CN110551689B - 一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用，本发明针对乌斑鳢脑组织细胞的特征，采用胶原酶I和胰酶联合消化法分离脑组织细胞，进行原代培养，继而成功构建了乌斑鳢脑细胞系，已连续传至100代以上，可提供大量的乌斑鳢脑来源细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。乌斑鳢脑细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，而且乌斑鳢脑细胞系还可用于鳢源舒伯特气单胞菌的黏附特性研究，可以直接应用于病原特性研究及疫苗研制。

Description

一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种乌斑鳢脑细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

乌鳢和斑鳢都是比较常见的经济鱼类，两者同属于鲈形目(Perciformes)、鳢亚目(Channoidei)、鳢科(Channidae)。乌鳢俗名为黑鱼，生性比较凶猛、好斗，繁殖力强，多分布于长江流域及以北一带的水系，而斑鳢主要分布在长江流域以南地区，例如广东、海南、广西、福建、云南等。乌斑鳢的父本大多数来自湖南省、山东省等地区的乌鳢，而其母本则多是广东省本土的斑鳢，将两者杂交培育出的子一代即称为乌斑鳢，这类杂交技术属于鱼类远缘杂交的种间杂交。申请人成功培育出第一条乌斑鳢。个体具有明显的杂交优势，不仅个体生长速度快，肌肉品质和营养价值都很高，此外，成年个体体型大还具有较强的抗病能力，可生活在低氧环境下和饵料系数也相对较低等优势。

在自然环境下，鳢科鱼类的自身的抗病能力十分强，几乎不会出现发病现象。但是，随着鳢科鱼类养殖的集约化程度不断提高、养殖规模和养殖密度的逐步扩大，鳢科鱼类发生传染病的情况日趋增多。随着各种病害的频繁发生，细菌性和病毒性疾病的暴发，制约了鳢科鱼类养殖业快速的发展和推广。为了进一步了解乌斑鳢感染病毒的机制，需要建立一株敏感性较高的细胞系，为今后进行病毒类疾病的诊断和病毒疫苗的研制打下基础。鱼类原代细胞系的建立目前是一种较为成熟的技术，但是要获得一株对病毒敏感的细胞系，具有偶然性和困难性。针对现有问题，建立一株需要鱼类细胞系有效的途径是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞系，从而筛选出敏感的细胞系。

细胞系还是进行基因功能分析的理想材料，而对鱼类免疫基因功能的发掘意义重大。鱼类是特异性免疫***和非特异性***并存的脊椎动物，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，非特异性免疫起着重要作用。

舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)，属气单胞菌科，气单胞菌属，亦被称为舒氏气单胞菌。它是一种革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛分布于淡水、半咸水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，可致人的伤口感染，引起腹泻的重要致病菌。在水产养殖业尤其是鳢科鱼类养殖中，该菌引起的病害频繁发生，该菌可引起鱧科鱼类患结节病。据文献报道，该菌对鱼类细胞具有黏附作用。

目前鱼类细胞的原代培养技术基本可以分为两种，组织块培养法和消化培养法。但是缺点均是容易产生机械损伤，细胞不易迁出。现在仍未见乌斑鳢脑来源细胞系的报道。可见目前需要研究一种乌斑鳢脑细胞系的构建方法，为后期建立乌斑鳢其他组织细胞系和进行病毒研究奠定扎实的基础。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种乌斑鳢脑细胞系(CAMB)。

本发明的次要目的在于提供乌斑鳢脑细胞系的构建方法。

本发明的再一目的在于提供乌斑鳢脑细胞系的应用。

为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：

一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018125。

进一步的，该方法为：将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I消化，再加入胰酶消化，加入乌斑鳢脑细胞培养液培养，放入胰酶中进行消化，收集消化后的细胞进行原代培养和传代培养即可获得乌斑鳢脑细胞系。

进一步的，包括以下步骤：

1)将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I中进行消化，收集细胞，再加入胰酶中进行消化，收集消化后的细胞；

2)将上步收集到的细胞加入乌斑鳢脑细胞培养液制成细胞悬液，在26～28℃条件下进行原代培养；

3)当原代培养细胞长满培养瓶底时，去培养液，用胰酶液消化，消化后去酶液，加入乌斑鳢脑细胞培养液重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养。

进一步的，所述乌斑鳢脑组织先浸泡在三抗溶液中，所述三抗溶液为青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液。

进一步的，乌斑鳢脑组织为剪碎的无菌的乌斑鳢脑组织。

进一步的，所述胶原酶I 0.1％w/v，消化10-15min；所述胰酶0.25％w/v。消化时间为10～15min。

进一步的，所述乌斑鳢脑细胞培养液为为M199培养基；所述M199培养基还包括终浓度为100u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液和20﹪胎牛血清，pH为7.2～7.6。

进一步的，步骤(3)胰酶液中含有0.25％w/v胰酶和0.02％w/v EDTA。

上述乌斑鳢脑细胞系在培养鱼类病毒中的应用；所述病毒为鲤春病毒血症病毒、乌斑鳢弹状病毒、蛙虹彩病毒、基因I型草鱼呼肠孤病毒、罗非鱼湖病毒的至少一种。

上述乌斑鳢脑细胞系在气单胞菌粘附性的应用；所述气单胞菌为鳢源舒伯特气单胞菌。

近年来有关鱼类非特异性相关功能基因组的克隆及免疫调节机理的研究已成为热点,本发明通过细菌黏附细胞实验对病原与宿主之间进行非特异性免疫功能研究。

本发明的有益效果是：

本发明乌斑鳢脑细胞系首次在体外成功培养，采用胰酶和胶原酶共同消化分离脑组织细胞，培养7天时，明显出现延伸生长；15天后铺满培养皿，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态；细胞连续传代培养16个月已传至50代，仍然保持上皮细胞形态特点、生长特性；甚至连续培养100代仍保持较强的生长特性和增殖特性，可提供大量的乌斑鳢脑来源细胞。

本发明细胞系特性稳定，目前传至100代，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本发明乌斑鳢脑细胞系对多种鱼类病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，可以直接应用于病原研究。

附图说明

图1为相差显微镜下的乌斑鳢脑细胞系的形态；A为原代细胞；B为20代乌斑鳢脑细胞；C为50代乌斑鳢脑细胞；D为80代乌斑鳢脑细胞；

图2为悬浮CAMB的检测参数；注：细胞计数：12215个；平均体积：1.28pL；平均直径：13.5μm；

图3为乌斑鳢脑细胞系的最适培养条件；A为培养基：B为血清浓度；C为温度；

图4为乌斑鳢脑细胞染色体；其中A为乌斑鳢脑细胞染色体，Number of cells为细胞数目、Number of chromosome为染色体数目；

图5.乌斑鳢肾细胞病毒敏感性；其中A.空白对照；B.TiLV；C.SVCV；D.HSHRV；E.FV3；F.GCRV；

图6.CAMB细胞的病毒感染PCR电泳图；其中泳道1：感染TiLV-2017A的CAMB细胞；泳道3：感染SVCV的CAMB细胞(套式PCR产物)；泳道5：感染SVCV的CAMB细胞(普通PCR产物)；泳道7：感染HSHRV的CAMB细胞；泳道9：感染FV3的CAMB细胞；泳道11：感染基因I型GCRV的CAMB细胞；泳道2、4、6、8、10和12分别为各病毒感染组的空白对照(加PBS组)；

图7为鳢源舒伯特气单胞菌JW-I菌株对乌斑鳢脑细胞的黏附性(1000×)；其中A.空白对照；B.鳢源舒伯特气单胞菌JW-I黏附细胞。

具体实施方式

一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018125。

优选的，该方法为：将乌斑鳢脑组织放入胶原酶I消化，再加入胰酶消化，加入到乌斑鳢脑细胞培养液进行原代培养，细胞进行传代培养即可获得乌斑鳢脑细胞系。

优选的，包括以下步骤：

1)将乌斑鳢脑组织放入胰酶中进行消化，收集细胞，再加入胶原酶I中进行消化，收集消化后的细胞；

2)将上步收集到的细胞加入乌斑鳢脑细胞培养液制成细胞悬液，在26～28℃，4.5～5.5％CO₂条件下进行原代培养；

3)当原代培养细胞长满培养瓶底时，去培养液，用胰酶液消化，消化后去酶液，加入乌斑鳢脑细胞培养液重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养。

优选的，所述乌斑鳢脑组织先浸泡在三抗溶液中，所述三抗溶液为青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液。

优选的，乌斑鳢脑组织为剪碎的无菌的乌斑鳢脑组织。

优选的，所述胶原酶I 0.1％w/v，消化10-15min；所述胰酶0.25％w/v，消化时间为10～15min。

优选的，所述乌斑鳢脑细胞培养液为为M199培养基；所述M199培养基还包括终浓度为100u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液和20﹪胎牛血清，pH为7.2～7.6。

优选的，步骤(3)胰酶液中含有0.25％w/v胰酶和0.02％w/v EDTA。

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018125。

实施例1乌斑鳢脑细胞的分离和原代培养

实验材料和试剂

实验动物：10g-30g的乌斑鳢(经过反复的分子方法验证此为未感染水产动物病毒的健康乌斑鳢)。

实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子和纱布等。

培养基和相关试剂

青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液浓度为10000u/ml；

培养基：含有浓度为100U/ml青霉素-链霉素-两性霉素B三抗和20﹪胎牛血清(Gibco公司)的M199培养基(gibco公司)；

胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，

EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml；医用酒精；

0.01M的PBS缓冲液(NaCl 80g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，KCl 25 2g，水1000ml)。

检测健康的乌斑鳢，在实验室内暂养15天，无其他疾病，开始实验。

具体方法：

(1)取乌斑鳢在医用酒精中浸泡5min，在无菌条件下，剪取乌斑鳢的脑，将乌斑鳢剪碎的无菌的脑组织放入浓度为200u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液中泡5min；

(2)剪成小块(约1mm³)，然后0.1％的胶原酶I消化10-15min，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，加0.25％胰酶消化液，消化10-15min，离心去上清，最后加入乌斑鳢脑细胞培养液，重悬混匀成细胞悬液；

(3)将细胞悬液移入培养瓶，放入到27℃培养箱中培养；

(4)待培养2天后观察细胞贴壁情况，适当加入乌斑鳢脑细胞培养液(保证培养液pH7.2-7.6)。待细胞铺板到1/3的时候(3～4天)，更换新鲜的培养液一次；

(5)待细胞铺满培养皿底(7-8天)，用胰酶消化液初步消化细胞后，将消化的细胞放入乌斑鳢脑细胞培养液进行传代培养，传代比率为1:2-1:3。

将乌斑鳢脑细胞系冻存以备用；复苏后能够继续稳定增殖生长。日后根据细胞生长情况，隔3-5天传代1次。

乌斑鳢脑细胞培养液：包括终浓度为100u/ml的青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液，20﹪胎牛血清的M199培养基，pH为7.2～7.6。

实验结果：图1为相差显微镜下的乌斑鳢脑细胞系的形态，呈现典型的上皮样细胞形态。图2是乌斑鳢脑细胞系悬浮特性，结果表明乌斑鳢脑细胞系均一性好，直径大多为12-18微米。

实施例2乌斑鳢脑细胞系的传代培养和冻存保种

试剂

胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，

EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

冻存液：含10﹪DMSO、25﹪的特级胎牛血清的M199培养基。

实验方法

待细胞生长至90﹪时，弃掉旧的培养基，加入1ml胰酶消化液进行消化；待细胞呈现“白雾”状的时候，加入2ml的乌斑鳢脑细胞培养液，以终止胰酶的作用，轻轻晃动，使细胞混匀，计数。1000rpm，离心5min，去除培养液，加入1.5ml细胞冻存液，重悬细胞。

收集细胞到冻存管中，于冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期。

一个月后，按照常规细胞复苏的方法，进行细胞复苏，细胞增殖能力仍然很强，状态良好。一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018125。

实施例3乌斑鳢脑细胞系生长特性测定

试剂

胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

培养基：不同浓度的特级胎牛血清的M199培养基。DMEM、MEM、L-15培养基

实验方法

1乌斑鳢脑细胞最佳培养基的确定

选择DMEM、M199、MEM、L-15四种细胞培养基，并添加终浓度为10％的FBS制备细胞培养液。调整细胞密度为2×10⁵mL-1，四种培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1天从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线。

结果：确定乌斑鳢脑细胞的最适培养基为M199或L-15培养基(图3 A)。

M199培养基，根据Medium 199培养基(含Earle’s平衡盐溶液)说明书要求，在容器中加入1L水，并将容器放到磁力搅拌器上，边搅拌便加入Medium 199培养基(含Earle’s平衡盐溶液)干粉。当充分搅匀和溶解后，加入10％的胎牛血清。用粉状NaHCO₃调节培养液的pH至7.2～7.6。尽快过滤除菌，分装后，-20℃保存。

L-15培养基，根据Leibovitz's L-15培养基(含L-谷氨酰胺)说明书要求，在容器中加入1L水，并将容器放到磁力搅拌器上，边搅拌便加入L-15培养基(含L-谷氨酰胺)干粉。当充分搅匀和溶解后，加入10％的胎牛血清。用粉状NaHCO₃调节培养液的pH至7.2～7.6。尽快过滤除菌，分装后，-20℃保存。

2乌斑鳢脑细胞最适血清浓度的确定

分别配制含有胎牛血清FBS浓度为5％、10％、15％、20％的培养液。调整细胞密度为2×10⁵mL^-1。将四种血清浓度培养基各按2.5mL/孔的量接种于6孔板，于27℃的培养箱中培养。每1天从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线。

结果：发现FBS浓度为10％～20％均适合罗非鱼脑细胞的培养(图3 B)。

3乌斑鳢脑细胞最适培养温度的确定

选择15℃、22℃、27℃、32℃四个不同培养温度，使用添加10％FBS的DMEM培养液，调整细胞密度为2×10⁵mL^-1，细胞悬液按2.5mL/孔的量接种于6孔板并置于于四个不同培养温度培养箱里。每1d从每个实验组里取出3孔细胞，用Trypsin-EDTA消化法收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线，发现22℃、27℃均适合罗非鱼脑细胞的培养(图3 C)。收集细胞并计数，共培养7天，连续计数7次，绘制其生长曲线。

实验结果：乌斑鳢脑细胞最适培养条件为：在含有10％胎牛血清的M199培养基中，27℃下培养。

实施例4乌斑鳢脑细胞的染色体分析

第60代乌斑鳢肾细胞于对数生长期加入终浓度为8μg/mL的秋水仙素，27℃处理16h后收集细胞，用0.075mol/L的KCl低渗处理20min，加入1mL预冷的卡诺固定液，1000r/min离心5min去上清后，用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。冷滴片法滴片，干燥后，用5％的Giemsa染色25min。镜检，分别选择100个***相进行核型分析和统计。

结果显示(图4A)，第60代的乌斑鳢肾细胞43％的染色体为2n＝64，而乌斑鳢体细胞的染色体为2n＝45。

实施例5乌斑鳢脑细胞系对不同水生动物病毒的感染实验

将生长状况良好的两瓶乌斑鳢脑细胞进行传代，传代比率为1:3，充分混匀后分装至六个25cm²细胞培养瓶中，当细胞刚刚长满培养瓶底部时，也就是铺满瓶底80-90％时，吸弃培养基，HBSS缓冲液清洗两次，分别接入1mL鱼类病毒，鱼类病毒分别为：鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)、乌斑鳢弹状病毒(Hybrid snakeheadrhabdovirus,HSHRV)、蛙虹彩病毒(Frog virus3,FV3)、基因I型草鱼呼肠孤病毒(GrassCarp Reovirus,GCRV)，罗非鱼湖病毒(TiLV)。PBS作为空白对照组，根据培养温度不同，分别设立空白对照。

病毒孵育1h后，弃病毒液，加入5mL细胞维持液(含5％FBS的M199培养基)，接入SVCV的细胞培养瓶置于22℃恒温培养箱，接入另外四种病毒的细胞瓶放置28℃的培养箱。空白对照放置28℃培养。每天观察细胞生长以及细胞病变效应CPE，一旦出现CPE病变，在细胞未完全脱落之前收集细胞悬液，并进行RNA提取，然后进行RT-PCR检测。未出现病变的接毒组盲传3代后，收集样本进行RT-PCR实验，通过检测病毒转录本分析病毒是否在CAMB细胞中增殖。

收集样本时将培养瓶取出，放置于-20℃冰箱过夜，后取出待培养基融化后，用力敲打培养瓶，使细胞完全脱落。吹打混匀冻融后，取出200μL细胞悬液于离心管中进行RNA提取并进行PCR检测。琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

结果：CAMB细胞分别接种五种水生动物病毒后，如图5。细胞内出现明显的细胞病变(CPE)。在接种第5天收集各病毒悬液200μL提取RNA。其中FV3目的条带为531bp，HSHRV条带大小为480bp，SVCV的检测为半套式反应，两次PCR的产物能分别检测到714bp和606bp的片段。基因I型GCRV的目的条带为661bp，TiLV-2017A目的条带为700bp(图6)。

根据PCR及凝胶电泳实验结果，接种不同种病毒的细胞中，均可检测到目的条带，说明乌斑鳢脑细胞系能够增殖以下病毒TiLV、FV3、HSHRV、GCRV、SVCV，为水生动物的研究提供了有力的材料。

实施例6乌斑鳢脑细胞系对鳢源舒伯特气单胞菌JW-I的黏附实验

鳢源舒伯特气单胞菌含有鞭毛，鞭毛蛋白参与细菌的吸附、侵袭及定植，对于黏附素对宿主的黏附起到重要作用，是细菌的重要毒力因子之一。

将已经培养好的乌斑鳢脑细胞传至6孔细胞培养板(预先放置细胞爬片)中，28℃培养24h，待细胞长成单层后，用PBS洗涤3次。分别加入1.0mL细菌浓度为5x10 cfu/ml的细胞培养液。同时空白组添加PBS，每组三个平行。将细胞系在28℃下孵育90min，PBS洗涤3-4次，除去未黏附的细菌，待盖玻片晾干后，室温固定5min(固定液配比：甲醇和冰乙酸的体积比为3:1)，自然干燥，使用迪夫快速细胞染色液染色，水洗、封片，油镜下随机选择30个细胞，对每个细胞所黏附的菌进行计数。试验重复3次。

结果如图7所示，鳢源舒伯特气单胞菌JW-I对乌斑鳢脑细胞有较强的黏附性，油镜下可见平均黏附细菌数为40±2个。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种乌斑鳢脑细胞系CAMB于2018年6月13日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018125。

2.权利要求1所述乌斑鳢脑细胞系在培养鱼类病毒中的应用；所述病毒为鲤春病毒血症病毒、乌斑鳢弹状病毒、蛙虹彩病毒、基因I型草鱼呼肠孤病毒、罗非鱼湖病毒的至少一种。

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