CN106167828A - 快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用，涉及南瓜杂交种的纯度鉴定技术领域。该方法包括以下步骤：A、提取南瓜杂交种子的DNA；B、以提取的DNA作为模板，配制聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；C、将PCR扩增产物进行电泳分离；D、根据电泳分离出的条带，计算种子纯度。本发明能够将现有的PCR所需时间缩短75.7％，大幅提高SSR方法测定种纯的速度，能够满足大批量生产，且无需使用昂贵进口仪器，从而大幅降低早期投入与后期生产成本。

Description

快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用

技术领域

本发明涉及南瓜杂交种纯度鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用。

背景技术

目前，我国农作物杂交种的纯度需达到或超过法律规定的比例方可上市销售。为检验杂交种的纯度，现有大致三种方法：a.包括田间小区种植检验法在内的形态检验法；b.包括同工酶电泳法在内的蛋白质电泳技术检验法；c.包括SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)分子标记技术在内的DNA分子标记检验法。其中，SSR分子标记检验法因其重复性和稳定性优异，而在近年来应用得越来越广泛。SSR又称微卫星序列，是指真核生物的基因组中散布的大量串联重复序列，其中2-4个碱基对长度的短重复序列在不同品种之间具有高度多态性，而这种SSR在结构上的最大特点是两端的序列保守，因此可设计与两端保守序列互补的引物，对SSR进行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增，来揭示不同品种间SSR序列长度的多态性。

这其中的PCR步骤需使用到PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物A、引物B和DNA模板在内的6种组分，目前已有许多研究者进行过对各组分用量的优化尝试，以期降低PCR步骤中的试剂成本。但当这一技术被研究机构或企事业单位应用到大批量生产实践中时，除经济成本外，往往也期望能控制时间成本。以当下普遍使用的标准PCR程序为例：94℃预变性3min，(94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s)，35个循环，72℃延伸10min，此扩增条件运行一次耗时约为1小时43分钟。以一天8小时工作制计，一台PCR仪仅可运行4.7次，以一块96孔PCR板检测96个样品计，一天可检测451个样品。再以一个批次的种子需检100粒计，即一天检4.5个批次。这对于种子大量生产的旺季期内几千个批次的检验需求来说，无疑杯水车薪。为解决这一问题，目前已有国外厂商推出快速PCR仪，通过加快升降温速度来缩短一次PCR运行所需的时间。然而这样一台PCR仪比之普通型号的PCR仪要贵很多，普通PCR仪约4万多，而快速PCR仪需12万左右，因为它的加热模块使用的是世界上导热效果最好的金属-黄金。而且，使用快速PCR仪时，如想达到最佳效果，还需配套使用较贵的特殊设计的PCR板，不利于大批量生产中的成本控制。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法及其应用，本发明能够将现有的PCR所需时间缩短75.7％，大幅提高SSR方法测定种纯的速度，能够满足大批量生产，且无需使用昂贵进口仪器，从而大幅降低早期投入与后期生产成本。

本发明提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：

A、选取南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；

B、以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；

C、将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；

D、选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。

在上述技术方案的基础上，所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，33～35个循环。

在上述技术方案的基础上，选取的南瓜品种为早蜜本品种时，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示。

在上述技术方案的基础上，步骤A的具体操作如下：

A1、选取至少100粒的南瓜杂交种子，浸种4小时，然后催芽36小时；

A2、选取健康的芽根作为提取材料，每个芽根截取1cm放入一个离心管中；每个离心管的处理如下：

将2×CTAB提取缓冲液预热至65℃后，取800μL提取缓冲液加入离心管中；使用磨样机磨碎材料，65℃水浴40min，水浴过程中摇匀离心管；向离心管中加入与提取缓冲液等体积的氯仿，摇匀，静置10min；将离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min；

另取一个干净的离心管，吸取上清液到该离心管中，再向该离心管中加入400μL预冷的异丙醇，在-20℃的温度下放置1小时；将该离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，加入70％乙醇洗涤沉淀后，除去上清液；烘干该离心管，加入40μL水溶解该离心管内的沉淀，得到南瓜杂交种子的DNA溶液。

在上述技术方案的基础上，聚合酶链式反应PCR体系包括：含Mg2+的10×PCR缓冲液、浓度为1mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP、浓度为0.5μmol/L的正向SSR引物、浓度为0.5μmol/L的反向SSR引物、2.5ng/μL的DNA、0.025U/μL的Taq DNA聚合酶、双蒸水。

在上述技术方案的基础上，步骤C的具体过程如下：

配制浓度为3％的琼脂糖凝胶，制作胶板；将所有PCR扩增产物分别点样后，120V电压条件下电泳45分钟，电泳结束后，将胶板放入凝胶成像***中拍照保存。

在上述技术方案的基础上，步骤D中，所述判断杂交种、父本、母本的具体过程如下：

电泳分离出的条带中，父本、母本分别有不同的带型，而子一代杂交种有父母本两条带；如电泳分离出的条带为双条带，则判定该种子为子一代杂交种，如为母本型条带则判定该种子为母本，如为父本型条带则判定该种子为父本。

本发明还提供上述的方法在早蜜本品种的南瓜杂交种纯度鉴定中的应用，包括以下过程：

选取早蜜本南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示；所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，35个循环，得到PCR扩增产物；

将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、自从1985年PCR作为一种专利所属的生物技术面世以来，科研工作者长期依赖于标准的PCR程序进行实验，即94℃预变性3min，(94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s)，35个循环，72℃延伸10min。该标准程序中使用的时间长度，在各地不同的实验室内也几乎不做大幅度的更改。而本发明的目的正是要打破这种常规思路，大大压缩运行一次PCR所需的时间。本发明将PCR程序中各个温度下的温育时间经过调整，改为(94℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s)，33～35个循环，并配合简单快捷的琼脂糖凝胶电泳进行检测，提高了整套种纯鉴定程序的速度。针对缩短PCR时间这一需求，目前已有厂商推出昂贵的快速PCR仪和配套使用的特殊耗材，而本发明使用普通PCR仪与普通耗材即可，大幅降低早期投入与后期生产成本。

2、本发明所需的PCR时间最少为25分钟，能够将现有的PCR所需时间缩短75.7％，节约电力，提高机器利用率，每台PCR仪每8小时可检测的种子由原先的4.5个批次提高到18个批次，增产300％。

附图说明

图1是采用标准PCR程序得到的早蜜本南瓜杂交种子DNA的PCR扩增产物的电泳结果图；

图2是本发明实施例1中PCR扩增产物的电泳结果图；

图3是本发明实施例2中PCR扩增产物的电泳结果图；

图4是本发明实施例3中PCR扩增产物的电泳结果图；

图5是本发明实施例4中PCR扩增产物的电泳结果图；

图6是对比例1中的PCR扩增产物的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

本发明实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：

A、选取早蜜本品种的南瓜杂交种子，提取DNA；

步骤A的具体过程如下：

A1、选取至少100粒早蜜本品种的南瓜杂交种子，浸种4小时，然后催芽36小时；

A2、选取健康的芽根作为提取材料，每个芽根截取1cm放入一个离心管中；每个离心管的处理如下：

将2×CTAB提取缓冲液预热至65℃后，取800μL提取缓冲液加入离心管中；使用磨样机磨碎材料，65℃水浴40min，水浴过程中摇匀离心管；向离心管中加入与提取缓冲液等体积的氯仿，摇匀，静置10min；将离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min；

另取一个干净的离心管，吸取上清液到该离心管中，再向该离心管中加入400μL预冷的异丙醇，在-20℃的温度下放置1小时；将该离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，加入70％乙醇洗涤沉淀后，除去上清液；烘干该离心管，加入40μL水溶解该离心管内的沉淀，得到南瓜杂交种子的DNA溶液。

2×CTAB提取缓冲液的配制方法为：在一定量的水中加入100ml浓度为1M、PH为8.5的三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl，40ml浓度为0.5M、PH为8.0的乙二胺四乙酸EDTA，81.816g的氯化钠NaCl，混匀后加20g的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，溶解，定容至1L，得到上述的2×CTAB提取缓冲液。

B、以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份的聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；PCR扩增条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，循环前不进行94℃预变性过程，循环后也不进行72℃延伸过程；PCR扩增的过程中，采用的扩增仪为杭州博日LifeEco基因扩增仪，该扩增仪具有两种温控模式，BLOCK模式和TUBE模式，本方法中，控温模式设置为BLOCK模式。

聚合酶链式反应PCR体系中，与早蜜本品种的南瓜杂交种子DNA相匹配的SSR引物名称为CMTm232，其正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示；

聚合酶链式反应PCR体系的体积可以为20μL，每一份20μL的PCR体系具体包括：2μL含Mg²⁺的10×PCR缓冲液、2μL浓度为10mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP、2μL浓度为5μmol/L的CMTm232正向引物、2μL浓度为5μmol/L的CMTm232反向引物、50ng的DNA、0.5U的TaqDNA聚合酶，剩余的为双蒸水。

C、将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；

步骤C的具体过程如下：

配制浓度为3％的琼脂糖凝胶，制作胶板；将所有PCR扩增产物分别点样后，120V电压条件下电泳45分钟，电泳结束后，将胶板放入凝胶成像***中拍照保存。

D、根据电泳分离出的条带，计算种子纯度；

步骤D的具体过程为：电泳分离出的条带中，父本、母本分别有不同的带型，而子一代杂交种有父母本两条带；如电泳分离出的条带为双条带，则判断该种子为子一代杂交种，如为母本型条带则判断该种子为母本，如为父本型条带则判断该种子为父本；杂交种纯度的计算公式为：子一代杂交种的数量/测定的种子总数×100％。

下面通过6个具体实施例和1个对比例对本发明进行说明。

实施例1：

本实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，包括以下步骤：

选取至少100粒早蜜本品种的南瓜杂交种子，浸种4小时，然后催芽36小时；选取健康的芽根作为提取材料，每个芽根截取1cm放入离心管中，共收集100管；每个离心管的处理如下：

将2×CTAB提取缓冲液预热至65℃后，取800μL提取缓冲液加入离心管中；使用磨样机磨碎材料，65℃水浴40min，水浴过程中摇匀离心管；向离心管中加入与提取缓冲液等体积的氯仿，摇匀，静置10min；将离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min；

另取一个干净的离心管，吸取上清液到该离心管中，再向该离心管中加入400μL预冷的异丙醇，在-20℃的温度下放置1小时；将该离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，加入70％乙醇洗涤沉淀后，除去上清液；烘干该离心管，加入40μL水溶解该离心管内的沉淀，得到南瓜杂交种子的DNA溶液。

以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份的聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；PCR扩增条件为：94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环，循环前不需要进行94℃预变性过程，循环后也不需要进行72℃延伸过程；

聚合酶链式反应PCR体系中，与早蜜本品种的南瓜杂交种子DNA相匹配的SSR引物名称为CMTm232，其正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示；聚合酶链式反应PCR体系的体积为20μL，包括：2μL含Mg²⁺的10×PCR缓冲液、2μL浓度为10mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP、2μL浓度为5μmol/L的CMTm232正向引物、2μL浓度为5μmol/L的CMTm232反向引物、50ng的DNA、0.5U的Taq DNA聚合酶，剩余的为双蒸水。

配制浓度为3％的琼脂糖凝胶，制作胶板；将100管PCR扩增产物分别点样后，120V电压条件下电泳45分钟，电泳结束后，将胶板放入凝胶成像***中拍照保存。电泳分离结果参见图2所示。

电泳分离出的条带中，父本、母本分别有不同的带型，而子一代杂交种有父母本两条带；参见图1所示，如电泳分离出的条带为双条带，则判断该种子为子一代杂交种，如为母本型条带则判断该种子为母本，如为父本型条带则判断该种子为父本；杂交种纯度的计算公式为：子一代杂交种的数量/100×100％。

实施例2：

本实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其中，

PCR扩增条件为：95℃变性2s，60℃退火20s，72℃延伸20s，33个循环，循环前不进行94℃预变性过程，循环后也不进行72℃延伸过程；

除PCR扩增条件外，本实施例中的其余步骤均与实施例1相同；

本实施例中的电泳分离结果参见图3所示。

实施例3：

本实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其中，

PCR扩增条件为：96℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸20s，34个循环，循环前不需要进行94℃预变性过程，循环后也不需要进行72℃延伸过程；

除PCR扩增条件外，本实施例中的其余步骤均与实施例1相同；

本实施例中的电泳分离结果参见图4所示。

实施例4：

本实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其中，

PCR扩增条件为：94℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，35个循环，循环前不需要进行94℃预变性过程，循环后也不需要进行72℃延伸过程；

除PCR扩增条件外，本实施例中的其余步骤均与实施例1相同；

本实施例中的电泳分离结果参见图5所示。

实施例5：

本实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其中，

PCR扩增条件为：94℃变性5s，60℃退火5s，72℃延伸10s，35个循环，循环前不需要进行94℃预变性过程，循环后也不需要进行72℃延伸过程；

除PCR扩增条件外，本实施例中的其余步骤均与实施例1相同。

实施例6：

本实施例提供一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其中，

PCR扩增条件为：94℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5s，35个循环，循环前不需要进行94℃预变性过程，循环后也不需要进行72℃延伸过程；

除PCR扩增条件外，本实施例中的其余步骤均与实施例1相同。

对比例1：

本对比例为一种鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其中，

PCR扩增条件为：96℃变性1s，60℃退火1s，72℃延伸5s，35个循环，循环前不进行94℃预变性过程，循环后也不进行72℃延伸过程；除PCR扩增条件外，本对比例中的其余步骤均与实施例1相同；本对比例中的电泳分离结果参见图6所示。

电泳分离结果分析：

对采用标准PCR程序得到的早蜜本南瓜杂交种DNA的PCR扩增产物进行电泳分离，结果参见图1所示。将现有技术与本实施例的PCR反应时间进行对比，图2～5中的条带逐渐变暗，但是仍然可以清楚分辨。参见图5所示，图中“0m/2s2s5s/0m”表示优化后的PCR程序：94℃预变性0min；94℃变性2s，55℃退火2s，72℃延伸5s，35个循环；72℃延伸0min。其余的以此类推。参见图6所示，当时间减少至0m/1s1s5s/0m时，子一代与母本的条带变得过于黯淡模糊，已不能够应用于生产。以此说明时间体系并非可以一味地减少。因此，实施例4中的PCR扩增条件是在满足电泳条带清晰度的前提下用时最少的PCR扩增条件。

本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种修改和变型，倘若这些修改和变型在本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则这些修改和变型也在本发明的保护范围之内。

说明书中未详细描述的内容为本领域技术人员公知的现有技术。

Claims (8)

1.一种快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、选取南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；

B、以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2～20s，60℃退火2～20s，72℃延伸5～20s，33～35个循环，得到PCR扩增产物；

C、将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；

D、选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。

2.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃～96℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，33～35个循环。

3.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于：选取的南瓜品种为早蜜本品种时，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQID No:2所示。

4.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，步骤A的具体操作如下：

A1、选取至少100粒的南瓜杂交种子，浸种4小时，然后催芽36小时；

A2、选取健康的芽根作为提取材料，每个芽根截取1cm放入一个离心管中；每个离心管的处理如下：

将2×CTAB提取缓冲液预热至65℃后，取800μL提取缓冲液加入离心管中；使用磨样机磨碎材料，65℃水浴40min，水浴过程中摇匀离心管；向离心管中加入与提取缓冲液等体积的氯仿，摇匀，静置10min；将离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min；

另取一个干净的离心管，吸取上清液到该离心管中，再向该离心管中加入400μL预冷的异丙醇，在-20℃的温度下放置1小时；将该离心管放入离心机中以12000转/分钟的速率离心10min，除去上清液，加入70％乙醇洗涤沉淀后，除去上清液；烘干该离心管，加入40μL水溶解该离心管内的沉淀，得到南瓜杂交种子的DNA溶液。

5.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，聚合酶链式反应PCR体系包括：含Mg²⁺的10×PCR缓冲液、浓度为1mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷dNTP、浓度为0.5μmol/L的正向SSR引物、浓度为0.5μmol/L的反向SSR引物、2.5ng/μL的DNA、0.025U/μL的Taq DNA聚合酶、双蒸水。

6.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，步骤C的具体过程如下：

配制浓度为3％的琼脂糖凝胶，制作胶板；将所有PCR扩增产物分别点样后，120V电压条件下电泳45分钟，电泳结束后，将胶板放入凝胶成像***中拍照保存。

7.如权利要求1所述的快速鉴定南瓜杂交种纯度的方法，其特征在于，步骤D中，所述判断杂交种、父本、母本的具体过程如下：

电泳分离出的条带中，父本、母本分别有不同的带型，而子一代杂交种有父母本两条带；如电泳分离出的条带为双条带，则判定该种子为子一代杂交种，如为母本型条带则判定该种子为母本，如为父本型条带则判定该种子为父本。

8.如权利要求1所述的方法在早蜜本品种的南瓜杂交种纯度鉴定中的应用，其特征在于，包括以下过程：

选取早蜜本南瓜杂交种子，分别提取每一粒种子中的DNA；以每一粒种子所提取的DNA作为模板，各配制一份聚合酶链式反应PCR体系，利用SSR引物对提取出的DNA进行PCR扩增，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No:1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示；所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性2s，60℃退火2s，72℃延伸5s，35个循环，得到PCR扩增产物；

将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离；选取的南瓜杂交种子中，有一部分父本、母本种子，根据电泳分离出的条带，判断杂交种、父本、母本，计算种子纯度；杂交种纯度的计算公式为：杂交种的数量/测定的种子总数×100％。