CN105506113B - 快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法 - Google Patents

快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种采用特异性引物快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法，从600对芸薹属十字花科SSR共同引物中筛选出在杂交种亲本多态性良好的引物，进一步对茎瘤芥杂交种涪杂1号‑8号及其亲本筛选，最终筛选出两条引物SSR Na14‑G06和SSR Ol11‑G11，对茎瘤芥的特异性强，该两条引物结合引物SSR Ol13‑E03能较好的分辨出“涪杂1号‑8号”杂交种与亲本条带以及杂交种中混有的油菜、白菜和儿菜等杂株，具体包括：应用改良CTAB快速法提取茎瘤芥杂交种DNA；用筛选出的引物对杂交种DNA模板进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，准确率高，大大缩短了茎瘤芥杂交种纯度的鉴定周期，具有较强的实用性。

Description

快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于SSR引物快速鉴定茎瘤芥杂交种的方法。
背景技术
随着国家对商品种子标准的不断提高，种子生产单位也对自己生产的种子质量检测更为严格。为了确保种子质量，销售前必须对种子进行纯度检测。榨菜，又叫茎瘤芥，目前榨菜杂交种的检测是利用田间生物学性状进行鉴定，但此法周期长、成本高，容易受到外界环境和检测人员水平的影响，可靠性较低，从而难以适时准确指导。SSR分子标记技术直接反映品种的遗传基础差异，为种子的纯度鉴定提供了一种更为快速、高效的方法。具有试验操作简单、结果稳定可靠、引物序列易交流等优点，可以弥补和克服种子纯度的形态学鉴定及同工酶电泳鉴定中的许多缺陷和难题，是对种子纯度进行快速、准确鉴定的发展方向和必然选择。
目前作物品种鉴定和纯度分析的检验技术，已经从传统的形态学方法发展到了分子水平。田间种植鉴定结果可靠，但鉴定周期较长；常用的酯酶同工酶对大多数品种能保证纯度的鉴定，但对少数品种特别是杂种酶谱偏母本型的品种不能准确鉴定。在各种 DNA分子标记中，SSR 标记应用于杂交种的鉴定和种子纯度检测，具有很大的优越性，得到了广泛的应用。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，海量EST、SNP 数据被提交至数据库并共享，为SNP 的筛选创造条件,易于实现自动化。但是由于榨菜研究起步较晚，EST、SNP 数据较少，目前还不便于SNP 标记。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能快速、准确的鉴定茎瘤芥杂交种的SSR分子标记方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法，包括DNA提取、PCR扩增步骤，所述的PCR扩增步骤中的PCR反应体系中包括以下序列的引物：
SSR Na14-G06正义链序列：AAACGGCTTGCATTGTTCTC；
反义链序列：GGCTTGCTTGATCCAGTCTC；
SSR Ol11-G11正义链序列：GTTGCGGCGAAACAGAGAAG；
反义链序列：GAGTAGGCGATCAAACCGAG；
SSR Ol13-E03 正义链序列：CTCTGTTTCCTCTGCCCAAC；
反义链序列：AGGGAAGGAAAGGACACGAC
中的其中任意两种组合。
采用本发明技术方案的快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法，SSR Na14-G06、SSROl11-G11、SSR Ol13-E03仅是引物的代号，相当于人的姓名，便于区分引物，不具有实质含义，先从600对芸薹属十字花科SSR共同引物中筛选出在杂交种亲本多态性良好的引物，再对茎瘤芥杂交种涪杂1号-8号及其亲本筛选，最终筛选出两条引物SSR Na14-G06和SSROl11-G11，对茎瘤芥的特异性强，该两条引物结合引物SSR Ol13-E03能较好的分辨出“涪杂1号-8号”杂交种与亲本条带以及杂交种中混有的油菜、白菜和儿菜等杂株，准确率高，大大缩短了茎瘤芥（榨菜）杂交种纯度的鉴定周期，具有较强的实用性SSR分子标记鉴定方法稳定可靠，不受杂交种生长环境的影响。并将茎瘤芥的SSR片段多态性与检测种子纯度联系起来，可以准确筛选和鉴定茎瘤芥杂交种及常规品种。同时使用聚丙烯酰胺电泳的方法可以简便、快速、准确地应用于茎瘤芥种质资源多态性及同源性鉴定。
进一步，所述的SSR Na14-G06正义链序列的TM值为58、反义链序列的TM值为62，SSR Ol11-G11、SSR Ol13-E03的正义链序列和反义链序列的TM值均为62。
进一步，所述的PCR反应体系中的还包括以下各组分：15μl：1×缓冲液，2.5μmol/LMgCl2、150μmol/L dNTP、1U DNA聚合酶和100 ng DNA模板，所述的每个引物含量为0.2μmol/L。
进一步，所述的PCR扩增的方法为：95℃预变性5min，1个循环；95℃预变性40s，62℃退火30 s，72℃延伸1min，每个循环降1℃，共11个循环；95℃预变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃再延伸5 min；4℃低温保存。
附图说明
图1是本发明中引物SSR Na14-G06扩增图；
图2是本发明中引物SSR Ol13-E03扩增图；
图3是本发明中引物SSR Ol11-G11扩增图。
具体实施方式
本发明快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法的实施例，其操作步骤具体如下：
一、试剂配制
1、DNA提取试剂配制
1M Tris-HCl(pH8.0)：浓HCl 42ml，Tris 121.1g定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存；注意：在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0.03个单位；
2×CTAB 配制如表1所示：
表1
成分 已有溶液浓度 终浓度 配1000ml所加量
CTAB 2% 20g
Tris-H（pH8.0） 1M 100mM 100 mL
EDTA 0.5M 20 mM 40 mL
NaCl 5M 1.4M 280 mL
（1）0.5Mol/L EDTA（PH8.0）：在800ml水中溶解186.1g二水乙二胺四乙酸二钠,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节PH值至8.0（约加入20g的NaOH），然后定容至1L，高压灭菌，室温保存。注意：二水乙二胺四乙酸二钠只有在PH值达到8.0的时候，才会慢慢溶解。
（2）1Mol/L Tris-HCl（PH8.0）：在800mL水中溶解121.1gTris碱，在溶解后至室温再调PH值，加入浓盐酸42mL调节PH值至PH8.0。加水定容1L，高压灭菌。注意：如果溶液呈现黄色，应丢弃。PH值因温度而异。随温度升高而降低。
（3）植物总DNA提取缓冲液：量取1Mol/L Tris-HCl（PH8.0）11ml，0.5Mol/L EDTA（PH8.0）5mL，称取NaCl8.2g，CTAB 4g。加水定容至100mL，高压灭菌。
（4）氯仿/异戊醇混合液：氯仿/异戊醇按24:1（V/V）混合。
2、PCR扩增试剂配制：
引物：用超纯水分别配制每种引物的左引物（L）和右引物（R）终浓度均为20μM/μl的工作液。
3、聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳及银染试剂配制：
（1）10×TBE电泳缓冲液：称取Tris108g,硼酸55g，量取EDTA0.5M(PH＝8.0)40mL，补水至1L。
（2）2％APS：称取2gAPS，补水至100mL。
（3）Acry: Bisacri (29:1)：取丙烯酰胺 145g和 Bisacry 5g，先用400mL去离子水溶解后，再加水定容至500ml。
（4）10%聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶:Acry:Bisacry(29:1) 25mL，TBE15ml，过硫酸铵（APS）1000μL，TEMED100μL，ddH2O35mL。
（5）固定液：140mL无水乙醇，10mL冰乙酸，加双蒸水1300mL，混匀。
（6）银染液：3gAgNO3，加1500mL双蒸水，混匀。
（7）显影液：1500mL双蒸水中加40g NaOH和4～5mL甲醛，混匀。
二、茎瘤芥杂交种“涪杂1-8号”种子的选择。
“涪杂1-8号”及其亲本材料均为重庆市渝东南农业科学院配制杂交种。随机选取杂交种若干，用培养皿垫滤纸进行发芽实验，中间只添加自来水若干，保持滤纸湿润，待发芽4-7天后作为本发明使用的材料。分别编号涪杂1号、1号母本、1号父本；涪杂2号、2号母本、2号父本；涪杂3号、3号母本、3号父本；涪杂4号、4号母本、4号父本；涪杂5号、5号母本、5号父本；涪杂6号、6号母本、6号父本；涪杂7号、7号母本、7号父本；涪杂8号、8号母本、8号父本。其中机械混杂的油菜、白菜、和儿菜也分别编号。
三、样品DNA提取和杂交种的总DNA提取，具体步骤如下：
1、 CTAB法提取DNA样品：
（1） 液氮研磨1g的榨菜叶片，转移到离心管中，改用研磨枪在冰上研磨，加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。
（2）加入500µL的60℃(或65℃) 预热的2×CTAB，颠倒混合均匀后在60℃（或65℃）水浴30min-1h小时，其间要上下颠倒混匀数次。
（3）取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。
（4）12000转速离心5-10min，将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上，离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿。
（5）用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层，尽量避免吸取到下层液体。若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。
（6）在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀，沉淀至少15分钟至过夜，时间越长，DNA的产量越多，污染也越多。
（7）12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。
（8）12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。
（9）在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。
（10）-20℃— -70℃低温保存。
2、改进的CTAB法提取杂交种的总DNA提取：选取发芽4-7天的嫩苗，每株置于研钵中，加入400uL CTAB快速研磨(在研磨的时候可能有泡沫产生，先加200uL磨，然后再加200uL捣一下)，转移匀浆至1.5mL离心管中，加入40ul5M醋酸钾和400uL氯仿，混匀，5000rpm离心10分钟，取上清于新的离心管中，加入2/3体积的异丙醇（或加入2-3倍体积的无水乙醇），混匀，12000rpm离心，沉淀用75%洗1-2次，晾干，加入50ul 灭菌水，溶液就可以进行种子纯度鉴定。
四、样品PCR扩增反应。
分别用筛选出的20对特异性引物对所有杂交种进行PCR扩增，
引物序列分别是：
SSR Na14-G06正义链序列：AAACGGCTTGCATTGTTCTC；
反义链序列：GGCTTGCTTGATCCAGTCTC；
SSR Ol11-G11正义链序列：GTTGCGGCGAAACAGAGAAG；
反义链序列：GAGTAGGCGATCAAACCGAG；
SSR Ol13-E03 正义链序列：CTCTGTTTCCTCTGCCCAAC；
反义链序列：AGGGAAGGAAAGGACACGAC。
其反应条件如下:
PCR反应体系为15μl：1×缓冲液，2.5μmol/L MgCl2、150μmol/L dNTP、0.2μmol/L引物、1U Tag酶和100 ng DNA摸板。
PCR反应程序为：95℃预变性5min 1个循环；95℃预变性40s，62℃退火30 s，72℃延伸1min，每个循环降1℃，共11个循环；95℃预变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃再延伸5 min；4℃低温保存；
PCR反应体系经PCR反应后得到PCR产物。
五、聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳及银染。1．PAGE 凝胶的制作
（1）将厚度为1.5mm的两块干净玻璃板配对组装到1mm的制胶条中，在台面平整后，用1%琼脂粉对玻璃板进行热封。
（2）待底部琼脂粉密封条凝固后，以保持密封状态，水平放置于台面上。
（3）将配置好的PAGE制胶液缓慢地倾斜倒入两块玻璃板的中间，并避免产生气泡，***梳齿，仔细观察玻板是否有侧漏，及时用制胶液补充，以免凝胶聚合产生气泡或凝胶收缩而使梳孔不完整从而影响后续实验。
（4）待凝胶聚合完毕后，可观察到梳孔完全成型，松开夹子，将制好的凝胶泡入1×TBE溶液中待用。2．PAGE 凝胶电泳
（1）将制好的PAGE凝胶按要求装入电泳槽中，加入适量的1×TBE电泳缓冲液，拔出梳齿，并观察加样孔是否有气泡产生，如有气泡产生，则需要用针筒将所有孔内气泡赶出，以免影响上样。
（2）用DNA Ladder点到不同板上不同位置，以标识上样次序及分子量大小，将适量的PCR产物分别上样到各个加样孔中，根据PCR产物的大小选择适宜的电泳条件，本研究中PCR产物大小约为150bp-700bp左右，因此均选用电压300V，电流为200mA来进行电泳70-120分钟。
3．银染
（1）电泳完毕后，按顺序拆卸胶板，小心撬开两块玻璃板，除去琼脂糖密封条，将凝胶置入固定液中，50rpm振荡固定12-15分钟。
（2）倒去固定液，并用蒸馏水冲洗一遍，加入银染液，50rpm振荡染色12分钟；将 染色液倒入专门的废液瓶中回收利用，凝胶用蒸馏水冲洗一遍。
（3）加入蒸馏水脱色30秒；50rpm振荡，然后用蒸馏水冲洗两遍。
（4）加入显影液，50rpm显影至清晰条带出现为止，倒去显影液，加入蒸馏水终止反应，在灯座上观察并照相保存。
六、每个杂交种的鉴定选择其中两个引物来鉴定。其中，涪杂1号、涪杂3号、涪杂5号、涪杂6号和涪杂8号，选用引物SSR Ol13-E03和SSR Ol11-G11同时鉴定；涪杂2号、涪杂4号和涪杂7号，选用引物SSR Na14-G06和SSR Ol11-G11同时鉴定，鉴定的具体操作为：
1、茎瘤芥杂交种涪杂1号检测：设定检测种子总数为W，首先应用引物SSR Ol11-G11进行扩增，有出现黑框表示条带即为机械混杂种子，统计数量为X；然后应用SSR Ol13-E03引物进行扩增，在杂交种检测电泳条带中，同“涪杂1号”扩增条带一致的即为杂交种，其余均为杂株，其中，同“1号母本”条带一致的为混入母本杂株，统计为Y,同“1号父本”条带一致的为混入父本杂株，统计为Z；同时可进一步检验机械混杂杂株与SSR Ol13-E03中检测黑框中C相同的即为油菜杂株，与黑框中D相同的即为儿菜杂株，与黑框中E相同的既为白菜杂株；最终检测涪杂1号纯度为(W-X-Y-Z)/W*100%。
2、茎瘤芥杂交种涪杂2号检测：设定检测种子总数为W，首先应用引物SSR Ol11-G11进行扩增，有出现黑框表示条带即为机械混杂种子，统计数量为X；然后应用SSR Na14-G06引物进行扩增，在杂交种检测电泳条带中，其中，同“涪杂2号”扩增条带一致的即为杂交种，其余均为杂株，同“2号母本”条带一致的为混入母本杂株，统计为Y,同“2号父本”条带一致的为混入父本杂株，统计为Z；同时可进一步检验机械混杂杂株与SSR Na14-G06中检测油菜相同的即为油菜杂株，与儿菜相同的即为儿菜杂株，与白菜相同的既为白菜杂株；最终检测涪杂1号纯度为(W-X-Y-Z)/W*100%。
3、茎瘤芥杂交种涪杂3号检测方法同涪杂1号检测。
4、茎瘤芥杂交种涪杂4号检测方法同涪杂2号检测。
5、茎瘤芥杂交种涪杂5号检测方法同涪杂1号检测。
6、茎瘤芥杂交种涪杂6号检测方法同涪杂1号检测。
7、茎瘤芥杂交种涪杂7号检测方法同涪杂2号检测。
8、茎瘤芥杂交种涪杂8号检测方法同涪杂1号检测。
检测结果如下：
如图1所示，对茎瘤芥杂交种涪杂2号田间检测同电泳结果一致，其中田间性状表现为涪杂2号母本，与图1中下标箭头代表2号母本电泳结果一致；田间性状表现为涪杂2号父本，与上标箭头代表2号父本电泳结果一致；田间性状表现为茎瘤芥杂交种涪杂2号，与圆圈内指涪杂2号电泳条带一致；田间性状表现为油菜，与黑框内A条带表示机械混杂油菜电泳结果一致；田间性状表现为儿菜，与黑框内B条带表示机械混杂儿菜电泳结果一致；田间性状表现为白菜，与黑框内C条带表示机械混杂白菜电泳条带一致。
如图2所示，对茎瘤芥杂交种涪杂1号田间检测同电泳结果一致，其中田间性状表现为涪杂1号母本，与图1中下标箭头代表1号母本电泳结果一致；田间性状表现为涪杂2号父本，与上标箭头代表1号父本电泳结果一致；田间性状表现为茎瘤芥杂交种涪杂1号，与圆圈内指涪杂1号电泳条带一致；田间性状表现为油菜，与黑框内D条带表示机械混杂油菜电泳结果一致；田间性状表现为儿菜，与黑框内E条带表示机械混杂儿菜电泳结果一致；田间性状表现为白菜，与黑框内F条带表示机械混杂白菜电泳条带一致。
如图3所示，田间性状表现为油菜，与黑框内G条带表示机械混杂油菜电泳结果一致；田间性状表现为儿菜，与黑框内H条带表示机械混杂儿菜电泳结果一致；田间性状表现为白菜，与黑框内K条带表示机械混杂白菜电泳结果一致；其中机械混杂的杂株中都有黑框内显示的条带，而茎瘤芥中未含有该条带。
涪杂3号、涪杂5号、涪杂6号、涪杂8号，检测电泳条带类型同涪杂1号。
涪杂4号和涪杂7号，检测电泳条带类型同涪杂1号。
由此可见：经验证田间鉴定结果与SSR鉴定结果基本一致，而且SSR鉴定能更准确鉴定杂交种的纯度，不受环境影响，结果更可靠。田间检测对检验者经验要求严格，由于田间检验经常是在播种后40天左右进行检测，植株的农艺性状还未完全显示，尤其是父母亲本与杂交种较难分辨，有时会判断失误。本发明选择4-7天苗龄和茎瘤芥植株充分表现后验证检测，电泳条带一致，计算纯度结果一致。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (1)

1.快速鉴定茎瘤芥杂交种纯度的方法，包括DNA提取、PCR扩增步骤，其特征在于：所述的PCR扩增步骤中的PCR反应体系中包含以下序列的引物：
SSR Ol11-G11正义链序列：GTTGCGGCGAAACAGAGAAG；
反义链序列：GAGTAGGCGATCAAACCGAG；
另外，还包括以下序列的引物：
SSR Na14-G06正义链序列：AAACGGCTTGCATTGTTCTC；
反义链序列：GGCTTGCTTGATCCAGTCTC；
SSR Ol13-E03正义链序列：CTCTGTTTCCTCTGCCCAAC；
反义链序列：AGGGAAGGAAAGGACACGAC
中的任意一种；
所述的SSR Na14-G06正义链序列的TM值为58℃、反义链序列的TM值为62℃，SSR Ol11-G11、SSR Ol13-E03的正义链序列和反义链序列的TM值均为62℃；
所述的PCR反应体系中的还包括以下各组分：15μL：1×缓冲液，2.5μmol/L MgCl2、150μmol/L dNTP、1U DNA聚合酶和100ng DNA模板，每个引物含量为0.2μmol/L；
所述的PCR扩增的方法为：95℃预变性5min，1个循环；
95℃预变性40s，62℃退火30s，72℃延伸1min，每个循环降1℃，共11个循环；95℃预变性40s，52℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃再延伸5min；4℃低温保存。
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利用SSR标记构建萝卜种质资源分子身份证;邱杨等;《植物遗传资源学报》;20140408;第15卷(第3期);摘要，表2 *
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