CN105462884B - 鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供鸭支原体培养基,由液体培养基和固体培养基组成,液体培养基由以下组分组成:去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,1%的酚红,含L‑谷氨酰胺的CMRL‑1066培养基,灭活的马血清,酵母浸出液,青霉素,L‑半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;除添加琼脂粉,去掉酚红外,固体培养基其余组分与液体培养基相同。利用上述培养基对鸭支原体分离纯化:在固体培养基上分离菌落,将分离的菌落置于液体培养基中生长,然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落增殖的纯化步骤,重复上述步骤直至得到纯化的鸭支原体。本发明的培养基可促进鸭支原体的生长,且分离纯化鸭支原体的成功率高。
Description
技术领域
本发明涉及细菌培养基及分离纯化的方法,具体涉及鸭支原体培养基及鸭支原体的分离纯化方法。
背景技术
鸭支原体(Mycoplasma anatis)主要引起鸭的传染性窦炎,临床上易感染雏鸭,导致眶下窦、鼻腔、气管及气囊的炎症,其中眶下窦肿胀最为典型。当鸭支原体与其他病原(如流感病毒、大肠细菌)混合感染时,可引起鸭呼吸困难、软脚、腹泻、共济失调、斜颈、转圈或倒退运动等一系列神经***症状,严重影响鸭的生长和发育;组织学病变表现为淋巴细胞性脑膜炎、纤维蛋白渗出性的气囊炎、间质性肺炎和淋巴滤泡性气管炎(Stipkovits,2012)。
1964年Robert首次报道从患有窦炎的小鸭中分离出鸭支原体,之后西班牙、美国等国家相继分离到鸭支原体,karpas、Amin等从北京鸭、短颈小野鸭和斑背浅鸭中分离出鸭支原体(Ivanics et al,1988;Poveda et al,1990;Goldberg et al,1995)。我国是世界上主要的鸭养殖基地,鸭肉产量占全球总量的66%;国内学者于1989年和1991年就证实了鸭支原体在我国的存在,而近两年国内有关鸭支原体合并病毒、细菌感染的病例屡见不鲜,给养鸭业造成了重大危害和经济损失,表明鸭支原体感染在我国持续时间已经很久。
鸭支原体是一类特殊的微生物,无细胞壁,由于其基因组较小,造成基因组中编码氨基酸和辅助因子合成的基因就少,导致支原体生物合成和代谢的能力相当有限;由于支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型,很难对环境变化做出调整,仅在特定的环境下生存,因此鸭支原体对体外培养基的选择相当苛刻,需要从中摄取脂肪酸、胆固醇、核酸前体和能量来源等营养成分促进自身繁殖。鸭支原体(Mycoplasma anatis)不同于其他禽类支原体,如鸡毒支原体(Mycoplasma gallispeticum)、滑液支原体(Mycoplasma symoviae)、泄殖腔支原体(Mycoplasma cloaclae)、莱氏无胆甾支原体(Acolaplasma laidlawii)等感染多种宿主,鸭支原体只寄生于鸭体内。关于鸭支原体的诊断,主要为聚合酶链反应(PCR)和直接免疫荧光实验(FA),二者均涉及支原体纯培养物即单个菌落的分离和培养;而目前分离鸭支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPLO培养基改良而来,仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题,易产生漏诊;因此,本领域亟需高效稳定、快速分离诊断鸭支原体的培养基以及分离纯化鸭支原体的方法,进而开展鸭支原体感染的治疗与防控研究。
发明内容
本发明提供了鸭支原体培养基,该培养基能够用来分离纯化鸭支原体,活菌滴度高,繁殖能力强;本发明还提供应用该培养基分离纯化鸭支原体的方法。
本发明为解决以上技术问题所采用的方案为:
鸭支原体培养基,包括液体培养基和固体培养基,所述液体培养基由以下组分组成:去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,1%的酚红,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基,灭活的马血清,酵母浸出液,青霉素,L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸;
所述固体培养基由以下组分组成:去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,琼脂粉,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基,灭活的马血清,酵母浸出液,青霉素,L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
作为优选,所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L,PPLO肉汤3-5g/L,葡萄糖4-6g/L,蛋白胨4-6g/L,胰蛋白胨8-10g/L,1%的酚红2-3mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500mL/L,灭活的马血清150-180mL/L,酵母浸出液45-55mL/L,青霉素200-300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L,余量为去离子水。
最优选地,所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,1%的酚红2mL/L,含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L,余量为去离子水。
作为优选,所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L,PPLO肉汤3-5g/L,葡萄糖4-6g/L,蛋白胨4-6g/L,胰蛋白胨8-10g/L,琼脂粉10-12g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L,灭活的马血清150-180mL/L,酵母浸出液45-55mL/L,青霉素200-300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L,余量为去离子水。
最优选地,所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂粉12g/L,含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L,余量为去离子水。
作为优选,所述酵母浸出液的制备方法为:将酵母溶于5倍去离子水中,在30℃下磁力搅拌1小时;10-15分钟内逐渐增加温度到40℃;之后每分钟增加5℃至沸点,煮沸3-5分钟,冷却至室温,离心,取上清,依次经0.8 μm、0.45 μm、0.22 μm的滤器过滤后收集滤液即得。
采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点:不断搅拌可使酵母的溶解性增加,浸出液色泽为淡黄色至黄色;缓慢升高温度可减少浸出液营养成份的破坏;整个制备过程的总时间控制在2小时左右,减少了污染杂菌的概率。
作为优选,除添加琼脂粉,去掉酚红指示剂外,所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。通常情况之下,固体培养基与液体培养基成分应该保持一致的,这样能够确保支原体生长状态的稳定;另外在大批量配置液体及固体培养基时可同时进行,节省人力和时间。
本发明还提供上述培养基的制备方法,所述液体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,1%的酚红充分混匀,调pH值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,冷却至50-55℃,加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺),灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液,无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液,添加时无先后顺序,最后微调pH值至7.7-7.8。
作为优选,所述固体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,琼脂粉充分混匀,调pH值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,放入50-55℃的水浴锅中冷却,加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺),灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液,无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液,添加时无先后顺序,混匀后倒平板,得固体培养基。
本发明的第三个目的是提供鸭支原体分离纯化的方法,包括以下步骤:
1. 用无菌棉签在鸭的鼻后孔、气管、泄殖腔或气囊采样、或挑取大约0.1mL的卵黄液(含部分卵黄膜)、或无菌条件下剪切小块病样组织接种到4.5mL的液体培养基中(棉签需弃掉),置于37℃、5% CO2培养箱中培养,24小时后,进行第一代盲传,无论液体培养基颜色是否改变,将上述液体培养物划线接种到固体培养基进行菌落生长;若此时,上述液体培养基pH下降,颜色由红色变为黄色,可按1:10的比例转接到新的液体培养基中传代增殖;若未发生pH值下降,继续放置培养箱中培养,待颜色变黄立即转接新的液体培养基和固体培养基。
2. 上述固体培养基培养5-7天,低倍镜下观察菌落的生长情况,用接种环无菌刮取平板上的菌落接种到新的液体培养基中培养生长,再将变黄的培养物接种到固体培养基上;重复该步骤,确保分离到支原体特征菌落。
步骤1和2表明,由于初步分离支原体时,病料本身和其他杂菌污染可能会抑制鸭支原体的生长,影响支原体的分离,因此,在首次接种液体培养基24小时后,无论液体培养基是否发生颜色改变,需在固体培养基中进行盲传;同时,根据液体培养基颜色的变化,考虑是否转接新液体培养基进行增殖。若24小时内液体培养基未发生颜色的改变,需继续放置在培养箱中培养,每日观察,待pH下降、液体变黄时转接新的液体培养基和固体培养基进行增殖和分离。由于病料的来源、类型不同,支原体在分离初期生长的速度也不尽相同,因此需多次重复步骤2,确保分离到支原体特征性菌落。
3. 用0.45μm-0.22μm的滤器过滤上述培养支原体特征菌落生长变黄的液体培养物,然后取200μL过滤的培养物(原液)加到1.8 mL液体培养基中做连续10倍稀释(10-1-10-7);将平皿划为8等分,依次取5μL原液和不同浓度的稀释液分别涂布到固体培养基上,37℃、5%CO2培养箱培养5-7天,用低倍显微镜观察,可见分布均匀,边缘整齐,中间较厚,周边透明的“油煎蛋”样圆形菌落。
4. 在显微镜下选取单个的特征菌落,并在平板底部做好标记;用一次性巴氏吸管吸取单一菌落并接种到4.5mL液体培养基中培养,当pH下降,液体由红色变为黄色时,重复步骤3和4;如此重复3次,得到纯化的鸭支原体,加甘油-80℃保存。
本发明对培养基进行了营养成分的筛选,通过添加CMRL-1066和马血清,增加了鸭支原体培养基的营养成分,使其富含核苷酸、维生素、胆固醇及蛋白质;通过添加酵母浸出液,提供了鸭支原体生长所需的氮源和微量元素;经反复实验表明,本发明的培养基能有效促进鸭支原体的繁殖,仅24小时即可生长,生长滴度可达102-3 CCU/mL,而在未添加上述成分之前,生长48小时生长滴度才能达到103 CCU/mL;通过添加醋酸铊、提高青霉素的浓度,可阻止环境中其他杂菌的生长,使培养基在2-8℃存储时间从之前的1-2月延长到半年。
利用上述培养基对鸭支原体分离纯化,是在固体培养基上分离菌落,将分离的菌落置于液体培养基中生长,然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落增殖的纯化步骤,重复上述步骤直至得到纯化的鸭支原体。利用本发明的培养基进行鸭支原体分离纯化的成功率高,在正确采样的前提下,通过最初病料接种、盲传培养和分离,到后来液体培养物的过滤、稀释、涂板、挑取单菌落增殖的纯化步骤,均能从临床病样中成功分离纯化出鸭支原体。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售。
实施例1
本发明的鸭支原体培养基由液体培养基和固体培养基组成,具体为:
液体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3 g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,1%的酚红2mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L,余量为去离子水。
配制500ml本发明的液体培养基的方法如下:将1L的三角瓶置于磁力搅拌机上,先量取100 mL的去离子水,缓慢滴加10%的醋酸铊溶液2.4mL,然后依次称取并加入PPLO肉汤1.5g,葡萄糖2.5g,蛋白胨2.4g,胰蛋白胨5g,1%的酚红2mL,充分混匀后用质量百分浓度为20%的NaOH调pH值为7.8,121℃高压灭菌15分钟;冷却至50-55℃,加入无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺)225mL,灭活的马血清90mL,酵母浸出液22.5mL,无菌的青霉素150万单位(溶于20mL去离子水),无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液(0.1g溶于10mL去离子水),无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(0.1g溶于10mL去离子水),用去离子水调至500ml,无菌条件下调pH值至7.8,置4℃冰箱备用。
固体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂粉12g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L,余量为去离子水。
配制500mL本发明的固体培养基:将1L的三角瓶置于磁力搅机上,先量取100 mL的去离子水,缓慢滴加10%的醋酸铊溶液2.4mL,然后依次称取PPLO肉汤1.5g,葡萄糖2.5g,蛋白胨2.4g,胰蛋白胨5g,琼脂粉6g,充分混匀后用质量百分浓度为20%的NaOH调pH值为7.8,121℃高压灭菌15分钟;放入50-55℃的水浴锅中冷却(此温度下可防止琼脂凝集及对后续添加物营养成分的破坏);加入无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺)225mL,灭活的马血清90mL,酵母浸出液22.5mL,无菌的青霉素150万单位(溶于20 mL去离子水),无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液(0.1g溶于10mL去离子水),无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液(0.1 g溶于10mL去离子水),用去离子水调至500ml,混匀后倒平板,放置4℃冰箱的平皿罐内备用。
上述培养基中酵母浸出液的制备方法为:称取酵母粉200g,加入1000mL去离子水,在30℃下磁力搅拌1小时;10-15分钟内逐渐增加温度到40℃;之后每分钟增加5℃至沸点,煮沸3-5分钟,冷却至室温,离心,取上清,依次经0.8 μm、0.45 μm、0.22 μm的滤器过滤后收集滤液,50mL分装后放入-20℃备用。
本发明的鸭支原体培养基的活菌滴度(CCU)测定:
取11支试管,加液体培养基4.5mL /管,在第1管中加入0.5mL 生长良好的培养液(鸭支原体模式株1340株:购自美国菌种保藏中心ATCC),振荡器混匀,换新的移液管,从第1管吸取0.5mL加入到第2管中,依次进行10倍稀释至第10管,最后一管中的0.5mL弃去;第11管为阴性对照。将试管放置37℃恒温箱中静置培养,每日观察颜色变化,连续观察10-12天,最后发生颜色变化的那管稀释度就是该培养物的CCU滴度。第10天读值,结果显示培养液的含菌量为1×109 CCU/mL。
应用实施例1制备的培养基分离纯化鸭支原体的方法如下:
1)用无菌棉签,从活体病鸭的气管中取样,立即将棉签放入含有4.5 mL培养基的试管中用力搅拌挤压,弃棉签,并尽快放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。
2) 24小时后,进行第一代盲传,将上述液体培养物划线接种到固体培养基进行菌落生长;若此时,上述液体培养基PH下降,颜色由红色变为黄色,可按1:10的比例转接新的液体培养基,若未发生PH值下降,继续放置培养箱中培养,待颜色变黄转接新的液体培养基和固体培养基。
3) 固体培养基培养5-7天,低倍镜下观察菌落的生长情况,用接种环无菌刮取平板上的菌落接种到液体培养基中培养生长,再将变黄的培养物接种到固体培养基上;重复该步骤,直至得到支原体特征菌落。
4)将特征菌落接种到液体培养基中生长,颜色变黄后,用0.22μm滤器过滤液体培养物;转接200μL滤液到1.8mL液体培养基中做连续10倍稀释(10-1-10-7);将原液和稀释液各5μL涂布固体培养基,37℃、5%CO2培养箱培养5天,可在低倍显微镜下观察到分布均匀的支原体菌落,选取单个菌落接种于液体培养基中培养,当液体由红色变为黄色后,重复该步骤;如此重复3次,即可得到纯化的鸭支原体,加甘油于-80℃保存。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于:
液体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液4.5mL/L,PPLO肉汤5g/L,葡萄糖4g/L,蛋白胨4g/L,胰蛋白胨9g/L,1%的酚红2.5mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基500mL/L,灭活的马血清150mL/L,酵母浸出液55mL/L,青霉素250万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L,余量为去离子水。
固体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液4.5mL/L,PPLO肉汤5g/L,葡萄糖4g/L,蛋白胨4g/L,胰蛋白胨9g/L,琼脂粉10g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基500mL/L,灭活的马血清150mL/L,酵母浸出液55mL/L,青霉素250万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L,余量为去离子水。
其余部分均相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于:
液体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液6.0mL/L,PPLO肉汤4g/L,葡萄糖6g/L,蛋白胨6g/L,胰蛋白胨8g/L,1%的酚红3mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基480mL/L,灭活的马血清170mL/L,酵母浸出液50mL/L,青霉素280万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L,余量为去离子水。
固体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液6.0mL/L,PPLO肉汤4g/L,葡萄糖6g/L,蛋白胨6g/L,胰蛋白胨8g/L,琼脂粉11g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基480mL/L,灭活的马血清170mL/L,酵母浸出液50mL/L,青霉素280万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.2g/L,余量为去离子水。
其余部分均相同。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于:
液体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液5.0mL/L,PPLO肉汤4.5g/L,葡萄糖5.5g/L,蛋白胨4.5g/L,胰蛋白胨8.5g/L,1%的酚红3mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基470mL/L,灭活的马血清160mL/L,酵母浸出液52mL/L,青霉素230万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L,余量为去离子水。
固体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液5.0mL/L,PPLO肉汤4.5g/L,葡萄糖5.5g/L,蛋白胨4.5g/L,胰蛋白胨8.5g/L,琼脂粉10.5g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基470mL/L,灭活的马血清160mL/L,酵母浸出液52mL/L,青霉素230万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1g/L,余量为去离子水。
其余部分均相同。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于:
液体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液5.5mL/L,PPLO肉汤3.5g/L,葡萄糖4.5g/L,蛋白胨5.5g/L,胰蛋白胨9.5g/L,1%的酚红2.5mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基490mL/L,灭活的马血清165mL/L,酵母浸出液52mL/L,青霉素260万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.15g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.15g/L,余量为去离子水。
固体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液5.5mL/L,PPLO肉汤3.5g/L,葡萄糖4.5g/L,蛋白胨5.5g/L,胰蛋白胨9.5g/L,琼脂粉11.5g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基490mL/L,灭活的马血清165mL/L,酵母浸出液52mL/L,青霉素260万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.15g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.15g/L,余量为去离子水。
其余部分均相同。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.鸭支原体培养基,其特征在于:由液体培养基和固体培养基组成,
所述液体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L,PPLO肉汤3-5g/L,葡萄糖4-6g/L,蛋白胨4-6g/L,胰蛋白胨8-10g/L,1%的酚红2-3mL/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L,灭活的马血清150-180mL/L,酵母浸出液45-55mL/L,青霉素200-300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L,余量为去离子水;
所述固体培养基配方为:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L,PPLO肉汤3-5g/L,葡萄糖4-6g/L,蛋白胨4-6g/L,胰蛋白胨8-10g/L,琼脂粉10-12g/L,含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L,灭活的马血清150-180mL/L,酵母浸出液45-55mL/L,青霉素200-300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L,余量为去离子水。
2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于:所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,1%的酚红2mL/L,含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L,余量为去离子水。
3.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于:所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂粉12g/L,含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L,余量为去离子水。
4.根据权利要求2所述的培养基,其特征在于:所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L,PPLO肉汤3g/L,葡萄糖5g/L,蛋白胨4.8g/L,胰蛋白胨10g/L,琼脂粉12g/L,含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L,灭活的马血清180mL/L,酵母浸出液45mL/L,青霉素300万单位/L,L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L,余量为去离子水。
5.根据权利要求1-4任一所述的培养基,其特征在于:所述酵母浸出液的制备方法为:将酵母溶于5倍去离子水中,在30℃下磁力搅拌1小时;10-15分钟内逐渐增加温度到40℃;之后每分钟增加5℃至沸点,煮沸3-5分钟,冷却至室温,离心,取上清,依次经0.8 μm、0.45μm、0.22 μm的滤器过滤后收集滤液即得。
6.根据权利要求1-3任一所述的培养基,其特征在于:除添加琼脂粉,去掉酚红指示剂外,所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。
7.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于:除添加琼脂粉,去掉酚红指示剂外,所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。
8.权利要求1-7任一所述的培养基的制备方法,其特征在于:所述液体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,1%的酚红充分混匀,调pH值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,冷却至50-55℃,加入配方量的无菌的含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基,灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液,无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液;最后微调pH值至7.7-7.8。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述固体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水,10%的醋酸铊溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,蛋白胨,胰蛋白胨,琼脂粉充分混匀,调pH值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,放入50-55℃的水浴锅中冷却,加入配方量的无菌的含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基,灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液,无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液;混匀后倒平板,得固体培养基。
10.应用权利要求1-7任一所述的鸭支原体培养基对鸭支原体分离纯化的方法,其特征在于:步骤如下:
1)无菌采集组织病料接种到液体培养基中进行培养,一定时间后,进行第一代盲传,将液体培养物接种到固体培养基中进行菌落生长;若此时,液体培养物pH下降,颜色由红色变为黄色,将培养物转接到新的液体培养基中生长;若未发生pH值下降,继续放置于培养箱中培养,待颜色变黄立即转接新的液体培养基和固体培养基;
2)在固体培养基上培养5-7天后,将菌落接种到新的液体培养基中培养生长;待液体培养基变黄时再将培养物接种到固体培养基中,重复该步骤,直到分离到支原体特征菌落;
3)将分离到的支原体特征菌落转接液体培养基,待培养基变黄时,过滤液体培养物,并将过滤的培养物加入到液体培养基中做连续10倍稀释,将原液和不同浓度的稀释液分别涂布到固体培养基上培养5-7天;
4)选取单个的特征菌落,接种到液体培养基中培养,当液体培养基由红色变为黄色时,重复步骤3)和4),如此重复3次,得到纯化的鸭支原体。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN103060221A (zh) * | 2012-08-31 | 2013-04-24 | 南京天邦生物科技有限公司 | 一种连续增菌培养鸡毒支原体培养基及制备方法 |
CN103074246A (zh) * | 2012-08-31 | 2013-05-01 | 南京天邦生物科技有限公司 | 一种低血清高效培养鸡毒支原体弱毒株培养基及其制备方法 |
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"Application of culture and polymerase chain reaction (PCR) methods for isolation and identification of Mycoplasma synoviae on broiler chicken farms";Bayatzadeh, M.A. et al.;《Archives of RaZi Institute》;20111231;第66卷(第2期);第87-94页 * |
"鸡毒支原体的分离和巢氏PCR鉴定研究";刘华栋等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20091015(第10期);D050-258 * |
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