CN103233066A

CN103233066A - 一种巨龙竹不同类型种源分子标记鉴定方法

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Publication number: CN103233066A
Application number: CN2013101313259A
Authority: CN
Inventors: 杨汉奇; 董禹然
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种巨龙竹秆型SSR分子标记鉴定方法。主要包括：筛选SSR引物，从115对巨龙竹SSR引物中筛选出在不同秆型间多态性良好的引物，用于巨龙竹秆型鉴定；用改进的CTAB法提取样品DNA；用筛选出的引物对样品DNA模板进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；将有效性和特异性好的扩增产物上毛细管电泳读出其等位基因类型；根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，进行准确的秆型鉴定。本发明还公开了对本方法的可靠性验证。本发明提供的鉴定巨龙竹秆型的SSR分子标记方法稳定可靠，不受巨龙竹生长环境的影响，可以简便、快速、准确、高通量地应用于巨龙竹通直型优质种源的鉴定。

Description

一种巨龙竹不同类型种源分子标记鉴定方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种种源鉴定方法，具体涉及一种基于SSR分子标记鉴定巨龙竹秆型的方法。

背景技术

巨龙竹（Dendrocalamus sinicus Chia et J. L. Sun）是世界上目前已知最高大的竹种，特有分布于滇南、滇西南的局部区域，具有较高的经济价值。巨龙竹种质资源分为秆形特征基本稳定2个明显不同的变异类型，即竹秆弯曲、歪扭，竹节变形、缩短的弯曲型巨龙竹和节间正常、节部平滑，竹秆通直、分枝高而少的通直型巨龙竹。

造成巨龙竹秆形差异的原因，主要是遗传因素（杜凡等，巨龙竹的变异类型及其引种区划的研究，2001，竹子研究汇刊，20（1）：19-21）。分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反应。目前,分子标记技术已成为揭示植物种内遗传变异广泛应用的技术。

简单序列重复（single sequence repeat）简称SSR或微卫星（microsatellite）序列，大量地存在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非编码区和编码区中，由串联的1-6 个核苷酸重复片段构成，长度一般在100bp 以下，具有长度的可变性。简单重复序列分布于巨龙竹整个基因组的不同位置上，不同表现型个体间每个位点上重复单位数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列的两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计双向引物。

通直型巨龙竹秆形特征是竹材工业化利用的优良指标，而弯曲型则不宜工业化利用。由于巨龙竹生长范围狭窄，当前有关巨龙竹的研究手段和方法相对落后。目前，还没有公开文献资料发表关于巨龙竹种源鉴定的方法。因此，发明一种可以鉴定遗传稳定的通直型优良种源的方法是当前巨龙竹推广栽培所急需解决的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种能快速、准确的鉴定巨龙竹种源类型的SSR分子标记方法。为实现本上述目的，本发明提供了如下技术方案，包括以下步骤。

（1）SSR引物筛选：从发明人前期设计的115对巨龙竹SSR引物中筛选特异性引物。

（2）选取拟鉴定的巨龙竹样品叶片，采用改进的CTAB法提取总DNA。

（3）用筛选出的引物分别对样品DNA模板进行PCR扩增。

（4）检测PCR扩增产物的有效性和特异性。

（5）用扩增效果良好的PCR产物上毛细管电泳，检测等位基因类型。

（6）根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，确定样品的秆型。

上述方法，步骤（1）所述的特异性引物的要求是，等位基因类型在通直型和弯曲型个体之间有显著多态性，即等位基因类型不同时为纯合子或杂合子，特异性好，没有明显杂峰。筛选出的5对SSR特异性引物，其核苷酸序列如下表1。

上述方法，步骤（3）所述的PCR扩增反应，采用如下反应体系：

20μl体系，包含10μL2×Taq PCR MasterMix，正反引物（5ng/μl）各0.32μl，DNA(50ng/μL)0.6μl,补足ddH₂O至20μl。

上述方法，步骤（3）所述的PCR扩增反应，采用如下反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，引物退火温度退火40s，72℃延伸50s，运行35个循环；72℃延伸7min，4℃低温保存。

上述PCR反应程序，每对引物退火温度如下表2。

上述方法，步骤（4）所述的PCR扩增产物的检测采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；有效性是指，有扩增产物；特异性是指，扩增产物只有1到2条清晰的条带。

上述方法，步骤（5）所述的毛细管电泳采用QIAxcel毛细管电泳***。

上述方法，步骤（6）所述巨龙竹的基因型与秆型的相关性，即不同基因型与两种秆型之间的对应关系，如下表3。

注：上述鉴定方法，当出现5对引物同时鉴定有差异情况，规定占多数的鉴定结果即为该样品最终的鉴定结果。

有益效果：本发明提供的SSR分子标记鉴定方法稳定可靠，不受巨龙竹生长环境的影响。并将巨龙竹的SSR片段多态性与秆型联系起来，可以准确筛选和鉴定巨龙竹优质种源。同时使用毛细管电泳的方法可以简便、快速、高通量地应用于巨龙竹通直型优质种源鉴定。

附图说明

图1：引物Den006扩增弯曲型样品的毛细管电泳峰图。

图2：引物Den006扩增通直型样品的毛细管电泳峰图。

图3：引物Den007扩增弯曲型样品的毛细管电泳峰图。

图4：引物Den007扩增通直型样品的毛细管电泳峰图。

图5：引物Den036扩增弯曲型样品的毛细管电泳峰图。

图6：引物Den036扩增通直型样品的毛细管电泳峰图。

图7：引物Den058扩增弯曲型样品的毛细管电泳峰图。

图8：引物Den058扩增通直型样品的毛细管电泳峰图。

图9：引物Den096扩增弯曲型样品的毛细管电泳峰图。

图10：引物Den096扩增通直型样品的毛细管电泳峰图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：云南省孟连县勐马镇巨龙竹样品采集。

选取新鲜且无病虫害的叶片，采摘后，对叶片材料进行快速硅胶干燥。分别选取弯曲型和通直型竹丛（丛1为弯曲型，丛2为通直型），每个竹丛各采3个样品，分别编号1-a、1-b、1-c；2-a、2-b、2-c。

实施例2：样品DNA提取采用改进的CTAB法提取巨龙竹样品的总DNA，具体步骤如下。

（1）用干净的镊子取少量硅胶干燥的样品叶片于对应编号的2ml离心管中。尽量取颜色鲜绿干净的叶片。

（2）研钵、杵子灼烧灭菌，4×CTAB 高压灭菌（120℃）。

（3）戴上一次性手套,将样品放于研钵中，加液氮半钵，加PVP粉少许（抗氧化），将材料研磨成粉末，将粉末转移到2ml离心管中，放于冰上暂存（每磨一个样换一次手套）。

（4）在离心管中加入预热到65℃的4×CTAB提取液1ml，再加入20ul DTT，混匀。

（5）在65℃水浴锅中水浴1小时，每隔10分钟取出横向摇匀几下。

（6）待样品冷却至室温，加入1ml氯仿-异戊醇（24：1）摇匀8分钟，然后12000r/min离心8分钟。

（7）将上清液转移到新的离心管钟，再加入1ml氯仿－异戊醇（24：1），上下颠倒摇匀8分钟，12000r/min离心8分钟。

（8）将上清液转移到新的1.5ml离心管钟，加入其体积70％的纯异丙醇（700ul，-20℃），沉降DNA，轻轻颠倒2－3次，可见白色絮状沉淀，-20℃放30分钟以上，12000r/min离心10分钟，弃上清液。

（9）加入500ul75℃乙醇洗涤2次，12000r/min离心5分钟，弃除乙醇。

（10）通风橱内吹干残余乙醇，然后加入100ul ddH₂O和2ul 10mg/ml RNase，37℃消化1.5-2小时，最后-20℃保存。

（11）用紫外分光光度计检测DNA浓度，并稀释到50ng/μL工作液。

实施例3：样品PCR扩增反应。

分别用5对特异性引物对所有样品DNA进行PCR扩增，其反应条件如下。

（1）反应体系：PCR反应为20μL体系，包含10μL2×Taq PCR MasterMix，正反引物（5ng/μL）各0.32μL，DNA(50ng/μL)0.6μL,补足ddH₂O至20μL。

（2）反应程序： 94℃预变性3min；94℃变性30s，引物退火温度退火40s，72℃延伸50s，运行35个循环；72℃延伸7min，4℃低温保存。

（3）5对引物的退火温度，如表2。

实施例4：聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳及银染。

1．PAGE 凝胶的制作。

（1）将厚度为1.5mm的两块干净玻璃板配对组装到1mm 的制胶条中，在台面平整后，用含有1%琼脂糖的1X TBE 溶液对玻璃板进行热封。

（2）待底部琼脂糖密封条凝固后，在胶条两侧各用一个夹子夹住，以保持密封状态，水平放置于台面上。

（3）将配置好的PAGE 制胶液缓慢地倒入两块玻璃板的中间，并避免产生气泡，***梳齿，仔细观察玻板是否有侧漏，及时用制胶液补充，以免凝胶聚合产生气泡或凝胶收缩而使梳孔不完整从而影响后续实验。

（4）待凝胶聚合完毕后，可观察到梳孔完全成型，松开夹子，将制好的凝胶泡入1×TBE 溶液中，使凝胶继续老化2个小时以上，便于凝胶完全聚合形成稳定的结构，待用。

2．PAGE 凝胶电泳。

（1）将制好的PAGE 凝胶按要求装入电泳槽中，加入适量的1×TBE 电泳缓冲液，拔出梳齿，并观察加样孔是否有气泡产生，如有气泡产生，则需要用针筒将所有孔内气泡赶出，以免影响上样。

（2）用50bpDNA Ladder 点到不同板上不同位置，以标识上样次序及分子量大小，将适量的PCR 产物分别上样到各个加样孔中，根据PCR 产物的大小选择适宜的电泳条件，本研究中PCR产物大小约为100bp-300bp左右，因此均选用电压200V，电流为200mA 来进行电泳70-120分钟。

3．银染。

（1）电泳完毕后，按顺序拆卸胶板，小心撬开两块玻璃板，除去琼脂糖密封条，将凝胶置入固定液中，50rpm振荡固定10分钟。

（2）倒去固定液，并用蒸馏水冲洗一遍，加入银染液，50rpm 振荡染色10分钟；将染色液倒入专门的废液瓶中回收利用，凝胶用蒸馏水冲洗一遍。

（3）加入脱色液脱色30秒；倒去脱色液，用蒸馏水冲洗两遍。

（4）加入显影液，50rpm显影至清晰条带出现为止，倒去显影液，加入蒸馏水终止反应，在灯座上观察并照相保存。

实施例5：主要试剂配制。

5.1 DNA提取试剂配制。

5.1.1 0.5Mol/l EDTA（PH 8.0）：在800ml水中溶解186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节PH值至8.0（约加入20g的NaOH颗粒），然后定容至1L，高压灭菌，室温保存。

注意：二水乙二胺四乙酸二钠只有在PH值达到8.0的时候，才会慢慢溶解。

5.1.2 1Mol/L Tris-HCl（PH 8.0）：在800ml水中溶解121.1gTris 碱，在溶解后至室温再调PH值，加入浓盐酸42ml调节PH 值至PH 8.0 。加水定容1L，高压灭菌。

注意：如果溶液呈现黄色，应丢弃。PH值因温度而异。随温度升高而降低。

5.1.3 DTT：在32.4ml水中溶解5gDTT，分成小份贮存于 -20℃冰箱中备用。

5.1.4 植物总DNA提取缓冲液：量取1Mol/L Tris-HCl（PH 8.0）11ml，0.5 Mol/l EDTA（PH 8.0）5ml，称取NaCl 8.2g,CTAB 4g。加水定容至100ml，高压灭菌。

5.1.5 氯仿/异戊醇混合液：氯仿/异戊醇按24:1（V/V）混合。

5.2 PCR扩增试剂配制。

5.2.1引物：用超纯水分别配制左引物（L）和右引物（R）终浓度均为5ng/μl的工作液。

5.3聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳及银染试剂配制：

5.3.1 10×TBE 电泳缓冲液1（l）：称取Tris108g,硼酸55g，量取EDTA0.5M(PH＝8.0)40ml，补水至1l。

5.3.2 10％APS：称取10gAPS，补水至100ml。

5.3.3 Acry: Bisacri (29:1)：取Acry 190g和Bisacry 10g，先用400 ml去离子水溶解后，再加水定容至500ml。

5.3.4 8%聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶: Acry:Bisacry(29:1) 5ml，TBE 2.5ml，过硫酸铵（APS）180μl，TEMED 16μl，ddH2O 17.5ml。

5.3.5固定液:400ml蒸馏水中加入40 ml乙醇和2ml乙酸，混匀。

5.3.6银染液:400ml蒸馏水中加入4ml20%AgNO₃，混匀。

5.3.7脱色液:400ml蒸馏水中加入80μl10% Na₂S₂O₃，混匀。

5.3.8显影液:400ml蒸馏水中加入40ml15%NaOH和2ml甲醛，混匀。

实施例6：毛细管电泳经聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测显示只有一到两条带，且条带清晰的PCR产物上毛细管电泳（QIAxcel System）,导出数据。

数据结果如下表4。

实施例7：鉴定样品杆型对照表3中的对应关系，判断每个样品的秆型，结果如下表5。

由上表结果得出结论：丛1为弯曲型，丛2为通直型。鉴定结果与样品采集信息一致。

上述实例描述是为了便于理解和应用本发明，根据本发明的方法，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杨汉奇、董禹然

<120> 一种巨龙竹不同类型种源分子标记鉴定方法

<130> 2013

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 1

gtcaggaggc acaacaaaat 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 2

gacctctgct ttcggataa 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 3

aaacaaagcc agtactcaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 4

ctaaccctga gcgtgaccac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 5

atctaggtgg tatgaacaat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 6

cgtatgtatt tgtgtatcgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 7

tgtgctattc tgtgttgatt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 8

gctttcattt actgccctct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 9

agaagaaggg aactcacaaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 巨龙竹（Dendrocalamus sinicus）

<400> 10

atgtgttttt tcggggattg 20

Claims

1.一种巨龙竹秆型的SSR分子标记鉴定方法，包括以下步骤：SSR引物筛选，筛选5对特异性引物；选取拟鉴定的巨龙竹样品叶片，采用改进的CTAB发提取总DNA；分别用每一对引物对样品DNA模板进行PCR扩增；将PCR 产物进行电泳检测，检测产物的有效性、特异性；用扩增效果良好的PCR产物上毛细管电泳，检测等位基因类型；根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，确定样品的秆型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的筛选SSR引物要求是，等位基因类型在通直型和弯曲型个体之间有显著多态性，即等位基因类型不同时为纯合子或杂合子，特异性好，没有明显杂峰。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的SSR引物是从发明人根据巨龙竹序列设计115对SSR引物中筛选得到的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，进行PCR扩增时，采用下述扩增体系：20μl体系，10μl2×Taq PCR MasterMix，正反引物（5ng/μl）各0.32μl，DNA(50 ng/μl)0.6μl,补足ddH₂O至20μl。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，进行PCR扩增时，采用下述扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，引物退火温度退火40s，72℃延伸50s，运行35个循环；72℃延伸7min，4℃低温保存。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的PCR扩增产物进行的电泳检测采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的毛细管电泳采用QIAxcel毛细管电泳***。

8. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：筛选得到的SSR特异性引物，其核苷酸序列如下表。

Figure 2013101313259100001DEST_PATH_IMAGE001

9. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述每对引物采用退火温度分别为：Den006,61℃；Den007,61℃；Den036,50℃；Den058,48℃；Den096,52℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（6）中，各对引物等位基因类型和巨龙竹秆型的对应关系如下表。