CN105524905A - 一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，以含高活力酸性蛋白酶的蛋白酶和其他食品级酶制剂为主要原料，科学复配具有高活力酸性蛋白酶和抑制黄曲霉、大肠杆菌的生长繁殖、分解黄曲霉毒素的霉菌培养物，含有多种植物酶系的植物提取物，能有效抑制黄曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，对黑曲霉、米曲霉抑制效果不明显且增香调味的香辛料提取物，具有选择性吸附黄曲霉毒素的脱霉素，可明显提高酱油复合酶存储稳定性的保护剂、激活剂和抗氧化剂等，制得的酱油复合酶酶系全、酶活力高、稳定性强、效力高，食品安全性高。可显著提高酱油产量24％，提高酿造酱油的全氮利用率16.5％和氨基酸生成率18.4％。

Description

一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及酱油复合酶，具体涉及一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶。

背景技术

我国酱油酿造从古代劳动人民的自然网落制曲到19世纪50年代末期开始的深层通风制曲，都离不开制曲工艺，曲子中的微生物是否优良，酶活是否高，酶系是否丰富，直接影响到酱油的产量和质量。众所周知，制曲工艺不仅占地面积大，而且劳动强度高，若采用直接加酶不制曲工艺，不仅省去了制曲工序，大大降低了劳动强度，而且由于曲子中酶系复配合理，还能提高酱油的产量和质量。

酿造酱油是利用制曲过程中微生物的多种酶对原料中的蛋白质和淀粉进行水解，形成酱油的色、香、味、体等成分的过程。目前国内普遍采用的酱油菌种是沪酿3.042米曲霉，该菌分泌的蛋白酶多以中性和碱性蛋白酶为主，而酸性蛋白酶含量较低。发酵过程中随着酱醅pH值得下降，中性和碱性蛋白酶活力逐渐下降，而酸性蛋白酶活力又过低，最终导致原料全氮利用率不高，酱油鲜味不足等缺陷。因此，提高酱油曲中酸性蛋白酶的比例是解决酱油生产上原料利用率不高和产品质量较差的有效途径之一。

中国专利CN102488181A公开了一种复合酶制剂及其在酱油发酵头渣中的应用。本发明的复合酶制剂，由以下重量百分比组成：淀粉酶3～8％，复合蛋白酶50～70％，纤维素酶15～35％，果胶酶10～20％，β-葡聚糖酶2～5％，所述复合蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶组成。本发明还公开了上述复合酶制剂在酱油发酵头渣中提高蛋白质收得率的应用，将所述复合酶制剂溶于水，添加到天然晒制或保温发酵的酱油酿造提取第一道酱油后的酱渣(头渣)中，可以有效分解头渣中与蛋白质结合的淀粉、纤维质、果胶和β-葡聚糖，进而将头渣中的蛋白质分解成为氨基酸，提高酱油中的氨基态氮和固形物的含量。本发明的复合酶制剂可以有效补充酱渣中的酶系的不足，提高酱油生产中原料蛋白质的收得率，降低酱油生产成本。上述公开的专利中复合蛋白酶不含酸性蛋白酶，其中的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分别为植物酶和动物酶，成本高，酶制剂获取原料缺乏，工业化和规模化受到制约，并且复合酶酶系不全，活力低，主要适用于酱油发酵头渣的添加，应用范围受限。《中国调味品》公开了“酿造酱油专用酶制剂在酿造酱油生产中的应用”(蔡坤华、戎文文、蒋永杰、陈永林，2002年3月，第3期，文章编号：1000-9973(2002)03-0010-03)。其中专用酶制剂含有真菌α-淀粉酶、复合蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶等多种酶系，跟稀糖浆盐水和成曲混合，拌料入池进行保温发酵，促进了酱油生产原料中蛋白质和淀粉原料的的分解，提高了原料利用率，同时促进了风味物质的形成，改善了酱油风味，全氮利用率达到79.30％，比对照组提高了7.15％；氨基酸生成率大53.45％，比对照组提高8.20％。酿造酱油专用酶制剂应用在酱油酿造中取得了成功。上述公开的技术文献酶系仍然不全，比如，虽然采用了脱脂豆粕，但仍然存在残留脂肪，脂肪酶的添加可有酶解解残留脂肪细胞，加速其他酶制剂的渗透，提高酶解效率，进而提高蛋白质及淀粉原料利用率，缩短发酵时间等，同时，专用酶制剂作为一种商品，其存储稳定性及效力是需要考虑的很重要的问题，并且，还应考虑防止黄曲霉菌(毒素)、细菌杂菌污染等食品安全性问题，以同时提高酿造酱油的产量和质量(理化指标和卫生指标)。

因此，开发和研究适合与人民生活息息相关的调味品——酿造酱油的复合酶制剂仍是本领域技术人员的责任和追求。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有酿造酱油复合酶的缺陷，以含高活力酸性蛋白酶的蛋白酶和其他食品级酶制剂为主要原料，科学复配具有高活力酸性蛋白酶和抑制黄曲霉、致病性大肠杆菌的生长繁殖、分解黄曲霉毒素的霉菌培养物，含有多种植物酶系的的植物提取物，能有效抑制黄曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，对黑曲霉、米曲霉抑制效果不明显且增香调味的香辛料提取物，具有选择性吸附黄曲霉毒素的脱霉素，可明显提高酱油复合酶存储稳定性(酶活力和效力)的保护剂、激活剂和抗氧化剂等，制备一种酶系全、酶活力高、稳定性强、效力高，有效提高酿造酱油产量和质量及食品安全性的酱油复合酶。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，由以下重量份数的原料组成：

蛋白酶25-35份，淀粉酶10-20份，植物提取物10-15份，霉菌培养物5-15份，半纤维素酶10-12份，果胶酶6-10份，植酸酶6-9份，酯酶5-8份，香辛料提取物5-8份，保护剂4-6份，激活剂4-6份，脱霉素1-3份，抗氧化剂0.2-0.5份；

所述植物提取物中含有丰富的植物蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植物酶；

所述植物提取物中还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅可为酱油复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备酸性蛋白酶和霉菌培养物的发酵培养基成分，提高蛋白酶活力和微生物产酶能力；同时可为酱油曲提供全面、丰富的营养物质；

所述植物提取物采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓缩等低温提取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的食品安全性；

所述植物提取物的制备方法为：将大麦芽和小麦芽按质量比4-6:1-3均匀混合，粉碎至粒度0.5-1mm,得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于超声波清洗机中在功率200W、频率30KHz条件下超声清洗5-10min，沥干，室温下破碎至粒度0.5-1mm，并按质量比5-7:2-4:1-3均匀混合，加入混合物质量2-4倍的粉碎麦芽得原料混合物，加入原料混合物质量1-3倍的水，用柠檬酸调节pH值为3-4，在功率150-300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间60-80s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度20-35℃，如此辐照10次，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间90-105s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-60℃，如此辐照10次，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度25-35kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)提取15-20min；提取液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:1-2均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、低温粉碎即得植物提取物；

优选地，所述超声波清洗机中清洗液为0.3-0.5％的碳酸氢钠溶液。

所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：酸性蛋白酶70％，中性蛋白酶10％，碱性蛋白酶10％，耐盐谷氨酰胺酶10％；

所述酸性蛋白酶和霉菌培养物是以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil)CCTCCNO：M2013601为出发菌株，经特定发酵条件下的液体深层发酵而制得，并且发酵培养基中科学复配了上述制备的植物提取物；

优选地，所述酸性蛋白酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO：M2013601的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将种子罐液体种子以5％接种量接入发酵罐培养基，培养温度31-32℃，搅拌速度200-400r/m，通风量1:1-2,培养时间10-12h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至26-30℃，搅拌速度400-600r/m，通风量1:1-3,恒温培养8-10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至23-25℃，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,培养时间22-31h，然后，将种子罐液体种子以3％接种量追加接入发酵罐，最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至31-32℃，搅拌速度200-400r/m，通风量1:1-2,恒温培养10-12h；接着以1-2℃/h降温速率缓慢降温至23-25℃，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,恒温培养22-31h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性蛋白酶；

所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物5-10g,干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮60-80g,玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，干酪素5-10g，中草药提取物5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1-3g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min；

所述种子罐培养基组成为：麸皮60-80g,玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖10-15g，中草药提取物10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，干酪素5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1-3g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min；

所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x10⁸-8.0x10⁸个/ml；

所述发酵罐培养基组成为：麸皮60-80g,玉米粉50-60g，植物提取物40-60g，豆饼粉35-40g，中草药提取物20-30g，海藻糖10-30g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，干酪素3-5g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾1-3g，硝酸钾1-2g,硫酸锌0.1-0.2g,纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min；

所述中草药提取物的制备方法如下：

按重量份数计，称取黄芪60-70份，当归50-60份，党参40-45份，甘草40-45份，鱼腥草35-45份，神曲35-45份，柴胡10-15份，黄芩10-15份；将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃-90℃保持2-4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:1.5，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣1-3倍重量的水，控制温度85℃-95℃保持1-3h，然后降温至25-35℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2-4:1-3合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；

所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比5:3:1:0.5均匀混合。

所述霉菌培养物含有较强的微生物活性，在酱油发酵过程中不仅可持续提供高活力酸性蛋白酶，而且可有效抑制黄曲霉、致病性大肠杆菌的生长繁殖、分解黄曲霉毒素；

优选地，所述霉菌培养物是上述酸性蛋白酶制备时的发酵液经减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎而得到的；

所述霉菌培养物活菌含量为7x10¹⁰-9x10¹⁰CFU/g。

所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：30％糖化酶，30％真菌α-淀粉酶，20％普鲁兰酶，10％β-淀粉酶，10％中温α-淀粉酶；

所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：30％耐温β-葡聚糖复合酶，30％β-葡聚糖复合酶，15％甘露聚糖酶，15％的木聚糖酶，10％的戊聚糖酶。

所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：60％酸性脂肪酶，15％中性脂肪酶，10碱性脂肪酶，10％酸性磷酸酶，5％磷酸酯酶。

所述香辛料提取物可有效抑制黄曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，对黑曲霉、米曲霉抑制效果不明显；

所述香辛料可有效防止酱油发酵过程杂菌污染，保证发酵正常进行，还可代替食品防腐剂延长酱油的保质期，并且可为酿造酱油调味增香；

进一步地，所述香辛料提取物的制备方法为：将香辛料清洗、沥干，加入其质量0.1-1倍的苹果醋润湿2-6h,于-18—-22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎粒度0.5-3mm,接着加入香辛料质量1-3倍的苹果醋，在功率150-300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间60-80s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度20-35℃，如此辐照10次，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间90-105s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-60℃，如此辐照10次，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度25-35kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率300-500Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)提取15-20min；充分搅拌提取液，密封，自然发酵3-5d，过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒度为0.1-0.3mm即得香辛料提取物；

优选地，所述香辛料为花椒、黑胡椒、草果、肉蔻、八角、小茴香、陈皮、肉桂、丁香、沙姜干中的一种或多种完整香辛料；

优选地，所述香辛料的重量份数组成为：花椒20-30份，黑胡椒20-30份，草果10-15份，肉蔻10-15份，八角8-12份，小茴香8-10份，陈皮5-8份，肉桂3-5份，丁香2-4，沙姜干1-3份。

所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌20-30份，氯化钙10-20份，硫酸钠10-20份，氯化镁5-10份。

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:灵芝多糖20-30份，海藻糖20-30份，NaCl10-20份，(NH₄)₂SO₄10-15份，半胱氨酸10-15份。

所述脱霉素是由美国杜邦公司生产的一种不同于普通硅铝酸盐的硅铝酸盐衍生物，具有网格状多层或链状结构，二价或三价阳离子与氧或羟基形成八面体的共价结构；二氧化硅则与氧或羟基形成四面体的共价结构。具有强选择性吸附作用，能有效吸附原料(大豆、小麦、豆饼、豆粕等)中黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等多种毒素，而且不会吸附氨基酸、维生素、微量元素等营养成份，不影响微生物的正常生长和繁殖，可有效防止原料毒素对酱油发酵过程中糖化、发酵菌种的危害，促进其健康增殖和发酵，提高产酶、发酵能力。

所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种组合；

优选地，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比2-4:2-4:1-3均匀混合；

所述葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物均为市购商品。

上述含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法，包括如下步骤：

首先将所述保护剂、激活剂超微粉碎，随后立即依次加入蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、植酸酶、酯酶、植物提取物均匀混合，最后依次加霉菌培养物、香辛料提取物、抗氧化剂及脱霉素，混合均匀后密封包装即得含酸性蛋白酶的酱油复合酶。

本发明另一个目的是含酸性蛋白酶的酱油复合酶在酱油酿造中的应用。

使用方法：

1.复合酶作用条件：适应pH值2-6，最适pH值3.5-5.5；适应温度30-55℃，最适反应温度42-45℃。

2.使用方法：1)在制作酱醅过程与酱油成曲、稀糖浆盐水混合后进行酱醅保温发酵,也可在润料过程添加进行原料预处理；2)将复合酶与45℃水按质量比1:10均匀混合，调整pH值为3.5-5.5，活化30-50min,使用效果最佳。

3.使用量：施曲发酵时为原粮干重的0.02-0.2％；原料预处理时为原粮干重的0.01-0.05％。

本发明提供的宇佐美曲霉801-2是由实验室保藏的一株产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉801依次经紫外线复合氯化锂诱变、亚硝基胍诱变、硫酸二乙酯诱变，并对突变株分离、筛选，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉801-2。

本发明提供的产高活力酸性蛋白酶的菌株具体为宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2。该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学邮编：430072)，保藏号为CCTCCNO：M2013601，分类命名为宇佐美曲霉801-2Aspergillususamil801-2。

本发明宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2(CCTCCNO：M2013601)具有以下微生物学特征：

1、形态学特征：

宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径35-50μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基15-20(长度)×3-4.0(直径)μm，瓶梗6-8(长度)×2-4(直径)μm，分生孢子球形或近球形，较小，直径3.5-5.0μm，褐色，壁粗糙。

2、培养学特征：

宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，32℃4天菌落直径82mm；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，有少量渗出液；菌落反面略带黄色。

3、生理生化特征：

宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2可在马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生长，最适PH值5-6，最适生长温度31-32℃，最适产酶温度23-25℃。

本发明菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→再复筛→扩大实验(发酵性能测定)。

按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株宇佐美曲霉801-2，发酵72-96小时后酸性蛋白酶酶活可达14000U/mL，对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃下，60分钟酶活没有下降。55℃与60℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。65℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。70℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到原有酶活的75％。酸性蛋白酶适应反应温度30-55℃，最适反应温度40-50℃，同样条件下达到同样酶活耐受温度比出发菌平均提高了8-12℃，适应pH值范围2-6，最适pH值2.5-3.5。

有益效果：

本发明酱油复合酶以含高活力酸性蛋白酶的蛋白酶和其他食品级酶制剂为主要原料，科学复配具有高活力酸性蛋白酶和抑制黄曲霉、致病性大肠杆菌的生长繁殖、分解黄曲霉毒素的霉菌培养物，含有多种植物酶系的的植物提取物，能有效抑制黄曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，对黑曲霉、米曲霉抑制效果不明显且增香调味的香辛料提取物，具有选择性吸附黄曲霉毒素的脱霉素，可明显提高酱油复合酶存储稳定性(酶活力和效力)的保护剂、激活剂和抗氧化剂等，制得的酱油复合酶酶系全、酶活力高、稳定性强、效力高，食品安全性高。本发明酱油复合酶可显著提高酱油产量，与对照组相比，提高21-28％，平均提高酱油产量24％。可显著提高酿造酱油的口感，与对照组相比香味更浓，口感更醇厚、味更鲜，色泽和体态差异不大；可显著提高酿造酱油的全氮利用率和氨基酸生成率，与对照组相比，分别提高16.5％和18.4％；全氮和氨基态氮含量分别提高22.8％和32.9％。

具体表现在：

1.本发明的植物提取物中含有丰富的植物蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植物酶；还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅可为酱油复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备酸性蛋白酶和霉菌培养物的发酵培养基成分，提高蛋白酶活力和微生物产酶能力；同时可为酱油曲提供全面、丰富的营养物质；所述植物提取物采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓缩等低温提取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的食品安全性。

2.本发明的酸性蛋白酶以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCCNO：M2013601为出发菌株，根据其最适生长温度和最适产酶温度，细化了孢子增殖和发酵产酶阶段的工艺参数，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种，尤其是梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了出发菌株的抗应激能力，致使菌种的产酶能力最大限度地显现。并且本发明对培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强了微生物的代谢功能，使得本发明所产酸性蛋白酶活力高、耐受温度较高、稳定性强、适于工业化生产。

3.本发明酸性蛋白酶制备过程中发酵培养基植物提取物的添加，使得发酵液酸性蛋白酶酶活力大幅度提高，由13000-14000U/mL提高至19000-22000U/mL，增幅57.14％；发酵液粗酶液可耐受较高温度，40℃、45℃、50℃下，60分钟酶活没有下降。55℃与60℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。65℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。70℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到原有酶活的75％。酸性蛋白酶适应反应温度30-55℃，最适反应温度40-50℃，适应pH值范围2-6，最适pH值2.5-3.5。宽泛的pH作用范围和温度作用范围、高活力和强热稳定性更加适合酱油酿造，可充分酶解大豆等蛋白质原料，提高全氮利用率和氨基酸生成率，进而提高酱油的产量和质量，降低生产成本。

4.本发明的霉菌培养物含有较强的微生物活性，活菌含量为7x10¹⁰-9x10¹⁰CFU/g。在酱油发酵过程中不仅可持续提供高活力酸性蛋白酶，而且可有效抑制黄曲霉、致病性大肠杆菌的生长繁殖、分解黄曲霉毒素。对黄曲霉菌的抑制率为73-95％，对黄曲霉毒素B1的降解率为58.78％。

5.本发明的香辛料提取物可有效抑制黄曲霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，对黑曲霉、米曲霉抑制效果不明显；可有效防止酱油发酵过程杂菌污染，保证发酵正常进行，还可代替食品防腐剂延长酱油的保质期，并且可为酿造酱油调味增香。

6.本发明的脱霉素是由美国杜邦公司生产的一种不同于普通硅铝酸盐的硅铝酸盐衍生物，具有网格状多层或链状结构，二价或三价阳离子与氧或羟基形成八面体的共价结构；二氧化硅则与氧或羟基形成四面体的共价结构。具有强选择性吸附作用，能有效吸附原料(大豆、小麦、豆饼、豆粕等)中黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等多种毒素，而且不会吸附氨基酸、维生素、微量元素等营养成份，不影响微生物的正常生长和繁殖，可有效防止原料毒素对酱油发酵过程中糖化、发酵菌种的危害，促进其健康增殖和发酵，提高产酶、发酵能力。

7.本发明的抗氧化剂可有效防止复合酶酶分子结构氧化而造成酶活性损失，提高酶活力稳定性。在0℃和40℃条件下储存12个月，复合酶中单酶酶活损失分别为0.37％和0.50％，比对比例分别降低22.9％和66.7％，有效防止在包装、储存、运输、使用等环节因环境改变、操作方法不当而造成酶的失活，尤其可防止高温造成的酶失活。

8.本发明的保护剂有效减缓了复合酶制剂的回潮；同时可增强复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高20-30℃，耐冷冻温度可降低10-15摄氏度，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复合酶的保质期，达到同样的酶活力，比同类产品保质期可延长2-3年。

9.本发明的激活剂创造了酶催化作用的最佳条件，充分发挥了酶的活力，彻底有效的分解了酿造原料中蛋白质、淀粉、半纤维素、脂肪等大分子物质，不仅提高了原料利用率，而且增加酱油曲和霉菌孢子的营养物质，同时提供了酱油必须的香味物质及其前体物。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1原料制备

1.植物提取物的制备：

将大麦芽、小麦芽按质量比5:2均匀混合，粉碎至粒度0.8mm,得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于盛有0.4％的碳酸氢钠溶液的超声波清洗机中在功率200W、频率30KHz条件下超声清洗8min，沥干，室温下破碎至粒度0.8mm，并按质量比6:3:2均匀混合，加入混合物质量3倍的粉碎麦芽得原料混合物，加入原料混合物质量2倍的水，用柠檬酸调节pH值为3.5，在功率200W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间70s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度30℃，如此辐照10次，同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；保温2h,然后，在功率300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间105s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度50℃，如此辐照10次，同时在功率400W,频率45KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度30kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场提取18min；提取液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:1.5均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、低温粉碎即得植物提取物；

2.酸性蛋白酶的制备：

所述酸性蛋白酶的制备方法包括如下步骤：

(1)菌种活化

将保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO：M2013601的斜面菌种接种于斜面培养基，32℃培养40h进行菌种活化，如此活化3次；

(2)液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤(1)活化后斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，32℃、100rpm摇床培养40h；

②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以8％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，32℃、100rpm摇床培养40h；

④种子罐培养：将三级种子以8％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为6，培养温度31℃，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)1:1,培养时间40h；

所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x10⁸个/ml；

(3)发酵罐发酵

将步骤(2)中种子罐液体种子以5％接种量接入发酵罐培养基，培养温度32℃，搅拌速度300r/m，通风量(V/V)1:1.5,培养时间11h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至28℃，搅拌速度500r/m，通风量(V/V)1:2,恒温培养9h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至24℃，搅拌速度600r/m，通风量(V/V)1:3,培养时间27h，然后，将步骤(2)中种子罐液体种子以3％接种量追加接入发酵罐，最后以2℃/h升温速率缓慢升温至32℃，搅拌速度300r/m，通风量(V/V)1:1.5,恒温培养11h；接着以2℃/h降温速率缓慢降温至24℃，搅拌速度600r/m，通风量(V/V)1:3,恒温培养27h；

(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性蛋白酶。

经上述方法制备的酸性蛋白酶在室温下保存12个月后酶活损失为1.8％，发酵液酸性蛋白酶酶活力可达22000U/mL。

所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物7g,干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。

所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮70g,玉米粉55g，豆饼粉38g，海藻糖12g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，干酪素8g，中草药提取物8g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；

所述种子罐培养基组成为：麸皮70g,玉米粉55g，豆饼粉38g，海藻糖12g，中草药提取物12g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，干酪素8g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；

所述发酵罐培养基组成为：麸皮70g,玉米粉55g，植物提取物50g，豆饼粉38g，中草药提取物25g，海藻糖20g，鱼粉8g，氯化铵11g，氯化钙8g，干酪素4g，硫酸镁3g，磷酸氢二钾2g，硝酸钾2g,硫酸锌0.2g,纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；

所述中草药提取物的制备方法如下：按重量份数计，称取黄芪65份，当归55份，党参42份，甘草42份，鱼腥草40份，神曲40份，柴胡12份，黄芩12份；将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至52℃，加入混合物料总重量8％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:1.5，控制温度至70℃保持4h，过滤，得第一滤液；添加滤渣2倍重量的水，控制温度90℃保持2h，然后降温至30℃，过滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比3:2合并,滤液真空浓缩后冷冻干燥、粉碎即得中草药提取物；

所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比5:3:1:0.5均匀混合。

酶活力单位定义：1mL粗酶液，于40℃、pH3.0条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，以U/mL表示。

3.霉菌培养物的制备：酸性蛋白酶制备时的发酵液经减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎即得霉菌培养物；所述霉菌培养物中活菌含量为9x10¹⁰CFU/g。

4.香辛料提取物的制备：

所述香辛料提取物的制备方法为：将香辛料清洗、沥干，加入其质量0.5倍的苹果醋润湿4h,于-18℃冷冻1.5h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度4cm，粉碎粒度2mm,接着加入香辛料质量2倍的苹果醋，在功率200W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间70s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度30℃，如此辐照10次，同时在功率300W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温2h,然后，在功率400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间90s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度50℃，如此辐照10次，同时在功率500W,频率50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度30kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率400Hz条件下进行高压脉冲电场(PEF)提取20min；充分搅拌提取液，密封，自然发酵4d，过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒度为0.2mm即得香辛料提取物；

所述香辛料的重量份数组成为：花椒25份，黑胡椒25份，草果12份，肉蔻12份，八角10份，小茴香9份，陈皮7份，肉桂4份，丁香3，沙姜干2份。

实施例2

一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，由以下重量份数的原料组成：蛋白酶30份，淀粉酶15份，植物提取物12份，霉菌培养物10份，半纤维素酶11份，果胶酶8份，植酸酶8份，酯酶7份，香辛料提取物6份，保护剂5份，激活剂5份，脱霉素2份，抗氧化剂0.4份；

所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：酸性蛋白酶70％，中性蛋白酶10％，碱性蛋白酶10％，耐盐谷氨酰胺酶10％；

所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：30％糖化酶，30％真菌α-淀粉酶，20％普鲁兰酶，10％β-淀粉酶，10％中温α-淀粉酶；

所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：30％耐温β-葡聚糖复合酶，30％β-葡聚糖复合酶，15％甘露聚糖酶，15％的木聚糖酶，10％的戊聚糖酶；

所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：60％酸性脂肪酶，15％中性脂肪酶，10碱性脂肪酶，10％酸性磷酸酶，5％磷酸酯酶；

所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌25份，氯化钙15份，硫酸钠15份，氯化镁8份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:灵芝多糖25份，海藻糖25份，NaCl15份，(NH₄)₂SO₄12份，半胱氨酸12份；

所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比3:3:2均匀混合；

所述酸性蛋白酶、植物提取物、霉菌培养物、香辛料提取物均为实施例1制备；

上述含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法，包括如下步骤：首先将所述保护剂、激活剂超微粉碎，随后立即依次加入蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、植酸酶、酯酶、植物提取物均匀混合，最后依次加霉菌培养物、香辛料提取物、抗氧化剂及脱霉素，混合均匀后密封包装即得含酸性蛋白酶的酱油复合酶。

实施例3

一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，由以下重量份数的原料组成：蛋白酶25份，淀粉酶10份，植物提取物10份，霉菌培养物5份，半纤维素酶10份，果胶酶6份，植酸酶6份，酯酶5份，香辛料提取物5份，保护剂4份，激活剂4份，脱霉素1份，抗氧化剂0.2份；

所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌20份，氯化钙10份，硫酸钠10份，氯化镁5份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:灵芝多糖20份，海藻糖20份，NaCl10份，(NH₄)₂SO₄10份，半胱氨酸10份；

所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比2:2:1均匀混合；

所述蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶同实施例2；

所述酸性蛋白酶、植物提取物、霉菌培养物、香辛料提取物均为实施例1制备；

上述含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法同实施例2。

实施例4

一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，由以下重量份数的原料组成：蛋白酶35份，淀粉酶20份，植物提取物15份，霉菌培养物15份，半纤维素酶12份，果胶酶10份，植酸酶9份，酯酶8份，香辛料提取物8份，保护剂6份，激活剂6份，脱霉素3份，抗氧化剂0.5份；

所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌30份，氯化钙20份，硫酸钠20份，氯化镁10份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:灵芝多糖30份，海藻糖30份，NaCl20份，(NH₄)₂SO₄15份，半胱氨酸15份；

所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比4:4:3均匀混合；

所述蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶同实施例2；

所述酸性蛋白酶、植物提取物、霉菌培养物、香辛料提取物均为实施例1制备；

上述含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法同实施例2。

实施例5

一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，由以下重量份数的原料组成：蛋白酶25份，淀粉酶20份，植物提取物15份，霉菌培养物5份，半纤维素酶10份，果胶酶10份，植酸酶9份，酯酶5份，香辛料提取物8份，保护剂4份，激活剂4份，脱霉素3份，葡萄籽原花青素0.2份；

所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌30份，氯化钙10份，硫酸钠10份，氯化镁10份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:灵芝多糖30份，海藻糖30份，NaCl10份，(NH₄)₂SO₄10份，半胱氨酸15份；

所述蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶同实施例2；

所述酸性蛋白酶、植物提取物、霉菌培养物、香辛料提取物均为实施例1制备；

上述含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法同实施例2。

实施例6酸性蛋白酶的热稳定性分析

将实施例1酸性蛋白酶发酵粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃下，60分钟酶活没有下降。55℃与60℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。65℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。70℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到原有酶活的75％。说明酸性蛋白酶热稳定性较强。

实施例7酸性蛋白酶的pH稳定性分析

将实施例1酸性蛋白酶发酵粗酶液分别置于pH值2.0、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液pH值2.0、2.5、3.5下，60分钟酶活没有下降。pH值4.5下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到90％。pH值5.5下，30分钟降到原有酶活的90％，60分钟降到85％。pH值6.0下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％，说明酸性蛋白酶耐pH范围较宽泛。

实施例8植物提取物对酸性蛋白酶酶活力的影响

采用本发明实施例1中酸性蛋白酶的制备方法，其它工艺条件、工艺参数、培养基等发酵条件完全相同，唯一区别是发酵培养基不加植物提取物，形成对比例，发酵完毕，采用同一检测方法测定发酵液酸性蛋白酶活力，检测结果如表1：

表1发酵液酸性蛋白酶活力

项目	实施例1	对比例	差异	增幅
					发酵液酸性蛋白酶活力	22000U/mL	14000U/mL	8000U/mL	57.14％

以上结果表明：本发明制备的植物提取物含有较高的酸性蛋白酶活力，发酵培养基中添加植物提取物，发酵液酸性蛋白酶活力可从14000U/mL提高至22000U/mL，酸性蛋白酶酶活力提高57.14％，同时也表明：本发明酱油复合酶中科学复配植物提取物，可提供丰富、全面的植物酶系。

实施例9抗氧化剂对酱油复合酶酶活力的影响

采用本发明实施例2制备的含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其它原料、原料组份、制备方法完全相同，唯一区别是原料组分不含抗氧化剂，形成对比例，分别于0℃和40℃条件下储存12个月，采用《GB/T23535-2009脂肪酶制剂》中检测方法测定酸性脂肪酶的酶活力，计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力的百分率，结果如表2

表2储存期复合酶中酸性脂肪酶酶活力损失率

以上结果表明，在0℃和40℃条件下储存12个月，实施例2中的酸性脂肪酶比对比例中的酸性脂肪酶酶活损失分别降低18％和65.6％，说明抗氧化剂的科学复配，显著提高了复合酶中各组分酶的活力，酶活损失大幅降低，尤其在高温条件下效果更加显著。

实施例10本发明霉菌培养物对黄曲霉菌孢子数的影响及产毒的抑制率、毒素分解率

将本发明实施例1制备的霉菌培养物与黄曲霉菌均以5％接种量在PDA液体培养基上31℃共同培养7天，形成试验组，对照组不接种霉菌培养物，其他培养条件完全相同，自第3天开始，每天测定发酵液黄曲霉菌孢子数和培养物孢子数及对黄曲霉菌产毒的抑制率，检测结果如表3，发酵终了，采用酶联免疫法分别测定对照组和试验组发酵液中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量，结果如表4

表3

表4

以上结果表明：本发明霉菌培养物可显著抑制黄曲霉霉菌的生长繁殖，抑制率为73-95％，有效降解黄曲霉毒素，对黄曲霉毒素B1的降解率为58.78％。

实施例11酱油复合酶对酿造酱油产量和质量的影响

一、试验地点：湖南某一酱油厂酿造车间。

二、试验时间：2013年10月8日-2014年4月8日，历时180天。

三、试验方案设计：1.试验为单因子设计，设置试验组和对照组，对照组和试验组的原料、工艺、设备、操作人员、环境及管理方式均相同，区别是：试验组在酱醅制作过程添加本发明实施例2-5制备的酱油复合酶，对照组不添加。2.按原料干重0.02-0.2％准确称取本发明实施例2-5制备的酱油复合酶，将其与45℃水按质量比1:10均匀混合，调整pH值为4，活化40min,与稀糖浆盐水混合后，加入酱油成曲制作成酱醅，保温发酵。3.对酱油产量和成品部分理化指标及卫生指标进行检测。4.试验组和对照组中每种复合酶(实施例2-5)各投料10批次，计算平均值。

四、检测结果

1.酱油复合酶对酱油产量的影响：投料量(豆粕、麸皮、面粉)1000kg，43℃发酵14天，复合酶添加量0.03％。

表5复合酶对酱油产量的影响单位：kg

复合酶	试验组	对照组	差异
				实施例2	3411	2665	28％
实施例3	3213	2634	22％
				实施例4	3355	2684	25％
实施例5	3127	2548	21％
				平均	3277	2633	24％

注：1.试验组和对照组均折合为二级酱油标准计算；2.套用油的在计算中减去套拥油的量。

以上结果表明，本发明酱油复合酶可显著提高酱油产量，与对照组相比，提高21-28％，平均提高酱油产量24％。

2.酱油复合酶对酱油质量的影响对上述试验组和对照组的成品酱油的主要质量指标：全氮、氨基态氮进行检测，计算全氮利用率和氨基酸生成率，同时聘请10位经验丰富的职业酿造师对成品酱油的综合口感进行100分值评分，其中香气、色泽、滋味、体态各占25分，试验组和对照组均取平均值，结果如表6

表6复合酶对酱油质量的影响

以上结果表明：本发明酱油复合酶可显著提高酿造酱油的口感，与对照组相比香味更浓，口感更醇厚、味更鲜，色泽和体态差异不大；可显著提高酿造酱油的全氮利用率和氨基酸生成率，与对照组相比，分别提高16.5％和18.4％；全氮和氨基态氮含量分别提高22.8％和32.9％。大大提高了原料利用率，降低了酿造酱油的生产成本。

Claims (10)

1.一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，由以下重量份数的原料组成：蛋白酶25-35份，淀粉酶10-20份，植物提取物10-15份，霉菌培养物5-15份，半纤维素酶10-12份，果胶酶6-10份，植酸酶6-9份，酯酶5-8份，香辛料提取物5-8份，保护剂4-6份，激活剂4-6份，脱霉素1-3份，抗氧化剂0.2-0.5份；

所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：酸性蛋白酶70％，中性蛋白酶10％，碱性蛋白酶10％，耐盐谷氨酰胺酶10％；

所述淀粉酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：30％糖化酶，30％真菌α-淀粉酶，20％普鲁兰酶，10％β-淀粉酶，10％中温α-淀粉酶；

所述半纤维素酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：30％耐温β-葡聚糖复合酶，30％β-葡聚糖复合酶，15％甘露聚糖酶，15％木聚糖酶，10％戊聚糖酶。

所述酯酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：60％酸性脂肪酶，15％中性脂肪酶，10碱性脂肪酶，10％酸性磷酸酶，5％磷酸酯酶；

所述激活剂是由如下质量组份的无机盐均匀混合而成：氯化锌20-30份，氯化钙10-20份，硫酸钠10-20份，氯化镁5-10份；

所述保护剂由以下重量份数的原料组成:灵芝多糖20-30份，海藻糖20-30份，NaCl10-20份，(NH₄)₂SO₄10-15份，半胱氨酸10-15份。

2.如权利要求1所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其特征在于，所述酸性蛋白酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO：M2013601的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将种子罐液体种子以5％接种量接入发酵罐培养基，培养温度31-32℃，搅拌速度200-400r/m，通风量1:1-2,培养时间10-12h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至26-30℃，搅拌速度400-600r/m，通风量1:1-3,恒温培养8-10h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至23-25℃，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,培养时间22-31h，然后，将种子罐液体种子以3％接种量追加接入发酵罐，最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至31-32℃，搅拌速度200-400r/m，通风量1:1-2,恒温培养10-12h；接着以1-2℃/h降温速率缓慢降温至23-25℃，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,恒温培养22-31h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体酸性蛋白酶。

3.如权利要求1所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其特征在于，所述植物提取物的制备方法为：将大麦芽和小麦芽按质量比4-6:1-3均匀混合，粉碎至粒度0.5-1mm,得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于超声波清洗机中在功率200W、频率30KHz条件下超声清洗5-10min，沥干，室温下破碎至粒度0.5-1mm，并按质量比5-7:2-4:1-3均匀混合，加入混合物质量2-4倍的粉碎麦芽得原料混合物，加入原料混合物质量1-3倍的水，用柠檬酸调节_pH值为3-4，在功率150-300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间60-80s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度20-35℃，如此辐照10次，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间90-105s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-60℃，如此辐照10次，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度25-35kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场提取15-20min；提取液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:1-2均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、低温粉碎即得植物提取物。

4.如权利要求1所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其特征在于，所述霉菌培养物活菌含量为7x10¹⁰-9x10¹⁰CFU/g。

5.如权利要求1所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其特征在于，所述香辛料提取物的制备方法为：将香辛料清洗、沥干，加入其质量0.1-1倍的苹果醋润湿2-6h,于-18—-22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎粒度0.5-3mm,接着加入香辛料质量1-3倍的苹果醋，在功率150-300W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间60-80s,进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度20-35℃，如此辐照10次，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；保温1-3h,然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波辐照总时间90-105s,进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-60℃，如此辐照10次，同时在功率300-500W,频率40-50KHz条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室温，于电场强度25-35kV/cm，脉冲时间400-600μs,脉冲频率300-500Hz条件下进行高压脉冲电场提取15-20min；充分搅拌提取液，密封，自然发酵3-5d，过滤，滤液减压浓缩、冷冻干燥、低温粉碎至粒度为0.1-0.3mm即得香辛料提取物。

6.如权利要求5所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其特征在于，所述香辛料的重量份数组成为：花椒20-30份，黑胡椒20-30份，草果10-15份，肉蔻10-15份，八角8-12份，小茴香8-10份，陈皮5-8份，肉桂3-5份，丁香2-4，沙姜干1-3份。

7.如权利要求1所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶，其特征在于，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物中的任一一种或几种组合。

8.如权利要求1所述一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先将所述保护剂、激活剂超微粉碎，随后立即依次加入蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶、植酸酶、酯酶、植物提取物均匀混合，最后依次加霉菌培养物、香辛料提取物、抗氧化剂及脱霉素，混合均匀后密封包装即得含酸性蛋白酶的酱油复合酶。

9.如权利要求8所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶的制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂为葡萄籽原花青素、迷迭香提取物和杏叶提取物按质量比2-4:2-4:1-3均匀混合。

10.如权利要求1所述的一种含酸性蛋白酶的酱油复合酶在酱油酿造中的应用。