CN105274189B - 棉花杂交种亲子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种棉花杂交种亲子鉴定方法，该方法使用分布于棉花基因组26条染色体的36对SSR核心引物(Seq ID No.1‑72)，通过对两个亲本与待测杂交种进行DNA指纹检测，采用亲权排除位点与双亲杂合位点统计分析后鉴定假设杂交种与亲本的亲子关系。本发明方法操作简单，准确稳定，适用于棉花杂交种亲子关系快速鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种棉花杂交种亲子鉴定方法。
背景技术
棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。近年来，随着棉花杂交育种工作的迅速开展，加上杂交种所表现出的杂种优势，棉花杂交种在我国得到了广泛的推广与种植。棉花杂交种具有高产、优质、抗逆性强等优良特征特性，一般较常规品种增产15％左右。然而，棉花杂交种生产为劳动密集型产业，制种成本相对较高，杂交种子棉收购价格一般是普通常规棉种的4-5倍，受利益的驱动，即使在管理严格的情况下，以常规种(或亲本)冒充杂交种、或其他杂交种冒充畅销杂交种等掺杂使假的现象仍时有发生。依据形态性状进行杂交种田间鉴定的传统手段时效性差，且容易受到环境与主观因素的影响，杂交种市场混乱的局面难以得到有效控制。
近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简单重复序列(SSR)标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性，SSR标记已成为品种鉴定首选技术之一。
由于SSR标记是共显性标记，因此，如果杂交种与亲本间存在亲子关系，则杂交种的谱带必须由两个亲本提供。如果假设杂交种的某位点表现的谱带在对应的两个假设亲本上均没有出现，这种不符合孟德尔遗传分离规律的位点即为亲权排除位点，亲权排除位点数越多，表明亲本与杂交种存在亲子关系的可能性越低。反之，如果假设杂交种的某位点表现的带型为两个假设亲本上谱带的杂合互补带型，且两个假设亲本在该位点表现为不一样的带型，这种符合孟德尔遗传分离规律的位点即为双亲杂合位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花杂交种亲子鉴定方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供用于鉴定棉花杂交种的SSR-PCR引物组合，
本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的，所述引物组合由下列引物对中的两种或两种以上组成：
NAU3254-F和NAU3254-R、NAU2277-F和NAU2277-R、NAU1190-F和NAU1190-R、NAU1071-F和NAU1071-R、MUCS101-F和MUCS101-R、NAU934-F和NAU934-R、NAU1200-F和NAU1200-R、NAU874-F和NAU874-R、NAU905-F和NAU905-R、NAU1362-F和NAU1362-R、BNL3257-F和BNL3257-R、BNL1317-F和BNL1317-R、BNL2960-F和BNL2960-R、BNL1231-F和BNL1231-R、BNL3442-F和BNL3442-R、BNL3261-F和BNL3261-R、BNL1421-F和BNL1421-R、BNL2449-F和BNL2449-R、CIR246-F和CIR246-R、NAU2437-F和NAU2437-R、BNL830-F和BNL830-R、JESPR292-F和JESPR292-R、NAU1167-F和NAU1167-R、NAU1028-F和NAU1028-R、CIR216-F和CIR216-R、NAU3110-F和NAU3110-R、BNL3646-F和BNL3646-R、BNL3171-F和BNL3171-R、NAU1103-F和NAU1103-R、BNL4030-F和BNL4030-R、BNL3140-F和BNL3140-R、JESPR110-F和JESPR110-R、NAU1125-F和NAU1125-R、BNL827-F和BNL827-R、NAU3588-F和NAU3588-R、CIR170-F和CIR170-R，其中，F表示上游引物，R表示下游引物；上述引物对的核苷酸序列分别如Seq ID No.1-72所示。
本发明还提供含有上述引物组合的鉴定棉花杂交种的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明还提供一种棉花杂交种亲子鉴定方法，包括以下步骤：
1)分别提取亲本棉花以及待测棉花杂交种籽粒样品中的DNA；
2)分别以步骤1)中提取的DNA为模板，利用上述引物组合进行PCR扩增反应；
3)分析亲本及杂交种的PCR扩增产物。
PCR反应体系以20μl计为：含1.5mmol/L Mg2+的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mMdNTPs0.8μl，20μM上、下游引物各0.15μl，2.5U/μl TaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH2O补齐至20μl。
PCR反应条件为：95℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃2分钟，共30个循环；72℃7分钟。
步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
优选地，步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μl TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
步骤3)中分析PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(恒功率90W电泳1h)，然后通过银染检测，对棉花亲本样品与待测杂交种样品的36个位点的DNA指纹谱带进行比对分析：
亲权排除位点数≥2，判定待测杂交种与亲本无亲子关系；
0≤亲权排除位点数≤1，且双亲杂合位点数≥2，判定待测杂交种与亲本存在亲子关系；
0≤亲权排除位点数≤1，且双亲杂合位点数≤1，判定待测杂交种为亲本或近似亲本。
所述银染检测包括以下步骤：用10％乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液固定5min；用双蒸水快速漂洗1次；用0.3％AgNO3溶液染色5min；用双蒸水快速漂洗1次；用3％NaOH和0.5％甲醛组成的显影液显影；用10％无水乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液定影。
本发明提供一种棉花杂交种亲子关系DNA指纹鉴定的方法，使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套核心引物(共36对引物)对两个亲本与待测杂交种进行检测，所述核心引物的核苷酸序列见表1。
表1棉花杂交种亲子鉴定核心引物核苷酸序列
根据本发明的DNA指纹检测方法，其包括提取待测品种的DNA、使用上述36对核心引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。
本发明涉及一种棉花杂交种亲子鉴定方法，该方法使用分布于棉花基因组26条染色体的36对SSR核心引物，通过对两个亲本与待测杂交种进行DNA指纹检测，采用亲权排除位点与双亲杂合位点统计分析后鉴定假设杂交种与亲本的亲子关系。本发明方法操作简单，准确稳定，适用于棉花杂交种亲子关系快速鉴定。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1分布于棉花基因组26条染色体的36对SSR核心引物的获得
以32份来源于我国3大棉区(新疆棉区、黄河流域棉区、长江中下游棉区)棉花主产省份的主栽品种作为核心引物的筛选评价材料，对大量SSR候选引物进行筛选，综合考虑引物的鉴别能力、扩增效果及染色体分布情况，从每条染色体优选出1-2对多态性高、稳定性好的引物作为核心引物，共计36对(表2)。
表236对核心引物基本信息
| 引物名称 | 类型 | 染色***置 | 重复序列 |
| NAU3254 | EST | 1 | (GCA)5 |
| NAU2277 | EST | 2 | (ACAT)10 |
| NAU1190 | EST | 3 | (GGC)6 |
| NAU1071 | EST | 3 | (TTC)10 |
| MUCS101 | EST | 4 | (TCT)2(GAC)6 |
| NAU934 | EST | 5 | (TC)11 |
| NAU1200 | EST | 5 | (CAG)11 |
| NAU874 | EST | 6 | (AT)18 |
| NAU905 | EST | 6；25 | (AAT)17 |
| NAU1362 | EST | 7 | (ATA)6 |
| BNL3257 | Genomic | 8 | (AC)13,(AT)10 |
| BNL1317 | Genomic | 9；23 | (AG)14 |
| BNL2960 | Genomic | 10 | (GA)10 |
| BNL1231 | Genomic | 11 | (AG)15 |
| BNL3442 | Genomic | 11 | (CA)14(TA)5 |
| BNL3261 | Genomic | 12 | (GA)18 |
| BNL1421 | Genomic | 13 | (AG)29,(AG)14 |
| BNL2449 | Genomic | 13；10 | (GA)16,(TC)16 |
| CIR246 | Genomic | 14 | (TG)6 |
| NAU2437 | EST | 15 | (ATAC)8 |
| BNL830 | Genomic | 15 | (AC)10 |
| JESPR292 | Genomic | 16 | (CTT)7 |
| NAU1167 | EST | 17；3 | (GATAGG)4 |
| NAU1028 | EST | 17 | (AATT)5 |
| CIR216 | Genomic | 18 | (CA)9 |
| NAU3110 | EST | 19 | (AGA)10 |
| BNL3646 | Genomic | 20 | (TC)14 |
| BNL3171 | Genomic | 21 | (GA)26 |
| NAU1103 | EST | 21 | (AGC)7 |
| BNL4030 | Genomic | 22；5 | (GT)10 |
| BNL3140 | Genomic | 23 | (GA)11 |
| JESPR110 | Genomic | 23 | (GA)16 |
| NAU1125 | EST | 24 | (GGCTTC)5 |
| BNL827 | Genomic | 25 | (CA)19 |
| NAU3588 | EST | 25 | (GTA)7 |
| CIR170 | Genomic | 26 | (TG)7 |
实施例2鉴定待测棉种是否由‘中棉所48’亲本产生的F1代种子
实验目的：鉴定由某杂交种制种基地提供的棉种是否为‘中棉所48’两个亲本所配制的F1代种子。
检测流程如下：
1、DNA提取
随机挑取‘中棉所48’父本、母本及待测杂交种干种子各5粒进行DNA制备。
(1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2ml的离心管中。
(2)加入800μl DNA提取液(1％SDS，0.01mol/L EDTA8.0，0.7mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。
(3)水浴结束后，加入等体积800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(体积比依次为25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。
(4)将上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。
(5)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70％乙醇的离心管中，洗涤两次。
(6)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200μl TE(pH8.0)或ddH2O，充分溶解备用。
2、SSR-PCR扩增
采用36对核心引物进行PCR扩增(引物序列见表1)，PCR反应体系见表3。
表3 PCR反应体系
反应程序：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。
3、电泳检测
(1)清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用纯水擦洗一遍，再用95％酒精擦洗一遍。在方板上涂上1ml Binding Silane(0.5％)，凹板上涂上1mlRepel silane(2％)。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
(2)6％变性聚丙烯酰胺凝胶的制备见表4。
表46％变性聚丙烯酰胺凝胶配制
注：40％PA胶：190g丙烯酰胺与10g双丙烯酰胺用水稀释至500ml。TEMED和10％APS在灌胶前加入。
(3)灌胶：灌胶过程中防止出现气泡，轻轻***梳子，使其聚合2小时以上。
(4)变性：20μl PCR样品加5μl6×上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5分钟，4℃冷却10分钟。
(5)电泳：用移液器吹吸加样槽，清除气泡，擦入样品梳子，每一个加样孔点入5μl样品。90W恒功率电泳1小时。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Bindingsilane的玻璃板上。
4、银染
固定：10％无水乙醇+0.5％冰醋酸固定液，轻轻晃动5分钟；
漂洗：双蒸水快速漂洗，不超过10秒；
染色：0.3％AgNO3溶液中染色5分钟；
漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10秒；
显影：3％NaOH+0.5％甲醛显影液，轻轻晃动至带纹出现；
定影；固定液中定影5分钟。
5、结果分析
通过以上检测，获得‘中棉所48’两个亲本与待测杂交种在36个位点上的DNA指纹图谱(表5)，指纹比对分析结果表明：待测杂交种在14个位点表现为双亲杂合位点，其他22个位点的带型与父本或母本一致，无亲权排除位点。根据判定标准，表明受检假设杂交种与中棉所48两个亲本具有亲子关系，即假设杂交种为‘中棉所48’的真实杂交种。
表5‘中棉所48’父本、母本及假设杂交种指纹信息
注：Size为PCR扩增产物的片段大小值，单位bp。
实施例3鉴定待测棉种是否由‘中棉所48’亲本产生的F1代种子
实验目的：鉴定由另一杂交种制种基地提供的棉种是否为‘中棉所48’两个亲本所配制的F1代种子。
按照实施例2的步骤，进行DNA制备，PCR扩增、电泳检测及银染检测。
结果分析：通过以上检测，获得两个亲本与假设杂交种在36个位点上的DNA指纹图谱(表6)，指纹比对分析结果表明：待测杂交种在14个位点的带型表现为亲权排除位点，6个位点表现为双亲杂合位点，其他16个位点与父本或母本带型一致。根据判定标准，表明受检假设杂交种与‘中棉所48’两个亲本无亲子关系，即待测杂交种不是‘中棉所48’的真实杂交种。
表6‘中棉所48’父本、母本及假设杂交种指纹信息
注：Size为PCR扩增产物的片段大小值，单位bp。
实施例4鉴定待测棉种是否由‘中棉所48’亲本产生的F1代种子
实验目的：鉴定由另一杂交种制种基地提供的棉种是否为‘中棉所48’两个亲本所配制的F1代种子。
按照实施例2的步骤，进行DNA制备，PCR扩增、电泳检测及银染检测。
结果分析：通过以上检测，获得两个亲本与假设杂交种在36个位点上的DNA指纹图谱(表7)，指纹比对分析结果表明：待测杂交种在36个位点的带型均未表现为亲权排除位点或双亲杂合位点，且36个位点与母本带型一致。即该基地提供的种子样品为‘中棉所48’的母本。
表7‘中棉所48’父本、母本及假设杂交种指纹信息
| 引物名称 | 父本 | Size1 | Size2 | 母本 | Size1 | Size2 | 假设杂交种 | Size1 | Size2 | 备注 |
| NAU3254 | Z48F | 276 | 285 | Z48M | 276 | 291 | F1 | 276 | 291 | |
| NAU2277 | Z48F | 144 | Z48M | 144 | F1 | 144 | ||||
| NAU1190 | Z48F | 228 | 239 | Z48M | 218 | 222 | F1 | 218 | 222 | |
| NAU1071 | Z48F | 162 | 171 | Z48M | 162 | 171 | F1 | 162 | 171 | |
| MUCS101 | Z48F | 154 | 160 | Z48M | 154 | 160 | F1 | 154 | 160 | |
| NAU934 | Z48F | 206 | 214 | Z48M | 204 | 214 | F1 | 204 | 214 | |
| NAU1200 | Z48F | 225 | Z48M | 237 | F1 | 237 | ||||
| NAU874 | Z48F | 148 | 182 | Z48M | 148 | 180 | F1 | 148 | 180 | |
| NAU905 | Z48F | 161 | 167 | Z48M | 161 | 167 | F1 | 161 | 167 | |
| NAU1362 | Z48F | 236 | Z48M | 233 | F1 | 233 | ||||
| BNL3257 | Z48F | 212 | Z48M | 212 | F1 | 212 | ||||
| BNL1317 | Z48F | 185 | 205 | Z48M | 181 | 195 | F1 | 181 | 195 | |
| BNL2960 | Z48F | 152 | Z48M | 157 | F1 | 157 | ||||
| BNL1231 | Z48F | 202 | Z48M | 202 | F1 | 202 | ||||
| BNL3442 | Z48F | 109 | 126 | Z48M | 109 | 126 | F1 | 109 | 126 | |
| BNL3261 | Z48F | 196 | 208 | Z48M | 200 | F1 | 200 | |||
| BNL1421 | Z48F | 231 | Z48M | 231 | F1 | 231 | ||||
| BNL2449 | Z48F | 149 | Z48M | 149 | F1 | 149 | ||||
| CIR246 | Z48F | 166 | Z48M | 146 | F1 | 146 | ||||
| NAU2437 | Z48F | 237 | 245 | Z48M | 245 | F1 | 245 | |||
| BNL830 | Z48F | 103 | Z48M | 103 | F1 | 103 | ||||
| JESPR292 | Z48F | 174 | Z48M | 174 | F1 | 174 | ||||
| NAU1167 | Z48F | 195 | 201 | Z48M | 195 | 201 | F1 | 195 | 201 | |
| NAU1028 | Z48F | 232 | 243 | Z48M | 232 | 246 | F1 | 232 | 246 | |
| CIR216 | Z48F | 150 | Z48M | 150 | F1 | 150 | ||||
| NAU3110 | Z48F | 214 | 223 | Z48M | 214 | 232 | F1 | 214 | 232 | |
| BNL3646 | Z48F | 149 | 159 | Z48M | 149 | 159 | F1 | 149 | 159 | |
| BNL3171 | Z48F | 231 | Z48M | 222 | F1 | 222 | ||||
| NAU1103 | Z48F | 180 | 192 | Z48M | 180 | 189 | F1 | 180 | 189 | |
| BNL4030 | Z48F | 112 | Z48M | 116 | F1 | 116 | ||||
| BNL3140 | Z48F | 105 | Z48M | 105 | F1 | 105 | ||||
| JESPR110 | Z48F | 186 | Z48M | 186 | F1 | 186 | ||||
| NAU1125 | Z48F | 244 | Z48M | 244 | F1 | 244 | ||||
| BNL827 | Z48F | 250 | 261 | Z48M | 250 | 269 | F1 | 250 | 269 | |
| NAU3588 | Z48F | 239 | 260 | Z48M | 239 | 260 | F1 | 239 | 260 | |
| CIR170 | Z48F | 161 | Z48M | 157 | F1 | 157 |
注：Size为PCR扩增产物的片段大小值，单位bp。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种棉花杂交种亲子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别提取亲本棉花以及待测棉花杂交种籽粒样品中的DNA；
2)分别以步骤1)中提取的DNA为模板，利用用于鉴定棉花杂交种的SSR-PCR引物组合进行PCR扩增反应；
3)分析亲本及杂交种的PCR扩增产物；
所述用于鉴定棉花杂交种的SSR-PCR引物组合，由下列引物对组成：
NAU3254-F和NAU3254-R、NAU2277-F和NAU2277-R、NAU1190-F和NAU1190-R、NAU1071-F和NAU1071-R、MUCS101-F和MUCS101-R、NAU934-F和NAU934-R、NAU1200-F和NAU1200-R、NAU874-F和NAU874-R、NAU905-F和NAU905-R、NAU1362-F和NAU1362-R、BNL3257-F和BNL3257-R、BNL1317-F和BNL1317-R、BNL2960-F和BNL2960-R、BNL1231-F和BNL1231-R、BNL3442-F和BNL3442-R、BNL3261-F和BNL3261-R、BNL1421-F和BNL1421-R、BNL2449-F和BNL2449-R、CIR246-F和CIR246-R、NAU2437-F和NAU2437-R、BNL830-F和BNL830-R、JESPR292-F和JESPR292-R、NAU1167-F和NAU1167-R、NAU1028-F和NAU1028-R、CIR216-F和CIR216-R、NAU3110-F和NAU3110-R、BNL3646-F和BNL3646-R、BNL3171-F和BNL3171-R、NAU1103-F和NAU1103-R、BNL4030-F和BNL4030-R、BNL3140-F和BNL3140-R、JESPR110-F和JESPR110-R、NAU1125-F和NAU1125-R、BNL827-F和BNL827-R、NAU3588-F和NAU3588-R、CIR170-F和CIR170-R，其中，F表示上游引物，R表示下游引物；上述引物对的核苷酸序列分别如Seq ID No.1-72所示；
步骤3)中分析PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过银染检测，对棉花亲本样品与待测杂交种样品的36个位点的DNA指纹谱带进行比对分析：
亲权排除位点数≥2，判定待测杂交种与亲本无亲子关系；
0≤亲权排除位点数≤1，且双亲杂合位点数≥2，判定待测杂交种与亲本存在亲子关系；
0≤亲权排除位点数≤1，且双亲杂合位点数≤1，判定待测杂交种为亲本或近似亲本。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：含1.5mmol/L Mg2 +的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs 0.8μl，20μM上、下游引物各0.15μl，2.5U/μl TaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH2O补齐至20μl。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃2分钟，共30个循环；72℃7分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中DNA提取具体方法如下：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
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