8.8,7.4Hz,1H),7.10(d,J＝9.1Hz,2H),5.22(bs,2H),4.61(t,J＝4.4Hz,2H),4.17(bs,2H),3.86(s,3H),3.72-3.64(m,2H),3.65(s,3H),2.10-1.95(m,4H),1.74(bd,J＝14.3Hz,2H),1.60(bd,J＝14.3Hz,1H),1.46-1.31(m,1H),2质子未观察到。分析实测值：C,48.33；H,4.64；N,13.32.C32H33BrCl2N8O4.3H2O.1/4EtOAc计算值：C,48.31；H,5.04；N,13.66。
根据一般程序B，向N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(舒尼替尼；Sun等人，JMedChem,2003,46(7),1116-1119)(199mg,0.50mmol)在NMP中的溶液(1mL)中加入5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(100mg,0.45mmol)，获得N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化乙铵，其通过制备HPLC进一步纯化获得N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]乙铵三氟乙酸盐(144)(190mg,64％),熔点162-165℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ13.74(s,1H),10.89(s,1H),8.13(s,1H),7.80-7.75(m,2H),7.73(s,1H),6.96-6.91(m,1H),6.87-6.84(m,1H),5.03(s,2H),3.90(s,3H),3.61-3.48(m,8H),2.45(s,3H),2.42(s,3H),1.34(t,J＝7.1Hz,6H)。19FNMR[(CD3)2SO,376.5MHz]δ-73.97(s,3.31F),-122.71(m,1F)。分析实测值：C,50.50；H,4.89；N,13.88.C29H33F4N7O6·0.31(F3CCOOH)·H2O计算值：C,50.46；H,5.05；N,13.91。
根据一般程序C，向N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(舒尼替尼；Sun等人，JMedChem,2003,46(7),1116-1119)(199mg,0.50mmol)的NMP溶液(1mL)中加入5-(溴甲基)-1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑(122)(106mg,0.45mmol)，除了使用EtOAc代替MeCN外。获得N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]溴化乙铵(145)(268mg,93％),熔点244-248℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ13.74(s,1H),10.89(s,1H),7.79-7.75(m,2H),7.73(s,1H),5.04(br,2H),3.77(s,3H),3.58-3.46(m,8H),2.46(s,3H),2.45(s,3H),2.42(s,3H),1.34(t,J＝7.1Hz,6H)。分析实测值：C,52.59；H,5.64；N,14.98.C28H35BrFN7O4·0.5H2O计算值：C,52.42；H,5.66；N,15.28。
A.2.前药的效果
不可逆的erbB1、2、4抑制剂(11-14)和相当的可逆抑制剂(16)(其中迈克尔受体双键被饱和)与其一系列的具有可断裂的还原性触发剂的季铵盐前药(17-23,27)进行了比较。进行了一系列的试验以评价前药的失活度，其在缺氧条件下在细胞内的活化，其在单电子还原条件下的断裂及其在A431肿瘤异种移植物中的效果。
试验:方法和材料
A.2.1细胞的erbB1抑制：含氧和缺氧试验条件
将人A431表皮样癌细胞以400,000细胞/孔接种在含有α-最低必需培养基(αMEM)的6孔板中，所述培养基含有10％胎牛血清、10mMD-葡萄糖和0.2mM2’-脱氧胞苷。A431细胞在含氧或缺氧条件下贴壁90分钟，随后加入1uM的试验化合物，在含氧或缺氧条件下继续保留4小时。随后用无血清培养基洗涤细胞3次，洗去试验化合物，放回培养箱中，在含氧条件下过夜。细胞随后用100ng/mLEGF刺激15分钟，随后抽吸培养基，细胞用冰冷的PBS洗涤。在改良的RIPA缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4,1％NP-40,0.25％脱氧胆酸钠,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMNa3VO4,1mMNaF和1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒合剂(Sigma))裂解细胞，在冰上孵育5-10分钟。使用BCA试验测定样品的蛋白浓度。使用适当的抗体通过蛋白质印迹测定相对于肌动蛋白上样量的EGFR磷酸化。在15孔NuPAGE4-12％凝胶(Invitrogen)中每孔加入1ug总蛋白。电泳后将蛋白转移到0.45μm硝酸纤维素膜(Biorad)上，用在TBS-Tween0.1％中的2％BSA(ICPBio)封闭1小时，如所述在TBS-Tween0.1％中稀释抗体。
使用SupersignalWestPico化学发光底物(Pierce/ThermoScientific)检测蛋白。磷酸化蛋白检测后，斑点用RestoreWesternBlot脱除缓冲液(Pierce/ThermoScientific)脱除30分钟，洗涤，再封闭，并用抗肌动蛋白的抗体孵育。
A.2.2细胞生长抑制实验
通过胰蛋白酶消化(1x胰蛋白酶/EDTA,GibcoBrl)从含有5％胎牛血清的α-最低必需培养基(αMEM)收集对数期指数生长的人A431、BT474、SKBR3、SKOV3、SW620、H1975和HT29癌细胞，计数并以800-1500细胞/孔的细胞密度接种于96孔板(Nunc)中。半数细胞样品接种于已在缺氧环境预平衡和保持的培养板(90％N2,5％H2,5％CO2,37℃；厌氧培养室,CoyLaboratoryProducts,)中。含氧(21％O2)或缺氧(<10ppmO2)条件下3小时贴壁后，细胞暴露在一定范围的经过适当稀释的前药或效应物浓度下4小时。该阶段结束时从缺氧室中回收缺氧平板，在标准CO2培养箱(37℃)中在含氧条件下培养20小时。洗去所有平板的化合物，使细胞在含有5％FBS和抗生素的αMEM中增殖4天。细胞在三氯乙酸中固定(30分钟)，洗涤并用磺基罗丹明B染色(SRB,60min)，之后在酸化的水中洗涤。使SRB溶解，在450nm处读取吸光度，计算细胞密度。相对于未处理的孔计算增殖抑制率。
A.2.3含氧和缺氧细胞代谢试验
在T75烧瓶中生长A431和SKOV3细胞，以40K的密度接种，此密度在生长7天后能产生80-90％汇合的细胞层。细胞用PBS洗涤，0.05％胰蛋白酶/EDTA收集，室温下在1000rpm离心5分钟，再悬浮于1mL细胞培养基中(含有10％FCS、10mMD-葡萄糖和0.2mM2’-脱氧胞苷的α-MEM)。使用库尔特计数器测定细胞数，将适当数目的细胞转移到新试管中。按照每孔5x105个细胞平铺到24孔板中，每孔总体积350μL/(即14.3x105个细胞/mL)。细胞在37℃孵育2小时贴壁，平衡缺氧样品。在每孔中加入50μL含有80μM化合物20的细胞培养基(至350uL/孔)，使各孔中的最终化合物20的浓度为10μM，两种细胞系一式两份。细胞在37℃孵育1、2或3小时。在适当的时间从培养箱/缺氧室移出24孔板，放置在冰上。将各孔中的物质转移到冰上的微量离心管中。每个用药处理的孔中加入800μL乙腈(用化合物11和20的D6内标，各0.5uM)，充分提取细胞单层。随后涡旋混合全部内容物(1200uL＝400+800uL)，转移至-80℃保存，直到进行LC-MS/MS***分析。对照样品采用类似的程序。使用对照样品构建校准曲线，分别用化合物20和化合物11。在分析当天，将样品从-80℃冰箱中取出，在冰上融化，涡旋混合，在13000rpm离心5分钟，沉淀细胞碎片。将35uL上清小心转移至HPLC上样器，与85uL甲酸盐缓冲液混合(45mM,pH4.5)。将25uL重构的样品进样到LC-MS/MS***中。
A.2.4血浆和肿瘤药代动力学试验
将化合物20配成pH4.0的乳酸盐缓冲液，以133μmol/kg的剂量通过腹腔注射施用到24只具有A431肿瘤异种移植物的雌性NIH-III小鼠中。在T＝0.25,1,3,5,24,36,48和72小时在异氟烷麻醉下通过尾部放血收集血样(每组n＝3)。在T＝0.25,1,3,5,24,36,48和72小时(每组n＝3)收集A431肿瘤样品，立即冷冻在液氮中，储存在-80℃下，直到制备样品进行药物分析。将小片的(～100mg)组织放置在生物研磨孔(之前在液氮中冷却)中，用不锈钢研棒捣2-3次研磨成细粉。将冷冻的粉末收集到预称重的微量离心管中(放置在干冰上)。加入4份体积的冰冷的乙腈(各含有0.5uM化合物20和11的D6内标)，从粉碎的组织中提取药物。微量离心管在13,000rpm离心10分钟，沉淀细胞碎片和蛋白质。向10μl血浆(收集在EDTA中)中加入40μl冰冷的乙腈(0.5uM化合物20和11的D6内标)。混合所得溶液，在13,000rpm离心5分钟。将上清液(40ul)转移至HPLC进样器中，与80ul45mMpH4.5的甲酸盐缓冲液混合，随后在装有二极管阵列吸光度检测器(DAD)和线内质量检测器的Agilent6410LC-MS/MS上测定化合物20、化合物11和来自施用化合物20的小鼠的样品中化合物11的浓度。通过在电喷雾负离子模式中调制多模式离子源检测器进行分析，干燥气流5.5L/分，喷雾压力55psi、干气温度350℃，喷雾器温度225℃，毛细管电压2500V，充电电压2000V，322nmDAD检测，8nm带宽。基于MRM跃迁在m/z564>314(前药)和m/z425>314(效应物)以及570>314(前药的D6内标)和431>314(效应物的D6内标)处量化。分析物使用0.01％甲酸在乙腈(80％)-水(20％)混合物和0.01％甲酸在水(100％)中的溶液梯度洗脱，使用ZorbaxSBC-18快速解析HT3.0x50mm，1.8微米(Agilent)HPLC柱，流速为0.6ml/分。
A.2.5体内效果试验
A431异种移植物：向无特异性病原体的纯合雌性CD-1裸鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)皮下接种A431细胞的单细胞混悬液(5x106细胞/100μL；右胁侧)。建立A431异种移植物后(通常为6-10天)，将小鼠随机分成治疗组。所有的化合物在乳酸盐缓冲液(pH4)中制备。按照预定的日程和剂量水平通过腹腔注射向小鼠给药(0.01-0.03ml/g)。以一定间隔测定肿瘤体积和体重。肿瘤体积按π(长×宽2)/6计算。测定肿瘤增至治疗前体积4倍的时间(RTV4)，按治疗组相对于对照的RTV4的中值百分比增加计算肿瘤生长抑制率(％TGI)。使用SigmaStatv3.5通过MannWhitneyU检验测定RTV4的统计学差异。
SKOV3异种移植物：向无特异性病原体的纯合雌性NIH-III裸鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)皮下接种SKOV3细胞的单细胞混悬液(1x107细胞/100μL；右胁侧)。建立SKOV3异种移植物后(通常为50-65天)，将小鼠随机分成治疗组。所有的化合物在乳酸盐缓冲液(pH4)中制备。按照预定的日程和剂量水平通过腹腔注射向小鼠给药(0.01-0.03ml/g)。以一定间隔测定肿瘤体积和体重。肿瘤体积按π(长×宽2)/6计算。测定肿瘤增至治疗前体积4倍的时间(RTV4)，按治疗组相对于对照的RTV4中值百分比增加计算肿瘤生长抑制率(％TGI)。使用SigmaStatv3.5通过MannWhitneyU检验测定RTV4的统计学差异。
A.2.6辐射分解还原试验
引入还原当量后，使用60Coγ射线辐照器测定样品前药在溶液中释放效应物的相对活性。前药以小于等于50μM的浓度溶于Millipore水中(含有加入的50mM甲酸钠缓冲液，pH7，加入5mM磷酸钠)。密闭玻璃容器中的溶液用N2O气体连续饱和30分钟后以7.5Gy/分的剂量进行放射分解，预先用Fricke放射量测定法测定(Fricke和Hart,“ChemicalDosimetry”，在RadiationDosimetry卷2,Attrix,F.H.；Roesch,W.C.；Tochilin,E.(编辑),AcademicPress,NewYork,1966,pp167-239.)。在上述使用的辐射条件下，每Gy产生0.66μM浓度的单电子还原当量(CO2 .-自由基)(Mulazzani等人，J.Phys.Chem.,90,5347-5352,1980.)，前药(P)通过电子转移而还原。
γ-辐射+H2O→e- aq+H.+.OH+H3O+
e- aq+N2O→.OH+OH-+N2
.OH/H.+HCOO-→H2O/H2+CO2 .-
CO2 .-+P→P.-+CO2
一式两份的受辐射的样品中各前药的损耗及其效应物的形成通过HPLC-质谱(MS)监测。测定了0.95还原当量水平下前药浓度的百分比下降和效应物形成。此外，记录了来自各前药甲基-硝基芳族的检测。0.95还原当量水平下前药浓度下降超过50％，表明了单电子化学计量。
使用脉冲辐解来实时监测单电子还原和化合物的稳定性。使用装配了快速光谱检测***的线性加速器递送高能电子短脉冲(200ns4MeV中2-3Gy)(Anderson等人，J.Phys.Chem.A,101,9704-9709,1997)。将前药溶解于含有甲酸盐离子的N2O-饱和溶液中，如前所述，在经过脉冲辐解后在数微秒内迅速形成所述化合物的自由基阴离子。通过在对应于触发剂部分的苄基类基团形成的波长处分析动态临界物确定断裂速率(Bays等人，J.Am.Chem.Soc.,105,320-324,1983；Anderson等人，J.Phys.Chem.A,101,9704-9709,1997)。
结果和讨论
A.2.7酶抑制活性
在分离的酶测定中分别测定了表1的化合物抑制erbB1、erbB1T790M、erbB2和erbB4的能力。该测定利用了合成的能够进行FRET的肽底物。这些底物的磷酸化使其免于被开发试剂切割，使其FRET能力保持完整。数据表示为抑制肽底物磷酸化50％需要的药物浓度(IC50)。如其他人所述(Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734)，当比较具体的单独酶测定中的化合物时，由于酶的性质、底物和整体测定条件等因素，其差异很大。进一步发现，对于能够不可逆抑制酶的化合物而言，IC50表现出与该酶可逆和不可逆的结合。对于能够快速并完全烷基化酶的化合物而言，IC50值来自以化学计量的方式对酶活性的基本滴定(即无限抑制)，因此仅被认为是“表观”的IC50。该性质的测定已被常规使用(Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734；Wissner等人，JMedChem,2003,46,49-63；Wissner等人，BioorgMedChemLett,2004,14,1411-1416；Tsou等人，JMedChem,2005,48,1107-1131；Klutchko等人，JMedChem,2006,49,1475-1485)，以在本文所述的一组测定条件内对化合物评分。
在所述测定条件下，已知的不可逆erbB1/2抑制剂11确认为erbB1、2和4的有效抑制剂(IC50分别为0.22nM、8nM和2.7nM)，这与在这些酶ATP结合区域出口处使半胱氨酸残基烷基化的能力一致，参照了对其他erbB1选择性4-苯胺基喹唑啉的总-erbB效力。在该测定中，11比之前基于固相ELISA测定的报道更有效(Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734)(erbB1IC50＝11nM,erbB2IC50＝301nM)，但与最近报道的使用等价的Z’-LYTE测定的erbB1IC50(0.22nM)相当(Michalczyk等人，BioorgMedChem,16,2008,3482-3488.)。化合物11还显示对erbB1的T790M突变体具有良好的效果(IC5010.3nM)，该突变体已知对于不可逆erbB抑制剂敏感。该突变体具有庞大的看门残基，其认为能够阻断临床可逆的4-苯胺基喹唑啉类吉非替尼和厄洛替尼的结合，以及保留ATP-结合亲和性，从而导致吉非替尼和厄洛替尼敏感性非小细胞肺癌中约50％的患者复发。相反，化合物16是化合物11的直接可逆类似物，其是erbB1选择性的，对于erbB2、erbB4和erbB1T790M显示10-42倍的效力下降，这与不能烷基化这些酶并改善抑制效果一致。该测定中最重要的是，化合物11的季铵盐前药(17-22)显示为分离的erbB1的有效抑制剂(IC500.20-0.56nM)，但在抑制分离的erbB2、erbB4和erbB1T790M方面同样显示至少14-44倍的效果下降。一种趋势是化合物11的叔胺的季铵化作用产生了作为erbB家族的不可逆抑制剂的化合物(也参见下文基于细胞的药物清洗(wash-out)数据)，这是因为已知的4-苯胺基喹唑啉骨架的erbB1选择性和针对单独的erbB1T790M的效力下降对于前药(17-22)是很明显的。
表1.分离的erbB家族酶的抑制(IC50)
表1的脚注
aInvitrogenZ’-LYTE激酶测定按照由InvitrogenSelectScreenKinaseProfiling提供的商业服务一式二份进行，使用10μMATP。bND＝未测定。
通过磷酸化-erbB1状态的免疫印迹测定，测定了表2的化合物抑制EGF刺激的A431细胞的erbB1自体磷酸化作用的能力。化合物11-13显示为细胞erbB1的有效抑制剂(IC50分别为9、45和16nM)。化合物11的直接可逆类似物化合物16也是(IC5018nM)。反之，季铵盐衍生物(19-23,27)相对于各自的效应物分子其抑制完整A431细胞内erbB1自身磷酸化作用的效果要低27-201倍。前药的细胞内erbB1抑制效果的下降和前文所述分离的酶的erbB1抑制效果的保留均由于正电荷的季铵盐前药的细胞排除。
表2.完整A431细胞的erbB1自身磷酸化抑制(IC50)
表2的脚注
a抑制完整A431细胞内EGF刺激的erbB1自身磷酸化50％需要的浓度，使用抗-磷酸酪氨酸抗体通过蛋白质印迹测定。数值为两次测定的平均值(STDEV<20％)。b细胞erbB1抑制相对于母体激酶抑制剂的下降倍数。
A.2.8细胞的erbB1抑制：不可逆的清洗测定
根据已知的不可逆erbB1/2抑制剂11(前药20的效应物)和化合物16，评价了季铵盐前药20在完整A431细胞中不可逆地抑制erbB1自身磷酸化的能力。细胞连续暴露在药物(1μM)中1小时，随后用EGF刺激，测定全细胞裂解物，通过蛋白质印迹测定磷酸化-erbB1水平，或者暴露在药物(1μM)中1小时，随后在EGF刺激和磷酸化-erbB1的蛋白质印迹前洗去未结合的药物(图1A/B)。如之前所述的化合物11(Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734)，A431细胞中的erbB1自身磷酸化被完全抑制，而不考虑所述细胞是否在EGF刺激前洗去未结合的药物。这强有力地证明发生了erbB1的不可逆抑制。相反，化合物16是细胞的自身磷酸化的有效抑制剂(IC50＝18nM,表2)但却不能进行酶烷基化，因为其在6-位没有被迈克尔受体取代。因此，化合物16在未进行药物清洗的细胞中显示了完全的erbB1自身磷酸化抑制，而洗去药物的细胞保留了其自身磷酸化erbB1的能力，表明化合物16是有效的erbB1可逆抑制剂。在前药20中观察到类似的趋势，暴露在1μM药物中(与该化合物erbB1自身磷酸化的细胞IC50相一致(555nM,表2))的未清洗的细胞中自身磷酸化未被完全抑制，洗去药物的细胞中完全回复了自身磷酸化erbB1的能力，这与前药20是erbB1的可逆抑制剂这一点是一致的。
图1显示了化合物11、16和20的A431细胞自身磷酸化。细胞暴露在1μM试验化合物中1小时，直接用EGF刺激、裂解并进行EGFR蛋白质印迹(erbB1)和磷酸化EGFR蛋白质印迹(磷酸化erbB1)，或用无药物介质充分洗涤除去试验化合物后，进行EGF刺激、细胞裂解和蛋白质印迹。A：蛋白质印迹。B：使用细胞内总EGFR蛋白标准化蛋白载量后的蛋白质免疫印迹的量化。
A.2.9细胞生长抑制活性
测定了表3中化合物抑制三种人癌细胞系增殖的能力，与之前的文献进行比较(Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734)A431(表皮)，其过表达erbB1；SKBR3(乳腺)，其过表达erbB2，而erbB1程度较低；以及SW620(结肠)，其作为对照系，不在显著水平表达erbB1或erbB2。将这些细胞在含氧条件下暴露在试验化合物中24小时，或在缺氧条件下暴露4小时，随后在含氧条件下暴露20小时。随后洗去药物，继续孵育4天后用磺基罗丹明B染色进行细胞存活试验。
表3.A431、SKBR3和SW620细胞中细胞增殖的抑制(IC50)
表3的脚注
a测定了5个浓度的剂量-响应曲线。细胞在测试化合物中暴露24小时，随后用无药物介质连续洗涤。IC50(μM)值是抑制细胞生长50％需要的浓度，从剂量-响应曲线中获得。数值是介于3-9次独立测定的平均值(所有情况下％CV<20)。b试验全部在含氧条件下进行。c相对于母体激酶抑制剂，在含氧下细胞生长抑制下降的倍数。d24小时的前4小时的药物暴露在低氧条件下进行。e低氧条件下细胞毒性比值＝相对于仅在含氧条件下的细胞，接受4小时缺氧的细胞的细胞生长抑制增加的倍数。
相对于SW620(IC50＝3.43μM)细胞，不可逆的erbB1/2抑制剂11更有效地抑制A431(IC50＝0.040μM)和SKBR3(IC50＝0.081μM)细胞的增殖。该化合物和其他报道化合物(12和13)的特点和IC50值与先前报道的结果(在药物暴露和孵育时间方面的差异)一致(Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734)。抑制剂14具有7-甲氧基喹唑啉骨架，与化合物11活性相当，在抑制表达erbB家族成员的细胞生长中最为有效。相反，在erb1/2细胞系中，可逆抑制剂16比其不可逆对比物11的活性要低32-39倍。当细胞经过4小时缺氧处理时，化合物11-14和16未显示任何显著的效果变化。
季铵盐前药(17-23,27)相对于各自的激酶抑制剂(11,12,16)其抑制A431细胞生长的效果要低12-277倍，抑制SKBR3细胞生长的效果要低19-332倍，抑制SW620细胞生长的效果要低18-123倍。经过4小时缺氧处理细胞后，表4中的某些前药(19,20,22和23)在抑制A431和SKBR3细胞(但非SW620细胞)生长中的效果显著增强。A431细胞中的低氧条件下细胞毒性比值(HCR)为10.4至26.8，SKBR3细胞为6.7至18.1，这与硝基杂环还原性触发剂的低氧选择性还原、随后触发剂断裂释放不可逆的erbB1、2、4抑制剂相一致。
A.2.10辐射分解还原
与正常组织中正常含氧量条件下不同，在实体瘤的低氧区域亲电性前药可通过单电子过程选择性还原，形成或释放细胞毒性效应物(Brown和Wilson,NatureRev.Cancer,2004,4,437-447)。前药必须含有具有单电子还原电位E(1)的触发剂，E(1)相对于NHE为-0.6V至-0.2V，优选介于-0.5V至-0.3V。许多化合物的E(1)值可以从文献中获得(例如Wardman,P.J.Phys.Chem.Ref.Data,1989,18,1637-1755.)或通过多种方法测定。例如脉冲辐射分解方法测定前药经单电子还原后形成的自由基阴离子和诸如紫精和醌化合物的参考标准间的平衡常数，从该数据计算化合物的E(1)值(Meisel和Czapski.J.Phys.Chem.,1975,79,1503-1509)。前药17-22、140-145的E(1)值通过脉冲辐射分解方法测定，为介于-0.493V和-0.388V之间的范围(表4)。它们均被认为具有适当的E(1)值，能在生物背景中酶促形成其自由基阴离子。
在溶液中辐射分解后，具有适当E(1)值的前药可以通过多种方法测定其释放效应物部分的能力。例如，辐射分解前后的质谱(MS)和/或高效液相色谱(HPLC)鉴定了起始化合物和辐射分解形成的产物。某些单电子还原剂能在含有不同溶质的溶液辐射分解后产生。例如在经γ-辐射后含有甲酸盐离子的溶液中形成的CO2 .-基团，具有-1.90V的低E(1)值(Schwarz等人，Inorg.Chem.,1985,24,433-439.)，易于将电子转移到具有较高E(1)值的化合物上。在所使用的辐射条件下，每Gy(Jkg-1)吸收的辐射剂量产生0.66μM浓度的单电子还原当量(CO2 .-基团)(Mulazzani等人，J.Phys.Chem.,1980,90,5347-5352.)。通过比较前药浓度的下降和溶液辐射分解后产生的还原当量的浓度，可以确定需要单或多电子还原以使得前药完全分解。通常，在0.95还原当量转移到前药时，即找到前药单电子去除的证据，以最小化同一前药分子的多电子还原。在单电子去除前药的情况下，通常表明其自由基阴离子的断裂。该结论可通过组合HPLC-MS鉴定释放的细胞毒性效应物和来自过渡态苄基类基团的产物(例如H原子抽离形成的甲基硝基芳族化合物(MNA))得到进一步支持。该过程已显示在某些相关的芳基甲基四价氮芥中发生(Anderson等人，J.Phys.Chem.,1997,101,9704-9709；Wilson等人，Radiat.Res.,1998,149,237-245.)。前药19和20获得的数据与其在单电子还原水平的消耗(在0.95还原当量水平下前药减少>50％)一致，释放的效应物(化合物11)通过HPLC-MS检测，表4。类似的，稳态辐射分解后的HPLC-MS分析证实前药140、143和144在单电子还原后释放其各自的效应物。相反，从前药21获得的数据与需要双电子还原的消耗相一致。单电子还原后未观察到效应物(化合物11)的释放。前药17、18、22和142在单电子还原后未释放其各自的效应物化合物，仅在多电子还原后消耗。
希望选择所述还原性前药，使其在触发剂部分单电子还原后，具有可控的断裂速率常数。虽然在肿瘤细胞含氧量低的区域快速断裂释放高浓度的细胞毒性效应物是需要的，对于含氧量正常的正常组织细胞则并非如此。单电子还原的基于硝基芳烃的前药被氧气重新氧化(其有效抑制效应物释放)的速率常数kO2如下式所表达：
logkO2/M-1s-1＝(4.6±0.1)–(5.0±0.2)xE(1)C/C-
其中E(1)C/C-是前药的单电子还原电位(Wardman等人，Biochem.Soc.Symp.,1995,61,171-194；Anderson等人，Org.Biomol.Chem.2005,3,2167-2174)。
单电子还原的前药的断裂速率常数kfrag可使用脉冲辐射分解测定，以观察自由基阴离子断裂后产生的苄基类基团的吸收光谱的时间解析形成(Anderson等人，J.Phys.Chem.A,1997,101,9704-9709.)。前药19,20,140,141和143-145的kfrag值通过脉冲辐射分解测定，显示于表4中。在表3中所述的前药中，前药19和20具有低氧条件下单电子还原后最优选的断裂速率常数范围，这与其在体外的基于A431和SKBR3细胞的抗增殖试验中具有最高的低氧条件下细胞毒性比值相一致(表3)。
表4.所选前药通过CO2 .-基团的辐射分解还原
表4的脚注
a相对于甲基紫精测定,E(1)MV2+/MV+.＝-447±7mV。b在0.95还原当量下通过HPLC-MS进行的测定；>50％表明单电子还原后的断裂。c通过HPLC-MS进行的甲基硝基芳烃(MNA)的检测。d在360-390nm区域形成的苄基类基团吸收的脉冲辐射分解数据。
A.2.11A431异种移植物中化合物19、20和21的体内筛选
通过腹腔内注射乳酸盐缓冲液，按照q4dx3方案比较了前药19,20和21在A431异种移植物中以各自最大耐受剂量施用时的效果(图2)。
图2显示了化合物19,20和21针对A431异种移植物的效果。
前药20(q4dx3MTD＝133μmol/kg/剂)在A431异种移植物中显示了很大的效果(肿瘤生长抑制计算值,TGI>>210％)，而前药19(q4dx3MTD＝75μmol/kg/剂)具有微弱的活性(TGI＝120％)，前药21(q4dx3MTD＝75μmol/kg/剂)无活性(TGI＝10％)。各前药基于相同的效应物(化合物11)，区别仅在于所用的还原性触发剂性质。所述前药活性的排序(20>19>21)与脉冲辐射分解测定的单电子还原后触发剂断裂速率常数(20>19>21)和体外观察到的A431细胞中前药的HCR(20>19>21)相一致，验证了前药的低氧选择性活化，效应物在A431异种移植物低氧区域释放，随后通过后扩散进入肿瘤含氧细胞的假设正是前药19和20的作用机制。
A.2.12化合物20的溶解性和稳定性
通过HPLC在一定范围的溶质内研究了季铵盐前药20的溶解性和化学稳定性。经测定其在α-MEM细胞培养基中具有1112μM的溶解度，同时具有良好的稳定性(半衰期＝58小时)。在37℃下，在α-MEM中24小时后，通过HPLC未观察到效应物11的释放。此外前药20在DMSO和乳酸盐缓冲液(pH＝4)中基本稳定(半衰期>96小时)。
A.2.13化合物11和20的鼠毒性和药代动力学
表5描述了以乳酸盐缓冲液(pH4)腹腔注射后，不可逆erbB1/2抑制剂11和前药20的最大耐受剂量(MTD)和血浆药代动力学。两种化合物显示腹泻和体重下降，表明剂量限制的胃肠道毒性。若体重下降>起始重量的15％，则进行人道主义处死。MTD值定义为所有药物相关原因导致的小于1/7的死亡率。以单剂量或q4dx3日程施用时，前药20的耐受比化合物11好1.8倍。两种化合物以其各自单剂量MTD(见下一部分)的一部分进行的多剂量日程中均具有良好的耐受，体重下降为唯一观察到的毒性。腹腔单次施用42％的单剂量MTD后测定了各化合物的血浆药代动力学。前药20曲线下面积(AUC)比化合物11高23倍，而施用前药20后血浆中发现的化合物11的量很低(效应物的AUC是前药AUC的1％)，表明前药20在体内对非特异性释放保持稳定。
表5.化合物11和20的体内毒性和药代动力学
表5的脚注
a测试化合物以pH4.0的乳酸盐缓冲溶液通过腹腔注射施用。
b在雌性无肿瘤CD-1裸鼠上进行；每组小鼠n＝3。
c在雌性A431肿瘤CD-1裸鼠上进行；每组小鼠n＝7。小鼠按q4dx3日程给药(例如星期一、星期四、星期二)。
d根据构建的血浆浓度/时间曲线预测的AUC。测试化合物的血浆浓度通过LC-MS在施用42％的单剂量MTD后5、15分钟，1、2和4小时测定，参见方法试验部分。
A.2.14化合物11和20效果的比较
在更长的Q4dx6日程中，通过腹腔内施用乳酸盐缓冲液直接比较了同等剂量(单剂MTD的63％)的前药20和效应物11在A431异种移植物中的效果。前药20在生长延迟方面显示比效应物11更好的效果，经测定是统计学显著性的(图3A)。各试剂的剂量和施用日程通过平均体重下降判定为相同毒性的(图3B)，用效应物11治疗的小鼠死亡为2/12，用前药20治疗的小鼠死亡为0/12。
图3A显示了化合物11和20针对A431异种移植物的效果。
图3B显示用化合物11和20处理后A431小鼠的平均体重变化。
A.2.15细胞的erbB1抑制：含氧和低氧条件下
图10显示化合物11和16-22的A431细胞自身磷酸化抑制。细胞在含氧和低氧条件下暴露在1μM测试化合物下4小时，随后用无药物介质充分洗涤，除去测试化合物。血清饥饿过夜，随后用EGF刺激，裂解并进行磷酸化-EGFR(磷酸化-erbB1)的蛋白质印迹，或使用肌动蛋白作为蛋白上样对照。
化合物19和20显示对p-erbB1的低氧选择性抑制。化合物17,18,21和22未显示明显的p-erbB1低氧选择性抑制。
A.2.16化合物11和20在细胞系中的细胞生长抑制活性
图11显示含氧和低氧条件下化合物11和20在A431、BT474、SKBR3、SKOV3和SW620细胞中的细胞增殖抑制(IC50)。
化合物20在一系列细胞系中显示低氧选择性抗增殖活性，所述选择性在已知过表达erbB家族成员的细胞系中最高(A431,BT474,SKBR3,SKOV3)。相反，不可逆的erbB1/2抑制剂11在所述细胞系中未显示低氧选择性抗增殖活性。
A.2.17化合物20的细胞代谢：含氧和低氧条件下
图12显示了当A431和SKOV3细胞在含氧和低氧条件下用10uM前药20处理时，通过LCMS测定的抑制剂11相对于无细胞对照的时间依赖性释放。
已证明A431和SKOV3细胞能在低氧条件下选择性代谢前药20，产生不可逆的erbB1/2抑制剂11，其速率分别为200和500pmol/小时/百万细胞。前药20的某些低氧选择性还原在含有5％胎牛血清的无细胞培养基中发生，以62pmol/小时的速率释放抑制剂11。
A.2.18化合物11和20在各自的q4dx3MTD下的血浆和A431肿瘤药代动力学
图13显示了当以q4dx3MTD(分别为133和75umol/kg)向雌性A431带瘤NIHIII小鼠腹腔内施用单剂量的各测试化合物时，血浆和A431肿瘤中化合物20和化合物11(来自施用化合物20和直接施用)的浓度，其作为相对于时间的函数。
表6显示了当以q4dx3MTD(133umol/kg)向雌性A431带瘤NIHIII小鼠施用(ip)单剂量的化合物20时，计算的血浆和A431肿瘤的化合物20和化合物11(来自施用的化合物20)的0-72小时曲线下面积(AUC)。
表6
以各自的MTD(133和75umol/kg；ip)施用后，通过LC/MS/MS检测测定了雌性NIHIII小鼠中前药20和抑制剂11的血浆和A431肿瘤药代动力学(使用D6内标)。前药20血浆AUC0-72h为2016umol-h/L，约是施用抑制剂11的110倍(18umol-h/L)。后者肿瘤AUC0-inf为100umol-h/kg，半衰期为(t1/2)9小时。相反，前药20的肿瘤AUC0-72h为2245umol-h/kg，到72小时为止具有约30umol/kg的稳定的肿瘤组织浓度，从而不能测定t1/2。与该较长前药保留时间相一致，从前药20中释放的抑制剂11的肿瘤组织t1/2>72h，提供了464umol-h/kg的AUC0-72h。因此，施用前药20后，A431肿瘤中的抑制剂11的AUC至少比以同等毒性施用抑制剂11本身高4.6倍。
图14显示了化合物11和20针对SKOV3异种移植物的效果。
图15显示用化合物11和20治疗的SKOV3带瘤小鼠的平均体重变化。
在Q3dx6日程中，通过腹腔内施用同等毒性剂量(分别为133和56umol/kg/剂)的乳酸盐缓冲液直接比较了前药20和效应物11在SKOV3异种移植物中的效果。前药20在生长延迟方面显示比效应物11更好的效果，经测定是统计学显著性的(图14)。各试剂的剂量和施用日程通过平均体重下降判定为毒性相同的(图15)，用效应物11治疗的小鼠死亡为1/7，用前药20治疗的小鼠死亡为0/7。
图16显示了前药20和效应物11在体外A431细胞内对细胞HER1(erbB1,EGFR)和Erk1/2磷酸化的剂量依赖性抑制。
通过磷酸化-HER1和磷酸化-Erk1/2状态的蛋白质免疫印迹测定检测了前药20和11抑制EGF-刺激的A431细胞中的HER1(erbB1)和Erk1/2的磷酸化的能力。化合物11显示为细胞HER1和Erk1/2的有效抑制剂。相反，季铵盐衍生物20在抑制HER1和Erk1/2中的效果要低约60倍。
A.2.19化合物82和140-144在细胞系内的抑制活性
表7显示了前药82,140,141,142,143和144在A431、H1975和HT29细胞中对细胞增殖的抑制效果
表7.A431、H1975和HT29细胞中细胞增殖的抑制(IC50)
表7的脚注
a测定了5个浓度的化合物剂量-响应曲线。细胞暴露于测试化合物中24小时后用无药物介质洗涤(x3)。IC50(umol/L)值是相对于未处理的对照抑制50％的细胞生长所需要的浓度。数值为2-5次独立测定的平均值(所有测定中％CV<20)。b整个试验在含氧条件下进行。c24小时药物暴露的最初4小时在缺氧条件下进行。d低氧条件下细胞毒性比值＝相对于仅接受含氧条件的细胞，接受4小时缺氧条件的细胞的试验内IC50倍数变化。
细胞接受4小时缺氧条件后，表7的前药(82,140,141,143和144)在抑制所有三种细胞系生长方面的效果显著加强。A431细胞中低氧条件下细胞毒性比值(HCR)范围为7-62，H1975细胞中为3-28，HT29细胞中为5-31，这与硝基杂环还原性触发剂的低氧选择性还原后触发剂断裂释放激酶抑制剂相一致。释放的激酶抑制剂的性质影响细胞系灵敏度，例如前药82显示针对A431细胞具有最高的抗增殖活性和低氧选择性，而前药144显示针对HT29细胞具有最高的抗增殖活性和低氧选择性。
A.2.20总结
收集的数据表明，具有在迈克尔受体附近的叔胺的不可逆erbB1、2、4抑制剂的季铵盐前药在含氧条件下的基于细胞的靶调节和抗增殖测定中活性较低。具有可断裂的还原性触发剂的前药经单电子还原后在适当的速率常数下断裂，释放具有叔胺的不可逆erbB1、2、4抑制剂，其在缺氧条件下进行的基于细胞的抗增殖测定中选择性地更为有效，可以更大量的药物暴露水平递送到小鼠，因而在肿瘤异种移植物试验中相对于其母体的不可逆erbB1、2、4抑制剂具有改善的治疗指数。
部分B
B.1.合成
B.1.1化学合成
由Dunedin,NZ的Otago大学的微量化学实验室进行燃烧分析。使用电热模型9200测定熔点并读数。在BrukerAvance-400光谱仪上测定1HNMR谱，参照Me4Si。在VarianVG-70SE光谱仪上以额定的5000分辨率记录高分辨质谱。在ThermoFinniganMSQ单四极杆质谱仪上记录质谱。使用APCI源进行质量检测，同时使用阳离子和阴离子采集。除非另外说明，化合物通过硅胶60基质的快速柱色谱(Scharlau,230-400目ASTM)纯化，使用所说明的洗脱液。
B.1.1.14-苯胺基吡啶并[3,4-d]嘧啶激酶抑制剂的合成(方案7)
B.1.1.1.1(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(161)
将6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶-4(3H)-酮(93)(4.0g,24.2mmol)、亚硫酰氯(100mL)和催化量的DMF(3滴)的非均质混合物回流搅拌1小时。所得溶液在45℃(水浴温度)减压蒸发获得淡棕色的固体。向该固体中加入3-溴-4-氟苯胺(5.1g,26.8mmol)和无水DMA(25mL)的混合物。反应混合物在室温下搅拌40分钟，随后加入5％碳酸氢钠溶液(250mL)，混合物在室温下搅拌15分钟。过滤收集沉淀的固体，用水和己烷连续洗涤数次，在硅胶上真空干燥获得N-(3-溴-4-氟苯基)-6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-胺(162)(8.13g,99％),熔点275-277℃(文献熔点269-270℃；Smaill等人，JMedChem,1999,42,1803-1815)；1HNMRδ[(CD3)2SO]10.12(s,1H),8.97(s,1H),8.74(s,1H),8.32(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),8.23(解析困难d,J＝0.8Hz,1H),7.93-7.87(m,1H),7.46(t,J＝8.8Hz,1H)。C13H7BrF2N4分析计算值:C,46.32；H,2.09；N,16.62％。实测值：C,46.54；H,3.33；N,16.42％。
在氮气气氛下，在75℃(水浴温度)下搅拌化合物162(13.9g,41.3mmol)和4-甲氧基苄胺(54.3mL,413mmol)的无水DMSO溶液(100mL)95小时。随后冷却溶液，加入石油醚(500mL)。室温下搅拌15分钟后，分层，倒出石油醚层。该过程重复2次，随后向所得DMSO层加入水(500mL)，混合物在室温下搅拌1小时，沉淀黄/橙色固体，其通过过滤收集，用水洗涤(5x100mL)，真空干燥后用石油醚洗涤(2x100mL)。微黄的橙色固体随后与热丙酮(1L)搅拌约3小时，加入水(1L)以沉淀所需的产物。过滤收集固体，用丙酮/水(1:1,5x80mL)洗涤，在硅胶上真空干燥获得纯的黄/橙色固体状的N4-(3-溴-4-氟苯基)-N6-(4-甲氧基苄基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(165)(14.8g,79％)，熔点181-184℃；1HNMRδ[(CD3)2SO]9.69(s,1H),8.75(s,1H),8.37(s,1H),8.26(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.91-7.83(m,1H),7.42(t,J＝8.8Hz,1H),7.33(brd,J＝8.6Hz,2H),7.27(t,J＝6.3Hz,1H),7.16(s,1H),6.91-6.85(m,2H),4.49(d,J＝6.3Hz,2H),3.71(s,3H)。C21H17BrFN5O分析计算值:C,55.52；H,3.77；N,15.42％.实测值：C,55.75；H,3.88；N,15.44％。
向搅拌的化合物165(15.9g,34.9mmol)在三氟乙酸中的均质溶液(80mL)中加入苯甲醚(7.58mL,69.8mmol)。混合物在室温下搅拌20小时。35℃(水浴温度)下减压除去大部分三氟乙酸。所得红棕色油用石油醚(400mL)在室温下搅拌约10分钟。倒出石油醚层，用更多的石油醚重复该过程(2x300mL)。残余物随后用5MNH3在0℃搅拌5分钟，随后在室温下搅拌45分钟。由此获得的固体通过过滤收集，用水洗涤(3x60mL)，真空干燥。随后用热丙酮(500mL)搅拌固体30分钟。加入水(800mL)，混悬液在室温下搅拌1小时。再次过滤收集固体，用水(6x70mL)、石油醚/乙酸乙酯(3:1,4x100mL)连续洗涤，减压干燥获得N4-(3-溴-4-氟苯基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(159)(11.5g,99％),熔点269-271℃(文献熔点268-270℃)。1HNMR与报道值一致(Smaill等人，JMedChem,1999,42,1803-1815)。
在氮气气氛下，在0℃(水浴温度)下向(E)-4-溴丁-2-烯酸甲酯(53.7g,300mmol)在THF中搅拌的均质溶液(100mL)中滴加一水合氢氧化锂(16.4g,390mmol)的水溶液(80mL)(在35分钟内)。加入后混合物在0℃搅拌3小时。加入冷水(300mL)和石油醚(400mL)，将混合物在0℃搅拌10分钟。分离橙色层并弃去。随后加入乙酸乙酯/石油醚(1:10,300mL)，将混合物再次在0℃搅拌10分钟，随后分离橙色层并弃去。水溶液在0℃用浓硫酸酸化至pH<1。用二氯甲烷(400mL；200mL)萃取产物，干燥合并的有机相萃取物(MgSO4)，在35℃(水浴温度)减压蒸发获得黄色油。所述油在50℃(水浴温度)用石油醚(2x500mL)搅拌。在20-25℃(水浴)减压浓缩合并的石油醚萃取物，诱导产物沉淀。混悬液在5℃放置过夜，随后通过过滤收集固体，用冷石油醚洗涤，干燥获得(E)-4-溴丁-2-烯酸(9)(19.9g,40％)。
方法A:使用酰氯的酰胺偶联
向酸159(496mg,3.00mmol)在无水二氯甲烷中的溶液(6mL)中加入草酰氯(508mg,4.00mmol)，将混合物在室温下搅拌40分钟。随后在室温下减压蒸发溶液获得油，将其溶于无水THF(5mL)，在0℃下加入到化合物8a(668mg,2.00mmol)、三乙胺(0.84mL,6.00mmol)和THF(15mL)的搅拌混合物中。1小时后加入另一批来自草酰氯(508mg,4.00mmol)和酸9(496mg,3.00mmol)的酰氯，继续在0℃搅拌30分钟。加入40％NHMe2(15.2mL,12.0mmol)和DMA(10mL)的混合物，将反应混合物在0℃至室温搅拌19小时。在25℃减压蒸发挥发物，获得棕色油，随后与1％的碳酸钠溶液(100mL)在0℃搅拌30分钟。过滤收集由此形成的固体，用水洗涤数次，干燥。该物质在硅胶柱色谱上用二氯甲烷至二氯甲烷/MeOH(15:1)洗脱获得黄/橙色固体状的(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(161)(400mg,45％)，熔点163-166℃；1HNMRδ[(CD3)2SO]10.96(s,1H),10.33(s,1H),9.02(brs,1H),8.99(brs,1H),8.63(s,1H),8.24(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.92-7.84(m,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),6.87(dt,J＝15.5,6.0Hz,1H),6.52(brd,J＝15.5Hz,1H),3.09(dd,J＝6.0,1.2Hz,2H),2.19(s,6H)。C19H18BrFN6O.MeOH分析计算值:C,50.33；H,4.65；N,17.61％。实测值：C,50.38；H,4.31；N,17.86％。
方法B:使用DCC偶联酰胺
0℃下在氮气气氛中向DCC(7.23g,35.1mmol)在无水THF中的搅拌溶液(10mL)中加入酸9(5.79g,35.1mmol)在无水THF中的溶液(25mL)。反应混合物搅拌45分钟后，加入苯胺159(2.34g,7.01mmol)在无水DMA中的混悬液(18mL)。随后加入二异丙基乙胺(DIPEA)(6.11mL,35.1mmol)，将最终反应混合物在0℃搅拌45分钟后加入40％二甲胺水溶液(10.6mL,84.0mmol)。20分钟后加入冰水(100mL)，随后加入冷的2％碳酸钠水溶液(400mL)。产物用乙酸乙酯萃取(600mL)，连续用水(300mL)、冷的2％碳酸钠水溶液(300mL)和水(300mL)洗涤。干燥该乙酸乙酯溶液(Na2SO4)，减压蒸发获得固体，随后通过硅胶柱色谱纯化，用DCM/MeOH(梯度为100:0至15:1)获得(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(161)(2.4g,77％)。
方法C:通过HornerWadswortbEmmons偶联法偶联酰胺
室温下在氮气气氛中向CDI(8.44g,52.0mmol)和无水THF(32mL)的搅拌混合物中加入2-(二乙氧基磷酰基)乙酸(10.2g,52.0mmol)的THF溶液(28mL)。加入后将反应混合物在40℃(水浴)搅拌20分钟(至停止放出气体)。加入化合物159(13.4g,40.0mmol)在无水THF(45mL)和DMA(50mL)中的溶液，反应物继续在40℃搅拌。通过TLC(乙酸乙酯)监测反应，发现在1.5小时后仅完成约70％。因此，通过将CDI(4.22g,26.0mmol)在无水THF(16mL)中的溶液加入到2-(二乙氧基磷酰基)乙酸(5.10g,26.0mmol)的无水THF溶液(7mL)中，制备另一批试剂。将该额外的试剂加入到反应混合物中，随后在40℃继续搅拌2小时，倒入水中(1,000mL)，在室温下用石油醚(1,500mL)搅拌16小时。随后倒出石油醚层。加入更多的石油醚(800mL)，搅拌混合物15分钟。过滤收集固体，用水洗涤(5x200mL)，干燥获得2-(4-(3-溴-4-氟苯基氨基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-2-氧代乙基膦酸二乙基酯(160)(20.1g,98％),熔点214-217℃。1HNMRδ(CDCl3)9.45(s,1H),9.03(s,1H),8.73(s,1H),8.55(s,1H),8.13(dd,J＝6.0,2.6Hz,1H),7.77(s,1H),7.70-7.63(m,1H),7.18(dd,J＝8.7,8.2Hz,1H),4.31-4.18(m,4H),3.15(d,J＝21.0Hz,2H),1.39(t,J＝7.1Hz,6H)。C19H20BrFN5O4P.0.2H2O分析计算值:C,44.24；H,3.99；N,13.58％。实测值：C,44.00；H,4.09；N,13.42％。
室温下在氮气气氛中向2,2-二乙氧基-N,N-二甲基乙胺(15.7g,97.5mmol)和水(16.4mL)的搅拌混合物中加入37％HCl水溶液(16.4mL,195mmol)，加入后将混合物在40℃(水浴)搅拌25小时。随后冷却至0℃(水浴)获得溶液A。室温下在氮气气氛中将KOH(14.0g,250mmol)溶于水(75mL)。随后冷却至0℃(水浴)获得溶液B。室温下在氮气气氛中向化合物160(19.97g,39.0mmol)搅拌的非均匀混合物中加入最小量的DMA(60mL)获得均质溶液。随后加入LiCl(1.65g,39.0mmol)，所得混合物在0℃(水浴)下搅拌15分钟。随后加入冷的溶液B，反应物在0℃搅拌2分钟。加入冷的溶液A，最终混合物在0℃下在氮气气氛中搅拌。反应通过TLC(DCM/MeOH＝10:1)监测。30分钟后加入更多的KOH(5.0g,89mmol)，继续在0℃搅拌反应物1.5小时。随后倒入水中(1,000mL)。加入石油醚(1,000mL)，混合物在室温下搅拌20分钟。倒出石油醚层，加入更多的石油醚(600mL)，混合物再次搅拌15分钟。过滤收集固体，用水洗涤(5x200mL)，硅胶/KOH减压干燥获得(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(161)(16.9g,97％)。
B.1.1.1.2(2E)-4-(二甲基氨基)-N-{4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}-2-丁烯酰胺(170)
将6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶-4(3H)-酮(93)(4.90g,29.68mmol)在SOCl2(250mL)、CH2Cl2(50mL)和DMF(8滴)中的溶液加热回流3小时。随后真空蒸馏除去溶剂，蒸干残余物。所得粗制4-氯-6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶溶于CH2Cl2(50mL)和iPrOH(120mL)，加入4-氟-3-(三氟甲基)苯胺(5.85g,32.66mmol)，使用空气冷凝器在84℃加热回流溶液30分钟。在回流过程中，CH2Cl2被蒸发，粗制产物从剩下的iPrOH中析出，为淡黄色固体。混合物冷却至室温，倒入冰冷的5％Na2CO3水溶液烧杯中，在0℃搅拌15分钟。过滤收集固体，用水和己烷洗涤数次，真空干燥箱中干燥(45℃)过夜获得黄色固体状的6-氟-N-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-胺(163)(9.68g,100％)，熔点247-249℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.25(s,1H),8.99(s,1H),8.75(s,1H),8.34(dd,J＝6.5,2.7Hz,1H),8.26-8.30(m,1H),8.24(s,1H),7.60(t,J＝9.7Hz,1H)。C14H7F5N4分析计算值：C,51.54；H,2.16；N,17.17％；实测值：C,51.37；H,2.30；N,16.93％。
在氮气下在70℃向搅拌的化合物163(14.30g,43.87mmol)的DMSO溶液(90mL)中缓慢加入4-甲氧基苄胺(57.3mL,482.52mmol)。所得溶液在70-75℃搅拌48小时，随后冷却至室温，倒入搅拌的冰水(1L)烧杯中。过滤收集所得固体，用水洗涤，真空干燥箱中干燥(45℃)2小时。粗产物用CH2Cl2研磨获得黄色固体状的N4-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)-N6-(4-甲氧基苄基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(166)(14.40g,74％)，熔点202-204℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ9.83(s,1H),8.77(s,1H),8.38(s,1H),8.27-8.30(m,1H),8.21-8.24(m,1H),7.55(t,J＝9.7Hz,1H),7.28-7.34(m,3H),7.17(s,1H),6.86-6.90(m,2H),4.50(d,J＝6.3Hz,2H),3.71(s,3H)。C22H17F4N5O分析计算值:C,59.59；H,3.86；N,15.79％；实测值：C,59.31；H,4.07；N,15.46％。
室温下用苯甲醚(490μL,4.51mmol)处理化合物166(1.0g,2.26mmol)的TFA溶液(20mL)。将混合物搅拌过夜，随后用乙酸乙酯稀释，减压除去溶剂，残余物用己烷研磨，随后用氨水(5N,100mL)处理，搅拌30分钟。过滤收集所得固体，用水洗涤，真空干燥获得黄色固体状的N4-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(168)(720mg,99％)，熔点252-255℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ9.90(s,1H),8.72(s,1H),8.38(s,1H),8.34(dd,J＝6.5,2.6Hz,1H),8.24-8.28(m,1H),7.54(t,J＝9.7Hz,1H),7.14(s,1H),6.30(s,2H)。C14H9F4N5.0.55EtOAc分析计算值:C,52.35；H,3.63；N,18.84％；实测值：C,51.96；H,3.70；N,18.46％.
在0℃下，在氮气中用酸9(506mg,3.07mmol)在无水THF(2mL)中的溶液处理DCC(633mg,3.07mmol)在THF(2mL)中的搅拌溶液。混合物搅拌2小时，随后用化合物168(200mg,0.62mmol)在DMA(2mL)中的溶液处理，随后用二异丙基乙胺(DIPEA)(535μL,3.07mmol)处理，继续在0℃搅拌3小时。由此形成粗制(E)-4-溴-N-(4-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基氨基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基)丁-2-烯酰胺，在0℃用40％的二甲胺(942μL,18.60mmol)水溶液搅拌处理1小时。混合物用乙酸乙酯稀释(300mL)，随后倒入冰水烧杯(600mL)中，搅拌10分钟，随后用EtOAc萃取。合并的有机萃取物用2％的冷Na2CO3水溶液、水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，使用EtOAc/MeOH(9:1)洗脱。从CH2Cl2/二异丙基醚重结晶获得淡黄色固体状的(2E)-4-(二甲基氨基)-N-{4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}-2-丁烯酰胺(170)(175mg,65％)，170-172℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ10.93(s,1H),10.42(s,1H),9.04(s,1H),9.01(s,1H),8.64(s,1H),8.24-8.28(m,2H),7.56(t,J＝9.6Hz,1H),6.88(dt,J＝15.4,6.0Hz,1H),6.53(d,J＝15.4Hz,1H),3.10(dd,J＝6.0,1.1Hz,2H),2.19(s,6H)。C20H18F4N6O.0.4CH2Cl2分析计算值：C,52.32；H,4.05；N,17.94％；实测值：C,51.99；H,4.28；N,18.07％。
B.1.1.1.3(2E)-4-(二甲基氨基)-N-[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-丁烯酰胺(171)
将6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶-4(3H)-酮(93)(6.64g,40.2mmol)、亚硫酰氯(150mL)和催化量的DMF(5滴)的混悬液回流搅拌30分钟，获得均质混合物，45℃(水浴温度)减压蒸发获得淡棕色的固体。向该固体中加入3-乙炔基苯胺(6.56g,44.2mmol)和无水DMA的混合物(40mL)。反应混合物随后在室温搅拌40分钟，随后加入5％碳酸氢钠溶液(500mL)，将所得混合物在室温下搅拌15分钟。过滤收集固体，用水和己烷分别洗涤数次。随后在硅胶上真空干燥固体获得N-(3-乙炔基苯基)-6-氟吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-胺(164)(10.5g,99％),熔点225-227℃；1HNMRδ[(CD3)2SO]10.06(s,1H),8.96(s,1H),8.74(s,1H),8.28(解析困难d,J＝0.6Hz,1H),8.10(t,J＝1.7Hz,1H),7.95-7.90(m,1H),7.46(t,J＝7.9Hz,1H),7.32-7.27(m,1H),4.22(s,1H)。C15H9BrFN4分析计算值:C,68.18；H,3.43；N,21.20％。实测值：C,67.80；H,3.50；N,20.81％。
将化合物164(8.90g,33.7mmol)和4-甲氧基苄基胺(44.2mL,337mmol)在无水DMSO(80mL)中的混合物在氮气下在70℃(水浴温度)下搅拌158小时。所得溶液快速冷却，随后用石油醚(2x400mL)在室温下搅拌15分钟，随后倒出石油醚。向DMSO层加入水(400mL)，将混合物在室温下搅拌3小时。过滤收集析出的固体，用水洗涤(5x100mL)后吸干，随后用石油醚洗涤(2x100mL)，再次吸干。所得棕橙色固体溶于热丙酮(400mL)中，加入水(500mL)，随后将混合物在室温下搅拌1小时，过滤收集所得固体，用丙酮/水(1:1,5x80mL)洗涤，真空硅胶干燥获得黄/橙色固体状的N4-(3-乙炔基苯基)-N6-(4-甲氧基苄基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(167)(10.3g,80％)，熔点200-203℃；1HNMRδ[(CD3)2SO]9.63(s,1H),8.75(s,1H),8.38(s,1H),8.03(brs,1H),7.94-7.88(m,1H),7.41(t,J＝7.9Hz,1H),7.34(brd,J＝8.6Hz,2H),7.28-7.21(m,2H),7.19(s,1H),6.92-6.85(m,2H),4.50(d,J＝6.3Hz,2H),4.19(s,1H),3.71(s,3H)。C23H19N5O分析计算值:C,72.42；H,5.02；N,18.36％。实测值：C,72.28；H,5.05；N,18.22％。
向搅拌的化合物167(12.3g,32.3mmol)在无水DCM(325mL)中的均质溶液中加入三氟乙酸(24.5mL,323mmol)，随后加入苯甲醚(7.11mL,64.6mmol)。将所得混合物在室温下搅拌70小时，随后倒入石油醚(1L)，在室温下搅拌约30分钟。倒出石油醚层并弃去。使用更多的石油醚(800mL)重复该过程。将剩余的残余物溶于丙酮/水(1:1,200mL)，室温下用5MNH3(500mL)搅拌1小时。过滤收集所述固体，用丙酮/水(1:4,5x100mL)和石油醚/乙酸乙酯(3:1,5x100mL)连续洗涤，真空干燥获得N4-(3-乙炔基苯基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(169)(8.56g,98％)，熔点220-225℃(分解)；1HNMRδ[(CD3)2SO]9.69(s,1H),8.70(s,1H),8.38(s,1H),8.08(t,J＝1.7Hz,1H),7.95-7.89(m,1H),7.40(t,J＝7.9Hz,1H),7.34(brd,J＝7.7Hz,1H),7.16(s,1H),6.25(s,2H),4.17(s,1H)。C15H11N5.2H2O.0.2CH3COCH3分析计算值:C,60.65；H,5.29；N,22.67％.实测值：C,60.54；H,5.01；N,22.56％。
0℃下在氮气中向DCC(7.23g,35.1mmol)在无水THF中的溶液(25ml)中加入固体酸9(5.79g,35.1mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌35分钟，加入固体苯胺169(1.83g,7.01mmol)，随后加入无水DMA(20mL)和二异丙基乙胺(DIPEA)(6.11ml,35.1mmol)。将最终反应混合物在0℃搅拌45分钟，随后冷却至-15至-20℃(浴)。随后加入40％二甲胺水溶液(10.6mL,84.0mmol)，25分钟后将反应混合物倒入冷的2％碳酸钠水溶液(200mL)中，产物用乙酸乙酯(600mL)萃取，随后用水(300mL)、冷的2％碳酸钠水溶液(300mL)和水(300mL)连续洗涤。干燥乙酸乙酯溶液(Na2SO4)，减压蒸发获得固体，通过硅胶柱色谱纯化，使用DCM/MeOH(梯度为100:0至15:1)洗脱获得黄/橙色固体状的(2E)-4-(二甲基氨基)-N-[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-丁烯酰胺(171)(1.33g,51％)，熔点163-166℃；1HNMRδ[(CD3)2SO]10.89(s,1H),10.25(s,1H),9.02(s,1H),9.00(s,1H),8.63(s,1H),8.02(brs,1H),7.94-7.87(m,1H),7.42(t,J＝7.9Hz,1H),7.26(brd,J＝7.7Hz,1H),6.88(dt,J＝15.4,6.0Hz,1H),6.52(brd,J＝15.4Hz,1H),4.19(s,1H),3.09(dd,J＝6.0,1.2Hz,2H),2.19(s,6H)。C21H20N6O.0.2H2O分析计算值:C,67.08；H,5.47；N,22.35％。实测值：C,66.88；H,5.47；N,22.22％。
B.1.1.2还原型触发剂α-甲基溴化物的合成
B.1.1.2.15-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(方案8，途径3)
0℃下向化合物101(20.0g,157.36mmol)(根据Chauviére等的方法制备，J.Med.Chem.2003,46,427-440)和K2CO3(32.62g,236.04mmol)在DMF中的混悬液(200mL)中滴加入碘甲烷(14.70mL,236.04mmol)。所得混合物加热至室温，搅拌2小时，在室温下蒸发过量的碘甲烷。过滤除去沉淀，在45-50℃减压浓缩DMF滤液。使用MeCN/DCM(1:9)彻底萃取获得的残余物，合并的萃取物通过短的硅胶柱过滤。去除溶剂后粗产物从MeCN和甲苯中重结晶获得灰白色晶状固体的化合物111(15.74g,71％),熔点161-163℃。1HNMR(CDCl3)δ7.33(s,1H),3.65(s,3H),2.63(s,3H)。与之前报道的一致(Hosmane等人，J.Org.Chem.,1985,50(26),5892-5)。
将化合物111(4.00g,28.34mmol)和NBS(5.30g,29.78mmol)在MeCN中的溶液(200mL)用1000w的卤化钨灯辐照回流2小时。真空除去约一半的溶剂后加入水(100mL)。继续减压浓缩获得白色沉淀，其通过过滤收集，用水洗涤，真空干燥获得白色固体状的5-(溴甲基)-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(105)(4.69g,75％)。1HNMR(CDCl3)δ7.44(s,1H),4.89(s,2H),3.78(s,3H)。与之前报道的一致(Stribbling等人，PCT国际专利公开号WO2008/039087)。
B.1.1.2.25-(溴甲基)-1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑(122)(方案10)
0℃下向化合物118(50.0g,393.39mmol)和K2CO3(81.55g,590.08mmol)在DMF中的混悬液(300mL)中滴加碘甲烷(36.74mL,590.08mmol)。所得混合物温热至室温，搅拌2小时后在室温下蒸发除去过量的碘甲烷。过滤除去沉淀，45-50℃减压浓缩DMF滤液。使用MeCN/DCM(1:9)彻底萃取获得的残余物，通过短的硅胶柱过滤。去除溶剂后粗产物从MeCN(含有少量的MeOH)和甲苯中重结晶获得白色晶状固体的化合物119(52.22g,94.0％),1HNMR(CDCl3)δ7.66(s,1H),3.67(s,3H),2.43(s,3H)。LR-MS(APCI+ve):m/e142.5(M+1)。与之前报道的一致(Rav-Acha和Cohen,J.Org.Chem.1981,46(23),4717-4720)。
在-35到-25℃(干冰/MeCN浴)下将化合物119(33.0g,233.83mmol)和二氯乙酸叔丁基酯(64.90g,350.74mmol)(在DCM中从二氯乙酰氯、叔丁醇和三乙胺制备)的DMF溶液(400mL)滴加到叔丁醇钾(91.83g,818.40mmol)的DMF混悬液中(400mL)。将所得混合物在-25℃下再搅拌20分钟，随后倒入0.5NHCl中(约1000mL)。用标准的乙酸乙酯/水溶液处理，用乙酸乙酯/己烷(3:2)在硅胶柱色谱上洗脱，获得黑色固体状的粗制化合物120(23.83g,35％)，其不需进一步纯化即使用。LR-MS(APCI+ve)m/e290.5/292.5(3:1,M+1)。
如前制备的化合物120(23.83g,82.25mmol)用回流的乙酸(120mL)处理45分钟，随后在减压条件下蒸干。用标准的NaHCO3/DCM处理残余物，随后用乙酸乙酯在硅胶柱色谱上洗脱，获得白色固体状的化合物121(10.00g,64％)。1HNMR(CDCl3)δ5.03(s,2H),3.67(s,3H),2.46(s,3H)。LR-MS(APCI+ve):m/e190.4/192.4(3:1,M+1)。
将化合物121(10.00g,52.74mmol)和LiBr(4.80g,55.20mmol)在乙酸乙酯中的混悬液(500mL)加热回流4小时，随后进行标准的乙酸乙酯/水处理。获得的固体再次用上述LiBr/乙酸乙酯处理。通过加入己烷，从DCM/i-Pr2O沉淀粗产物获得灰白色固体状的5-(溴甲基)-1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑(122)(11.46g,93％)。1HNMR(CDCl3)δ4.88(s,2H),3.64(s,3H),2.46(s,3H)。C5H6BrN3O2.4％己烷的分析计算值:C,28.16；H,2.96；N,18.80％。实测值：C,27.81；H,3.27；N,19.05％。LR-MS(APCI+ve):m/e234.4/236.4(1:1,M+1)。
1.1.2.35-(溴甲基)-2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(125)(方案11)
向化合物111(12.65g,90.00mmol)在氯仿中的混悬液(100mL)中缓慢加入溴(5.53mL,108.00mmol)。所得混合物搅拌2小时后加入水(130mL)。蒸馏除去氯仿，过滤收集所得沉淀，用水洗涤，真空干燥获得白色固体状的化合物123(15.50g,79％)，熔点180-181℃，与之前报道的数值一致(Pyman和Timmis,J.Chem.Soc.,Trans.,1923,123,494-503)。1HNMR(CDCl3)δ3.63(s,3H),2.69(s,3H)。C5H6BrN3O2分析计算值:C,27.29；H,2.75；N,19.10％。实测值：C,27.56；H,2.83；N,19.10％.LR-MS(APCI+ve):m/e220.3/222.3(1:1,M+1)。
用过量的NaOMe(1.72g,31.78mmol)处理化合物123(1.00g,4.54mmol)在回流的MeOH中的溶液(40mL)3小时。减压除去溶剂，将所得残余物混悬于MeOH/DCM(1:9)，通过短硅胶柱过滤。随后真空除去溶剂获得灰白色固体状的化合物124(442mg,57％)，熔点103-105℃。1HNMR(CDCl3)δ4.11(s,3H),3.40(s,3H),2.59(s,3H)。C6H9N3O3分析计算值：C,42.10；H,5.30；N,24.55％。实测值：C,42.20；H,5.37；N,24.61％.LR-MS(APCI+ve):m/e172.5(M+1)。
将化合物124(750mg,4.38mmol)和NBS(858mg,4.82mmol)在MeCN中的溶液(30mL)用1000w的卤化钨灯辐照回流2小时。真空除去溶剂后，残余物在硅胶柱色谱上使用乙酸乙酯/己烷(梯度从1:2到2:1)洗脱获得白色固体状的5-(溴甲基)-2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑(125)(200mg,18％)。1HNMR(CDCl3)δ4.85(s,2H),4.14(s,3H),3.51(s,3H)。LR-MS(APCI+ve):m/e250.4/252.4(1:1,M+1)。
B.1.1.2.43-[5-(溴甲基)-4-硝基-1H-咪唑-1-基]丙腈(115)(方案9，途径2)
将化合物101(1.00g,7.87mmol)、丙烯腈(1.56mL,23.60mmol)和MTBD(48mg,0.31mmol)在MeCN(10mL)中的混合物加热回流过夜(16小时)。过滤混合物除去某些沉淀，向滤液中加入甲苯(10mL)。减压浓缩部分所得溶液除去乙腈，获得白色沉淀，其通过过滤收集获得灰白色固体状的化合物117(1.26g,89％)。1HNMR(d6-DMSO)δ7.84(s,1H),4.37(t,J＝6.6Hz,2H),3.08(t,J＝6.6Hz,2H),2.61(s,3H)。LR-MS(APCI+ve):m/e181.4(M+1)。
将化合物117(540mg,3.00mmol)和NBS(560mg,3.15mmol)在MeCN中的溶液(20mL)用1000w的卤化钨灯辐照回流1小时。真空除去约一半的溶剂后加入水(10mL)，继续减压浓缩获得白色沉淀，其通过过滤收集，用水洗涤，真空干燥获得灰白色固体状的3-[5-(溴甲基)-4-硝基-1H-咪唑-1-基]丙腈(115)(689mg,89％)。1HNMR(d6-DMSO)δ8.04(s,1H),5.08(s,2H),4.48(t,J＝6.8Hz,2H),3.17(t,J＝6.8Hz,2H)。LR-MS(APCI+ve):m/e259.4/261.4(1:1,M+1)。
B.1.1.2.63-[5-(溴甲基)-4-硝基-1H-咪唑-1-基]丙酰胺(116)(方案9,途径2)
将3-[5-(溴甲基)-4-硝基-1H-咪唑-1-基]丙腈(115)(680mg,2.62mmol)用90％的硫酸(5mL)在65-70℃处理1小时后倒在冰上。使用标准的乙酸乙酯/NaHCO3处理后，所得粗产物在THF中通过添加i-Pr2O沉淀，获得灰白色固体状的3-[5-(溴甲基)-4-硝基-1H-咪唑-1-基]丙酰胺(116)(420mg,58％)，熔点139-141℃。1HNMR(d6-DMSO)δ7.90(s,1H),7.44(br,1H),7.00(br,1H),5.06(s,2H),4.32(t,J＝6.8Hz,2H),2.70(t,J＝6.8Hz,2H)。LR-MS(APCI+ve):m/e277.5/279.5(1:1,M+1)。
B.1.1.3季铵盐还原性前药的合成(方案16-19)
方法D:在NMP中制备季铵盐前药后通过Et2O沉淀
在氮气下向二甲胺效应物在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的溶液中分批加入α-甲基溴化物触发剂(0.7-1.0当量)。将所得混合物搅拌12小时至数天，随后加入***。过滤收集由此形成的沉淀，用DCM充分洗涤。粗产物通过分级沉淀法从含有数滴三乙胺的乙腈和二烷的混合物中进一步纯化(根据需要进行1-3次)。离心收集沉淀的产物，随后倒出母液。产物随后用THF/DCM(1:1)和己烷先后洗涤，真空干燥获得白色或灰白色固体状的前药。
方法E:在NMP中制备季铵盐前药后通过MeCN沉淀.
向二甲胺效应物在NMP中的溶液中加入α-甲基溴化物触发剂(1.0-1.2当量)。将所得混合物搅拌过夜(～15小时)。向所述反应混合物中搅拌滴加MeCN，直到开始产生沉淀。所得混合物继续搅拌2小时，通过离心或过滤收集沉淀，用MeCN、乙酸乙酯和己烷洗涤。真空干燥获得白色或灰白色固体状的前药。如果需要，所述产物可从NMP和MeCN中重结晶进一步纯化。
B.1.1.3.1(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(42)
根据方法C，将化合物161(500mg,1.12mmol)与α-甲基溴化物105(225mg,1.02mmol)在NMP(3mL)中反应16小时获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(42)(658mg,97％),熔点166-170℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.31(s,1H),10.35(s,1H),9.07(s,1H),9.00(s,1H),8.66(s,1H),8.25-8.23(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),8.14(s,1H),7.90-7.86(m,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.06-6.99(m,1H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.06(brs,2H),4.45(d,J＝7.2Hz,2H),3.88(s,3H),3.13(s,6H)。C24H24Br2FN9O3·1.2H2O分析计算值:C,41.96；H,3.87；N,18.35％。实测值：C,42.05；H,3.77；N,18.14％。
根据方法D，将化合物161(2.0g,4.49mmol)与α-甲基溴化物105(1186mg,5.39mmol)在NMP(5mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(42)(2.11g,70％)。1HNMR与前述相同。
B.1.1.3.2(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(43)
根据方法D，将化合物161(700mg,1.57mmol)与α-甲基溴化物IIa-2(442mg,1.87mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(43)(750mg,70％),熔点181-184℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.30(s,1H),10.36(s,1H),9.07(s,1H),9.00(s,1H),8.66(s,1H),8.25-8.23(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.90-7.86(m,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.07-6.99(m,1H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.07(brs,2H),4.44(d,J＝7.0Hz,2H),3.76(s,3H),3.11(s,6H),2.44(s,3H)。C25H26Br2FN9O3·0.1己烷·1.2H2O分析计算值:C,43.33；H,4.23；N,17.76％。实测值：C,43.21；H,4.46；N,17.77％。
B.1.1.3.3(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(172)
根据方法D，将化合物161(700mg,1.57mmol)与α-甲基溴化物201(468mg,1.89mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(172)(930mg,85％)，熔点173-176℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.30(s,1H),10.35(s,1H),9.06(s,1H),9.00(s,1H),8.65(s,1H),8.25-8.23(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.90-7.86(m,1H),7.43(t,J＝8.8Hz,1H),7.06-6.99(m,1H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.07(brs,2H),4.44(d,J＝7.2Hz,2H),3.76(s,3H),3.11(s,6H),2.79(q,J＝7.4Hz,2H),1.29(t,J＝7.4Hz,3H)。C26H28Br2FN9O3·0.05己烷·2H2O分析计算值:C,43.05,H,4.49,N,17.18％。实测值：C,43.17；H,4.75；N,17.36％。
B.1.1.3.4(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(44)
根据方法C，将化合物161(481mg,1.08mmol)与α-甲基溴化物125(270mg,1.08mmol)在NMP(3mL)中反应15小时获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(44)(530mg,71％),熔点245℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.29(s,1H),10.35(s,1H),9.06(s,1H),9.00(s,1H),8.65(s,1H),8.25-8.22(m,1H),7.90-7.86(m,1H),7.43(t,J＝8.8Hz,1H),7.06-6.99(m,1H),6.79(d,J＝15.3Hz,1H),5.07(br,2H),4.42(d,J＝7.2Hz,2H),4.09(s,3H),3.57(s,3H),3.12(s,6H)。C25H26Br2FN9O4·0.2己烷·1.5H2O分析计算值:C,42.55；H,4.33；N,17.04％。实测值：C,42.47；H,4.14；N,16.89％。
B.1.1.3.5(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(49)
根据方法C，将化合物161(700mg,1.57mmol)与α-甲基溴化物115(411mg,1.59mmol)在NMP(2mL)中反应15小时获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(49)(897mg,81％),熔点132℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.31(s,1H),10.35(s,1H),9.07(s,1H),9.00(s,1H),8.66(s,1H),8.32(s,1H),8.25-8.22(dd,J＝6.4,2.8Hz,1H),7.90-7.86(m,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.04-6.97(m,1H),6.79(d,J＝15.2Hz,1H),5.08(br,2H),4.61(t,J＝6.8Hz,2H),4.43(d,J＝6.8Hz,2H),3.20(t,J＝6.8Hz,2H),3.11(s,6H)。C26H25Br2FN10O3·0.8THF·H2O分析计算值:C,44.96；H,4.32；N,17.96％。实测值：C,44.80；H,4.48；N,17.84％。
B.1.1.3.6(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(47)
根据方法C，将化合物161(400mg,0.90mmol)与α-甲基溴化物116(249mg,0.90mmol)在NMP(2mL)中反应15小时获得(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(47)(306mg,47％),熔点168℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.31(s,1H),10.36(s,1H),9.07(s,1H),9.00(s,1H),8.66(s,1H),8.25-8.23(m,2H),7.90-7.86(m,1H),7.46-7.42(m,2H),7.05-6.98(m,2H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.12(brs,2H),4.47-4.41(m,4H),3.12(s,6H),2.76(t,J＝6.2Hz,2H)。C26H27Br2FN10O4·0.3THF·1.5H2O分析计算值:C,42.37；H,4.24；N,18.17％。实测值：C,42.40；H,4.20；N,18.17％。
B1.1.3.7(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(1-丙炔基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(173)
根据方法E，将化合物161(100mg,0.22mmol)与α-甲基溴化物200(64mg,0.25mmol)在NMP(0.5mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(1-丙炔基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(173)(94mg,60％),熔点185-188℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.30(s,1H),10.35(s,1H),9.07(s,1H),9.00(s,1H),8.66(s,1H),8.25-8.22(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.90-7.86(m,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.05-6.98(m,1H),6.79(d,J＝15.3Hz,1H),5.05(br,2H),4.43(d,J＝6.9Hz,2H),3.86(s,3H),3.13(s,6H),2.22(s,3H)。分析实测值：C,44.59；H,3.92；N,16.97％.C27H26Br2FN9O3·1.5H2O计算值：C,44.40；H,4.00；N,17.26％。
B1.1.3.8(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(48)
根据方法E，将化合物161(100mg,0.22mmol)与α-甲基溴化物127(63mg,0.26mmol)在NMP(0.5mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(48)(132mg,85％)，其进一步使用制备HPLC纯化，用CH3CN/H2O/TFA洗脱获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(48TF)(112mg,69％),熔点151-154℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.32(s,1H),10.39(s,1H),9.06(s,1H),9.01(s,1H),8.66(s,1H),8.22(s,1H),7.86(s,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.07-7.00(m,1H),6.79(d,J＝15.2Hz,1H),5.15(br,2H),4.44(d,J＝7.2Hz,2H),4.06(s,3H),3.15(s,6H)。
B1.1.3.9(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(174)
根据方法E，将化合物161(100mg,0.22mmol)与5-(溴甲基)-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑(IIIq-1)(54mg,0.25mmol)(Everett等人，BioorgMedChemLett,1999,9,1267-1272)在NMP(0.5mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(174)(131mg,88％),熔点197℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.29(s,1H),10.36(s,1H),9.07(s,1H),8.99(s,1H),8.66(s,1H),8.24-8.22(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.89-7.85(m,1H),7.56(s,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.03-6.96(m,1H),6.77(d,J＝15.2Hz,1H),4.87(s,2H),4.29(d,J＝7.2Hz,2H),4.02(s,3H),3.09(s,6H)。分析实测值：C,41.72；H,3.82；N,18.18％.C24H24Br2FN9O3·1.5H2O计算值：C,41.64；H,3.93；N,18.21％。
B1.1.3.10(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(4-乙基-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(175)
根据方法E，将化合物161(200mg,0.45mmol)与5-(溴甲基)-4-乙基-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑(IIIq-2)(123mg,0.49mmol)(Jiao等人，WO2008151253A1)在NMP(1mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(4-乙基-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(175)(198mg,84％),熔点181-184℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.29(s,1H),10.36(s,1H),9.07(s,1H),9.00(s,1H),8.66(s,1H),8.24-8.22(dd,J＝6.4,2.6Hz,1H),7.89-7.85(m,1H),7.44(t,J＝8.8Hz,1H),7.03-6.96(m,1H),6.76(d,J＝15.2Hz,1H),4.86(s,2H),4.33(d,J＝7.2Hz,2H),3.99(s,3H),3.06(s,6H),2.75-2.70(q,J＝6.6Hz,2H),1.23(t,J＝6.6Hz,3H)。分析实测值：C,43.25；H,4.21；N,17.37％.C26H28Br2FN9O3·1.6H2O计算值：C,43.24；H,4.36；N,17.46％。
B.1.1.3.11(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(50)
根据方法D，将化合物170(700mg,1.61mmol)与α-甲基溴化物105(425mg,1.93mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(50)(895mg,85％),熔点176-180℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.32(s,1H),10.48(s,1H),9.08(s,1H),9.02(s,1H),8.67(s,1H),8.28-8.23(m,2H),8.14(s,1H),7.58(t,J＝9.7Hz,1H),7.06-6.99(m,1H),6.81(d,J＝15.3Hz,1H),5.06(brs,2H),4.45(d,J＝7.3Hz,2H),3.88(s,3H),3.13(s,6H)。C25H24BrF4N9O3·0.5(EtOAc)·H2O分析计算值:C,45.26；H,4.22；N,17.59％。实测值：C,45.22；H,4.43；N,17.57％。
B.1.1.3.12(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(51)
根据方法D，将化合物170(700mg,1.61mmol)与α-甲基溴化物122(453mg,1.93mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(51)(909mg,84％),熔点174℃(分解)。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.32(s,1H),10.47(s,1H),9.08(s,1H),9.02(s,1H),8.67(s,1H),8.27-8.23(m,2H),7.57(t,J＝9.7Hz,1H),7.07-6.99(m,1H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.05(brs,2H),4.43(d,J＝6.9Hz,2H),3.75(s,3H),3.11(s,6H),2.44(s,3H)。C26H26BrF4N9O3·1.5H2O分析计算值:C,44.90；H,4.20；N,18.13％。实测值：C,44.95；H,4.42；N,17.98％。
B.1.1.3.13(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(58)
根据方法D，将化合物171(580mg,1.56mmol)与α-甲基溴化物105(411mg,1.86mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(58)(730mg,79％),熔点179-182℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.29(s,1H),10.30(s,1H),9.06(s,1H),9.02(s,1H),8.66(s,1H),8.14(s,1H),8.02(t,J＝1.6Hz,1H),7.90-7.88(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H),7.43(t,J＝8.0Hz,1H),7.27(d,J＝7.4Hz,1H),7.07-6.99(m,1H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.06(brs,2H),4.45(d,J＝7.2Hz,2H),4.20(s,1H),3.88(s,3H),3.13(s,6H)。C26H26BrN9O3·1.3H2O分析计算值:C,50.71；H,4.68；N,20.47％。实测值：C,50.63；H,4.82；N,20.26％。
B.1.1.3.14(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(59)
根据方法D，将化合物171(580mg,1.56mmol)与α-甲基溴化物122(437mg,1.87mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(59)(705mg,75％),熔点177-181℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.28(s,1H),10.31(s,1H),9.06(s,1H),9.02(s,1H),8.66(s,1H),8.02(s,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.43(t,J＝8.0Hz,1H),7.27(d,J＝7.6Hz,1H),7.07-6.99(m,1H),6.80(d,J＝15.3Hz,1H),5.06(brs,2H),4.43(d,J＝7.0Hz,2H),4.20(s,1H),3.75(s,3H),3.11(s,6H),2.44(s,3H)。C27H28BrN9O3·1.3H2O分析计算值:C,51.48；H,4.90；N,20.01％。实测值：C,51.54；H,4.92；N,19.88％。
B.1.1.3.15(2E)-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(176)
根据方法D，将化合物171(475mg,1.28mmol)与α-甲基溴化物201(375mg,1.52mmol)在NMP(3mL)中反应获得(2E)-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(176)(595mg,75％),熔点173-177℃。1HNMR[(CD3)2SO]δ11.29(s,1H),10.30(s,1H),9.06(s,1H),9.02(s,1H),8.66(s,1H),8.02(t,J＝1.7Hz,1H),7.90-7.88(m,1H),7.43(t,J＝8.0Hz,1H),7.27(d,J＝7.7Hz,1H),7.07-6.99(m,1H),6.81(d,J＝15.2Hz,1H),5.06(brs,2H),4.43(d,J＝6.8Hz,2H),4.20(s,1H),3.76(s,3H),3.11(s,6H),2.79(q,J＝7.4Hz,2H),1.29(t,J＝7.4Hz,3H)。C28H30BrN9O3·1.2H2O分析计算值:C,52.37；H,5.09；N,19.63％。实测值：C,52.31；H,4.93；N,19.76％。
B.2.前药的效果
比较了不可逆的erbB1、2、4抑制剂(161,170,171)和其具有可断裂的还原性触发剂IIId-1(化合物105)的季铵盐前药(42,50,58)的效果。进行了一系列的测试以评价前药的失活程度，其在低氧条件下在细胞内的活化，单电子还原后的断裂以及在众多肿瘤异种移植物中的效果。
试验:方法和材料
B.2.1细胞erbB1抑制试验
将在含有5％胎牛血清的α-最低必需培养基(αMEM)中生长的人A431表皮样癌细胞和SKOV3卵巢癌细胞暴露在一定浓度范围的测试药物下1小时，之后制备全细胞裂解物。在300μl修饰的RIPA缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4,1％NP-40,0.25％脱氧胆酸钠,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMNa3VO4,1mMNaF和1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒合剂(Sigma,100x))裂解细胞，在冰上孵育30分钟。使用BCA试验测定样品的蛋白浓度。使用15.625-1000μg/ml的标准白蛋白(Pierce)制备BSA校准曲线。标准品和样品在0.1MNaOH中稀释。将蛋白样品在-20℃冰箱中存储，随后进行蛋白质印迹分析。使用适当的抗体通过蛋白质印迹测定erbB1和erbB2的表达及其磷酸化程度。为检测erbB1/2，按5μg总蛋白/孔和5μlKaleidoscope蛋白标准品(Biorad)加到15孔7.5％PAGE凝胶上。在100V下电泳，直到蓝色前端到达凝胶底部。电泳后将蛋白转移到0.45μm硝酸纤维素膜上(Biorad)，用2％的BSA在0.1％TBS-Tween中的溶液封闭1小时。如所述在TBS-Tween0.1％中稀释抗体。蛋白使用SupersignalWestPico化学发光底物检测(Pierce/ThermoScientific)。检测磷酸化蛋白后，斑点用RestoreWesternBlot脱色缓冲液(Pierce/ThermoScientific)脱色10分钟，洗涤，并用针对总蛋白的抗体孵育。斑点的光密度测定使用ImageJ软件进行。数值使用SigmaPlot10作图。通过BCA测定(如前所述)测定蛋白载量，使用总erbB1/2信号强度进行验证。通过光密度测定法(ImageJ)计算条带强度，由此确定IC50值。
B.2.2细胞生长抑制实验
通过胰蛋白酶消化(1x胰蛋白酶/EDTA,GibcoBrl)从含有5％胎牛血清的α-最低必需培养基(αMEM)收集对数期指数生长的人A431、H1975和SKOV3癌细胞，计数，并以800-1500细胞/孔的细胞密度接种于96孔板(Nunc)中。半数细胞样品接种于已在缺氧环境预平衡和保持的培养板(90％N2,5％H2,5％CO2,37℃；厌氧培养室,CoyLaboratoryProducts,)中。3小时含氧(21％O2)或缺氧(<10ppmO2)条件下贴壁后，细胞暴露在一定范围的前药或效应物浓度下4小时，所述浓度经过适当的稀释。该阶段结束时从缺氧培养箱中回收缺氧平板，在标准CO2培养箱(37℃)中在含氧条件下培养20小时。洗去所有平板的化合物，使细胞在含有5％FBS和抗生素的αMEM中增殖4天。细胞在三氯乙酸中固定(30分钟)，洗涤并用磺基罗丹明B染色(SRB,60min)，之后在酸化的水中洗涤。使SRB溶解，在450nm处读取吸光度，计算细胞密度。相对于未处理的孔计算增殖抑制率。
B.2.3体内效果试验
向无特异性病原体的纯合雌性NIH-III裸鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)皮下接种H1975细胞的单细胞混悬液(5x106细胞/100μL；右胁侧)。建立H1975肿瘤异种移植物后(通常为8-12天)，将小鼠随机分成治疗组。所有的化合物在乳酸盐缓冲液(pH4)中制备。按照预定的日程和剂量水平通过腹腔注射向小鼠给药(0.01-0.03ml/g)。生长延迟试验中将小鼠随机进行治疗，每天在治疗后测定肿瘤体积[π(长度x宽度2)/6]和体重。测定肿瘤增至治疗前体积4倍的中位时间(RTV4)，按治疗组相对于对照的RTV4百分比增加来计算肿瘤生长抑制率(TGI)。使用SigmaStatv3.5通过MannWhitneyU检验测定RTV4的统计学差异。
B.2.4SKOV3异种移植物试验
向无特异性病原体的纯合雌性NIH-III裸鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,MA)皮下接种SKOV3细胞的单细胞混悬液(1x107细胞/100μL；右胁侧)。建立SKOV3异种移植物后(通常为50-65天)，将小鼠随机分成治疗组。化合物42和161在乳酸盐缓冲液(pH4)中制备。按照预定的日程和剂量通过腹腔注射向小鼠给药(0.01-0.03ml/g)。以一定间隔测定肿瘤体积和体重。肿瘤体积按π(长×宽2)/6计算。测定肿瘤增至治疗前体积4倍的时间(RTV4)，按治疗组相对于对照的RTV4中值百分比增加来计算肿瘤生长抑制率(％TGI)。使用SigmaStatv3.5通过MannWhitneyU检验测定RTV4的统计学差异。
B.2.5血浆和组织药代动力学试验
将化合物42配成DMSO/5％葡萄糖(20:80)的溶液，以20μmol/kg的正常低剂量通过静脉注射施用到9只具有H1975肿瘤异种移植物的雌性NIH-III小鼠中。在T＝2,6和24小时异氟烷麻醉下通过尾部放血收集血样(每组n＝3)。在T＝2,6和24小时(每组n＝3)收集H1975肿瘤、皮肤和肝样品，立即冷冻在液氮中，储存在-80℃下，直到制备样品进行药物分析。将小片的(～100mg)组织放置在生物研磨孔(之前在液氮中冷却)中，用不锈钢研棒研磨成细粉。将冷冻的粉末收集到预称重的微量离心管中(放置在干冰上)。加入4份体积的冰冷的乙腈(各含有0.5uMD6-161作为内标)，从粉碎的组织中提取药物。微量离心管在13,000rpm离心10分钟，沉淀细胞碎片和蛋白质。向10μl血浆(收集在EDTA中)中加入40μl冰冷的乙腈(含有0.5uMD6-161作为内标)。混合所得溶液，在13,000rpm离心5分钟。将上清液(40ul)转移至HPLC进样器中，与80ul45mMpH4.5的甲酸盐缓冲液混合，随后在装有二极管阵列吸光度检测器(DAD)和线内质量检测器的Agilent6410LC-MS/MS上测定来自施用化合物42的小鼠的样品中化合物42、化合物161的浓度。通过在电喷雾正离子模式中配制多模式离子源检测器进行分析，干燥气流5L/分，喷雾压力60psi、干气温度275℃，喷雾器温度150℃，毛细管电压2000V，充电电压2000V，322nmDAD检测，8nm带宽。基于MRM跃迁在m/z584>400(前药42)和m/z445>400(化合物161)以及451>400(D6-161内标)处量化。分析物使用100％乙腈和0.01％甲酸-水溶液梯度洗脱，使用ZorbaxSBC-18快速解析HT3.0x50mm，1.8微米(Agilent)HPLC柱，流速为0.6ml/分。
将化合物42和化合物161配制成乳酸盐缓冲液，以其各自的q3dx4MTD(分别为100μmol/kg和31.6μmol/kg)的75％通过腹腔内注射施用至30只具有A431肿瘤异种移植物的雌性NIH-III小鼠中。在T＝2,6,24,48和72小时在异氟烷麻醉下通过尾部放血收集血样(每组n＝3)。在T＝2,6,24,48和72小时(每组n＝3)收集A431肿瘤样品，立即冷冻在液氮中，储存在-80℃下，如前述直到制备样品进行药物分析。
B.2.6辐射分解还原试验
使用脉冲辐解来实时监测单电子还原和前药42的稳定性。使用装配快速光谱检测***的线性加速器递送高能电子短脉冲(200ns4MeV中2-3Gy)(Anderson等人，J.Phys.Chem.A,101,9704-9709,1997)。将测试化合物溶解于含有甲酸盐离子的N2O-饱和溶液中，如前所述，在经过脉冲射解后在数微秒内迅速形成所述化合物的自由基阴离子。通过在对应于触发剂部分的苄基类残基形成的波长处分析动态临界物确定断裂速率(Bays等人，J.Am.Chem.Soc.,105,320-324,1983；Anderson等人，J.Phys.Chem.A,101,9704-9709,1997.)。
结果和讨论
B.2.7细胞酶抑制活性
通过磷酸化-erbB1状态的蛋白质免疫印迹测定，检测了化合物161,170和171及其各自的前药42,50和58在EGF-刺激的A431细胞中抑制erbB1自身磷酸化的能力(表8)。类似地检测化合物161及其前药42在抑制SKOV3细胞中磷酸化-erbB2基线水平的能力。化合物161,170和171显示为细胞erbB1的有效抑制剂(IC50分别为5、8和8nM)。相反，其季铵盐衍生物前药42,50和58在完整A431细胞中对erbB1自身磷酸化的抑制效果要分别低82倍、121倍和64倍。化合物161也显示是SKOV3细胞内erbB2的有效抑制剂(IC50为6nM)，相反，季铵盐前药42在这方面效果要低35倍。所述前药在细胞内erbB1/2抑制效果的下降主要是由于正电荷的季铵盐的存在导致细胞排除前药。
表8.完整的A431和SKOV3细胞中erbB1和erbB2自身磷酸化的分别抑制(IC50)
表8的脚注
a抑制完整的A431细胞中erbB1的EGF-刺激的自身磷酸化或SKOV3细胞中磷酸化-erbB2基础水平的50％所需要的浓度，通过使用抗-磷酸化酪氨酸抗体的蛋白质印迹测定。b相对于母体激酶抑制剂，细胞erbB1/2抑制下降的倍数。
B.2.8细胞erbB1抑制：不可逆的清洗测定
根据不可逆的erbB1/2抑制剂BIBW-2992(Minkovsky和Berezov.CurrentOpinioninInvestigationalDrugs,2008,9(12),1336-1346)和可逆的erbB1抑制剂厄洛替尼(Sanborn和Davies,ExpertReviewofClinicalPharmacology,2009,2(1),15-36)，评价了erbB1、2、4抑制剂161及其季铵盐前药42在完整A431细胞中不可逆抑制erbB1自身磷酸化的能力。细胞连续暴露在药物(1μM)中1小时，随后用重组表皮生长因子(EGF；Invitrogen,NZ)刺激，或者暴露在药物(1μM)中1小时，随后在EGF刺激前洗去未结合的药物(15次)。制备全细胞裂解物，通过用抗-磷酸化酪氨酸多克隆抗体(UpstateBiotech,#06-427)蛋白质印迹来可视化检测磷酸化-erbB1(图19)。如之前描述的大量不可逆erbB1抑制剂所述(Fry等人，PNAS,1998,95(20),12022-12027；Smaill等人，JMedChem,1999,42,1803-1815；Smaill等人，JMedChem,2001,44,429-440；Tsou等人，JMedChem,2001,44,2719-2734；Wissner等人，JMedChem,2003,46,49-63；Tsou等人，JMedChem,2005,48,1107-1131；Klutchko等人，JMedChem,2006,49,1475-1485)，BIBW-2992完全抑制了A431细胞中的erbB1自身磷酸化，而不考虑所述细胞是否在EGF刺激前洗去未结合的药物，观察同样显示抑制剂161强有力地支持erbB1发生了不可逆抑制。相反，已知的细胞erbB1自身磷酸化的可逆抑制剂厄洛替尼不能进行酶烷基化，因为其在6位未被迈克尔受体取代。因此，厄洛替尼在未洗去药物的细胞中显示了显著的erbB1自身磷酸化抑制，但是洗去药物的细胞则完全恢复了其响应EGF刺激的自身磷酸化erbB1的能力。在前药42中也观察到类似的结果，其中洗去药物的细胞完全恢复了其自身磷酸化erbB1的能力，这与前药42是可逆的erbB1抑制剂是一致的。
图19显示了相对于可逆和不可逆的erbB1抑制剂厄洛替尼和BIBW-2992，化合物161和42的A431细胞erbB1自身磷酸化抑制。细胞暴露在测试化合物(1μM)中1小时，随后直接用EGF刺激，裂解并进行EGFR(erbB1)和EGF刺激的磷酸化酪氨酸(即磷酸化-erbB1)蛋白质印迹测定，或者用无药物介质充分洗涤除去测试化合物后进行EGF刺激、细胞裂解和蛋白质印迹分析。
B.2.9细胞生长抑制活性
测试了表9中的化合物抑制三种人癌细胞系增殖的能力，以与文献报道进行比较：A431(表皮样癌)，其过表达erbB1；H1975(非小细胞肺癌)，其过表达erbB1L858R,T790M(erbB1的双突变体形式，已知对批准的可逆erbB1抑制剂厄洛替尼具有耐药性)以及SKOV3(卵巢癌)，其过表达erbB2。将细胞在有氧条件下暴露在测试化合物下24小时，或在缺氧条件下暴露4小时，随后在含氧条件下暴露20小时。其随后洗去药物，继续孵育4天后用磺基罗丹明B染色进行细胞存活试验。
表9.A431、H1975和SKOV3细胞中细胞增殖的抑制(IC50)
表9的脚注
a测定了5个浓度的剂量-响应曲线。细胞在测试化合物中暴露24小时，随后用无药物介质洗涤(x3)。IC50(μM)值是相对于未处理对照的抑制50％细胞生长需要的浓度。数值是介于2-12次独立试验的平均值(所有情况下％CV<20)。b试验全部在含氧条件下进行。c相对于母体激酶抑制剂，含氧条件下细胞生长抑制下降的倍数。d24小时的前4小时药物暴露在缺氧条件下进行。e低氧条件下细胞毒性比值＝相对于仅在含氧条件下的细胞，接受4小时缺氧的细胞的细胞生长抑制增加的倍数。
相对于H1975(IC50＝1.15-1.70μM)和SKOV3(IC50＝0.55-0.99μM)细胞，不可逆erbB1、2、4抑制剂161、170和171更有效地抑制了A431细胞的增殖(IC50＝0.027-0.24μM)，当细胞接受4小时缺氧培养时，未显示任何显著的效力变化。
季铵盐前药(42,50和58)相对于其各自的激酶抑制剂(161,170和171)其抑制A431细胞生长的效果要低56-74倍，抑制H1975细胞生长的效果要低30-86倍，抑制SKOV3细胞生长的效果要低42-133倍。此外表9中所有前药(42,50和58)在细胞缺氧培养4小时后均显著地更有效抑制所有三种细胞系的生长。A431细胞的低氧条件下细胞毒性比值(HCR)为60.0至77.9，H1975细胞为10.8-77.7，SKOV3细胞为20.3-38.5，这与硝基杂环还原性触发剂的低氧选择性还原后，触发剂断裂释放不可逆的erbB1、2、4抑制剂相一致。
B.2.10辐射分解还原
与正常组织中正常含氧量条件下不同，在实体瘤的低氧区域亲电性前药可通过单电子过程选择性还原(Brown和Wilson,NatureRev.Cancer,2004,4,437-447)。前药必须具有单电子还原电位E(1)，E(1)相对于NHE为-0.6V至-0.2V，优选介于-0.5V至-0.3V。许多化合物的E(1)值可以从文献中获得(例如Wardman,P.J.Phys.Chem.Ref.Data,1989,18,1637-1755.)或通过多种方法测定。例如脉冲辐射分解方法测定前药经单电子还原后形成的自由基阴离子和诸如紫精和醌化合物的参考标准间的平衡常数，从该数据可计算化合物的E(1)值(Meisel和Czapski.J.Phys.Chem.,1975,79,1503-1509)。前药42的E(1)值通过脉冲辐射分解方法测定为-0.425±0.008V，其被认为是适当的E(1)值，能在生物环境中酶促形成前药自由基阴离子。
希望选择所述还原性前药，使其在触发剂部分单电子还原后，具有可控的断裂速率常数。虽然在肿瘤细胞含氧量低的区域快速断裂释放高浓度的细胞毒性效应物是需要的，但对于正常含氧量下的正常组织细胞则并非如此。单电子还原的基于硝基芳烃的前药被氧气重新氧化的速率常数kO2如下式所表达：
logkO2/M-1s-1＝(4.6±0.1)–(5.0±0.2)xE(1)C/C.-
(Wardman等人，Biochem.Soc.Symp.,1995,61,171-194；Anderson等人，Org.Biomol.Chem.2005,3,2167-2174)。
单电子还原的前药的断裂速率常数kfrag可使用脉冲辐射分解测定，以观察触发剂断裂后产生的苄基类基团的吸收光谱的形成(Anderson等人，J.Phys.Chem.A,1997,101,9704-9709.)前药42的kfrag值通过脉冲辐射分解测定，为50±10s-1，认为是在低氧条件下单电子还原后需要的范围内的断裂速率。其与前药42在体外基于A431、H1975和SKOV3细胞的抗增殖试验中所具有的低氧条件下细胞毒性比值一致(表8)。
B.2.11前药42、50和58的溶解性和稳定性
通过HPLC在一定范围的溶质内研究了季铵盐前药42、50和58的溶解性和化学稳定性(表10)。它们在水中均显示良好的溶解性和稳定性。前药58在α-MEM和PBS中比前药42和50更易溶解，但后者在这些溶质中也具有可接受的溶解度。所有这些前药在α-MEM和PBS中均显示了可接受的稳定性，它们的半衰期均>24小时。
表10.前药42、50和58在α-MEM、PBS和水中的稳定性
表10的脚注
a经HPLC测定在37℃下在所述溶质中24小时后溶液中保留的母体百分比。
B.2.12化合物42、50和58在H1975异种移植物中的体内效果
通过腹腔内注射乳酸盐缓冲液，按照q4dx3日程比较了前药42、50和58在H1975异种移植物中以各自最大耐受剂量(MTD)施用时的效果(图20)。
图20显示了当以其各自的MTD的q4dx3日程测试时，化合物42、50和58针对H1975异种移植物的效果。
前药42(q3dx4MTD＝133μmol/kg/剂)显示在H1975异种移植物中具有相当的效果(肿瘤生长抑制计算值,TGI＝229％)，而前药50(q3dx4MTD＝316μmol/kg/剂)活性较弱(TGI＝114％)，前药58(q3dx4MTD＝75μmol/kg/剂)具有中等活性(TGI＝171％)。各前药均基于同一还原性触发剂(105)，区别在于所用效应物的性质。所述前药的活性排序(42>58>50)与各自效应物在体外H1975细胞的效果试验中观察到的前药的剂量耐受一致。
B.2.13化合物42和161针对SKOV3和H1975异种移植物的体内效果
图21显示了化合物42和161针对SKOV3异种移植物的效果。通过腹腔内注射乳酸盐缓冲液，按照q3dx9日程以同等毒性剂量直接比较了前药42和化合物161在SKOV3异种移植物中的效果(分别为100和31.6μmol/kg/剂)。前药42在生长延迟方面显示比化合物161更好的效果，用化合物161治疗的小鼠死亡为1/7，用前药20治疗的小鼠死亡为0/7。
图22显示了化合物42和161对NIHIII裸鼠中H1975异种移植物生长的效果。通过腹腔内注射乳酸盐缓冲液，按照q3dx4日程以同等毒性剂量直接比较了前药42和化合物161在H1975异种移植物中的效果(分别为133和42.2μmol/kg/剂)。前药42在生长延迟方面显示比化合物161更好的效果，用化合物161治疗的小鼠肿瘤生长抑制率(TGI)为100％，用前药20治疗的小鼠TGI为188％。
B.2.14前药42针对H1975和A431异种移植物的体内效果
图23显示了前药42对NIHIII裸鼠中生长的大H1975异种移植物的效果。前药42以133、100或75umol/kg/剂的剂量按照q3dx8日程通过腹腔施用乳酸盐缓冲液进行给药。所有剂量水平的前药42均显示对H1975生长延迟的效果，相对于乳酸盐处理的对照，其肿瘤生长抑制率(TGI)分别为275％、213％和154％(p<0.01)。因此前药42在MTD以下的剂量具有很好的抗肿瘤活性，从而建立了治疗窗口。
图24显示了前药42对NIHIII裸鼠中生长的大A431异种移植物的效果。前药42以80、60、40或20mg/kg/剂的剂量按照q3dx8日程通过腹腔施用乳酸盐缓冲液进行给药。所有剂量水平的前药42均显示对A431生长延迟的效果，相对于乳酸盐处理的对照，其肿瘤生长抑制率(TGI)分别为843％、786％、800％和400％(p<0.01)。因此前药42在MTD以下的剂量具有很好的抗肿瘤活性，从而建立了治疗窗口。
B.2.15前药42的鼠毒性和药代动力学
表10描述了前药42的q3dx4最大耐受剂量(MTD)以及组织和血浆药代动力学。前药42显示了体重下降和偶发稀便，表明胃肠道毒性是剂量限制性的。若体重下降>起始重量的15％，则进行人道主义处死。MTD值定义为所有药物相关原因导致的小于1/7的死亡率。已确定多剂量方案给药时，前药42具有良好的耐受，唯一观察到的毒性是体重下降。
以DMSO/5％葡萄糖(15:85)单次静脉给药(20μmol/kg)后，测定前药42和化合物161(来自前药42的给药)的血浆和组织药代动力学。前药42在血浆、H1975肿瘤、肝和皮肤中的曲线下面积(AUC0-24hr)分别为24.7、123、256.2和197.7μM.小时。化合物161(来自前药42)在血浆、H1975肿瘤、肝和皮肤中的曲线下面积(AUC0-24hr)分别为0.6、7.6、14.6和4.4μM.小时。
表11.前药42的体内毒性和药代动力学
表11的脚注
a测试化合物以pH4.0的乳酸缓冲溶液通过腹腔内注射按所述日程施用。在具有H1975肿瘤的雌性NIH-III裸鼠中进行；在3项独立的研究中死亡率为0/16。
b测试化合物以DMSO/5％葡萄糖(15:85)通过静脉内注射进行施用，在具有H1975肿瘤的雌性NIH-III裸鼠中进行；每组n＝3小鼠。测试化合物的血浆和组织浓度通过LC-MS-MS在2、6和24小时测定。从浓度/时间曲线计算AUC0-24hr。
C施用前药42产生的化合物161的AUC0-24hr值。
图25显示了血浆和A431肿瘤中化合物42和化合物161的浓度(来自施用化合物42和直接施用时)，其作为时间的函数，其中雌性A431肿瘤NIHIII小鼠以约75％的q4dx3MTD(分别为100和31.6umol/kg)施用单剂(ip)的试验化合物。前药42的血浆AUC0-72h为215umol-h/L，约比施用抑制剂161(8umol-h/L)高27倍。后者得到49umol-h/kg的肿瘤AUC0-inf。相反，前药42的肿瘤AUC0-72h为2821umol-h/kg，其具有稳定的肿瘤组织浓度，到72小时为约30umol/kg，以至于无法测定t1/2。与该较长的前药保留时间一致，从前药20中释放的抑制剂161同样在肿瘤组织具有延长的t1/2，提供了72umol-h/kg的AUC0-inf。因此，施用前药42后，A431肿瘤中的抑制剂161的AUC至少比以同等毒性施用抑制剂161本身高1.5倍。
B.2.16总结
收集的数据表明，具有在迈克尔受体附近的叔胺的不可逆erbB1、2、4抑制剂的季铵盐前药在含氧条件下的基于细胞的靶调节和抗增殖测定中活性较低。具有适当选择的可断裂的还原性触发剂的前药经单电子还原后在适当的速率常数下断裂，释放具有叔胺的不可逆erbB1、2、4抑制剂，其在缺氧条件下进行的基于细胞的抗增殖测定中选择性地更为有效，能够以良好耐受的剂量递送到小鼠，在A431、SKOV3和H1975肿瘤异种移植物试验中具有显著的抗肿瘤活性。
工业实用性
本发明提供了一系列的前药，其特征为含有能在还原后断裂的触发剂，从而释放激酶抑制剂。本发明的前药具有稳定的正电荷。该特征是重要的，因为正电荷使其相比其母体激酶抑制剂更难渗透入细胞。
不受任何理论限制的条件下，该渗透性的减小被认为通过将前药排除在细胞内的激酶靶点之外而减弱了所述前药相对于母体激酶抑制剂的细胞内激酶抑制效果。该活性减弱的优点是当激酶抑制剂剂量限制性的毒性来自健康组织中有关激酶的抑制时，允许前药以相对于母体激酶抑制剂更高的暴露水平施用给动物。前药在肿瘤中有效的还原性断裂释放了激酶抑制剂，从而在肿瘤组织中产生比全身性施用母体激酶抑制剂更高浓度的激酶抑制剂。因此，相对于母体激酶抑制剂可以获得更好的效果。
本发明前药的正电荷还被认为能导致随时间的持续的肿瘤滞留。迄今为止的结果显示可获得基本随时间稳定的肿瘤组织浓度(至少24小时，最高72小时)。这表明，不论何时何地发生肿瘤组织缺氧，均可通过单电子还原酶释放和活化前药。当许多肿瘤中具有短暂和变化性质的缺氧时，该特点尤其有利。
选择具有适当E(1)和断裂速率常数(kfrag)的触发剂/激酶抑制剂组合也认为对效果具有贡献，其通过帮助缺氧选择性和从前药中缓慢释放活性激酶抑制剂，以便足够的前药被保留在肿瘤中以靶向于随时间而出现在肿瘤细胞不同部分的缺氧区域。
本发明的化合物可用于需要抑制激酶活性的任何治疗用途中。在一个特定的方面，本发明提供了治疗哺乳动物(包括人)的异常的细胞生长的方法，包括向所述哺乳动物施用有效治疗异常细胞生长的量的本发明化合物(优选式I或式II的化合物)。在该方法的一个实施方案中，所述异常细胞生长是癌症，包括但不限于，骨癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、***癌、胰腺癌、皮肤癌、子宫癌、卵巢癌、慢性或急性白血病、***、外阴癌、***癌、霍奇金病、尿道癌、肾上腺癌、小肠癌、肾癌、膀胱癌、脑干神经胶质瘤和睾丸癌。
本发明的化合物可单独或与其他治疗剂或治疗方案(尤其是用于***的)组合使用。这可以是治疗哺乳动物(包括人)的异常细胞生长的方法，包括向所述哺乳动物施用有效治疗异常细胞生长的量的本发明化合物(优选式I或式II的化合物)与选自下列的抗肿瘤剂的组合：烷化剂、抗代谢物、有丝***抑制剂、嵌入剂、生长因子抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞周期抑制剂、生物反应修饰剂、抗体、细胞毒素、抗激素和抗雄性激素。
类似的，本发明提供了治疗哺乳动物(包括人)的异常细胞生长的方法，包括向所述哺乳动物施用有效治疗异常细胞生长的量的本发明化合物(优选式I或式II的化合物)和靶向放射疗法的组合。
当用于任何前述的方法时，本文的化合物可通过口服、经直肠、肠胃外(静脉内、肌内或皮下)、池内、***内、腹腔内、膀胱内、局部或含服或鼻喷雾施用给人和动物。
适于注射的组合物可包括生理上可接受的无菌水或非水溶液、分散液、混悬液或乳液，以及用于在无菌可注射溶液或分散液中重构的无菌粉末。适当的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、甘油、植物油和油酸乙酯。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒剂。在这些剂型中，活性成分与至少一种惰性常规载体混合，例如本领域技术人员已知的柠檬酸钠、磷酸二钙或填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶解延缓剂、吸收加速剂、吸附剂和润滑剂。
用于口服施用的液体剂型包括可药用的乳剂、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。
本发明的化合物可以药用或治疗有效的剂量水平施用给患者，例如约0.1至约3,000mg/天的范围。所用的剂量最终依赖于所治疗的病症或障碍，以及具体的治疗途径。剂量也将根据本发明的化合物是否作为单一疗法单独施用或与一种或多种活性剂或治疗方案(例如放射疗法)组合施用而变化。
在整个说明书中，除非另外说明，术语“包含”、“包括”等解释为开放性的含义，而不是封闭式的含义，即“包括但不限于”的含义。
所有上文参考的出版物均以其整体引入本文。
本说明书中对现有技术的任何参考不应理解为承认或以任何形式的暗示表明该现有技术构成公知常识的一部分。
上文描述了包含优选形式的本发明。其修饰和改变对于本领域技术人员来说是很明显的，因此也包括在内。
实施方案：
1.包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂芳族硝基杂环或芳族硝基碳环触发剂的化合物，所述化合物具有正电荷。
2.实施方案1的化合物，其中所述触发剂在单电子还原水平断裂。
3.实施方案1或2的化合物，其中所述激酶抑制剂具有可季铵化的氮，所述触发剂与所述氮直接或间接相连形成四价氮。
4.包含激酶抑制剂和芳族硝基杂环或芳族硝基碳环的可断裂触发剂的化合物，所述触发剂在单电子还原水平断裂，所述激酶抑制剂具有可季铵化的氮，且触发剂直接或间接地连接该氮，形成四价氮。
5.实施方案3或4的化合物，其中在触发剂断裂后，含有触发剂所连接的氮的激酶抑制剂完整释放。
6.实施方案1至5任一项所述的化合物，其E(1)为相对于NHE为-0.6V至-0.2V。
7.实施方案1至5任一项所述的化合物，其E(1)为相对于NHE为-0.5V至-0.3V。
8.实施方案1至5任一项所述的化合物，其E(1)为相对于NHE为-0.35V至-0.45V。
9.实施方案1至5任一项所述的化合物，其E(1)为相对于NHE为-0.4V至-0.45V。
10.实施方案2至5任一项所述的化合物，其在单电子还原后的断裂速率常数为1至4000s-1。
11.实施方案2至5任一项所述的化合物，其在单电子还原后的断裂速率常数为1至3000s-1。
12.实施方案2至5任一项所述的化合物，其在单电子还原后的断裂速率常数为1至1500s-1。
13.实施方案2至5任一项所述的化合物，其在单电子还原后的断裂速率常数为2至60s-1。
14.实施方案2至5任一项所述的化合物，其在单电子还原后的断裂速率常数为20至60s-1。
15.实施方案2至5任一项所述的化合物，其相对于NHE的E(1)为-0.2V至-0.6V，单电子还原后的断裂速率常数为1至4000s-1。
16.实施方案2至5任一项所述的化合物，其相对于NHE的E(1)为-0.3V至-0.5V，单电子还原后的断裂速率常数为1至3000s-1。
17.实施方案2至5任一项所述的化合物，其相对于NHE的E(1)为-0.3V至-0.5V，单电子还原后的断裂速率常数为1至1500s-1。
18.实施方案2至5任一项所述的化合物，其相对于NHE的E(1)为-0.35V至-0.45V，单电子还原后的断裂速率常数为2至60s-1。
19.实施方案2至5任一项所述的化合物，其相对于NHE的E(1)为-0.4V至-0.45V，单电子还原后的断裂速率常数为20至60s-1。
20.包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂触发剂的化合物，其中所述激酶抑制剂具有直接或间接地连接触发剂的可季铵化的氮，其中所述触发剂具有式IIId的结构：
其中＊是连接点；R8选自H和C1-C3烷基；并且R9选自H和C1-C6烷基。
21.实施方案20的化合物，其中R8是H。
22.实施方案20或21的化合物，其中R9是H或C1-C3烷基。
23.实施方案20或21的化合物，其中R9是甲基。
24.实施方案20的化合物，其中R9是甲基，R8是H。
25.实施方案1-24任一项所述的化合物，其中所述激酶抑制剂是可逆的激酶抑制剂。
26.实施方案1-24任一项所述的化合物，其中所述激酶抑制剂是不可逆的激酶抑制剂。
27.实施方案26的化合物，其中所述激酶抑制剂是不可逆的erbB1、2、4酪氨酸激酶抑制剂。
28.实施方案27的化合物，其中所述不可逆的erbB1、2、4酪氨酸激酶抑制剂具有与捕获半胱氨酸的官能团连接的碱性叔胺部分。
29.实施方案28的化合物，其中捕获半胱氨酸的官能团与所述叔胺通过接头部分(CH2)n连接，其中n是0-6的整数。
30.实施方案28或29的化合物，其中所述捕获半胱氨酸的官能团是迈克尔受体。
31.实施方案30的化合物，其中所述迈克尔受体是含双键或三键的酰胺类迈克尔受体。
32.式I的四价氮盐：
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
R1是式–(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；
R2、R3和R4可各自独立的选自叔胺激酶抑制剂(R2)(R3)(R4)N的脂肪族或芳族基团，或R2、R3和R4中的两者可形成激酶抑制剂的脂肪族或芳族杂环胺环，或R2、R3和R4中的一个可以不存在，且R2、R3和R4中的两个形成激酶抑制剂的芳族杂环胺环。
33.实施方案32的四价氮盐，其中X选自卤化物、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、甲苯磺酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐和甲酸盐。
34.实施方案32的四价氮盐，其中X是卤化物，优选是溴化物或氯化物。
35.实施方案32的四价氮盐，其中X是甲酸盐或三氟乙酸盐。
36.根据实施方案32-35任一项的四价氮盐，其中R1选自式III的基团：
其中：
＊是与式I化合物四价氮的连接点；
R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、F、Cl、Br、I、NO2、CN、COOH、COO(C1-C6烷基)、CONH2、CONH(C1-C6烷基)、CON(C1-C6烷基)2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2、SO2NH(C1-C6烷基)、SO2N(C1-C6烷基)2、SO2(C1-C6烷基)以及如实施方案50所定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；
R9选自H、C1-C6烷基和实施方案50定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；并且
R10选自H和C1-C6烷基。
37.根据实施方案36的四价氮盐，其中R1选自式IIIc的基团，其中R8是H并且R9是CH3。
38.根据实施方案36的四价氮盐，其中R1选自式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN。
39.根据实施方案36的四价氮盐，其中R1选自式IIId的基团，其中R8选自H和C1-C3烷基，并且R9选自H和C1-C6烷基。
40.实施方案39的化合物，其中R8是H。
41.实施方案39或40的化合物，其中R9是H或C1-C3烷基。
42.实施方案39或40的化合物，其中R9是甲基。
43.实施方案39的化合物，其中R9是甲基并且R8是H。
44.根据实施方案36的四价氮盐，其中R1选自式IIId的基团，其中R8是1-丙炔基，R9是CH3。
45.根据实施方案36的四价氮盐，其中R1选自式IIId的基团。
46.根据实施方案36的四价氮盐，其中R1选自式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基，并且R9是CH3。
47.根据实施方案32至35任一项的四价氮盐，其中R1选自下列基团:
其中＊是与式I化合物的四价氮的连接点。
48.实施方案32-47任一项的四价氮盐，其中R2和R3构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环。
49.实施方案32-47任一项的四价氮盐，其中所述激酶抑制剂选自衍生自下列化合物的基团：
50.式II的季铵盐:
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
Y是N或C-R7，其中R7选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和式VI的基团
其中＊是连接点，并且其中
T选自O、NH、N(C1-C6烷基)和直键；
m选自0-6的整数；
U选自OR44、CF3、OCF3、CN、NR45R46、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N1-甲基哌嗪基、吗啉基、CON(R47)(R48)、SO2N(R49)(R50)、N(R51)COR52、N(R53)SO2R54、COR55、SOR56、SO2R57以及COOR58；并且
R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50、R51、R52、R53、R54、R55、R56、R57、R58独立的选自H和C1-C6烷基；
Z是N或C-CN；
n是0-6的整数；
R1是式(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、CH2CH2OH、CH2CH2O(C1-C6烷基)，或R2和R3可以一起构成非芳族碳环或含有至少一个杂原子的非芳族杂环；
R5选自苯胺、吲哚、二氢吲哚、胺、氨基吲哚和氨基吲唑，其各自任选可被一个或多个选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、CONH2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2和SO2(C1-C6烷基)的取代基所取代；并且
R6选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和式V的基团
其中
＊是连接点；
V选自(CH2)k，其中k是0-6的整数，O、NH和N(C1-C6烷基)；且
R41选自H和C1-C6烷基。
51.根据实施方案50的季铵盐，其中X选自卤化物、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、甲苯磺酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐和甲酸盐。
52.根据实施方案50的季铵盐，其中X是卤化物，优选溴化物或氯化物。
53.根据实施方案50的季铵盐，其中X是甲酸盐或三氟乙酸盐。
54.根据实施方案50-53任一项的季铵盐，其中R1选自式III的基团：
其中
＊是与式II化合物四价氮的连接点；
R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、F、Cl、Br、I、NO2、CN、COOH、COO(C1-C6烷基)、CONH2、CONH(C1-C6烷基)、CON(C1-C6烷基)2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2、SO2NH(C1-C6烷基)、SO2N(C1-C6烷基)2、SO2(C1-C6烷基)以及如实施方案50定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；
R9选自H、C1-C6烷基和实施方案50定义的式VIa的基团，但其中＊是与式III基团的连接点；并且
R10选自H和C1-C6烷基。
55.根据实施方案54的季铵盐，其中R1选自式IIIc的基团，其中R8是H并且R9是CH3。
56.根据实施方案54的季铵盐，其中R1选自式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CONH2、CONHMe、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN。
57.根据实施方案54的季铵盐，其中R1选自式IIId的基团，其中R8选自H和C1-C3烷基，并且R9选自H和C1-C6烷基。
58.实施方案57所述的化合物，其中R8是H。
59.实施方案57或实施方案58所述的化合物，其中R9是H或C1-C3烷基。
60.实施方案57或实施方案58所述的化合物，其中R9是甲基。
61.实施方案57所述的化合物，其中R9是甲基，R8是H。
62.实施方案54的季铵盐，其中R1选自IIId的基团，其中R8是1-丙炔基，R9是CH3。
63.实施方案54的季铵盐，其中R1选自IIId的基团。
64.实施方案54的季铵盐，其中R1选自式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基，并且R9是CH3。
65.根据实施方案50-53任一项的季铵盐，其中R1选自下列基团：
其中＊是与式II化合物的四价氮连接点。
66.根据实施方案47-65任一项的季铵盐，其中R2和R3形成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环。
67.根据实施方案50-65任一项的季铵盐，其中R5选自式IV的基团:
其中
＊是连接点；
R11、R18、R19、R21、R26、R31和R36独立的选自H和C1-C6烷基；
R12、R13、R14、R15、R16、R17、R20、R22、R23、R24、R25、R27、R28、R29、R30、R32、R33、R34、R35、R37、R38、R39和R40独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、CONH2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2和SO2(C1-C6烷基)；并且
W是N或C-H。
68.根据实施方案50-53任一项的季铵盐，其中
Y是N,
Z是N或C-CN,
R1选自下列基团：
(a)式IIIc的基团，其中R8是H，R9是CH3；
(b)式IIId的基团，其中(i)R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，并且R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN；或(ii)R8是1-丙炔基，R9是CH3；
(c)式IIIf的基团，其中R8是H并且R9是CH3；以及
(d)式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基和C1-C6烷氧基，R9是CH3；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基，或者一起构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
＊是连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
(b)式IVd的基团，其中
＊是连接点；
R21是H；并且
R22和R23独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R24和R25独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
W是N或C-H；以及
(c)式IVf的基团，其中
＊是连接点；
R31是H；并且
R32和R33独立的选自H或F；
R34和R35独立的选自H、C1-C6烷基、F、Cl、Br、I、CH2F、CHF2、CF3；
W是N或C-H；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
69.根据实施方案50-53任一项的季铵盐，其中
Y是C-H或C-(C1-C6烷氧基)，
Z是N或C-CN；
R1选自下列基团：
(a)式IIIc的基团，其中R8是H，R9是CH3；
(b)式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，并且R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN；或R8是1-丙炔基，R9是CH3；
(c)式IIIf的基团，其中R8是H并且R9是CH3；以及
(d)式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基或乙基)和C1-C6烷氧基(例如OCH3)，R9是CH3；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基，或者一起构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
＊是连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
(b)式IVd的基团，其中
＊是连接点；
R21是H；并且
R22和R23独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R24和R25独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
W是N或C-H；以及
(c)式IVf的基团，其中
＊是连接点；
R31是H；并且
R32和R33独立的选自H或F；
R34和R35独立的选自H、C1-C6烷基、F、Cl、Br、I、CH2F、CHF2、CF3；
W是N或C-H；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
70.根据实施方案50-53任一项的季铵盐，其中：
Y是C-R7；其中R7是式VIb的基团；
Z是N或C-CN；
R1选自下列基团：
(a)式IIIc的基团，其中R8是H，R9是CH3；
(b)式IIId的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C2-C6炔基、CF3、OCF3、Br、NO2和CN，并且R9选自CH3、CH2CH2CONH2和CH2CH2CN；或R8是1-丙炔基，R9是CH3；
(c)式IIIf的基团，其中R8是H并且R9是CH3；以及
(d)式IIIq的基团，其中R8选自H、C1-C6烷基(例如甲基或乙基)和C1-C6烷氧基(例如OCH3)，R9是CH3；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基，或者一起构成选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、N1-甲基哌嗪和吗啉的环；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
＊是连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
(b)式IVd的基团，其中
＊是连接点；
R21是H；并且
R22和R23独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R24和R25独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
W是N或C-H；以及
(c)式IVf的基团，其中
＊是连接点；
R31是H；并且
R32和R33独立的选自H或F；
R34和R35独立的选自H、C1-C6烷基、F、Cl、Br、I、CH2F、CHF2、CF3；
W是N或C-H；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
71.实施方案50的季铵盐，选自下列化合物：
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-(4-硝基苄基)-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(17)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-(2-硝基苄基)-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(18)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-5-硝基-1H-吡咯-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(19)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(20)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(21)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-吡唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(22)
(2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(3-硝基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(22A)
1-((2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-4-氧代-2-丁烯基)-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(23)
4-((2E)-4-{[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-4-氧代-2-丁烯基)-4-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化吗啉-4-(24)
(2E)-4-{[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(25)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)-6-喹唑啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(27A)
(2E)-4-{[4-(4-氟-3-甲氧基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(27B)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(42)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(43)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(44)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙炔基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(45)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(46)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(47)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(48)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(48TF)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(49)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(50)
(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(51)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(52)
(2E)-N-[(2-乙炔基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(53)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(54)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(55)
(2E)-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(56)
(2E)-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(57)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(58)
(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(59)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-甲氧基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(60)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙炔基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(61)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(62)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(63)
(2E)-N-[(2-氰基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(64)
(2E)-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(65)
(2E)-4-({4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3S)-四氢-3-呋喃氧基]-6-喹唑啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(82)
(2E)-4-({4-[3-氯-4-(2-吡啶基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-三氟乙酸铵(83)
(2E)-4-{[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(84)
2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N,N-二乙基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化乙铵(140)
2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基溴化乙铵(141)
4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化吡啶(142)
1-[2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)乙基]-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(143)
N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]三氟乙酸乙铵(144)
N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基-2-[({5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}羰基)氨基]溴化乙铵(145)
4-({[4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-喹唑啉基]氧基}甲基)-1-甲基-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]三氟乙酸哌啶(146)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(172)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(1-丙炔基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(173)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(174)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(4-乙基-1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(175)，和
(2E)-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(176)。
72.药物组合物，包含实施方案1的化合物和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂。
73.包含实施方案1的化合物和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂的药物组合物，其用于治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病，包括癌症。
74.治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病例如癌症的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的实施方案1的化合物。
75.实施方案1的化合物在制备用于治疗增殖性疾病例如癌症的药物中的用途。
76.药物组合物，包含实施方案32的式I的四价氮盐和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂。
77.包含实施方案32的式I的四价氮盐和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂的药物组合物，其用于治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病，包括癌症。
78.治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病例如癌症的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的实施方案32的式I的四价氮盐。
79.实施方案32的式I的四价氮盐在制备用于治疗增殖性疾病例如癌症的药物中的用途。
80.药物组合物，包含实施方案50的式II的四价氮盐和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂。
81.包含实施方案50的式II的四价氮盐和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂的药物组合物，其用于治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病，包括癌症。
82.治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病例如癌症的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的实施方案50的式II的四价氮盐。
83.实施方案50的式II的四价氮盐在制备用于治疗增殖性疾病例如癌症的药物中的用途。
84.激酶抑制剂在制备根据实施方案1、4和20任一项的用于治疗增殖性疾病例如癌症的化合物中的用途。
85.激酶抑制剂在制备根据实施方案32的用于治疗增殖性疾病例如癌症的式I的季铵盐中的用途。
86.激酶抑制剂在制备根据实施方案50的用于治疗增殖性疾病例如癌症的式II的季铵盐中的用途。
87.实施方案84-86的用途，其中所述激酶抑制剂选自AST-487、CHIR-258、伊马替尼、VX-680、LY-333531、MLN-518、SU-14813、舒尼替尼、PI-103、ZD6474、索拉非尼、达沙替尼、PD166285、PD166285类似物A、PD166285类似物B、AEE788、N-甲基星状孢子素、BIBW2992、HKI272、EKB569、吉非替尼、Vargatef、Cediranib、Bosutinib、AZD0530、BIRB796、PHA-665752、10-DEBC、GDC-0941、MK-2206类似物、Masitinib、SU11274、XL880、XL184、ZM39923、AZD1152、Danusertib、ZM447439、PKI-587、(2E)-N-[4-(3-溴苯胺基)-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(11)、
(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(161)、
2E)-4-(二甲基氨基)-N-{4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}-2-丁烯酰胺(170)以及
(2E)-4-(二甲基氨基)-N-[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-丁烯酰胺(171)。
88.适合用于制备实施方案1、4、20、32和50任一项的化合物的激酶抑制剂，选自：
(2E)-N-[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(161)
2E)-4-(二甲基氨基)-N-{4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}-2-丁烯酰胺(170)和
(2E)-4-(二甲基氨基)-N-[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]-2-丁烯酰胺(171)。
89.还原性活化的可断裂芳族硝基杂环或芳族硝基碳环在制备用于治疗增殖性疾病例如癌症的根据实施方案1、4、20、32和50任一项的化合物中的用途。
90.实施方案89的用途，其中硝基杂环或硝基碳环为实施方案20中所定义的式IIId。

Claims (20)

1.包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂芳族硝基杂环或芳族硝基碳环触发剂的化合物，所述化合物具有正电荷。
2.包含激酶抑制剂和芳族硝基杂环或芳族硝基碳环的可断裂触发剂的化合物，所述触发剂在单电子还原水平断裂，所述激酶抑制剂具有可季铵化的氮，且触发剂直接或间接地连接该氮，形成四价氮。
3.包含激酶抑制剂和还原性活化的可断裂触发剂的化合物，其中所述激酶抑制剂具有直接或间接地连接触发剂的可季铵化的氮，其中所述触发剂具有式IIId的结构：
其中*是连接点；R8选自H和C1-C3烷基；并且R9选自H和C1-C6烷基。
4.式I的四价氮盐：
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
R1是式–(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；
R2、R3和R4可各自独立的选自叔胺激酶抑制剂(R2)(R3)(R4)N的脂肪族或芳族基团，或R2、R3和R4中的两者可形成激酶抑制剂的脂肪族或芳族杂环胺环，或R2、R3和R4中的一个可以不存在，且R2、R3和R4中的两个形成激酶抑制剂的芳族杂环胺环。
5.式II的季铵盐:
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
Y是N或C-R7，其中R7选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和式VI的基团
其中*是连接点，并且其中
T选自O、NH、N(C1-C6烷基)和直键；
m选自0-6的整数；
U选自OR44、CF3、OCF3、CN、NR45R46、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、N1-甲基哌嗪基、吗啉基、CON(R47)(R48)、SO2N(R49)(R50)、N(R51)COR52、N(R53)SO2R54、COR55、SOR56、SO2R57以及COOR58；并且
R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50、R51、R52、R53、R54、R55、R56、R57、R58独立的选自H和C1-C6烷基；
Z是N或C-CN；
n是0-6的整数；
R1是式(CH2)nTr的基团，其中Tr是芳族硝基杂环或芳族硝基碳环，并且–(CH2)nTr作为还原性活化的可断裂触发剂起作用，n是0-6的整数；
R2和R3独立的选自C1-C6烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、CH2CH2OH、CH2CH2O(C1-C6烷基)，或R2和R3可以一起构成非芳族碳环或含有至少一个杂原子的非芳族杂环；
R5选自苯胺、吲哚、二氢吲哚、胺、氨基吲哚和氨基吲唑，其各自任选可被一个或多个选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、CONH2、CO(C1-C6烷基)、SO2NH2和SO2(C1-C6烷基)的取代基所取代；并且
R6选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和式V的基团
其中
*是连接点；
V选自(CH2)k，其中k是0-6的整数，O、NH和N(C1-C6烷基)；且
R41选自H和C1-C6烷基。
6.根据权利要求5的化合物，其为式II的季铵盐:
其中：
X是任何负电荷的平衡离子；
Y是N；
Z是N；
n是0-6的整数；
R1是式IIId的基团
其中*是连接点；R8选自H和C1-C3烷基；并且R9选自H和C1-C6烷基；
R2和R3独立的是C1-C6烷基；
R5是苯胺，其任选地被一个或多个选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2和CF3的取代基所取代；并且
R6是H。
7.根据权利要求6的化合物，其中X选自卤化物、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、甲苯磺酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐和甲酸盐。
8.根据权利要求6的化合物，其中X是溴化物或氯化物。
9.根据权利要求6的化合物，其中X是甲酸盐或三氟乙酸盐。
10.权利要求6-9中任一项所述的化合物，其中R8是H。
11.权利要求6-9中任一项所述的化合物，其中R9是H或C1-C3烷基。
12.权利要求6-9中任一项所述的化合物，其中R9是甲基。
13.权利要求6-9中任一项所述的化合物，其中R9是甲基，R8是H。
14.根据权利要求6-9任一项的化合物，其中R1选自下列基团：
其中*是与式II化合物的四价氮连接点。
15.根据权利要求6-9任一项的化合物，其中R5选自式IVa的基团:
其中
*是连接点；
R11独立的选自H和C1-C6烷基*；
R12、R13和R14独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2和CF3。
16.根据权利要求15的化合物，其中
Y是N,
Z是N,
R1选自式IIId的基团，其中R8选自H和C1-C3烷基并且R9是CH3；
R2和R3独立的是C1-C6烷基；
R5选自下列基团：
(a)式IVa的基团，其中
*是连接点；
R11是H；并且
R12、R13、R14各自独立的选自H、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、CH2F、CHF2、CF3、OH、NH2、NO2、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2；
R6是H；
X是任何负电荷的平衡离子；并且
n＝1或2。
17.权利要求6的化合物，其选自下列化合物：
(2E)-4-{[4-(4-氟-3-甲氧基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(27B)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(42)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(43)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(46)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(47)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(49)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(50)
(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(51)
(2E)-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(54)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(55)
(2E)-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-({4-[4-氟-3-(三氟甲基)苯胺基]吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基}氨基)-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(57)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(58)
(2E)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(59)
(2E)-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-N-{[1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(62)
(2E)-N-{[1-(3-氨基-3-氧代丙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(63)
(2E)-N-{[1-(2-氰基乙基)-4-硝基-1H-咪唑-5-基]甲基}-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(65)
2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N,N-二乙基-N-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化乙铵(140)
2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)-N-[(1,2-二甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二乙基溴化乙铵(141)
4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化吡啶(142)
1-[2-(4-{[6-(2,6-二氯苯基)-8-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基]氨基}苯氧基)乙基]-1-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]溴化哌啶(143)
(2E)-4-{[4-(3-溴-4-氟苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(172)
(2E)-N-[(2-乙基-1-甲基-4-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-{[4-(3-乙炔基苯胺基)吡啶并[3,4-d]嘧啶-6-基]氨基}-N,N-二甲基-4-氧代-2-丁烯-1-溴化铵(176)。
18.药物组合物，包含权利要求1-17任一项的化合物和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂。
19.包含权利要求1-17任一项的化合物和一种或多种可药用赋形剂或稀释剂的药物组合物在制备用于治疗哺乳动物、包括人的增殖性疾病的药物中的用途。
20.权利要求19所述的用途，其中所述增殖性疾病是癌症。
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