CN105779373A - 一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，利用非高温灭菌的核糖制成马铃薯核糖培养基，作为产孢培养基，培养制备稻曲病菌薄壁分生孢子。该培养基的制备及其应用方法的操作步骤如下：1)制备基础培养基；2)核糖的过滤灭菌；3)制备核糖培养基平板；4)植入稻曲病菌；5)恒温培养；6)新一代孢子的收集。本发明的特色与优点是：获得大量孢子所需时间短，且持续产孢时间长；操作技术简易便捷，无需振荡培养设备；新一代孢子的数量较多且孢子液较为纯净。

Description

一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术和微生物学技术。具体是一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法。

背景技术

在大多数真菌病害***中，病原菌的繁殖体除了具有繁殖扩大自身种群数量等作用外，更重要的是拥有与寄主互作识别，并发动侵染寄主的功能，因此在许多重要的植物病害研究过程中，都需要使用病原菌的繁殖体作试验材料，显而易见，高效便捷的繁殖体材料的培养制备方法，将非常有利于研究工作的顺利开展。稻曲病(由Ustilaginoideavirens(Cooke)Takahashi侵染引起)已成为我国水稻生产的一种重大病害，稻曲病菌的繁殖体包括有性态的子囊孢子、无性态的厚壁分生孢子和薄壁分生孢子三种类型，在实验室内，至今的研究工作主要是使用薄壁分生孢子(下文将薄壁分生孢子简称为“孢子”)。

至今，大家熟知的稻曲病菌薄壁分生孢子的培养制备技术，主要是液体培养方法，该方法的主要技术步骤是，先培养准备稻曲病菌的菌丝体，再将菌丝体移植入液体培养基进行振荡培养。实践工作中发现，该培养方法存在一些不足，如耗时较长，整个过程一般需要15天以上；需要振荡培养设备；培养产物混合液中包含有大量的菌丝团、菌体代谢产物和培养基组分等。采用该技术的培养产物中，虽然包含有大量的孢子，但要获得较为单纯的孢子液，往往需要滤掉菌丝和沉淀孢子等后续处理，由于培养产物呈粘稠状态，沉淀孢子往往需要高速离心机设备。

最近的进展已经建立了稻曲病菌薄壁分生孢子的平板培养制备技术，该技术方法采用常规的马铃薯蔗糖琼脂培养基培养制备孢子。用马铃薯蔗糖琼脂培养基制备孢子能克服液体培养方法的一些弊病。但以该培养基制备孢子的技术也存在一些明显不足，在产孢高峰后，平板菌落上很快生长大量的非产孢气生菌丝，导致孢子数量急剧下降，不能在较长时期内的稳定提供孢子使用；而且收集制备培养结果的新孢子液中仍存在较多的菌丝碎段。

发明内容

本发明的目的是提供一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，利用非高温灭菌的核糖制成马铃薯核糖培养基，作为产孢培养基，培养制备稻曲病菌薄壁分生孢子。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，操作步骤如下：

1.制备基础培养基

按配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水900ml，制备基础培养基，每瓶装90ml，常规高温灭菌后备用。

2.核糖的过滤灭菌

按配比为：核糖10g、水100ml，用水将核糖配成核糖溶液，在无菌条件下用细菌过滤器将该核糖溶液进行过滤灭菌，备用。

3.制备核糖培养基平板

将步骤1制备的基础培养基加热熔化，水浴平衡至60℃，同时将步骤2过滤灭菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后将二者同时转移到超净工作台无菌环境中，取10ml核糖溶液转入1瓶基础培养基中，摇动混合均匀后倒培养皿成为含有核糖的培养基平板；该培养平板的组分配比为：马铃薯100g，核糖10g，琼脂20g，水1000ml。

4.植入稻曲病菌

取出以孢子形式备存的稻曲病菌孢子液，无菌条件下将该孢子液植入步骤3准备完毕的培养平板，用T形玻棒将孢子液均匀涂布于平板面上。

5.恒温培养

将步骤4操作完毕的培养平板转入培养箱内，28℃恒温培养。

6.新一代孢子的收集

步骤5操作实施培养5天后，稻曲病菌能在培养平板上形成大量新一代薄壁分生孢子；将培养平板转到超净工作台上，用无菌水洗刷平板上的菌落，能获得新的纯净孢子液。

本发明的优点：

1)获得大量新一代孢子所需时间短，一般仅需要4～6天；持续时间长，能维持大量产孢时间超过15天。

2)操作技术简易便捷，无需振荡培养设备；

3)新一代孢子液较为纯净，混杂的菌丝碎较少，通常无需净化处理也适合许多研究工作的使用。

附图说明

图1是利用本发明的培养基及其应用方法，培养稻曲病菌5天后形成的微小菌落，菌落上形成大量新一代薄壁分生孢子。

图2是利用本发明的培养基及其应用方法，培养稻曲病菌20天后仍维持微小菌落状态，而且菌落上仍保持大量新一代薄壁分生孢子。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。

马铃薯蔗糖培养基是实验室常用的一种培养基，其碳素营养主要是蔗糖，至今发现，稻曲病菌的生长发育最适宜碳素也恰好是蔗糖，因而当前稻曲病菌的培养，尤其是薄壁分生孢子的制备培养，主要是使用马铃薯蔗糖培养基。同时由于对稻曲病菌产孢特性的认识有限，造成薄壁分生孢子的制备实践，长期以来一直使用液体培养技术。

最近首次公开建立的稻曲病菌孢子制备的平板培养技术，其所用的培养基也是以蔗糖为碳素营养的马铃薯蔗糖培养基。该技术利用稻曲病菌的微小菌落大量产孢的特性，在培养形成微小菌落期间收集孢子。

发明人在利用上述平板培养技术制备稻曲病菌孢子的实践中发现，通常在培养5～7天内，能收集到大量孢子。培养8天后，孢子数量急剧下降，原因是产孢高峰后，菌落继续生长形成旺盛的非产孢菌丝，特别是气生菌丝，将原来微小的产孢菌落遮盖。可见，该培养技术的实际产孢时间很短。实践上为了与下游相应需要孢子的工作对接，往往需要将各项工作进程进行较严格的同步设计，否则容易错过产孢高峰期。

发明人前期工作发现，采用常规方法制备的以核糖为碳素营养的马铃薯核糖培养基，对稻曲病菌的生长发育具有抑制作用，曾误认为核糖可以抑制稻曲病菌的生长发育。但最近的工作发现，核糖本身并不抑制稻曲病菌的生长发育，是核糖的高温处理产物对稻曲病菌具抑制作用；研究过程中意外发现，在核糖不经过高温灭菌(过滤灭菌)的马铃薯核糖培养基上(本发明将利用过滤灭菌的核糖所制成的马铃薯核糖培养基，简称为“核糖培养基”)，稻曲病菌反而可以长时期内持续形成后代新孢子。实际工作中，在该核糖培养基上培养5天后，培养平板上可呈现能产生大量新一代孢子的微小菌落，如图1所示，再往后培养，稻曲病菌菌落很少生长非产孢菌丝，直到培养20天后，仍然保持大量产孢状态的小菌落，如图2所示，而且此时仍能收集到大量的新一代孢子。可见，核糖培养基是稻曲病菌非常理想的产孢培养基，采用核糖培养基制备孢子，可以使得稻曲病菌的产孢时期大幅延长，从而保证在一段时期内，制备获取的孢子产量较为稳定，孢子的制备工作不容易与其它工作脱节。同时，由于在核糖培养基上，小菌落没有明显的非产孢菌丝生长发育的现象，结果收集的新一代孢子液中菌丝碎片较少，孢子更为纯净。

本发明的核糖培养基的制备需要2种灭菌技术合成，基础培养基(马铃薯琼脂)采用常规高温高压灭菌技术；而成分核糖(核糖溶液)不能经过高温处理，只能采取过滤灭菌；将这2种技术灭菌后的产物在非高温状态下混合，才能成为有效的产孢培养基。

把二块组分(马铃薯琼脂组分、核糖溶液组分)混合后，所有成分的有效浓度都下降，因此，混合前这二块组分的浓度，必须高于最后培养基的组分浓度(马铃薯100g，核糖10g，琼脂20g，水1000ml)。实际设计时，可依二块组分的混合比例计算出二块组分混合前的浓度。

这二块组分的混合比例可以是任意比，但在技术上需要考虑马铃薯和琼脂不宜制成较高的浓度；而核糖溶液在较高浓度时其粘性增大，不利于灭菌操作。经测试比较，以体积比例：马铃薯琼脂组分∶核糖溶液组分＝9∶1，为较适宜的混合比例。按这个混合比例，组分马铃薯琼脂的配比应为：马铃薯100g、琼脂20g、水900ml；而核糖溶液的配比应为：核糖10g、水100ml。

实际工作中，由于马铃薯琼脂组分的琼脂灭菌冷却后变成固体，不能任意量取，因而需要在灭菌前定量装瓶。每瓶定量装入90ml的马铃薯琼脂，使用时加入10ml的核糖溶液，这样的混合方式操作较为简单便捷。

制备培养结果获得的新一代孢子的数量与平板上形成小菌落的数量有关，而小菌落数量则与移植用母代孢子数量有关，在不导致小菌落重叠的情况下，母代孢子越多，培养获得的新一代孢子越多；通常将移植入每皿平板(培养皿直径为9cm)的母代孢子数控制在10⁴数量级为宜。当贮备用的母代孢子浓度为10⁶个/ml时，每皿平板可取10～100μl母代孢子液作移植体制备新一代孢子。

最后一步洗脱收集制备培养获得的新一代孢子，在超净工作台无菌操作，能获得没有污染的孢子液。若无需考虑污染问题，则可以在普通实验桌上洗脱收集孢子。

实施例1

采用本发明一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，培养制备稻曲病菌菌株Uv-108的薄壁分生孢子，按如下步骤实施操作：

1.制备基础培养基

按配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水900ml，制备基础培养基，每瓶装90ml，常规高温灭菌后备用。

2.核糖的过滤灭菌

按配比为：木糖10g、水100ml，用水将木糖配成木糖溶液，在无菌条件下用细菌过滤器将该木糖溶液进行过滤灭菌，备用。

3.制备核糖培养基平板

将步骤1制备的基础培养基加热熔化，水浴平衡至60℃，同时将步骤2过滤灭菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后将二者同时转移到超净工作台无菌环境中，取10ml核糖溶液转入1瓶基础培养基中，摇动混合均匀后倒培养皿(直径为9cm)成为含有核糖的培养基平板；该培养平板的组分配比为：马铃薯100g，核糖10g，琼脂20g，水1000ml。

4.植入稻曲病菌：取出以孢子形式备存的稻曲病菌菌株Uv-108的孢子液，无菌条件下将该孢子液植入步骤3准备完毕的培养平板，用T形玻棒将孢子液均匀涂布于平板面上。

5.恒温培养：将步骤4操作完毕的培养平板转入培养箱内，28℃恒温培养。

6.新一代孢子的收集：步骤5操作实施培养5天后，菌株Uv-108能在培养平板上形成大量新一代薄壁分生孢子；将培养平板转到超净工作台上，用无菌水洗刷一个平板菌落，能获得1.0×10⁶个孢子/ml的新孢子液120ml。

实施例2

采用本发明一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，培养制备稻曲病菌菌株Uv-110的薄壁分生孢子，按实施例1的步骤1至6操作实施，只是步骤4植入的菌株是Uv-110。实施步骤6操作后，用无菌水洗刷一个平板菌落，能获得1.0×10⁶个孢子/ml的新孢子液106ml。

实施例3

采用本发明一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，培养制备稻曲病菌菌株Uv-111的薄壁分生孢子，按实施例1的步骤1至6操作实施，只是步骤4植入的菌株是Uv-111。实施步骤6操作后，用无菌水洗刷一个平板菌落，能获得1.0×10⁶个孢子/ml的新孢子液133ml。

Claims (1)

1.一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法，其特征在于，利用非高温灭菌的核糖制成马铃薯核糖培养基，作为产孢培养基，培养制备稻曲病菌薄壁分生孢子；培养基的制备及其应用方法的操作步骤如下：

1)制备基础培养基：按配比为：马铃薯100g、琼脂20g、水900ml，制备基础培养基，每瓶装90ml，常规高温灭菌后备用；

2)核糖的过滤灭菌：按配比为：核糖10g、水100ml，用水将核糖配成核糖溶液，在无菌条件下用细菌过滤器将该核糖溶液进行过滤灭菌，备用；

3)制备核糖培养基平板：将步骤1)制备的基础培养基加热熔化，水浴平衡至60℃，同时将步骤2)过滤灭菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后将二者同时转移到超净工作台无菌环境中，取10ml核糖溶液转入1瓶基础培养基中，摇动混合均匀后倒培养皿成为含有核糖的培养基平板；该培养平板的组分配比为：马铃薯100g，核糖10g，琼脂20g，水1000ml；

4)植入稻曲病菌：取出以孢子形式备存的稻曲病菌孢子液，无菌条件下将该孢子液植入步骤3)准备完毕的培养平板，用T形玻棒将孢子液均匀涂布于平板面上；

5)恒温培养：将步骤4)操作完毕的培养平板转入培养箱内，28℃恒温培养；

6)新一代孢子的收集：步骤5)操作实施培养5天后，稻曲病菌能在培养平板上形成大量新一代薄壁分生孢子；将培养平板转到超净工作台上，用无菌水洗刷平板上的菌落，能获得新的纯净孢子液。