CN102242166A - 一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，包括：(1)将菊糖溶于水中，用酸在50-130℃下水解5-240min或用酶在20-90℃下水解5-240min，即得水解液；(2)在菊糖水溶液或由步骤(1)制得的菊糖水解液中加入氮源配制成发酵培养基，pH调至4.0-6.0灭菌；将细菌纤维素生产菌株的种子液接入发酵培养基，在20～30℃温度下静止培养或者在5～500rpm转速下动态培养，经过3～23天制得细菌纤维素。本发明的生产工艺具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

Description

一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法

技术领域

本发明属于细菌纤维素的制备领域，特别涉及一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的天然聚合物，广泛存在于树木、棉花等植物材料中。细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)则是一种由微生物发酵形成的一类纤维素，它与植物纤维素化学组成相似，因在吸水性能、物理和机械性能等诸多方面有着诸多优良性能，使其很适合作为一种生物材料应用于纺织(如粘胶纤维的原料)、造纸、音响、医药及食品工业等领域。在食品工业领域，细菌纤维素本身可以作为一种膳食纤维食品食用，如俗称“椰果”或者“椰纤果”。常见的用于发酵生产细菌纤维素的碳源有甘露醇，葡萄糖，果糖，蔗糖等，其中甘露醇和果糖作为碳源的培养效果相对较好，但这些碳源价格较高导致纤维素生产成本较高，不能用于大规模生产，因此寻找廉价合适的新碳源降低生产成本并提高纤维素产量是当前细菌纤维素研究领域的热点。菊糖也称菊粉，是由D-呋喃果糖分子以β-(2→1)糖苷键连接而成的线性直链果聚糖，末端常带有一个葡萄糖，聚合度为2-60。菊糖(菊粉)经水解可以生成75％以上D-果糖的高果糖浆或低聚果糖浆，因此以菊糖或其富含果糖的水解物为碳源，将更适合生产细菌纤维素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，该方法具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

本发明的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，包括：

(1)将菊糖溶于水中，用酸在50-130℃下水解5-240min或用酶在20-90℃下水解5-240min，即得水解液；其中，水解温度为100～130℃时在水解后将菊糖脱毒；

(2)在菊糖水溶液或由步骤(1)制得的菊糖水解液中加入氮源配制成发酵培养基，pH调至4.0-6.0灭菌；将细菌纤维素生产菌株的种子液接入发酵培养基，在20～30℃温度下静止培养或者在5～500rpm转速下动态培养，经过3～23天制得细菌纤维素。

所述步骤(1)中的菊糖水溶液浓度为1-350g/L。

所述步骤(1)中的酸为硫酸、磷酸、盐酸或硝酸，浓度为0.1～3mol/L。

所述步骤(1)中的酶为菊糖酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、糊精酶或淀粉酶中的一种或几种。

所述步骤(1)中的菊糖浓度为0.1g/mL，酸浓度为1.5mol/L，酸解温度为100℃，酸解时间为1.0～1.5小时。

所述步骤(2)中的氮源为0.1～1wt％的酵母浸膏和0.1～0.5wt％的胰蛋白胨；或者为0.1-2wt％的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。

所述步骤(2)中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacteroxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounassp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonascepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。

所述细菌纤维素生产菌株为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。

所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按体积百分比3-15％的接种量转接到发酵培养基；细菌纤维素生产菌株为红茶菌时按接入1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基，然后按1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量转接到发酵培养基。

所述细菌纤维素生产菌株为红茶菌时液体种子培养基和发酵培养基的组成均为：每1L水中，绿茶或者红茶1～10g，含糖为10～200g的菊糖水溶液或菊糖水解液，蛋白胨或者胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液、绿茶或红茶以及水，其中糖、茶、水的质量比为5∶0.1～0.4∶100～200，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或每1L水中，含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，121℃灭菌20min。

所述步骤(1)中的水解温度为100～130℃时获得的水解液脱毒具体方法有：

(1)采用NaOH将水解液pH值调到4.5-5.5，过滤沉淀，并重新微调pH到4.5-5.5；

(2)采用NaOH将水解液pH值调到4.5-5.5，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(3)采用NaOH将水解液pH值调到9.5-11，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新调节pH值到4.5-5.5；

(4)采用NaOH将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5；

(5)采用NaOH将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(6)采用NaOH将水解液pH值调到4.5-5.5，加10wt％的酶活为2.75U/mL的漆酶于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤掉沉淀物并重新微调pH值到4.5-5.5；

(7)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到4.5-5.5，过滤沉淀，并微调到pH4.5-5.5；

(8)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到4.5-5.5，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(9)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5-11，加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新调节pH值到4.5-5.5；

(10)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5；

(11)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(12)采用Ca(OH)₂将水解液pH值调到4.5-5.5，加10wt％的酶活为2.75U/mL的漆酶于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤掉沉淀物并重新微调pH值到4.5-5.5；

(13)采用25％-30％氨水将水解液pH值调到9.5-11，于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤并重新调pH值到4.5-5.5，然后加入活性炭吸附，反应后过滤掉活性炭并重新微调pH值到4.5-5.5；

(14)采用25％-30％氨水将水解液pH值调到4.5-5.5，加10％的酶活为2.75U/mL的漆酶于25-60℃温水浴条件下反应12h-24h，过滤掉沉淀物并重新微调pH值到4.5-5.5。

有益效果

本发明以价廉的菊粉(富含果糖、果低聚糖和果聚糖)或其富含果糖的水解物为原料，可以大大降低BC的生产原料成本；该生产工艺具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点；利用果糖是生产细菌纤维素的优质碳源特点，以菊糖生产的细菌纤维素产量高于其他碳源生产的，在细菌纤维素的生产领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为酸解时间对菊糖酸解还原糖得率的影响；

图2为硫酸浓度对菊糖酸解还原糖得率影响；

图3为水解温度对菊糖酸解还原糖得率影响；

图4为菊糖浓度对菊糖酸解还原糖得率影响图；

图5为菊糖及其酸解液发酵细菌纤维素产量；

图6为不同碳源制备的细菌纤维素膜绝对拉伸强度；

图7为细菌纤维素膜的相对湿膜拉伸强度；

图8为细菌纤维素膜的相对干膜拉伸强度；

图9为细菌纤维素膜的含水率；

图10为菊糖及菊糖酸解液培养细菌纤维素的红外图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

将1～10g菊糖加入10mL浓度为0.5～3mol/L的硫酸溶液中，配成0.1g/mL～1g/mL浓度的菊糖酸解液，将菊糖酸解液放入50～130℃的油浴锅中，酸解0.5～4小时。得到的菊糖酸解液用NaOH调pH至6，DNS法测菊糖酸解液还原糖含量，进而计算酸解得率。

菊糖酸解液还原糖含量测定：

以上所有试验都设置三个平行样品。

实验结果见图1-图4。结果显示菊糖硫酸水解效率与酸解时间，酸解温度，硫酸浓度及菊糖浓度有直接关系，各个因素不同，酸解效率不同。

最优的酸解条件是：菊糖浓度为0.1g/mL，酸解温度为100℃，硫酸浓度为1.5mol/L，酸解时间为1.5小时。

在以上单因素基础上，选择温度(因素A)、酸解浓度(因素B)、酸解时间(因素C)及菊糖浓度(因素D)为考察因素，按L₉(3⁴)正交试验表进行试验，DNS法测菊糖酸解液还原糖含量，进而计算酸解得率。

表1  L₉(3⁴)正交水平因素表

表2  正交实验分析结果

通过分析，菊糖浓度为0.1g/mL，酸解温度为100℃，硫酸浓度为1.5mol/L，酸解时间为2.0h条件下的水解得糖率最高，此时，菊糖酸解得率为96.35％。从极差值R的大小可知，各因素影响主次顺序是：D＞A＞B＞C，即菊糖浓度＞温度＞硫酸浓度＞酸解时间，其中菊糖浓度对菊糖酸解得率影响最大，其次为温度，硫酸浓度，酸解时间对菊糖酸解得率率无显著影响。正交实验结果显示最优组合为A₂B₂C₁D₁，即温度为100℃，酸浓为1.5mol/L，水解时间为1h，菊糖浓度为0.1g/mL。此条件下的菊糖酸解得率为98.71％。

薄层层析法分离菊糖及菊糖酸解液：

(1)标准液制备：称取葡萄糖、蔗糖、低聚果糖各1g于5mL容量瓶中，加水定容，配成20g/L的各种标准糖液，于4℃下冰箱保存。使用时，取各标准液1mL加3mL去离子水混合，形成糖浓度为5g/L的标准糖溶液。

(2)样品制备：菊糖称量1g加水溶解，转入50mL容量瓶中定容，于4℃下冰箱保存。使用时，取1mL加入3mL水，形成浓度为5g/L的溶液；

(3)菊糖酸解液制备：取1g菊糖，加入1.5mol/L浓度的硫酸10mL，在油浴锅中，100℃下分别酸解1.5h，NaOH调pH至6.0，定容至50mL，DNS法测得菊糖还原糖得率为97.44，于4℃下冰箱保存。使用时，取1mL加入3mL水，形成浓度约为5g/L的溶液；

(4)薄层层析：准确吸取一定量的标准液、样品液分别点于GF254硅胶板上，在储存有展层剂的展层缸中，上行展开，展层2.5h后，取出硅胶板，放入105℃烘箱中烘干，均匀喷洒上显色剂，再放入105℃烘箱中烘烤6min后显色。显色好的硅胶板放入扫描仪扫描层析图像，测量组分斑点到起点移动的距离，计算R_f值：R_f＝组分斑点移动的距离/溶剂至前沿移动的距离。

薄层层析结果显示菊糖酸解后得到的糖为单糖，即葡萄糖与果糖的混合糖。

实施例2

在菊糖溶于水中至浓度为0.1g/mL，调pH至5.0，加入菊粉酶至终浓度为1U/mL，于温度60℃水解2.0h获得一批菊糖水解液。以菊糖水解液为碳源，选择葡萄糖、果糖、葡萄糖和果糖的混合糖(1∶1)为对照碳源发酵生产细菌纤维素。

将培养1天的木葡糖酸醋杆菌ATCC23770或23767的液体种子培养基以6％的接种量接入不同碳源的发酵液培养基，在30℃的培养箱中静置培养15天或者在发酵罐中以100r/min的搅拌速度动态培养。将细菌纤维素转移至玻砂漏斗中。在105℃的烘箱里烘至恒重后计算细菌纤维素产量。

结果显示菊糖水解液发酵生产细菌纤维素的产量最高，达到15g/L，葡萄糖与果糖混合糖、果糖、葡萄糖次之。

实施例3

在菊糖溶于水中至浓度为0.1g/mL，调pH至6.0，加入菊粉酶糖、化酶和淀粉酶至终浓度为50U/mL，于温度20℃水解1.0h获得一批菊糖水解液。将1L水煮沸，加入绿茶或者红茶1-10g(茶叶5g时最优)，浸泡20min后滤去茶叶渣得到茶汤，然后加入菊糖水解液为碳源配成菊糖培养基，补加蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH5.0，巴氏灭菌30min。

将红茶菌按1～3片直径1cm圆片菌膜接入菊糖培养基，在30℃的培养箱中静置培养15天。将细菌纤维素转移至玻砂漏斗中。在105℃的烘箱里烘至恒重后计算细菌纤维素产量。结果显示菊糖水解液发酵生产细菌纤维素的产量可达到22g/L。

实施例4

在菊糖浓度为0.1g/mL，酸解温度为100℃，硫酸浓度为1.5mol/L，酸解时间为1.0h的条件下酸解一批菊糖，Ca(OH)₂调pH至12.0，30℃水浴里脱毒反应12h，硫酸调pH至6.0，过滤，加2％活性炭脱毒5min并微调pH至6.0，最终制得菊糖酸解液，分别以菊糖及菊糖水解液为碳源，选择葡萄糖、果糖、葡萄糖和果糖的混合糖(质量比为1∶1∶1∶1)为对照碳源发酵生产细菌纤维素。

将培养1天的木葡糖酸醋杆菌ATCC23770或23767的液体种子培养基以6％的接种量接入不同碳源的发酵液培养基，在30℃的培养箱中静置培养15天。将细菌纤维素转移至玻砂漏斗中。在105℃的烘箱里烘至恒重后计算细菌纤维素产量。

最终可得，菊糖及菊糖酸解液可以发酵生产细菌纤维素，其中菊糖发酵生产细菌纤维素的产量最高，达到16.06g/L，葡萄糖与果糖混合糖、果糖、葡萄糖次之，菊糖酸解液的产量最低，为8.47g/L。

实施例5

在菊糖浓度为0.1g/mL，酸解温度为130℃，硫酸浓度为1.5mol/L，酸解时间为1.0h的条件下酸解一批菊糖，Ca(OH)₂调pH至12.0，30℃水浴里脱毒反应12h，硫酸调pH至6.0，过滤，加2％活性炭脱毒5min并微调pH至6.0，最终制得菊糖酸解液，分别以菊糖及菊糖水解液为碳源，选择葡萄糖、果糖、葡萄糖和果糖的混合糖(质量比为1∶1∶1∶1)为对照碳源发酵生产细菌纤维素。

将培养1天的木葡糖酸醋杆菌ATCC23770或23767或红茶菌的液体种子培养基以6％的接种量接入不同碳源的发酵液培养基，在30℃的培养箱中静置培养15天。取出细菌纤维素膜，经1％的NaOH溶液，80℃保温2h，去离子水冲洗至中性。

用剪刀将其剪为4cm×1cm的条状，条状BC用滤纸吸取膜表面的水分，放入玻砂漏斗中称重(湿重)，每个样品五条做平行试验，用万能材料测试机测试拉伸强度，设定两个夹具之间的距离为2.5cm，速度为100mm/min。

BC膜的绝对拉力＝直接测得的拉伸强度

结果显示果糖发酵生产的细菌纤维素绝对拉伸强度最好，为1.81N，果糖与葡萄糖的混合糖发酵生产的细菌纤维素膜次之，葡萄糖的最差，为0.36N。相对湿膜拉伸强度最大的为果糖(2.69N/g)，其后依次为菊糖酸解液(2.01N/g)，菊糖(0.78N/g)，果糖与葡萄糖的混合糖(0.61N/g)和葡萄糖(0.27N/g)。相对干膜拉伸强度的顺序依次是果糖(868.1N/g)＞菊糖酸解液(375.4N/g)＞菊糖(330.3N/g)＞葡萄糖与果糖混合糖(226.9N/g)＞葡萄糖(96.2N/g)。不同碳源培养的细菌纤维素膜的含水率不同：菊糖培养的含水率最高，达到了99.77％，其后分别为混合糖与葡萄糖：99.71％，99.71％，果糖99.70％，菊糖酸解液培养的细菌纤维素膜的含水率最低，为99.47％。

将不同碳源发酵生产的细菌纤维素膜冷冻干燥，干燥后的样品分别用KBr压片法，经傅立叶红外仪扫描得到样品图谱，菊糖与菊糖发酵液发酵培养的BC膜的特征吸收峰范围相同，说明细菌纤维素膜是纤维素。

Claims (10)

1.一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，包括：

(1)将菊糖溶于水中，用酸在50-130℃下水解5-240min或用酶在20-90℃下水解5-240min，即得水解液；其中，水解温度为100～130℃时在水解后将菊糖脱毒；

(2)在菊糖水溶液或由步骤(1)制得的菊糖水解液中加入氮源配制成发酵培养基，pH调至4.0-6.0灭菌；将细菌纤维素生产菌株的种子液接入发酵培养基，在20～30℃温度下静止培养或者在5～500rpm转速下动态培养，经过3～23天制得细菌纤维素。

2.根据权利要求1所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的菊糖水溶液浓度为1-350g/L。

3.根据权利要求1所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的酸为硫酸、磷酸、盐酸或硝酸，浓度为0.1～3mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的酶为菊糖酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖化酶、糊精酶或淀粉酶中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的菊糖浓度为0.1g/mL，酸浓度为1.5mol/L，酸解温度为100℃，酸解时间为1.0～1.5小时。

6.根据权利要求1所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的氮源为0.1～1wt％的酵母浸膏和0.1～0.5wt％的胰蛋白胨；或者为0.1-2wt％的硫酸铵、玉米浆或麦芽汁。

7.根据权利要求1所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobactersp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。

8.根据权利要求7所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述细菌纤维素生产菌株为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)或红茶菌(kombucha)。

9.根据权利要求7所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述细菌纤维素生产菌株中除红茶菌以外的菌种按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基制备种子液，然后按体积百分比3-15％的接种量转接到发酵培养基；细菌纤维素生产菌株为红茶菌时按接入1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量接入液体种子培养基，然后按1～3片直径1cm圆片菌膜的接种量转接到发酵培养基。

10.根据权利要求9所述的一种以菊糖为碳源制备细菌纤维素的方法，其特征在于：所述细菌纤维素生产菌株为红茶菌时液体种子培养基和发酵培养基的组成均为：

每1L水中，绿茶或者红茶1～10g，含糖为10～200g的菊糖水溶液或菊糖水解液，蛋白胨或者胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液、绿茶或红茶以及水，其中糖、茶、水的质量比为5∶0.1～0.4∶100～200，pH3.0～7.5，巴氏灭菌30min；

或每1L水中，含糖为10～200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白胨或胰蛋白胨3g，酵母浸膏5g，pH3.0～7.5，121℃灭菌20min。

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