CN105392802B - 针对cxcr5的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对人CXCR5的单克隆抗体及其在治疗自身免疫或炎性疾病以及癌症中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及特异性针对CXCR5的抗体。更具体地，本发明涉及单克隆抗体，且更具体地是全人单克隆抗体，其以高亲和力特异性结合并中和人CXCR5。本发明还涉及编码所述抗体的核酸、用于表达这些核酸的载体，以及用于生产所述抗体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述抗体在诊断和/或治疗自身免疫疾病或炎性疾病以及癌症中的应用。
背景技术
初始B细胞啮合其B细胞受体(BCR)上的抗原(Ag)，上调CCR7并迁移至外部T细胞区以引发T细胞辅助，导致以T细胞依赖或不依赖方式进行分化。T细胞依赖型B细胞激活导致分泌浆细胞的短期IgM抗体。然而，与激活的T细胞的关联相互作用可进一步扩大B细胞功能并驱动滤泡分化。通过T细胞区运输的聚集的辅助T细胞暴露于抗原呈递细胞(APC)(如树突细胞)上MHC II型(MHCII)复合体上的相同抗原。抗原-MHCII复合体的呈递可导致具有相关抗原受体的T细胞的激活和增殖。激活的T细胞迁移至B细胞区域并以相同特异性啮合B细胞上MHCII结合的Ag，导致形成免疫突触。以该方式激活的B细胞催化滤泡生成并经历强烈增殖，分化为高亲和力记忆B细胞或长期浆细胞。通过BCR的体细胞高度突变生成高亲和力抗原结合B细胞的标准受到专门的间充质和T细胞群体的控制。通过与滤泡B辅助T细胞(TFH)相互作用来选择能够啮合并加工滤泡树突细胞(FDC)呈递的抗原的高亲和力抗原结合B细胞以进行进一步分化。与TFH细胞的相互作用促进选择高亲和力接头，以及用于分化为浆细胞和长期浆细胞的信号转导。B和TFH细胞上CXCR5的表达已知在优化生发中心内的这些相互作用中起关键作用。促进这些T和B细胞相互作用的特化微环境由组成型表达CXCL13的FDC产生，其促进表达CXCR5的特化的淋巴细胞子集的定位和停留。
在生发中心中，需要与CXCR5阳性TFH细胞相互作用以诱导高亲和力抗体应答。文献中越来越多的证据表明，B细胞在多发性硬化(MS)的发病中起作用，其生成导致髓磷脂破坏的特异性(自身)抗体。此外，B细胞涉及MS疾病过程的全部阶段，从起始(抗原捕获)至炎症和组织损伤并可在MS中起其他作用，包括但不限于抗原呈递和细胞因子产生。在现有的MS疗法中，直到最近之前都未直接靶向B细胞，其中试验性研究使用单克隆抗体(mAb)利妥昔单抗(抗CD20)。然而，随着许多当前MS疗法(干扰素β、糖皮质激素、米托蒽醌、那他珠单抗、芬戈莫德)和即将使用的MS疗法(阿来组单抗)具有影响B细胞行为的潜力，对B细胞的作用可能有助于其治疗效力。
CXCR5(也称为伯基特淋巴瘤受体，即BLR-1，和CD185)是一种G蛋白偶联的七次跨膜结构域受体(GPCR 7TM受体)，其在B细胞和CD4 T细胞亚群上高度表达。唯一已知的CXCR5配体是CXC趋化因子CXCL13(也称为BLC或BCA-1)。CXCR5的靶向删除显示该受体涉及B细胞迁移和***内的B细胞定位。在缺失CXCR5的情况下，B细胞无法从富T细胞区迁移至脾的B细胞滤泡，且结果是未形成功能性生发中心。CXCL13和CXCR5敲除小鼠具有类似表型，但有趣的是，其仍能够生成显著的抗原特异性应答，但比野生型小鼠中低得多。
CXCL13高度表达于发炎的中枢神经***(CNS)，但在正常CNS中实际上不可检测。CXCL13的鞘内产生被认为负责将CXCR5阳性B和T细胞招募至脑脊液(CSF)，且MS患者的CSF中大部分B细胞是CXCR5阳性的。还在继发进展型MS患者脑膜的淋巴滤泡样结构中观察到的FDC中检测到CXCL13表达。MS中发现的致病性B细胞应答是经证明调节B细胞功能的异位***构中淋巴细胞累积的直接产物。此外，非常靠近主动脱髓鞘损伤生成导致持久性自身免疫应答的自身抗原，从而在驱动疾病慢性化过程中起主要作用。CXCL13和B细胞激活因子(BAFF；B细胞存活的关键调控因子)都在小鼠的CNS中显著且恒定地上调并复发缓解或慢性复发实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)，表明在动物模型中，B细胞功能也在CNS炎症的慢性化过程中起作用。该发现与CXCL13敲除小鼠的表型一致，其显示与野生型对照相比较轻形式的EAE并具有炎性症状的快速消散和从疾病中完全恢复。这些研究证明，CXCL13和CXCR5在B细胞迁移、分化和增殖应答中起重要作用。血管***中存在的B细胞数量相对较低，因此特化的淋巴微环境内的定位对于与决定B细胞效应功能的其他淋巴细胞子集的相互作用而言至关重要。CXCR5的表达在该过程中起核心作用，因此CXCR5拮抗可潜在地通过降低招募至CNS的B和T细胞来阻断MS疾病，具体方法为通过抑制B细胞成熟为浆细胞或中心细胞和通过阻断与TFH细胞的相互作用和自身抗体产生。可能显著的是，CXCR5阻滞可通过减弱这些无菌淋巴环境内的自体抗原呈递来破坏异位淋巴滤泡发育，并促进炎性过程的缓解。
还在其他慢性炎性疾病(如类风湿性关节炎(RA)和舍格伦综合征)中通过CXCL13表达和与携带CXCR5的细胞相互作用鉴定到了异位***构的生成，且最近已证明CXCR5表达存在于多种胰腺癌中。因此，通过使用针对CXCR5的抗体，CXCR5的拮抗可以是这些疾病中有用的治疗方法。鉴于上文所述患有EAE的小鼠的CNS中BAFF和CXCL13(CXCR5的配体)表达的相似性，这是可信的，且原因是抗BAFF疗法是对炎性/自身免疫疾病治疗而言是广泛接受的。实际上，不同的抗BAFF抗体已上市或正在开发用于治疗炎性/自身免疫疾病：例如，已被批准用于***性红斑狼疮(SLE)的贝利木单抗也被评估针对诸如MS、RA和舍格伦综合征的疾病，且塔巴单抗(tabalumab)目前正在SLE和MS的临床试验中。
如上文所述，CXCL13/CXCR5通路在B细胞功能中起关键作用。Burkle等(2007)还证明，该通路参与癌症，如B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)。其特别证明，CLL患者的血清CXCL13水平显著高于健康患者。作者还证明，抗CXCR5抗体抑制对CXCL13的趋化性，表明CXCR5是针对CLL患者的新治疗靶标。
WO2009032661描述了特异性结合人CXCR5的胞外结构域的人源化抗体多肽。其还描述了治疗涉及CXCR5阳性细胞疾病患者的方法，包括给予所述患者结合CXCR5的CXCR5拮抗剂。
考虑到炎性和/或自身免疫疾病以及癌症对于公共健康的重要影响，因此还需要可特别用作治疗炎性和/或自身免疫疾病(如多发性硬化、类风湿性关节炎或舍格伦综合征)以及癌症(如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的癌症/淋巴瘤)的药物的新分子。
发明内容
本发明提供了特异性结合CXCR5的新单克隆抗体，特别是全人抗体。这些CXCR5抗体不仅能够结合还能够中和CXCR5。因此，其特别能够结合CXCR5+细胞，如B细胞。
在第一实施方式中，本发明描述了经由其互补决定区(CDR)序列结合CXCR5的抗体或其部分。包含所述CDR的抗体保留了这些CDR来源的母体分子的CXCR5结合特异性。
在另一个实施方式中，描述了所述抗体的构架区(FR)。所述FR将与本发明所述CDR组合。
在另一个实施方式中，还公开了感兴趣的抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列，以及可与其组合的优选的恒定区的氨基酸序列。
本发明的另一个实施方式由编码本发明抗体的多核苷酸序列、载体和包含所述多核苷酸序列的细胞系组成。
还描述了一种生成本发明所述抗体的方法。
本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，其包含一种或至少一种感兴趣的抗体。
在最后的实施方式中，本发明所述单克隆抗体用作药物。具体而言，其可用于治疗与CXCR5或CXCR5通路相关的疾病，并可用于治疗自身免疫或炎性疾病。具体而言，这类疾病或病症选自多发性硬化、类风湿性关节炎或舍格伦综合征。其还可用于治疗癌症，如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的其他类型的癌症。
定义
-术语“免疫球蛋白”(Ig)指由一种或多种多肽组成的蛋白，所述一种或多种多肽基本由免疫球蛋白基因编码。一种免疫球蛋白形式构成了抗体的基本结构单元。该形式是四聚体且由两个相同的免疫球蛋白链的对组成，各对具有一条轻链和一条重链。轻链具有两部分：可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)，其在轻链的上下文中也称为恒定区。重链也具有两部分：可变结构域(VH)和恒定区(CH)。在各对中，轻链和重链可变结构域共同主要负责结合抗原，且恒定区负责抗体效应功能。全长免疫球蛋白“轻链”(通常约25kDa)由N末端处的可变结构域基因(通常约110个氨基酸)和C末端处的κ或λ恒定区结构域(分别为CK和Cλ)编码。全长免疫球蛋白“重链”(通常约50kDa)类似地由可变结构域基因(通常约116个氨基酸)和后文所述其他恒定区基因之一(通常约330个氨基酸)编码。存在五种类型的哺乳动物重链，其由希腊字母命名：[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。重链类型分别将抗体的同种型限定为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。恒定区在相同同种型的所有抗体中都相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链[γ]、[α]和[δ]的恒定区由三个Ig恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和一个铰链区(用于增加挠性)组成；重链[ε]和[μ]的恒定区由四个Ig恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)和一个铰链区组成。
免疫球蛋白轻链或重链可变结构域由“构架”区组成，其被三个高变区打断。因此，术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，即轻链可变结构域中的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3和重链可变结构域中的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3(Kabat等1991)和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia和Lesk，1987)。“构架区”或“FR”残基是除了本文所限定的超变区残基之外的那些可变区残基。不同轻链的构架区(即L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)或不同重链的构架区(即H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)的序列在物种内是相对保守的。因此，“人构架区”是与天然产生的人免疫球蛋白的构架区基本相同(约85％或更高，通常约90-95％或更高)的构架区。抗体的构架区即组成轻链和重链的组合的构架区，其用作定位和对齐CDR。CDR主要负责与抗原表位的结合。
-本文所用术语“抗体”及其复数形式包括但不限于多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，如F(ab')2、Fab蛋白酶水解片段以及单链可变区片段(scFv)。还包括遗传工程改造的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、scFv和Fab片段，以及合成的抗原结合肽和多肽。
-术语“人源化”免疫球蛋白指包含人构架区和一个或多个来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”且提供构架区的人免疫球蛋白称为“受体”(通过将非人CDR接枝在人构架和恒定区上，或通过将整个非人可变结构域整合在人恒定区上(嵌合化)来进行人源化)。恒定区无需存在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同，如果需要调节效应功能则重链恒定区中的一些残基和CDR除外。“人源化抗体”是包含人源化轻链可变结构域和人源化重链可变结构域的抗体。在一些情况下，人源化抗体可保留人构架区内的非人残基以增强适当的结合特征和/或可将一些氨基酸突变导入CDR内以改进结合亲和力和/或降低免疫原性和/或提高人的程度和/或改进抗体的生物化学/生物物理学性质。通过人源化抗体，可提高生物半衰期，并降低了给予人后不良免疫反应的潜力。
-术语“全人”免疫球蛋白指包含人构架区和人CDR的免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高相同。因此，全人免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同，如果需要调节效应功能或药代动力学特征则重链恒定区中的一些残基除外。“全人抗体”或“全人单克隆抗体”是包含全人轻链可变结构域和全人重链可变结构域的抗体。在一些情况下，可将氨基酸突变导入CDR、构架区或恒定区内以改进结合亲和力和/或降低免疫原性和/或改进抗体的生物化学/生物物理学性质。
术语“重组抗体”指其中氨基酸序列不同于天然抗体的抗体。由于抗体生成中重组DNA技术的相关性，无需限制于天然抗体中发现的氨基酸的序列；可以重新设计抗体以获得所需的特性。可能的变化形式有很多且范围为从改变仅一个或一些氨基酸到完全重新设计例如可变结构域或恒定区。通常进行恒定区中的变化以改进、降低或改变诸如补体固定(例如补体依赖的细胞毒性，CDC)、与Fc受体相互作用，以及其他效应功能(例如抗体依赖的细胞毒性，ADCC)、药代动力学特性(例如与新生儿Fc受体结合；FcRn)。将进行可变结构域中的变化以改进抗原结合特性。除抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab')2以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。
-本文所用术语“抗体部分”指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合或可变区。所述部分或片段应维持完整链/抗体的至少一种活性，即其是“功能性部分”或“功能性片段”。如果其维持至少一种活性，其优选维持靶标结合特性。抗体部分(或抗体片段)的示例包括但不限于“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”。这些术语指包含重链和轻链可变结构域但缺少恒定区的抗体片段，所有片段都在单个多肽链中。通常，单链抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其促使形成允许抗原结合的所需结构。在具体的实施方式中，单链抗体还可以是双特异性和/或人源化的。
-“Fab片段”由一条轻链和一条重链的可变结构域和CH1结构域组成。Fab分子的重链无法与另一重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链且含有较多的恒定区(在CH1和CH2结构域之间)从而在两条重链之间形成链间二硫键的“Fab’片段”称作F(ab')2分子。“F(ab')2”含有两条轻链和两条重链，其含有CH1和CH2结构域之间的一部分恒定区，使得两条重链之间形成链间二硫键。在定义了一些重要术语后，现在可以关注于本发明的特定实施方式。
-在本发明的上下文中，术语“治疗”指对于疾病进展的任何有利影响，包括在疾病开始后减弱、减少和降低或缓解疾病发展。
-术语“药学上可接受的”旨在涵盖任何运载体，其不干扰活性成分的生物学活性的有效性并且对给予的宿主无毒。例如，对于胃肠道外给药，活性蛋白质可配制为用于在载剂中注射的单位剂型，载剂例如但不限于盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液。
-人免疫***已进化为对抗各种病毒、微生物和其他威胁。体液组分—抗体应答—是免疫***武器库的关键组分。抗体可包被、阻断和加工外来侵入物，且重要的是招募免疫效应细胞以使用多种防御措施来应对侵入物。人免疫***中存在多种抗体类型和同种型，各自被赋予多种效应功能，其可调节为针对侵入病原体的性质。重组治疗性抗体构建自人序列且几乎总是衍生自IgG类。迄今为止，大多数治疗性抗体衍生自IgG1同种型，其次是IgG2和IgG4。IgG1同种型具有广泛应用性的原因是其啮合免疫效应细胞和补体的嵌入能力(built-in ability)。抗体或效应细胞介导的效应功能主要包括细胞裂解(ADCC＝抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、吞噬作用(ADCP＝抗体依赖性细胞介导的吞噬作用)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。我们对于这些效应功能的认识大部分来自对抗体介导的杀伤的体外分析。例如，人PBMC(外周血单核细胞)与靶细胞(通常是肿瘤细胞系)和靶标特异性抗体的孵育导致靶细胞在数小时的时间内裂解。大多数(如果不是全部)ADCC由自然杀伤(NK)细胞进行。已确定，经典IgG效应功能由适当命名的Fcγ受体介导(Nimmerjahn和Ravetch，2011)。在人中，FcγRs包括三种激活受体，FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa，且这些受体在白细胞上以不同水平和专一性表达。通过ITAM胞内结构域的所有信号导致信号级联反应，导致各表达FcγR的细胞的同源效应功能。NK细胞几乎排他性地表达FcγRIIIa，且该受体确定负责介导体外ADCC。抗体Fc与补体蛋白C1q啮合触发的经典(抗体依赖性)补体通路包括非细胞和细胞机制，以及补体和FcγR通路之间的协同性。
发明详述
本发明基于新单克隆抗体的发现，更具体地是特异性针对CXCR5的全人单克隆抗体。具体而言，其特异性针对CXCR5的人和猕猴(例如食蟹猴)形式，即其是交叉反应性的。作为CXCR5的拮抗剂，这些抗体可用于治疗炎性和/或自身免疫疾病或病症，例如多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)或舍格伦综合征。其还可用于治疗癌症，如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的其他类型的癌症。
本发明提供了识别、结合、调节和/或中和CXCR5(优选CXCR5的人和猕猴(例如食蟹猴)形式)的单克隆抗体的应用。具体而言，本发明提供了结合、调节和/或中和CXCR5(优选CXCR5的人和猕猴(例如食蟹猴)形式)的轻链和重链可变结构域的应用。此外，本发明所述单克隆抗体抑制通过CXCR5的CXCL13信号传导。已证明(参见实施例部分)，其能够抑制CXCL13诱导的胞内钙流，抑制CXCL13诱导的趋化性和CXCL13诱导的ERK磷酸化。其还能够介导针对原代人B细胞的ADCC。本发明所述抗体优选消耗抗体，即优势在于其能够消除自体同源的T和B细胞以及相关树突细胞和巨噬细胞。其轻链和重链可变结构域可分别融合至κ或λ恒定结构域和选自任意同种型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的重链的恒定区，并可在多种宿主细胞中表达。优选地，选择的恒定区是IgG的恒定区，且更优选地是lgG1、IgG2或IgG4的恒定区，且更优选地是lgG1的恒定区。本发明所述抗体或其部分可以是糖基化/非糖基化和/或岩藻糖基化/非岩藻糖基化的。优选的本发明所述抗体的岩藻糖含量较低或是非岩藻糖基化的，允许增强的ADCC。
根据第一实施方式，结合CXCR5的本发明所述单克隆抗体中任一种或其片段的重链可变结构域包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3且其轻链可变结构域包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。优选地，1)重链可变结构域包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，其中H-CDR1由选自SEQ IDNO:8和9的氨基酸序列组成；H-CDR2由选自SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列组成；且H-CDR3由选自SEQ ID NO:12和13的氨基酸序列组成；且2)轻链可变结构域包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中L-CDR1由选自SEQ ID NO:14和15的氨基酸序列组成；L-CDR2由选自SEQ IDNO:16和17的氨基酸序列组成；且L-CDR3由选自SEQ ID NO:18和19的氨基酸序列组成。更优选地，本发明所述单克隆抗体具有其H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3组，包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID NO:8、10和12，2)氨基酸序列SEQ ID NO:8、11和12；或3)氨基酸序列SEQ ID NO:9、11和13。类似地，这些单克隆抗体优选具有其L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3组，包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID NO:14、16和18，2)氨基酸学SEQ ID NO:15、17和18；或3)氨基酸序列SEQ ID NO:15、17和19。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体或其部分，如本文所述，其中：1)这些单克隆抗体的重链可变结构域包含构架区(FR)H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，其中：H-FR1由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，H-FR2由选自SEQ ID NO:21和22的氨基酸序列组成，H-FR3由选自SEQ ID NO:23和24的氨基酸序列组成，且H-FR4由选自SEQ ID NO:25和26的氨基酸序列组成；且2)轻链可变结构域包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4，其中：L-FR1由选自SEQ ID NO:26、27和28的氨基酸序列组成，L-FR2由选自SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列组成，L-FR3由选自SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列组成，且L-FR4由SEQ IDNO:34的氨基酸序列组成。优选地，本发明所述单克隆抗体的重链可变结构域组H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID NO:20、21、23和25，或2)氨基酸序列SEQ ID NO:20、22、24和25，且其轻链可变结构域组L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID NO:26、29、32和34，或2)氨基酸序列SEQ ID NO:27、30、33和34，或3)氨基酸序列SEQ ID NO:28、31、33和34。优选地，本发明所述H-FR和L-FR与上文所述H-CDR和L-CDR相关。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体或其部分，优选全人单克隆抗体，其中重链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO:1、3、4、51、53、55、57、59和61的氨基酸序列组成；轻链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO:2、5、6、7、52、54、56、58、60、62和65的氨基酸序列组成。在优选的实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体，其中，该重链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列组成；且该轻链可变结构域包含或由选自SEQ ID NO:2、5、6和7的氨基酸序列组成。优选地，重链可变区和轻链可变区的组合选自1)SEQ ID NO:1和2(mAb称作40C01)，2)SEQ ID NO:3和7(mAb称作40C01-VH1-Vk3)，以及3)SEQ ID NO:4和7(mAb称作40C01-VH2-Vk3)。与母体mAb 40C01(SEQ ID NO 1和2)相比，使用具有SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列的重链可变区以及具有SEQ ID NO:5、6或7的氨基酸序列的轻链可变区获得的Fab的热稳定性显著提高。使用40C01-VH1-Vk3和40C01-VH2-Vk3获得了最佳结果。在替代性实施方式中，重链可变区和轻链可变区的组合还可选自：1)SEQID NO:51和52(mAb称作优化的42F03)、2)SEQ ID NO:53和54(mAb称作80A10)、3)SEQ IDNO:55和56(mAb称作80A11)、4)SEQ ID NO:57和58(mAb称作80B09)、5)SEQ ID NO:59和60(mAb称作80D11)、5)SEQ ID NO:61和62(mAb称作42F03)，以及6)SEQ ID NO:1和65(mAb称作12A01)。
还提供了其他重链可变区，其氨基酸序列与本发明所述重链可变区的序列至少90％或以上相同，至少95％或以上相同，或者至少99％或以上相同。还提供了其他轻链可变区，其氨基酸序列与本发明所述轻链可变区的序列至少90％或以上相同，至少95％或以上相同，或者至少99％或以上相同。
本发明所述工程改造的单克隆抗体(优选全人抗体)可包含任何类型的重链恒定区或其部分，其来自任何类的抗体(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何亚类(同种型)(特别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在需要抗体表现出细胞毒性活性时，重链恒定结构域通常是补体固定恒定结构域且类型通常是IgG1类。不需要这种细胞毒活性时，恒定区可以是IgG2或IgG4类。工程改造的抗体可含有来自一种以上类型或同种型的序列。在本发明中，可以使用IgG的IgG1、IgG2或IgG4类。例如，可以使用以下重链恒定区序列：1)在CH1结构域的214位具有精氨酸且在356和358位分别具有谷氨酸和甲硫氨酸的同种异型G1m(f)的IgG1，如Kabat等提出的人IgG的EU指数所示(Press和Hogg,Biochem J.1970)并公开于SEQ IDNO:38，2)具有SEQ ID NO:39所公开序列的IgG2同种型(亚型HC2h，参见WO2009010290)，或者3)Angal等，1993所述IgG4同种型，其中Kabat等提出的人IgG4的EU指数所示228位的丝氨酸和409位的精氨酸分别被脯氨酸和赖氨酸取代，其具有SEQ ID NO:40所公开的序列。应理解，上述恒定区序列可完整使用或仅使用其部分，例如其CH1、CH2和/或CH3部分。含有可变结构域和恒定结构域的重链的非限制性示例是SEQ ID NO:79和80的氨基酸序列。本发明所述工程改造的单克隆抗体还可包含任何类型的轻链免疫球蛋白基因，即κ独特恒定区基因或λ恒定区基因1、2、3、6或7。例如，可以使用以下轻链恒定区序列：λ恒定区基因3，如SEQ IDNO:63的序列，或κ独特恒定区基因，如SEQ ID NO:64的序列。含有可变结构域和恒定结构域的轻链的非限制性示例是SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
本发明的其他实施方式是一种分离的核酸分子或多核苷酸，其编码本发明所述任意抗体或其部分，或其互补链或简并序列。在这一方面，术语“核酸分子”或可互换的“多核苷酸”涵盖所有不同类型的核酸，包括但不限于脱氧核糖核酸(例如DNA、cDNA、gDNA、合成的DNA等)、核糖核酸(如RNA)和肽核酸(PNA)。在优选的实施方式中，该核酸分子是DNA分子，例如双链DNA分子或cDNA分子。术语“分离的”指核酸分子已经鉴定并与至少一种污染核酸分子分离，所述污染核酸分子通常在天然来源中与所述核酸分子结合。分离的核酸分子不同于其在天然中发现的形式或状态。分离的核酸分子因此可与其在天然细胞中存在的特定核酸分子区分。简并序列指编码与参考核苷酸序列相同的氨基酸序列的任意核苷酸序列，但其因为遗传密码简并性而包含不同的核苷酸序列。
在另一个实施方式中，核酸分子(也称作多核苷酸)编码本发明的单克隆抗体中任一种的重链或其部分，例如重链可变结构域，且另一个多核苷酸编码本发明的单克隆抗体中任一种的轻链或其部分，例如轻链可变结构域。在一个替代性实施方式中，一种独特的多核苷酸编码本发明的抗体中任一种的重链和轻链或其部分，例如可变结构域或Fab区。
在一个优选的实施方式中，编码本发明所述抗体的重链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:41、43、44、45、46、66、69、71、73、75或77。在一个优选的实施方式中，编码本发明所述抗体的轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQID NO:42、47、48、49、50、67、68、70、72、74、76或78。在一个替代性实施方式中，独特的多核苷酸编码本发明的抗体中任一种的重链和轻链可变结构域，其中，编码重链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:41、43、44、45、46、66、69、71、73、75或77，且编码轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:42、47、48、49、50、67、68、70、72、74、76或78。SEQ ID NO:43-46的初始57个核苷酸、SEQ ID NO:41-42、47-50、66-70、69-75或77-78的初始60个核苷酸，以及SEQ ID NO:76的初始63个核苷酸或SEQ ID NO:68的初始75个核苷酸编码前导序列。在本发明的上下文中，应理解这些核苷酸可移除或被编码前导序列的任何其他核苷酸序列的取代。因此，在另一个实施方式中，编码本发明的抗体的重链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:41的核苷酸61-129、SEQ ID NO:43的核苷酸58-426、SEQ ID NO:44的核苷酸58-426、SEQ ID NO:45的核苷酸58-426、SEQ ID NO:46的核苷酸58-426、SEQ ID NO:66的核苷酸61-399、SEQ ID NO:69的核苷酸61-438、SEQ ID NO:71的核苷酸61-420、SEQ ID NO:73的核苷酸61-414、SEQ ID NO:75的核苷酸61-405或SEQ ID NO:77的核苷酸61-399。类似地，在一个优选的实施方式中，编码本发明的抗体的轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:42的核苷酸61-381、SEQ ID NO:47的核苷酸61-381、SEQ ID NO:48的核苷酸61-381、SEQ ID NO:49的核苷酸61-381、SEQ ID NO:50的核苷酸61-381、SEQ ID NO:67的核苷酸61-378、SEQ ID NO:68的核苷酸76-396、SEQ ID NO:70的核苷酸61-384、SEQ ID NO:72的核苷酸61-390、SEQ IDNO:74的核苷酸61-390、SEQ ID NO:76的核苷酸64-384或SEQ ID NO:78的核苷酸61-381。在一个替代性实施方式中，独特多核苷酸编码本发明的抗体中任一种的重链和轻链可变结构域，其中，编码重链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:41的核苷酸61-429、SEQ ID NO:43的核苷酸58-426、SEQ ID NO:44的核苷酸58-426、SEQ ID NO:45的核苷酸58-426、SEQ ID NO:46的核苷酸58-426、SEQ ID NO:66的核苷酸61-399、SEQ ID NO:69的核苷酸61-438、SEQ ID NO:71的核苷酸61-420、SEQ ID NO:73的核苷酸61-414、SEQ IDNO:75的核苷酸61-405或SEQ ID NO:77的核苷酸61-399，并且编码轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID NO:42的核苷酸61-381、SEQ ID NO:47的核苷酸61-381、SEQ ID NO:48的核苷酸61-381、SEQ ID NO:49的核苷酸61-381、SEQ ID NO:50的核苷酸61-381、SEQ ID NO:67的核苷酸61-378、SEQ ID NO:68的核苷酸76-396、SEQ ID NO:70的核苷酸61-384、SEQ ID NO:72的核苷酸61-390、SEQ ID NO:74的核苷酸61-390、SEQ ID NO:76的核苷酸64-384或SEQ ID NO:78的核苷酸61-381。
由于遗传密码子的简并性，应理解可优化编码本发明所述抗体的多核苷酸。因此，还提供了与编码本发明所述重链可变区序列(例如上文列举的优选的多核苷酸序列)至少90％或以上相同、至少95％或以上相同或至少99％或以上相同的多核苷酸序列。类似地，还提供了与编码本发明所述轻链可变区序列(例如上文列举的优选的多核苷酸序列)至少90％或以上相同、至少95％或以上相同或至少99％或以上相同的多核苷酸序列。
本发明的另一个实施方式是一种包含DNA的载体，该DNA编码本发明所述单克隆抗体或其部分，例如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区。该载体可以是任意克隆或表达载体，整合或自动复制，在任何原核或真核细胞中起作用。具体而言，该载体可以是质粒、粘粒、病毒、噬菌体、原生质体、人工染色体等。该载体可包含重链和轻链的整个或部分编码序列，或轻链和重链编码序列中的任一种，或其任何部分。如果该载体包含重链和轻链的编码序列及其部分，这些编码序列可以各自可操作地连接启动子。对于重链和轻链编码序列或其部分，该启动子可以是相同的或不同的。重链和轻链编码序列或其部分还可可操作地连接单个启动子，此时重链和轻链的编码序列或其部分可优选由内部核糖体进入位点(IRES)隔开。用于真核基因病毒的合适启动子是，例如，衍生自病毒基因(如鼠或人巨细胞病毒(CMV))的启动子、小鼠双向CMV启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子或人延长因子-1α(EF-1α)启动子，其是本领域技术人员熟知的。该载体可包含调控元件，例如启动子、终止子、增强子、选择标志物、复制起点、绝缘子等。适当的核酸序列可通过多种方法***载体。通常，使用本领域已知的方法将DNA***适当限制性内切酶位点。含有一种或多种这些组分的合适载体的构建使用本领域技术人员已知的标准连接技术。
本发明的另一个实施方式是一种重组宿主细胞，所述细胞包含一种或多种上文所述核酸分子/多核苷酸或一种或多种上文所述载体。该宿主细胞可以是原核或真核细胞。原核细胞的示例包括细菌，例如大肠杆菌。真核细胞的示例是酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，包括任何原代细胞培养物或建立的细胞系(例如3T3、Vero、HEK293、TN5等)。合适的用于表达糖基化蛋白质的宿主细胞来自多细胞生物体。优选的有用的哺乳动物宿主细胞系的示例包括CHO、HEK293、NS0、SP2/0和COS细胞。本发明的抗体可通过本领域已知的任何技术生产，例如通过重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合。如果需要获得具有较低糖基化水平的抗体、非糖基化抗体或其非糖基化部分(如非糖基化Fc部分)，可有利地使用酵母表达***或工程改造的/糖工程改造的CHO细胞系。类似地，如果需要获得具有较低岩藻糖基化水平的抗体、非岩藻糖基化抗体或其非岩藻糖基化部分(如非岩藻糖基化Fc部分)，可有利地使用工程改造的/糖工程改造的酵母表达***或工程改造的/糖工程改造的CHO细胞系。
本发明的另一个实施方式因此是一种生产本发明的抗体或其部分(如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区)的方法，该方法包括在允许编码本发明所述抗体中任一种或其部分的核酸分子进行表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞，并回收/分离生产的多肽。生产的多肽可以是糖基化或非糖基化的，可以是岩藻糖基化或非岩藻糖基化的，或可含有其他翻译后修饰，这取决于使用的宿主细胞。生产本发明的抗体或其部分的方法还可包括以下步骤：纯化该抗体或其部分，和/或将所述抗体或其部分配制为药物组合物。
用于制备编码本发明所述抗体(包括其部分，如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区)的多核苷酸(包括DNA和RNA)的其他方法是本领域熟知的。可使用异硫氰酸胍提取并随后在CsCI梯度中提供离心分离来制备总RNA(Chirgwin JM等1979)。使用Aviv和Leder的方法从总RNA中制备Poly(A)+RNA(Aviv H等1972)。使用已知方法由poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。或者，可分离基因组DNA。编码CXCR5抗体或其部分的多核苷酸可随后通过例如杂交或PCR进行鉴定和分离。
可通过本领域已知的任何技术生产本发明所述抗体(包括其部分，如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区)，例如重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合。许多书和综述教导了如何使用载体和原核或真核宿主细胞来克隆和生产重组蛋白。
本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，其包含本发明所述单克隆抗体或其部分，例如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区。优选地，所述药物组合物还可包含至少一种其他赋形剂，例如缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、运载体、稀释剂、载剂等。
本发明的药物组合物可用于诊断、预防和/或治疗(局部或***性)炎性或自身免疫疾病/病症(如多发性硬化、类风湿性关节炎或舍格伦综合征)以及多种类型的癌症(如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的任何类型癌症)。本发明的药物组合物可与药学上可接受的运载体一起给予。
在另一个方面中，本发明提供了用作药物的本发明所述单克隆抗体或其部分，例如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区。具体而言，其可用于治疗炎性或自身免疫疾病/病症。优选地，所述疾病/病症选自MS、RA或舍格伦综合征。在另一个方面中，本发明提供了一种治疗患者中疾病的方法，包括给予患者本发明所述任意抗体或其部分或药物组合物。优选地，该疾病炎性或自身免疫疾病/病症，例如MS、RA或舍格伦综合征。在另一个方面中，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给予患者本发明所述任意抗体或其部分或药物组合物。优选地，该癌症是胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的任何类型癌症。
在另一个方面中，本发明提供了本发明所述单克隆抗体在制备用于治疗炎性或自身免疫疾病/病症以及癌症的药物中的应用。优选地，所述炎性或自身免疫疾病/病症选自MS、RA或舍格伦综合征。优选地，所述癌症是胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的任何类型癌症。
本发明所述药物组合物可以任何合适方式给予，例如静脉内、肌内、皮下或皮内。
对于胃肠道外(例如静脉内、皮下、肌内、皮内)给药，本发明的药物组合物可与药学上可接受的胃肠道外载剂(例如水、盐水、右旋糖溶液)和维持等张性(例如甘露醇)或化学稳定性(例如防腐剂和缓冲剂)的添加剂一起配制为溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。可通过通常使用的技术对该制剂进行灭菌。
给予个体的剂量可根据多种因素变化，包括药代动力学特性、给药途径、患者状态和特征(尤其是性别、年龄、体重、健康和体型)、症状程度、共同治疗、治疗的频率和所需效果。本发明的抗体或其部分(例如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区)可以其他替代形式生产、配制、给予或使用，这些形式优选根据所需使用和/或生产方法。还可生成有用的偶联物或复合物以在药物递送效力方面改进试剂。出于该目的，本发明所述抗体可以是具有诸如聚乙二醇和其他天然或合成的聚合物的分子的活性偶联物或复合物的形式(Harris JM等2003)。在这方面，本发明考虑化学修饰的抗体，其中抗体连接聚合物。通常，该聚合物是水溶性的，从而偶联物不会在水性环境(如生理环境)中沉淀。此外，可使用聚合物的混合物来生产偶联物。用于治疗的偶联物可包含药学上可接受的水溶性聚合物部分。合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、芳氧基-PEG、碳酸双琥珀酰亚胺酯PEG、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、右旋糖酐、纤维素或其他基于碳酸酯的聚合物。合适的PEG的分子量是约600至约60,000，包括例如5,000、12,000、20,000和25,000。偶联物还可包含这类水溶性聚合物的混合物。偶联物的示例包括上文所述的任何抗体和与N末端相连的聚烷基氧化物部分。PEG是一种合适的聚烷基氧化物。例如，可使用PEG修饰本发明公开的任意抗体，称作“PEG化”。可通过本领域已知的任意PEG化反应进行PEG化(Francis GE等1998)。例如，可使用反应性聚乙二醇分子通过酰化反应或通过烷基化反应来进行PEG化。优选地，这些修饰都不会显著影响抗体结合人或猕猴(如食蟹猴)CXCR5的能力。
本发明还包括针对人和/或猕猴(如食蟹猴)CXCR5的重组抗体或其部分，如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区，其在功能上等同于上文所述的那些。还包括经修饰的抗体或其部分，其提供改进的稳定性和/或治疗功效。经修饰的抗体或其部分的示例包括具有氨基酸残基保守取代以及一个或多个氨基酸缺失或***(其不明显不利地改变抗原结合应用性)的那些。取代的范围可以是从改变或修饰一个或多个氨基酸残基至完全重新设计某一区域，前提是维持治疗应用性。本发明的抗体或其部分可经翻译后修饰(例如乙酰化、氧化、脱酰胺化、外消旋化和磷酸化)或可经合成修饰(例如连接标记基团)。应理解，通过本方法设计的抗体或其部分可具有其他保守性氨基酸取代，其基本不影响抗原结合或其他免疫球蛋白功能。
本发明的单克隆抗体或其部分(如可变结构域(重链和/或轻链可变结构域)或Fab区)可包含衍生物。例如但不限于，这些衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。此外，衍生物可包含一种或多种非经典和/或非天然氨基酸。可通过修饰(例如取代、删除或添加)经鉴定涉及Fc区与FcRn受体相互作用的氨基酸残基来提高本发明的单克隆抗体的体内半衰期。
本文应用的所有参考文献，包括杂志文章或摘要、专利申请或任何其他参考文献，都通过引用全文纳入本文，包括所引用参考文献中的所有数据、表格、附图和文本。此外，本文所引用的参考文献内所引用的参考文献的全部内容也通过引用全文纳入本文。
以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明的一般性质，通过应用本领域技术范围内的知识(包括本文所引用参考文献的内容)，他人无需过多实验即能容易地就各种应用改良和/或修改这些具体实施方式，而不背离本发明总体理念。因此，基于本文所列出的教导和指南，应理解为这些修改和改良落入所公开实施方式的等同形式的含义和范围内。应理解，本文使用短语和术语的目的是描述而非限制。
附图说明：
图1显示可变重链的可变区氨基酸序列的比对并显示这2种变体之间构架区和CDR中氨基酸序列的差异，其使用人种系免疫球蛋白重链可变3-23(IGHV3-23*01)和人种系免疫球蛋白重链接合基团4(IGHJ4*02)。
图2显示可变轻链的可变区氨基酸序列的比对并显示这三种变体之间构架区和CDR中氨基酸序列的差异，其使用人种系免疫球蛋白轻链可变1-27(IGKV1-27*01)和人种系免疫球蛋白κ接合基团5(IGKJ5*01)。
图3：3种形式的40C01 mAb(40C01VH-VL、40C01VH1-Vk1和40C01VH1-Vk2)的DSC分析结果。四种全人IgG1抗体，抗CXCR5 40C01母体分子(40C01 VH-VL)、与轻链变体1(VH1-Vk1)配对的抗CXCR5 40C01重链变体1、与轻链变体2(VH1-Vk2)配对的抗CXCR5 40C01重链变体1以及同种型对照的热解折叠曲线。所有四种IgG1构建体的CH2和CH3结构域的解折叠转变都是相同的，而Fab解折叠转变高度可变。
图4：40C01VH1-Vk3和40C01VH2-Vk3变体获得的热分析图特征。三种全人IgG1抗体，与轻链变体3(VH1-Vk3)配对抗CXCR5 40C01重链变体1、与轻链变体3(VH2-Vk3)配对抗CXCR5 40C01重链变体2以及同种型对照的热解折叠曲线。所有四种IgG1构建体的CH2和CH3结构域的解折叠转变都是相同的，而两种抗CXCR5 40C01变体的Fab解折叠转变都远高于(80℃以上)同种型对照。
图5a-5h：表达人(组图a至f)和猕猴(g和h)CXCR5的L1.2细胞的CXCL13刺激的趋化性的抑制，其由以全抗体形式表达为IgG1、IgG2和IgG4的抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3和40C01-VH2-Vk3变体导致。针对基线活性(仅介质)和使用10nM CXCL13获得最大应答(100％)对结果进行标准化。显示的数据代表三次独立实验。所有点都重复三次(误差线显示+/-S.E.M)。
图6a-6b：显示以全抗体形式表达为IgG1的抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3(组图a)和40C01-VH2-Vk3(组图b)变体所导致的原代人B细胞的人CXCL13刺激的趋化性的抑制的代表性示例。这些结果表达为经计算的IC50(半最大抑制浓度)。数值为分别来自8次(40C01-VH1-Vk3)和5次(40C01-VH2-Vk3)单独实验的平均值+/-S.E.M。
图7a-7b：Alexa-Fluor 647标记的抗CXCR5 40C01变体与使用人CXCR5稳定转染的HEK-293细胞的结合
图8a-8b：Alexa-Fluor 647标记的抗CXCR5 40C01变体与全血中人B细胞的结合
图9：抗CXCR5 40C01变体与全血中猕猴B细胞的结合
图10a-10d：抗CXCR5 mAb对人全血中B细胞中CXCL13刺激的磷酸化的抑制
图11a-11b：抗CXCR5 mAb对猕猴全血中B细胞中CXCL13刺激的磷酸化的抑制
图12：使用KinExA方法测定抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3变体对细胞膜表达的CXCR5的KD。在0.02％NaN3存在的情况下使用30pM(实心菱形)或300pM(空心圆形)活性结合位点浓度的抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3连续稀释并孵育CXCR5-HEK-293细胞(5x 106/ml)并使之平衡。测量上清液中残留的游离mAb。(A)游离mAb百分比针对抗原浓度作图(任意提取每100万个细胞等于10-9M抗原)。进行使用未知抗原方法的多重曲线分析(“n-曲线分析”)来确定KD和抗原乘数(antigen multiplier)的最佳值(分别为B和C)。通过反复改变KD和抗原乘数的最佳值同时将其他参数保持为其最佳值来确定95％置信区间。
图13：使用KinExA方法测定抗CXCR5 mAb 40C01-VH2-Vk3变体对细胞膜表达的CXCR5的KD。在0.02％NaN3存在的情况下使用100pM(实心菱形)或1nM(空心圆形)活性结合位点浓度的抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3连续稀释并孵育CXCR5-HEK-293细胞(5x 106/ml)并使之平衡。测量上清液中残留的游离mAb。(A)游离mAb百分比针对抗原浓度作图(任意提取每100万个细胞等于10-9M抗原)。进行使用未知抗原方法的多重曲线分析(“n-曲线分析”)来确定KD和抗原乘数(antigen multiplier)的最佳值(分别为B和C)。通过反复改变KD和抗原乘数的最佳值同时将其他参数保持为其最佳值来确定95％置信区间。
图14：从靶向51Cr标记的人B细胞的外周血单核细胞(PBMC)中纯化的人NK细胞的抗CXCR5介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
图15A-15B：表达人(组图A)或猕猴(组图B)CXCR5的靶向51Cr标记的L1.2细胞的人PMBC的抗CXCR5介导的ADCC。在相同的试验条件下将相同的效应物/靶细胞混合物与抗CXCR5 mAb孵育，所述抗CXCR5 mAb使用标准糖基化内容物制备(40C01-VH1-Vk3-IgG1)或制备为非岩藻糖化抗体(40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖)。
图16：抗CXCR5抗体诱导的人B细胞消耗。在所示抗体浓度范围存在的情况下将人PBMC(5x 106/ml)培养过夜。从5个供体中通过流式细胞术评估淋巴细胞门选中CD19+B细胞的百分比。将各供体的数据标准化至同种型对照并合并5个供体的数据(POC＝对照百分比)。显示平均值±SEM。
序列说明：
SEQ ID NO:1：mAb 40C01和12A01的重链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:2：mAb 40C01的轻链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:3：mAb 40C01-VH1的重链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:4：mAb 40C01-VH2的重链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:5：mAb 40C01-Vk1的轻链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:6：mAb 40C01-Vk2的轻链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:7：mAb 40C01-Vk3的轻链可变区(氨基酸序列)
SEQ ID NO:8-19：40C01系列的mAb的CDR序列(氨基酸序列)
SEQ ID NO:20-34：40C01系列的mAb的FR序列(氨基酸序列)
SEQ ID NO:35：人CXCR5(氨基酸序列)
SEQ ID NO:36：食蟹猴CXCR5(氨基酸序列)
SEQ ID NO:37：恒河猴(氨基酸序列)
SEQ ID NO:38：重链恒定区–人IgG1，同种异型G1m(f)(氨基酸序列)
SEQ ID NO:39：重链恒定区–人IgG2 DI-NQ-HC2h亚型(氨基酸序列)
SEQ ID NO:40：重链恒定区–人IgG4 S228P-R409K亚型(氨基酸序列)
SEQ ID NO:41：mAb 40C01的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:42：mAb 40C01的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:43：mAb 40C01-VH1的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-57编码前导序列。
SEQ ID NO:44：mAb 40C01-VH1的重链可变区(密码子优化的核酸序列)。该序列的核苷酸1-57编码前导序列。
SEQ ID NO:45：mAb 40C01-VH2的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-57编码前导序列。
SEQ ID NO:46：mAb 40C01-VH2的重链可变区(密码子优化的核酸序列)。该序列的核苷酸1-57编码前导序列。
SEQ ID NO:47：mAb 40C01-Vk1的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:48：mAb 40C01-Vk2的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:49：mAb 40C01-Vk3的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:50：mAb 40C01-Vk3的轻链可变区(密码子优化的核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:51：mAb优化的42F03的重链可变区
SEQ ID NO:52：mAb优化的42F03的轻链可变区
SEQ ID NO:53：mAb 80A10的重链可变区
SEQ ID NO:54：mAb 80A10的轻链可变区
SEQ ID NO:55：mAb 80A11的重链可变区
SEQ ID NO:56：mAb 80A11的轻链可变区
SEQ ID NO:57：mAb 80B09的重链可变区
SEQ ID NO:58：mAb 80B09的轻链可变区
SEQ ID NO:59：mAb 80D11的重链可变区
SEQ ID NO:60：mAb 80D11的轻链可变区
SEQ ID NO:61：mAb 42F03的重链可变区
SEQ ID NO:62：mAb 42F03的轻链可变区
SEQ ID NO:63：轻链恒定区–λ恒定区基因3(氨基酸序列)
SEQ ID NO:64：轻链恒定区–κ独特恒定区基因3(氨基酸序列)
SEQ ID NO:65：mAb 12A01的轻链可变区
SEQ ID NO:66：mAb优化的42F03的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:67：mAb优化的42F03的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:68：mAb 80A10的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-75编码前导序列。
SEQ ID NO:69：mAb 80A10的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:70：mAb 80A11的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:71：mAb 80A11的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:72：mAb 80B09的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:73：mAb 80B09的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:74：mAb 80D11的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:75：mAb 80D11的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:76：mAb 42F03的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-63编码前导序列。
SEQ ID NO:77：mAb 42F03的重链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:78：mAb 12A01的轻链可变区(核酸序列)。该序列的核苷酸1-60编码前导序列。
SEQ ID NO:79：mAb 40C01-VH1-IgG1的重链(氨基酸序列)
SEQ ID NO:80：mAb 40C01-VH1-IgG2_DI-NQ-HC2h-亚型的重链(氨基酸序列)
SEQ ID NO:81：mAb 40C01-Vk3-c-κ的轻链(氨基酸序列)
实施例1–发现
1.1.表达人和猕猴CXCR5的稳定细胞系的生成
通过基因合成来生成密码子优化的编码人CXCR5(基于NCBI参考号NM_001716.3，其编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列)和猕猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))CXCR5(参见SEQ ID NO:36)的cDNA，其具有或不具有C末端标签。食蟹猴CXCR5的序列无法在公共数据库中获得。因此，使用基于人CXCR5和恒河猴(Macaca mulatta)(NCBI参考号XM_001100017.2，其编码SEQ ID NO:37的氨基酸序列)的简并寡核苷酸引物，通过RT-PCR从短尾猴脾cDNA(购自生物链公司(Biochain))中克隆cDNA序列。将全长cDNA亚克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA4(英杰公司(Invitrogen))中。通过使用市售可得的转染试剂(如Gene Porter(吉兰蒂斯公司(Genlantis)))进行转化以生成过表达密码子优化的hCXCR5的稳定细胞系：中华仓鼠卵巢细胞CHO-hCXCR5；犬胸腺细胞系Cf2Th-hCXCR5；仓鼠成纤维细胞细胞系R1610-hCXCR5；人胚胎肾细胞系HEK293-hCXCR5和过表达密码子优化的食蟹猴CXCR5的稳定细胞系：中华仓鼠卵巢细胞cCXCR5-CHO。使用新霉素(G418)选择表达转染的CXCR5基因的细胞。使用市售可得的抗CXCR5 mAb(mAb 190，R&D***公司(R&D systems))，通过FACs分析来鉴定对新霉素耐受且在细胞表面上表达高水平CXCR5的稳定克隆。
1.2.表达CXCR5的顺磁性蛋白脂质体(PMPL)的制备
通过MSM蛋白技术制备含有人或食蟹猴CXCR5的顺磁性蛋白脂质体(PMPL)，其中使用基于Mirzabekov等(2000)所述方法的MSM专有技术。简言之，收获过表达CXCR5的细胞，并在专有的去垢剂混合物中溶解细胞膜。无孔顺磁性珠的表面共价偶联链霉亲和素和识别CXCR5上C末端标签的抗体。这些偶联的珠用于捕获来自溶解的细胞裂解物的带C末端标签的CXCR5。充分清洗以除去污染物后，将珠与含有0.1–1％的生物素-DOPE的去垢剂溶解的脂质混合。通过透析除去去垢剂，其中脂质双层膜在珠周围自动组装且CXCR5回到其原始环境中。市售抗hCXCR5-PE偶联的抗体(R&D***公司)被用于通过easyCyte流式细胞术(密理博公司(Millipore))显示珠含有正确取向的CXCR5(即胞外部分暴露在珠的表面上)。用于生成hCXCR5-PMPL的条件也用于生成食蟹猴CXCR5的PMPL。
1.3.使用噬菌体展示技术生成抗CXCR5抗体。
使用噬菌体展示技术鉴定针对来自DYAX的人Fab-噬菌体410抗体文库的CXCR5的中和抗体，其中使用携带CXCR5的PMPL作为靶标。使用若干不同的选择臂来选择特异性结合人CXCR5的Fab(4-5轮选择)或结合人和食蟹猴CXCR5的交叉反应性Fab(使用针对人和食蟹猴CXCR5的交替选择轮次)。
将分离自第3轮选择输出的约9535个克隆的Fab重排至表达载体pXP1s-SacB(DYAX)中并使用IPTG(100μM)诱导18小时后在96或24孔板中在大肠杆菌BL21Gold细胞中表达，基本如Hoet等(2005)所述。通过与过表达CXCR5的人或食蟹猴细胞系在室温(RT)下孵育40分钟来筛选含有可溶性分泌Fab的培养介质。清洗掉未结合的Fab，随后将细胞与抗c-Myc小鼠单克隆抗体(9E10)在室温下孵育20分钟。清洗掉未结合的Fab，并将细胞与抗小鼠IgG-PE标记的二抗在室温下孵育20分钟。随后将细胞清洗两遍，固定并使用FACS酶标仪分析。
鉴定到了显示人-食蟹猴CXCR5交叉反应性的973个克隆。在进行序列分析后，鉴定到了168条独特序列，其中46条具有独特的重链CDR3序列(数据未显示)。随后将所有感兴趣的克隆都在哺乳动物细胞表达载体pTT5中重排为全人IgG1(加拿大国家研究委员会，参见申请US20110039339)，在HEK293细胞中瞬时表达并纯化用于在基于细胞的试验中测试。
1.4.抗体表达和纯化
将抗体重链和轻链单独亚克隆至pTT5载体中并在使用聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂转染后在适应于悬浮培养的HEK293细胞中瞬时共表达。将细胞在5％CO2潮湿培养箱中37℃下振荡孵育3天。收获并离心条件培养基以除去细胞碎片。使用标准方法通过蛋白A亲和层析从培养物上清液中纯化抗体，在Sephadex G25上对抗体脱盐并在所有试验中都在PBS中配制抗体(FLIPR钙试验除外，其在TBS中配制抗体)。对于大规模抗体制备(大于400ml培养物)，在Superdex-200树脂上进行额外的尺寸排阻色谱(SEC)步骤以除去聚集物。对纯化的蛋白进行以下QC分析：还原和非还原条件下的SDS PAGE：用于测定纯度和表观MW的SEC；用于浓度测定的UV光谱。使用Endosafe PTS试验测量内毒素污染。通常从50ml培养物中获得1-5mg的纯化的抗体。
1.5.针对抗CXCR5 Fab的基于细胞的结合试验
通过FACS评估抗CXCR5抗体与表达人CXCR5或物种直向同源物的原代细胞和细胞系的结合。简言之，将约1x105个表达CXCR5的细胞悬浮在含有浓度逐渐升高的抗CXCR5抗体(范围为0–100μg/ml)的FACS缓冲液(含有1％FBS和0.02％叠氮化钠)中，并在4℃下孵育20分钟。清洗细胞并随后重悬在含有PE标记的山羊抗人IgG(杰克逊实验室公司(JacksonLabs))的FACS缓冲液中，4℃下反应20分钟。随后将细胞清洗3次并重悬在100μl FACS缓冲液中并在FACScalibur仪器(BD科学公司(BD Sciences))上分析。将MFI针对抗体浓度作图并使用Graph pad prism软件计算EC50值。
mAb 80A11、80A10、80B09有针对人CXCR5的高度特异性(数据未显示)。42F03、12A01、40C01和80D11结合人和食蟹猴CXCR5(数据未显示)。实施例1.3中鉴定到的抗体都不与大鼠或小鼠CXCR5交叉反应。
1.6.FLIPR钙移动试验
使用Calcium 5试验试剂盒(分子装置公司(Molecular Devices))在FLIPR试验中测定表达CXCR5的细胞中抗CXCR5抑制CXCL13诱导的胞内钙移动(钙流)的能力。将R1610-hCXCR5细胞以每孔40,000-60,000个细胞置于96孔平底组织培养板中的CHO-S-SFM II无血清培养基(吉布科公司(Gibco))中并在37℃下在潮湿的5％CO2培养箱内孵育过夜以允许细胞粘附到孔的底部并形成单层，其融合度接近100％。根据试剂盒制造商的实验方案使用染料加载细胞，随后使用浓度逐渐升高(最高至1μM)的抗CXCR5抗体在37℃下预孵育1小时，清洗，随后暴露于130nM CXCL13。在Molecular Devices FLEXstation III仪器上监测钙流的变化。实施例1.5中鉴定到的所有抗体都能够抑制CXCL13诱导的胞内钙流(数据未显示)。
1.7.趋化性试验
在趋化性试验***中测定抗CXCR5抗体抑制过表达CXCR5的L1.2细胞的CXCL13诱导的迁移的能力。出于该目的，生成使用人或食蟹猴CXCR5稳定转染的小鼠前B细胞系L1.2。使用克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1 hygro DEST(英杰公司(Invitrogen))的人或食蟹猴CXCR5 cDNA通过电穿孔转染维持在含有5％热灭活FCS、2mM谷氨酰胺和50μM巯基乙醇的RPMI介质中的L1.2细胞。在含有600μg/ml潮霉素的介质中选择表达CXCR5的细胞，并在12-14天后通过在96孔组织培养板中以0.3个细胞/孔接种细胞来进行单细胞克隆。使用来自R&D***公司的抗CXCR5抗体(mAb 190)通过FACs测试生长出的克隆的CXCR5表达。扩增一个表达高水平CXCR5的克隆(L1.2/CXCR5克隆19)用于进一步应用。
对于趋化性试验，以0.7x 106个细胞/ml悬浮L1.2/CXCR5细胞并使用浓度逐渐升高的抗CXCR5抗体(0–1.0μM)在37℃下孵育30分钟。随后将细胞添加至具有8μm孔径滤器的Neuroprobe ChemoTx 96孔趋化性***的顶部腔体，其在底部微板腔体中含有10nMCXCL13。使用上盖覆盖组件并在5％CO2脉冲的潮湿空气培养箱内37℃下孵育5小时。5小时后，根据生产商的说明，移开滤器并将下方腔体中迁移的细胞转移至96孔平底黑板中。转移后，密封黑板并将其置于-80℃冷冻器中持续1-2小时或过夜以冷冻细胞。随后将细胞在室温下解冻20分钟并使用CyQuant(英杰公司)染色。在SynergyTMH4酶标仪(伯腾仪器公司(BioTek Instruments))上测量荧光。荧光与迁移的细胞数目成比例。计算各样品的趋化性指数(对CXCL13应答的荧光信号/趋化因子不存在时自发迁移的细胞的荧光信号)并以抗CXCR5抗体浓度函数的形式作图。采用GraphPad prism软件测定IC50值。
在实施例1.3中鉴定到的具有独特重链CDR3的46个克隆中，42个被成功重排并表达为IgG1。至少12个克隆能够中和CXCL13诱导的L1.2/CXCR5细胞趋化性，其IC50值的范围是1–2200nM(参见表1)。
实施例2–mAb 40C01的优化
2.1.重链和轻链变体
通过改变重链和轻链可变区中的构架区和CDR序列，单独修饰40C01重链(SEQ IDNO:1；VH)和轻链(SEQ ID NO:2；VL)的可变区的氨基酸序列。这些序列变化的目的是将构架氨基酸残基突变为该位置处发现的最同源的人种系残基，以提高相关细胞试验中的效力，通过阻止Asp异构化、Asn脱酰胺和Met氧化改善分子的可制造性，或消耗计算机鉴定的人T细胞表位的抗体，从而降低或消除其人中的潜在免疫原性。
构建了两条重链变体(SEQ ID NO:3和4)，作为人IgG1，IgG4(含有稳定铰链结构域的S241P氨基酸变化(Angal等，1993)和409位处具有Lys的同种异型)或修饰的IgG2(亚型HC2h，参见WO2009010290)重链同种型并命名为VH1(对应于SEQ ID NO:3)和VH2(对应于SEQID NO:4)。VH1和VH2包含以下突变(根据Kabat编号；带下划线的残基位于CDR之一中)：
VH1:D46E-D61A-M89V,
VH2:Y32S-D46E-D61A-M89V-M99K
在人κ链背景中构建了三种轻链变体并命名为Vk1、Vk2和Vk3。Vk1、Vk2和Vk3包含以下突变(根据Kabat编号；如上文所述，带下划线的残基位于CDR之一中)：
Vk1:K6Q-A7S-D9S-I31A-M48I-H49Y-A51T-R65S-N76S-A80P(还参见SEQ ID NO:5)，
Vk2:R6Q-A7S-D9S-I31A-A43V-M48I-H49Y-A51T-R65S-N76S-A80P(还参见SEQ IDNO:6)，
Vk3:R6Q-A7S-D9S-I31A-A43V-M48I-H49Y-A51T-R65S-N76S-A80P-S93A(还参见SEQ ID NO:7)
以所有可能的配对组合合并原始和变体重链和轻链以生成多种功能性全人抗CXCR5抗体。
2.2.差示扫描量热法(DSC)测量
通常使用差示扫描量热法(DSC，参见实施例)来研究多结构域蛋白质(如单克隆抗体)的稳定性。巨大的优势之一是其可用于精细调节蛋白质的单个结构域之间的相互作用。通过DSC测量单克隆抗体的温度诱导解折叠已成为监测蛋白质结构的不可或缺的根据。因此，正确解释观察到的转变是重要的。
在中性pH下通过DSC监测四种IgG1单克隆抗体的温度诱导解折叠。图3显示了所获热分析图的特征。完整抗体的所有四张热分析图都具有两个峰。对于对照IgG1同种型和原始40C01-VH-VL抗体而言，解折叠都代表两次转变，其解链温度(Tm)约71℃和83℃，且第一峰的幅度比第二峰大得多。基于比较完整IgG及其分离的Fab和Fc片段的研究结果(Ionescu等，2008)，可以推导，这些完整的两个抗体种的第一次解折叠事件与Fc片段中CH2结构域的解链和Fab片段的解链相关，而第二次转变主要代表CH3结构域的解折叠。该方法依赖以下假设：Fab片段以协作方式解折叠，即Fab片段的热分析图中仅观察到一次转变。
对于40C01 VH1-Vk1变体，热分析图具有相同的轮廓但第一峰具有较高的Tm，约74.5℃。对于40C01 VH1-Vk2变体，DSC热分析图具有不同的解链轮廓，具有约83℃的Tm的第二峰的幅度远大于具有约72℃的Tm的第一峰。由于DSC热分析图中峰值区域代表解折叠的实验焓，可推导出在该实施例中第二峰代表解折叠的Fc片段CH3结构域和Fab片段，而第一峰主要代表CH2结构域的解折叠。
在图3中，DSC分析显示，Fab片段的Tm从原始40C01抗体中的71℃升高至VH1-Vk1变体中的约74.5℃，并升高至VH1-Vk2变体的83℃。Fab片段的低稳定性或异质性可使长期储存或生产稳定性成为问题。因此，具有Tm为约83℃的Fab片段可视作有利于该治疗性单克隆抗体的研发。该Fab片段Tm的变化显示，其稳定性明显受到重链和轻链可变结构域序列的影响。因此，重链和轻链构架和CDR残基的变化通过精细调节VH与VL结构域之间的相互作用提高了分子的总体热稳定性，其中重链的变化发生在40C01 VH与VH1变体之间，轻链的变化发生在40C01 VH，Vk1与Vk2变体之间。
40C01 VH1-Vk3和VH2-Vk3所获得热分析图的轮廓示于图4。其DSC热分析图具有与40C01 VH1-Vk2变体相同的解链轮廓，其中第一峰的幅度远小于第二峰。第一次解折叠事件与Fc片段中CH2结构域的解链相关且第二次解折叠事件与Fc片段中CH3结构域和Fab片段的解链相关。对于40C01 VH1-Vk3和VH2-Vk3变体，对应于第一和第二峰的Tm分别为72℃和82℃以及72℃和81℃左右。从全长完整IgG1分子所获得热分析图计算得到的Fab片段的高于81℃的经推导高Tm值由哺乳动物细胞表达***中生成的相应重组Fab片段所获得的Tm值确认。40C01-VH1-Vk3和40C01-VH2-Vk3的重组Fab片段的DSC所获得的Tm分别为85.5℃和84.1℃(数据未显示)。
2.3.CXCL13刺激的L1.2-CXCR5细胞趋化性的抑制
遵循与实施例1.7中所公开实验方案类似的实验方案。
图5显示以全抗体形式表达为IgG1、IgG2和IgG4的抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3和40C01-VH2-Vk3变体对CXCL13刺激的L1.2-人和食蟹猴CXCR5的抑制。经计算的IC50(半最大抑制浓度)总结于表2。所有测试的mAb都以100％功效抑制趋化性。人CXCR5的不同的IgG同种型之间未观察到效力差异。对于人CXCR5，40C01-VH2-Vk3变体的效力比40C01-VH1-Vk3变体高10-20倍(前者的IC50在亚纳摩尔范围，后者为个位数纳摩尔范围)，而对于猕猴CXCR5，这些变体是等效的(亚纳摩尔范围)。
单价抗原与二价IgG抗体上单个结合位点的结合强度定义为亲和力。在溶液中，IgG抗体的各结合位点与单价抗原的结合是独立的。然而，当抗原的移动部分受限时，如在细胞膜上，诸如CXCR5的抗原上的表位在空间上接近IgG结合位点且一个位点的结合可提高其他结合位点的结合强度。抗体与抗原之间所有结合位点的强度总和定义为亲合力。亲合力受到抗体价态和抗原价态的影响。亲合力可以超过单个亲和力的总和。
为测试抗CXCR5 40C01变体的亲合力释放在趋化性抑制强度中起作用，测试40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3变体的重组Fab片段对人CXCR5-L1.2细胞趋化性的抑制。我们发现，40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3的重组Fab片段的IC50分别为288nM和20.9；而其相应全长人IgG1的IC50分别为0.38nM和0.05。完整IgG与其Fab片段之间抑制趋化性能力上的这些差异清楚地显示，IgG的二价是重要因素(数据未显示)。
2.4.人血清中CXCL13诱导的人原代B细胞趋化性的抑制
使用Ficoll-Paque Plus(GE医疗生命科学公司(GE Healthcare LifeSciences)，货号17-1440-03)从棕黄层中分离人淋巴细胞。使用MagCellect人B细胞分离试剂盒(R&D***公司，货号MAGH103)通过负选择纯化B细胞。将纯化的B细胞以3x 106个细胞/ml重悬于B细胞介质(RPMI1640，含有2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、25mg/ml Pen-Strep、50μMβ-巯基乙醇和10％热灭活FCS)中并在4℃下保持过夜以克服可能的体内脱敏(Hausdorff等1990；Tomhave ED 1994)并因此提高迁移的细胞数目。随后在100％非热灭火人血清(PAA实验室公司(PAA Laboratories)，货号C11-020)中将B细胞与40C01变体的1:4稀释物(从100μg/ml至0.38ng/ml)在37℃下预孵育20分钟。使用***以及5-μm孔径96孔趋化性版(ChemoTx#101-5，神经探针公司(Neuro Probe))评价人B细胞对300nM人趋化因子CXCL13(内部制得)的迁移。在具有5％CO2的潮湿培养箱中允许在37℃下进行2小时的趋化。随后将迁移的细胞转移至新鲜的96孔微板，在-80℃下储存数小时，解冻，使用(生命技术公司(Life Technologies)，货号C7026)染色并计数。用以下公式计算抑制百分比：抑制百分比＝100×(1-Abs处理下的平均细胞数目/未处理时的平均细胞数目)。
使用以下公式将结果表示为对照(即CXCL13诱导的)迁移百分比：％M d＝(Mab+CXCL13–Mbuffer/Mcxcl13–Mbuffer)x 100；其中M是迁移，Mab+cxcl13是由于抗体+cxcl13产生的迁移，Mbuffer是仅由于缓冲液产生的平均迁移，且Mcxcl13是仅由于cxcl13产生的平均迁移。CXCL13存在时的细胞迁移数目是100％。应注意，基础迁移是最小的(使用CXCL13获得的最大应答的约0.5％)。
图6显示40C01-VH1-Vk3变体的平均IC50是1.89nM，范围为0.29至3.09nM，且抑制百分比的范围为71至88.5％。40C01-VH2-Vk3变体的平均IC50是0.34nM，范围为0.082至0.479nM，且抑制百分比的范围为80.8至90.5％。
2.5.Alexa-Fluor 647标记的mAb与人CXCR5稳定转染的HEK-293细胞的结合
使用来自英杰公司(Invitrogen)的单克隆抗体标记试剂盒(货号A20186)使用Alexa Fluor 647染料标记抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3变体。通过直接免疫荧光试验检测标记的mAb与使用人CXCR5稳定转染的HEK-293细胞的结合。将总共1x 105个过表达人CXCR5的稳定的HEK-293细胞与FACS缓冲液(含有1％BSA和0.1％NaN3的PBS)中1:3连续稀释的Alexa Fluor 647 mAb(从60μg/ml至0.33ng/ml)在冰上孵育1小时。使用FACS缓冲液将细胞清洗两次并在FACSCalbur流式细胞仪(BD科学公司)上分析。通过以抗体浓度函数的形式对FL4荧光(Alexa Fluor 647染料的发射)进行作图来计算EC50(分别达到半最大细胞结合(％)和几何平均荧光强度(Geo平均)的Ab浓度)和EC80。这些EC50和EC80值用作各变体与人CXCR5阳性细胞的相对结合亲和力的测量值。从图7所示的结果中，我们计算得到40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3的EC50值分别为2.26nM和4.6nM。
2.6.Alexa-Fluor 647标记的mAb与全血中人B细胞的结合
使用来自英杰公司(Invitrogen)的单克隆抗体标记试剂盒(货号A20186)使用Alexa Fluor 647染料标记40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3变体。在肝素钠化试管中收集血液并在室温下静置2小时。随后向全血中添加叠氮化钠(NaN3)至终浓度0.01％。将Alexa-Fluor647标记的mAb的3次稀释(范围为60μg/ml至3ng/ml)中的系列1添加至血液样品中并在室温下孵育30分钟。将藻红蛋白(PE)标记的抗CD19(BD法敏进公司(BD Pharmingen)，货号555413)和抗人CXCR2(R&D***公司，货号FAB331P)mAb及其各自的同种型对照分别用于门选B细胞和监测粒细胞上的CXCR2表达。随后使用来自R&D***公司的人红细胞裂解试剂盒(货号WL1000)裂解标记的血红细胞，并将血细胞重悬在FACS缓冲液(PBS-1％BSA，0.1％NaN3)中并在FACS Calibur 3(BD生物科学公司)上通过流式细胞术分析。通过以抗体浓度的函数形式对FL4荧光进行作图(Alexa Fluor 647染料的发射)来计算EC50和EC80值。从图8所示的结果中，我们计算得到40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3的EC50值分别为1.92nM和7.22nM。在表达CXCR2的粒细胞群体(嗜中性粒细胞)上未检测到两种40C01变体的结合。
2.7.抗CXCR5 40C01变体与全血中猕猴B细胞的结合
在肝素钠化试管中收集猕猴(食蟹猴)血液并在室温下储存。随后向血液中添加叠氮化钠(NaN3)至终浓度0.01％。以500μg/ml和50ng/ml将5μl抗体稀释液一式两份加入45μl血液中并在室温下孵育30分钟。随后使用来自R&D***公司的人红细胞裂解试剂盒(货号WL1000)裂解血红细胞。使用来自依诺威克斯公司(Innovex)的Fc受体阻断剂(货号NB309)阻断Fc受体。藻红蛋白(PE)偶联的山羊抗人Fc片段(杰克逊免疫研究公司，货号109-116-098)和别藻蓝蛋白(APC)偶联的小鼠IgG2b抗人CD20(BD生物科学公司，货号559776)及其各自的同种型对照分别被用于检测抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3和VH2-Vk3变体mAb的结合和门选B细胞。在冰水孵育30分钟后，清洗血细胞，并重新在FACS缓冲液(PBS-1％BSA，0.1％NaN3)中并在FACS Calibur 3(BD生物科学公司)上通过流式细胞术分析。图9的结果显示，在50μg/ml下，两种40C01变体都显示与B细胞上表达的猕猴CXCR5的强且特异性的结合。
2.8.抗CXCR5 mAb对来自人和猕猴全血的B细胞中CXCL13刺激的ERK磷酸化的抑制
CXCL13与其趋化因子受体CXCR5的结合触发若干胞内信号传导事件，且特别是p44/42细胞***素活化蛋白(MAP)激酶(胞外信号调节激酶；ERK1/2)的瞬时磷酸化(激活)。该试验使用流式细胞术测量了抗CXCR5 40C01变体对全血中B细胞中CXCL13刺激的ERK磷酸化的抑制。
在肝素钠化试管中收集血液并在室温下静置2小时。向血液中添加抗体的连续稀释液并在37℃下孵育30分钟。随后在37℃下使用500nM人或350nM猕猴CXCL13激活全血中的B细胞。2分钟后，通过将细胞在4％甲醛中室温下固定8分钟来终止信号传导激活。固定后，添加曲通X-100至终浓度0.1％并在37℃下孵育35分钟。使用PBS清洗细胞，使用甲醇(50％终浓度)固定并在-20℃下孵育至少1小时。随后将细胞在实验台上温热至室温，清洗，并添加FACS染色缓冲液(含有4％FCS的PBS)中抗磷酸-p44/42 MAPK(ERK1/2)兔抗体(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)，货号4370S)的1/50稀释液并在室温下再孵育1小时。随后使用FACS染色缓冲液清洗细胞并添加Alexa Fluor 647驴抗兔IgG(英杰公司，货号A31573)的1/400稀释液和抗人CD20-PE(BD法敏进公司，货号556633)抗体的1/2.5稀释液并在冰上孵育1小时。随后清洗细胞并重悬在FACS染色缓冲液中并通过流式细胞术分析。显示CD20+细胞上门选的磷酸-ERK荧光直方图(FL4)(数据未显示)。报道了各样品的阳性细胞百分比。以经计算的抗CXCR5 mAb浓度和IC50的函数形式表示阳性细胞百分比。从图10的结果中，对于人血液中经计算的IC50，40C01-VH1-Vk3作为IgG1和IgG2时分别为0.17nM(组图D)和0.736nM(组图A)；且40C01-VH2-Vk3作为IgG1和IgG2时分别为0.45nM(组图C)和0.88nM(组图B)。从图11的结果中，对于猕猴血液中经计算的IC50，40C01-VH1-Vk3和40C01-VH2-Vk3都作为IgG1时均分别为0.195nM和1.57nM。获得的结果总结在表3中。
2.9.抗CXCR5 mAb变体针对细胞膜表达的CXCR5的Kd的测量
使用动力学排除试验(KinExA)来测定全人IgG2(亚型HC2h，参见WO2009010290)抗CXCR5 40C01抗体变体与稳定转染的HEK-293细胞的细胞表面上表达的人CXCR5之间平衡建立后维持在溶液中的游离抗体浓度，并从中测定平衡解链常数(Kd)。该方法提供了抗体与膜整合蛋白(如GPCR)的亲和力/亲合力的真实测量。
使用Accutase细胞脱离溶液收获稳定表达CXCR5(一种具有7次跨膜结构域的膜整合蛋白)的HEK-293细胞，以2x106个细胞/ml重悬并使用KinExA缓冲液(含有1mg/ml BSA和0.02％NaN3的PBS)在15个falcon管中1：2连续稀释。在KinExA缓冲液中制备适当恒定浓度的纯化的mAb并将等量的mAb与连续稀释的细胞混合。为获得标准Kd值，测试了两种不同浓度的mAb，对于40C01-VH1-Vk3变体是30pM和300pM，对于40C01-VH2-Vk3变体是100pM和1M。将细胞与mAb通过旋转混合，室温下混合至少24小时。随后对细胞离心并使用包被有山羊抗人IgG(H+L)(杰克逊免疫研究公司，货号109-005-003)PMMA珠和DyLight 649-偶联的抗人二抗(杰克逊免疫研究公司，山羊抗人Fc，货号109-495-098)(以KinExA缓冲液中1μg/ml使用)通过KinExA测量上清液中存在的游离mAb。使用KinExA软件并通过“n-曲线分析”来获得标准Kd，所述“n-曲线分析”将对于40C01-VH1-Vk3变体而言30pM和300pM下以及对于40C01-VH2-Vk3变体而言100pM和1nM下获得的曲线同时拟合至单个Kd值。使用KinExA软件将溶液中残留的游离mAb百分比针对抗原浓度作图(任意定义为每100万个细胞1nM抗原)并生成S型曲线。
通过使用n-曲线分析的KinExA软件计算40C01-VH1-Vk3和40C01-VH2-Vk3的Kd的代表性试验分别示于图12和13。人抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3的Kd为15.35pM，其中95％置信区间的Kd高值为41.84pM且Kd低值为2.29pM。通过该方法计算得到抗原乘数为11.3，其转化为1.6x 105个CXCR5受体/细胞。人抗CXCR5 mAb 40C01-VH2-Vk3的Kd为47.04pM，其中95％置信区间的Kd高值为92.41pM且Kd低值为20.44pM。通过该方法计算得到抗原乘数为22.94，其转化为2.8x 106个CXCR5受体/细胞。
2.10.抗CXCR5 40C01-VH1-Vk2介导的ADCC。
使用人B细胞作为靶标并使用人NK细胞作为效应细胞进行针对铬-51标记的靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验。使用各自的MACS细胞分离试剂盒(来自美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))从人PBMC中纯化B细胞和NK细胞。随后使用51Cr标记分离的B细胞。为测量细胞毒性，将效应(E)和靶(T)细胞(E/T比例10/1)与抗CXCR5-40C01-VH1-Vk2 mAb、利妥昔单抗(阳性对照IgG1 mAb)、抗鸡蛋溶菌酶mAb(阴性对照IgG1mAb)在37℃下共孵育4小时。使用以下公式计算细胞裂解百分比：特定裂解百分比＝((实验性每分钟计数(c.p.m.)–自发性c.p.m.)/(最大c.p.m.–自发性c.p.m.))x 100。图14中的结果显示，抗CXCR5 40C01-VH1-Vk2 mAb能够介导针对原代人B细胞的ADCC且其效力与良好记录的FDA批准的抗CD20抗体利妥昔单抗相当(如果未更好)。
2.11.非岩藻糖基化抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3-IgG1介导的ADCC
使用稳定表达人或猕猴(食蟹猴)CXCR5的L1.2细胞(参见上文实施例1.7)作为靶细胞并使用人PBMC作为效应细胞进行针对铬-51标记的靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验。为测量细胞毒性，将效应(E)和靶(T)细胞(E/T比例100/1)与抗CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG1 mAb、抗CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖mAb或单独的介质在37℃下共孵育4小时。使用以下公式计算细胞裂解百分比：特定裂解百分比＝((实验性每分钟计数(c.p.m.)–自发性c.p.m.)/(最大c.p.m.–自发性c.p.m.))x 100。图15的结果显示，抗CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG1 mAb能够介导针对表达人或猕猴CXCR5的L1.2靶细胞的ADCC。此外，在相同试验条件下，非岩藻糖基化形式的该抗体(抗CXCR5-40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖)显示增强的针对表达人或猕猴CXCR5的靶细胞的ADCC活性。
2.12.抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3-IgG1诱导人B细胞消耗
在抗CXCR5抗体或IgG1同种型对照抗体存在的情况下在浓度范围内培养来自5个供体的人PBMC。过夜孵育后，通过流式细胞术评估CD19+B细胞占淋巴细胞群体的百分比。该数据标准化至同种型对照并合并来自各供体的数据。如图16所示，我们观察到40C01-VH1-Vk3-IgG2_DI-NQ-HC2h不导致B细胞消耗。然而，40C01-VH1-Vk3-IgG1和40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖形式都导致人B细胞消耗。我们发现，40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖形式效力更高，因为诱导B细胞消耗所需的该抗体量较低。这些数据表明，40C01-VH1-Vk3-IgG1和40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖可诱导人B细胞的消耗，其中40C01-VH1-Vk3-IgG1_低_岩藻糖具有增强的效力。
表1：多种本发明的mAb的IC50值的总结表
表2：图5所获得的IC50值的总结表
表3：图10和11所获得的IC50值的总结表
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Claims (10)
1.一种结合并调节并/或中和CXCR5的单克隆抗体，其包含与SEQ ID NO: 1至少90%相同的重链可变结构域和与SEQ ID NO:2至少90%相同的轻链可变结构域，且选自：
a.重链可变结构域由SEQ ID NO: 3构成且轻链可变结构域由SEQ ID NO: 5构成的抗体；
b. 重链可变结构域由SEQ ID NO: 3构成且轻链可变结构域由SEQ ID NO: 6构成的抗体；
c.重链可变结构域由SEQ ID NO: 3构成且轻链可变结构域由SEQ ID NO: 7构成的抗体；
d.重链可变结构域由SEQ ID NO: 4构成且轻链可变结构域由SEQ ID NO: 7构成的抗体。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链恒定区，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
3.编码权利要求1或2所述单克隆抗体的重链和轻链的多核苷酸。
4.一种表达载体，其包含：
a. 编码权利要求1或2所述单克隆抗体的重链的多核苷酸和编码权利要求1或2所述单克隆抗体的轻链的多核苷酸，或
b. 权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其使用以下表达载体转化：
a. 包含编码权利要求1或2所述单克隆抗体的重链的多核苷酸的表达载体和包含编码权利要求1或2所述单克隆抗体的轻链的多核苷酸的表达载体，或
b. 权利要求4所述的表达载体。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，所述细胞是哺乳动物细胞。
7.一种生成权利要求1或2所述单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 培养权利要求5或6所述的宿主细胞，以及
b. 分离所述宿主细胞生成的所述抗体。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。
9.权利要求1或2所述的单克隆抗体用于制造药物的用途。
10.权利要求1或2所述的单克隆抗体用于制造药物的用途，所述药物是用于治疗自身免疫或炎性疾病以及癌症的药物。
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