CN105420310A - 优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法 - Google Patents

优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，通过采用Plackett-Burman试验设计和Box-Behnken试验设计，对发酵细菌纤维素的大米糖化液发酵培养基主要组分进行筛选，优化各组分的配比，获得优化的大米糖化液发酵培养基配方配比。用优化了的大米糖化液发酵培养基发酵细菌纤维素的产率为7.08g/L，是大米糖化液培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率（0.382g/L）的18.5倍，比基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率（4.80g/L）提高47.5%高，主要质量指标优于基础培养基培养的细菌纤维素，用优化的大米糖化液培养基制备细菌纤维素在持水性、结晶度、热稳定性等性质方面优于用基础培养基制备的细菌纤维素。

Description

优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法
技术领域
本发明涉及细菌纤维素生产领域，具体地说，是一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法。
背景技术
椰子水是最早用于生产细菌纤维素的原料，也是目前普遍使用的原料。近年来,细菌纤维素凭借其优良的特性被广泛运用于医疗、纺织、环保、造纸等诸多领域，导致细菌纤维素需要量巨大，使得有限的椰子水资源早已供不应求，且以椰子水为主要原料具有地域性限制，无法满足市场扩增的需要。寻找替代椰子水的细菌纤维素原料成为研究的一大热点。本发明人所在课题组前期研究表明，大米糖化液可用于培养细菌纤维素，但存在浓度高时转化率低，浓度低时产量低的问题。本发明针对大米糖化液培养细菌纤维素的问题，以常用的木醋杆菌为试验菌株，优化大米糖化液发酵培养基，将优化的大米糖化液发酵培养基所培养的细菌纤维素与基础培养基发酵的细菌纤维素在产量和产品特性方面进行比较，找到一种提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对目前椰子水生产细菌纤维素存在生产周期长、产量低、劳动强度大、生产成本高、受原料季节性和地域性限制的问题，研究用其他原料代替椰子水，生产出产量高、质量好的细菌纤维素。具体地说是利用大米糖化液代替椰子水，通过优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率和质量的方法。
本发明一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，是通过采用Plackett-Burman试验设计和Box-Behnken试验设计方法，对发酵细菌纤维素的大米糖化液发酵培养基主要组分进行筛选，优化各组分的配比，获得优化的大米糖化液发酵培养基配方配比，其配方配比为：酵母膏13.1g，蛋白胨10.0g，磷酸二氢钾5.7g，硫酸镁3.1g，硫酸亚铁0.3g，柠檬酸0.3g，无水乙醇40ml，用大米糖化液培养基基料配制成1000ml，用优化了的大米糖化液发酵培养基发酵细菌纤维素干膜的产率为7.08g/L，是大米糖化液培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率0.382g/L的18.5倍，比基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率4.80g/L提高47.5%，主要质量指标优于基础培养基培养的细菌纤维素。
所述的Plackett-Burman试验设计方法是以蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸、无水乙醇7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，每个因素取高、低2个水平，以细菌纤维素干膜产率g/L为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，得到其中显著影响的四个因素为酵母膏、KH2PO4、FeSO4和无水乙醇。
所述的Box-Behnken试验设计是在Plackett-Burman设计试验基础上，对影响细菌纤维素干膜产率的主要因素酵母膏、KH2PO4、FeSO4和无水乙醇按Box-Behnken试验设计方法做四因素、三水平的Box-Behnken试验，共进行29组试验，利用Design-Exper7.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到细菌纤维素干膜产率y对自变量酵母膏x 1 、KH2PO4 x 2 、FeSO4 x 3 、无水乙醇x 4 的多元回归方程：y=6.63+0.31x1-0.13x2-0.035x3+0.11x4-0.01x1x2-0.008x1x3-0.007x1x4+0.11x2x3+0.14x2x4+0.036x3x4-0.67x1 2-0.37x2 2-0.33x3 2-0.82x4 2，自变量与响应值有显著线性关系，预测值和试验值之间具有高度的相关性R 2=0.9306，可以应用于细菌纤维素发酵生产的理论预测，在获得回归非线性模型和响应面之后，为得到培养基最佳的质量浓度，对所得的回归拟合方程分别对各自变量x1、x2、x3、x4求极值，由极值点得出影响细菌纤维素干膜产率主要因素的最佳添加量为酵母膏13.1g/L，KH2PO45.7g/L，FeSO40.3g/L，无水乙醇40.4ml/L。
所述大米糖化液培养基基料的制备方法如下：
（1）大米粉碎，按1:12的比例加水，加热至80-90℃，糊化30min得大米糊；
（2）将大米糊降温至60℃,调pH到4.0-4.5；
（3）按每g大米加300u糖化酶的比例加入糖化酶，60℃保温糖化至碘液检测不显兰色，用DNS法测糖化液总糖含量；
（4）用水调整糖化液总糖含量为50g/L即得大米糖化液培养基基料。
所指的基础培养基配方为：蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8.0g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，用蒸馏水配成1000mL，灭菌冷却后加入无水乙醇3%v/v，利用基础培养基发酵细菌纤维素的产量为4.80g/L。
上述所指细菌纤维素主要质量指标为持水性、结晶度、热稳定性。
用优化的大米糖化液发酵培养基制备细菌纤维素的方法为：
（1）按优化的大米糖化液发酵培养基配方配比配制优化的大米糖化液发酵培养基，简称发酵培养基1000ml；
（2）取步骤（1）所得的发酵培养基于121℃灭菌20-30min，冷至室温；
（3）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（4）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（5）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（6）将步骤（5）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（7）将步骤（6）在80℃下干燥至恒重即得成品。
有益效果
本发明提供了优化大米糖化液培养基为原料发酵细菌纤维素的方法，能够达到提高细菌纤维素干膜产率和质量的目的，解决了细菌纤维素生产中地域性限制的难题，增加了细菌纤维素的产量，降低了生产成本，提高了经济效益。
附图说明
图1基础培养基细菌纤维素的TG-DTA图谱
图2大米糖化液培养基细菌纤维素的TG-DTA图谱。
具体实施方式
实施例1大米糖化液培养基基料的制备方法如下：
（1）大米粉碎，按1:12的比例加水，加热至80-90℃，糊化30min得大米糊；
（2）将大米糊降温至60℃,调pH到4.0-4.5；
（3）按每g大米加300u糖化酶的比例加入糖化酶，60℃保温糖化至碘液检测不显兰色，用DNS法测糖化液总糖含量；
（4）用水调整糖化液总糖含量为50g/L即得大米糖化液培养基基料。
实施例2基础培养基配制：
取蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8.0g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，用蒸馏水配成1000mL，灭菌冷却后加入无水乙醇3%v/v。若配制基础培养基2000ml，各组分按比例增加。
实施例3：用大米糖化液培养基基料发酵细菌纤维素
（1）按大米糖化液培养基基料的制备方法制备大米糖化液发酵培养基基料1000ml；
（2）取步骤（1）所得的发酵培养基于121℃灭菌20-30min，冷至室温；
（3）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（4）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（5）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（6）将步骤（5）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（7）将步骤（6）在80℃下干燥至恒重即得成品。
利用大米糖化液培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率为0.382g/L，远远小于基础培养基4.80g/L的产量。由于大米糖化液培养基基料的总糖含量与基础培养基的相同，都为50g/L，说明导致大米糖化液培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率不高的原因是除糖类外其他营养成分。
实施例4Plackett-Burman试验设计：
在单因素试验的基础上，以蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸、无水乙醇7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，每个因素取高、低2个水平，因素水平见表1。以细菌纤维素干膜产率R（g/L干膜重）为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，Plackett-Burman试验设计及响应值见表2。利用DesignExpert7.0对Plackett-Burman试验数据进行分析，经整理后如表3。
经软件分析，主效应中，酵母膏（P=0.0683）、KH2PO4(P=0.0765)、FeSO4(P=0.0511)、无水乙醇(P=0.0018)的效应显著，P值均小于0.10，可以作为进一步优化的关键因素。其他因素对结果影响不大（P>0.10）,再进一步研究中作为条件因素考虑。
注：*表示0.10水平上的差异
实施例5Box-Behnken试验设计：
在Plackett-Burman试验的基础上，对影响木醋杆菌在大米糖化液培养基中代谢合成细菌纤维素的主要因素按Box-Behnken试验设计进行29组试验，试验因素水平及编码见表4，试验结果见表5.利用Design-Exper7.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到细菌纤维素干膜产率（y）对自变量酵母膏（x 1 ）、KH2PO4(x 2 )、FeSO4(x 3 )、无水乙醇(x 4 )的多元回归方程：y=6.63+0.31x1-0.13x2-0.035x3+0.11x4-0.01x1x2-0.008x1x3-0.007x1x4+0.11x2x3+0.14x2x4+0.036x3x4-0.67x1 2-0.37x2 2-0.33x3 2-0.82x4 2。
由方差分析可知（表6），此模型极显著（P＜0.0001），失拟项不显著（P=0.2721），预测值与试验值间有高度相关性（R 2=0.9306），模型与实际拟合良好，自变量与响应值有显著线性关系，预测值和试验值之间具有高度的相关性，可以应用于细菌纤维素发酵生产的理论预测。
回归系数显著性检验结果（表7）表明，在模型参数中，x1、x2、x1 2、x2 2、x3 2、x4 2对细菌纤维素干膜产率影响极显著。在获得回归非线性模型和响应面之后，为得到培养基最佳的质量浓度，对所得的回归拟合方程分别对各自变量x1、x2、x3、x4求极值，得极值点分别为：x1=0.24，x2=-0.32，x3=1，x4=0.04，即酵母膏添加量为13.1g/L，KH2PO4添加量为5.7g/L，FeSO4添加量为0.3g/L，无水乙醇添加量为40.4ml/L。最优的培养基发酵条件下，理论细菌纤维素的最大产量为6.66g/L。优化后的培养基为酵母膏13.1g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO45.7g/L、MgSO43.1g/L、FeSO40.3g/L、柠檬酸0.3g/L、无水乙醇40.0ml/L，用大米糖化液培养基基料配制成1000mL。经实际测量，优化后的发酵培养基的细菌纤维素平均产量为7.08g/L，比较接近预测值，是优化前的18.5倍（0.382g/L）。
注：**表示0.05水平上的差异
实施例6用优化的大米糖化液发酵培养基制备细菌纤维素的方法：
（1）按优化的大米糖化液发酵培养基配方配比配制优化的大米糖化液发酵培养基，简称发酵培养基1000ml；
（2）取步骤（1）所得的发酵培养基于121℃灭菌20-30min，冷至室温；
（3）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（4）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（5）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（6）将步骤（5）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（7）将步骤（6）在80℃下干燥至恒重即得成品。
实施例7优化大米糖化液发酵培养基生产细菌纤维素性能检测：
步骤（1）细菌纤维素持水性和复水性分析
细菌纤维素持水性和复水性分析结果见表8。由表8可知，与基础培养基相比，大米糖化液培养基培养的细菌纤维素在持水性和复水性方面略高于基础培养基培养的细菌纤维素。
（2）细菌纤维素结晶度分析
根据X-射线衍射实验数据，分别根据公式计算各培养基细菌纤维素的结晶度，结果见表9。与基础培养基相比，大米糖化液培养基发酵的细菌纤维素结晶度86.24%，比基础培养基的76.27%提高了13.07%。
（3）细菌纤维素热稳定性分析
图1、图2为基础培养基和大米糖化液培养基发酵的细菌纤维素的TG-DTA图谱，由图1、图2的细菌纤维素TG曲线可知，所测样品的质量随温度变化可以分为三个阶段：0～170℃内的质量轻度损耗，170～550℃内的质量快速损耗阶段，550～800℃之间的质量轻微损耗阶段。在0～170℃阶段大米糖化液培养基、基础培养基所得的细菌纤维素的最大失重速率温度分别为60.0℃和46.9℃，表明该阶段的质量损失主要是细菌纤维素脱水产生的，故称失水阶段，由于所测样品没有达到恒重干燥的程度或者是因为吸收了空气中的水分，所以造成了最大失重速率处的温度不同；170～550℃阶段，最大失重速率处温度分别为346.8℃、333.5℃，此阶段质量降低速度快，持续时间长，为细菌纤维素的降解阶段,对于材料热稳定性采用最大失重速率法来衡量，最大失重速率处温度越高，细菌纤维素的热稳定性越好，说明热稳定性方面大米糖化液培养基优于基础培养基。

Claims (7)

1.一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是通过采用Plackett-Burman试验设计和Box-Behnken试验设计方法，对发酵细菌纤维素的大米糖化液发酵培养基主要组分进行筛选，优化各组分的配比，获得优化的大米糖化液发酵培养基配方配比，其配方配比为：酵母膏13.1g，蛋白胨10.0g，磷酸二氢钾5.7g，硫酸镁3.1g，硫酸亚铁0.3g，柠檬酸0.3g，无水乙醇40ml，用大米糖化液培养基基料配制成1000ml，用优化了的大米糖化液发酵培养基发酵细菌纤维素干膜的产量为7.08g/L，是大米糖化液培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率0.382g/L的18.5倍，比基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率4.80g/L提高47.5%，主要质量指标优于基础培养基培养的细菌纤维素。
2.根据权利要求书1所述的一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所述的Plackett-Burman试验设计方法是以蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸、无水乙醇7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，每个因素取高、低2个水平，以细菌纤维素干膜产率g/L为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，得到其中显著影响的四个因素为酵母膏、KH2PO4、FeSO4和无水乙醇。
3.根据权利要求书1所述的一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所述的Box-Behnken试验设计是在Plackett-Burman设计试验基础上，对影响细菌纤维素干膜产率的主要因素酵母膏、KH2PO4、FeSO4和无水乙醇按Box-Behnken试验设计方法做四因素、三水平的Box-Behnken试验，共进行29组试验，利用Design-Exper7.0软件对试验数据进行多元回归拟合，得到细菌纤维素干膜产率y对自变量酵母膏x 1 、KH2PO4 x 2 、FeSO4 x 3 、无水乙醇x 4 的多元回归方程：y=6.63+0.31x1-0.13x2-0.035x3+0.11x4-0.01x1x2-0.008x1x3-0.007x1x4+0.11x2x3+0.14x2x4+0.036x3x4-0.67x1 2-0.37x2 2-0.33x3 2-0.82x4 2，自变量与响应值有显著线性关系，预测值和试验值之间具有高度的相关性R 2=0.9306，可以应用于细菌纤维素发酵生产的理论预测，在获得回归非线性模型和响应面之后，为得到培养基最佳的质量浓度，对所得的回归拟合方程分别对各自变量x1、x2、x3、x4求极值，由极值点得出影响细菌纤维素干膜产率主要因素的最佳添加量为酵母膏13.1g/L，KH2PO45.7g/L，FeSO40.3g/L，无水乙醇40.4ml/L。
4.根据权利要求书1所述的一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所指大米糖化液培养基基料的制备方法如下：
（1）大米粉碎，按1:12的比例加水，加热至80-90℃，糊化30min得大米糊；
（2）将大米糊降温至60℃,调pH到4.0-4.5；
（3）按每g大米加300u糖化酶的比例加入糖化酶，60℃保温糖化至碘液检测不显兰色，用DNS法测糖化液总糖含量；
（4）用水调整糖化液总糖含量为50g/L即得大米糖化液培养基基料。
5.根据权利要求书1所述的一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所指基础培养基配方为：蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8.0g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，用蒸馏水配成1000mL，灭菌冷却后加入无水乙醇3%v/v，利用基础培养基发酵细菌纤维素干膜的产率为4.80g/L。
6.根据权利要求书1所述的一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所指细菌纤维素主要质量指标为持水性、结晶度、热稳定性。
7.根据权利要求书1所述的一种优化大米糖化液发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是用优化的大米糖化液培养基制备细菌纤维素的方法为：
（1）按优化的大米糖化液发酵培养基配方配比配制优化的大米糖化液发酵培养基，简称发酵培养基1000ml；
（2）取步骤（1）所得的发酵培养基于121℃灭菌20-30min，冷至室温；
（3）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（4）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（5）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（6）将步骤（5）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（7）将步骤（6）在80℃下干燥至恒重即得成品。
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