TWI772586B

TWI772586B - 三鏈抗體、其製備方法及其用途

Info

Publication number: TWI772586B
Application number: TW107147205A
Authority: TW
Inventors: 繆小牛; 匡智慧; 胡化靜; 倪海晴; 劉軍建
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2022-08-01
Also published as: AU2018393424B2; SG11202003782XA; US20220227870A1; EP3733715A1; BR112020012782A2; EP3733715A4; CA3081117A1; CN109970860A; JP2021507720A; IL275055A; AU2018393424A1; TW201927824A; KR20200104305A

Abstract

本發明提供了一種新型的經人工設計的包含三條多肽鏈的三鏈抗體，其中第一多肽鏈包含第一重鏈可變結構域，第二多肽鏈包含第一輕鏈可變結構域，該第一重鏈可變結構域與第一輕鏈可變結構域配對形成第一抗原結合位點；且第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點。本發明還提供了編碼該三鏈抗體的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、包含該多核苷酸或載體的宿主細胞、包含該三鏈抗體的免疫綴合物和包含該三鏈抗體或其免疫綴合物的醫藥組成物、以及該三鏈抗體在疾病的免疫治療、預防和/或診斷上的用途。

Description

三鏈抗體、其製備方法及其用途

本發明總體上涉及免疫學和抗體工程領域。具體而言，本發明涉及一種新型的經人工設計的三鏈抗體、編碼該三鏈抗體的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、包含多核苷酸或載體的宿主細胞、包含該三鏈抗體的免疫綴合物和包含該三鏈抗體或其免疫綴合物的醫藥組成物、以及該三鏈抗體在疾病的免疫治療、預防和/或診斷上的用途。

抗體分子能夠與其相應的抗原發生靶向性的特異性結合，正日益成為針對各種疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治療劑、預防劑和/或診斷劑。但是，僅針對一種靶點的單特異性抗體在臨床應用上存在一些局限性。患者在接受單特異性抗體治療後可能產生耐藥性或無應答。隨著對癌症和其他多種疾病的研究，認識到了往往有多種信號轉導通路參與疾病的發生和發展，單一靶點的免疫療法在許多疾病中通常並不足以發揮對疾病的治療作用。

由於多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)能夠特異性結合不同抗原，當一種抗原位於特定的免疫細胞上，另一種抗原位於疾病細胞上時，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)可以將特定的免疫細胞重新定向至疾病細胞，以增強免疫細胞對疾病細胞的殺傷力。另外，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)也能夠設計為同時作用於兩種或多種不同介質的信號轉導通路。這些優勢特性為多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)開闢了廣闊的應用前景。

已經藉由抗體工程開發了若干多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)樣式並且研究了它們在疾病應用上的適用性。目前，批准上市的2個雙特異性抗體產品分別是Micromet公司和Amgen公司開發的Blinatumomab以及Trion Pharma公司開發的Catumaxomab。Blinatumomab是第1個在美國獲批上市的用於治療B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)和B前體急性淋巴細胞白血病(ALL)的一種分子量約55KDa的單鏈雙特異性抗體，由分別針對CD19分子和針對CD3分子的兩種單鏈Fv分子藉由柔性連接肽融合而成，其利用幾乎在所有的B淋巴細胞腫瘤中都表達的CD19和在T細胞上表達的CD3，使T細胞與靶向細胞(腫瘤細胞)緊密聯結在一起，T細胞釋放穿孔素和粒端酶進入突觸間隙，引起腫瘤細胞發生一系列化學反應，從而消滅腫瘤細胞(Nagorsen D.和Baeuerle P.A.,Immunomodulatory therapy of cancer with T cell-engaging BiTE antibody blinatumomab，Exp Cell Res，2011，317：1255-1260)。Catumaxomab是由兩個分別源自親本小鼠IgG2a同種型和大鼠IgG2b同種型的半抗體組成的嵌合體，其中每個半抗體具有一條輕鏈和一條重鏈，抗CD3大鼠IgG2b半抗體用於T細胞識別，抗腫瘤細胞表面抗原EpCAM(上皮細胞黏附分子)的小鼠IgG2a半抗體用於腫瘤細胞識別(Chelius D等人，Structural and functional characterization of the trifunctional antibody catumaxomab，MAbs，2010，2：309-319)。Catumaxomab(Removab®)於2009年4月在歐洲獲准用於治療由EpCAM陽性上皮源性轉移瘤所引起的惡性腹水。

多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)根據不同的組成部分以及構建方式，可以分為許多種類。例如，根據多特異性抗體結構的左右對稱性，可分為對稱結構和不對稱結構；根據多特異性抗體有無IgG的Fc區，分為完整抗體和抗體片段；根據多特異性抗體中抗原結合位點的數量分為二價、三價、四價或更多價的抗體等。

不同的多特異性抗體設計各有利弊，例如，雖然Blinatumomab可以藉由重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞進行大規模培養生產，但是容易形成聚集物、在體內半衰期很短，實際使用的時候需要額外配備連續輸液裝置；Catumaxomab生產工藝複雜且鼠異源抗體比較容易在人體產生免疫原性問題。此外，四鏈免疫球蛋白(Ig)樣多特異性抗體中非相關重鏈和輕鏈的不想要配對導致無活性抗原結合位點和/或其他無功能的不想要的副產物的形成，這在抗體的臨床規模生產和治療性應用中也是一個問題(Klein, C.等人，Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies,mAbs,2012,4：653-663)。理論上，兩條重鏈能夠按四種不同的組合方式締合，並且這些重鏈中每一者均可以按隨機方式與輕鏈締合，產生2⁴(=總計16)種可能的鏈組合。在這16種理論上可能的組合當中，實際上發現了10種組合，但其中僅一種組合對應於所需功能性的多特異性抗體。難以從複雜混合物分離出所需的一種多特異性抗體和理論上最大12.5%的固有不良產率致使在細胞表達體系中產生四鏈Ig樣多特異性抗體是困難的。

本發明的新型抗體樣式克服了上述弊端。本發明提供了一種新的多特異性抗體樣式，該抗體樣式因各條鏈之間的正確偶合或配對而以增加的產率容易地產生，易於在體外的培養細胞中表達，不需要複雜的生產工藝。此外，本發明的多特異性抗體樣式能夠保持該多特異性抗體中的各抗原結合位點與相應的不同表位結合的親和力，且在結合不同表位的時候互相之間不會產生空間位阻的干擾，具有好的成藥性。進一步地，本發明的多特異性抗體樣式是物理穩定的和生物學穩定的，這允許該抗體具有更好的生產性和可發展性。

本文公開了藉由抗體工程方法構建的一種新型的包含三條多肽鏈的三鏈抗體。該三鏈抗體能夠以高親和力和高特異性與一種或多種抗原結合，較佳地，與兩種以上的抗原結合。本發明還提供了編碼該三鏈抗體的核酸分子、用於產生該三鏈抗體的表達載體、宿主細胞和方法。本發明還提供了包含本發明的該三鏈抗體的免疫綴合物和包含該三鏈抗體或其免疫綴合物的醫藥組成物。本文公開的三鏈抗體可以單獨或與其他藥物或其他治療模式聯合用來治療、預防和/或診斷疾病，如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤等。

因此，在一個方面，本發明提供了具有以下一個或多個特性的三鏈抗體：(a)以高親和力，例如以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與一種或多種抗原特異性結合；(b)易於在體外的培養細胞中表達，且三條鏈之間能夠正確偶合或配對；(c)具有良好的物理穩定性，特別地，具有良好的長期熱穩定性；且能長時間保持生物學活性；和(d)在與一種或多種抗原特異性結合後，藉由對各抗原所參與的信號傳導通路的作用發揮生物學功能；本發明的三鏈抗體至少是三價抗體(即，至少具有三個抗原結合位點)。在一個實施方案中，該三鏈抗體是(1+2樣式)的三價抗體，其第一多肽鏈包含第一重鏈可變結構域，第二多肽鏈包含第一輕鏈可變結構域，該第一重鏈可變結構域與第一輕鏈可變結構域配對(下文中縮寫為VH1/VL1對)形成第一抗原結合位點；且第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體包含的一個抗原結合位點靶向第一抗原，另兩個結合位點分別各自靶向第二抗原的相同或者不同表位。在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體包含的三個抗原結合位點靶向三種不同的抗原。在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體包含的三個抗原結合位點靶向相同的抗原。

在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含三條多肽鏈的三鏈抗體，其中第一多肽鏈包含第一重鏈可變結構域和免疫球蛋白CH1結構域，第二多肽鏈包含第一輕鏈可變結構域和免疫球蛋白CL結構域，該第一重鏈可變結構域與第一輕鏈可變結構域配對形成第一抗原結合位點；且第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點，其中該第三多肽鏈的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間具有或者不具有連接肽。

在一個實施方案中，該第三多肽鏈的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間具有包含甘胺酸(G)和絲胺酸(S)殘基的連接肽，例如，包含1-7個GGGGS重複的連接肽，較佳地，包含4個GGGGS重複的連接肽。

在一個較佳的實施方案中，本發明三鏈抗體中的該第三多肽鏈不包含免疫球蛋白CH1結構域；該單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點分別選自天然缺乏輕鏈的抗體的重鏈可變結構域(如駱駝科(Camelidae)物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域)、魚類中稱為新型抗原受體(new antigen receptor,NAR)的免疫球蛋白(如鯊魚血清中天然存在的IgNAR)中的單結構域抗原結合位點、和衍生自它們的經重組的單結構域抗原結合位點。從天然缺乏輕鏈的重鏈抗體衍生的重鏈可變結構域在本文中稱作VHH，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VHH分子可以衍生自駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)中產生的抗體。除駱駝科之外的其他物種也可以產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，這類VHH也處於本發明的範圍內。

在一個實施方案中，在本發明三鏈抗體的該第三多肽鏈中，該單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點分別是第一VHH和第二VHH，該第一VHH和第二VHH的序列相同或者不同，且結合相同或者不同的抗原，或者結合相同抗原上的不同抗原表位。

又在一個實施方案中，本發明提供了這樣的包含三條多肽鏈的三鏈抗體，其中第一多肽鏈從N端至C端包含第一重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域和Fc結構域；第二多肽鏈從N端至C端包含第一輕鏈可變結構域和免疫球蛋白CL結構域；且第三多肽鏈從N端至C端包含單結構域第二抗原結合位點、單結構域第三抗原結合位點和Fc結構域，較佳地，該免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白，更佳地，該免疫球蛋白是人IgG1免疫球蛋白。

在本發明提供的包含三條多肽鏈的三鏈抗體中，發明人還設計了能夠穩定三鏈抗體結構和有利於各條鏈之間的正確偶合或配對的胺基酸殘基。例如，在三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的Fc結構域中包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，從而該第一多肽鏈和第三多肽鏈彼此藉由該鉸鏈區處胺基酸殘基之間形成的二硫鍵穩定締合。在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈在各自的Fc結構域中分別包含Y349C和S354C或者分別包含S354C和Y349C(根據Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引進行編號，下文中稱為“EU編號”)，由此，第一多肽鏈和第三多肽鏈在Fc區進一步形成鏈間二硫鍵，以穩定第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第一多肽鏈和/或第三多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，該效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，該胺基酸突變存在於Fc區的CH2結構域，例如，該三鏈抗體包含在第一多肽鏈和/或第三多肽鏈第234和235位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是L234A和L235A(下文中稱為“LALA突變”)。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈各自的Fc結構域中分別包含凸起(“結(knob)”) 或空穴(“扣(hole)”)，並且第一多肽鏈Fc結構域中的該凸起或空穴可分別置於第三多肽鏈Fc結構域中的該空穴或凸起中，由此該第一多肽鏈和第三多肽鏈彼此形成“結入扣(knob-in-hole)”的穩定締合。在一個實施方案中，在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈的免疫球蛋白CH1結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的該凸起或空穴可分別置於CL結構域中的該空穴或凸起中，從而該第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。

本發明的三鏈抗體中的第一抗原結合位點、第二抗原結合位點和第三抗原結合位點可以結合相同抗原或者不同抗原上的表位。例如，該第一抗原結合位點結合第一抗原的表位，該第二抗原結合位點和第三抗原結合位點結合第二抗原上的相同或者不同表位，由此，該三鏈抗體是針對第一抗原和第二抗原的雙特異性抗體。當該第一抗原結合位點結合第一抗原的表位，該第二抗原結合位點和第三抗原結合位點分別結合第二抗原的表位和第三抗原的表位時，該三鏈抗體是三特異性抗體。不特別地限制本發明的三鏈抗體特異性結合的抗原類型，抗原可以是例如細胞因子、生長因子、激素、信號傳導蛋白、炎性介質、配體、細胞表面受體或其片段。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體特異性結合的抗原選自腫瘤相關抗原、免疫檢查點分子、免疫系統中的共刺激分子，以及這些分子的配體和/或受體，例如，CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、和4-1BB(CD137)。

本發明例示了如下所述的幾種三鏈雙特異性抗體。

i)在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體是抗CD47/PD-L1雙特異性抗體，該抗體能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的CD47結合，由此阻斷CD47與巨噬細胞表面SIRPα的結合，促進腫瘤組織浸潤區的巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用；並以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的PD-L1結合，由此抑制T細胞上的PD-1與腫瘤細胞表面PD-L1的結合，誘導T細胞活化並發揮抗腫瘤作用。

在一個實施方案中，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的GSIEHYYWS(SEQ ID NO：3)所示的VH CDR1、YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)所示的VH CDR2、ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)所示的VH CDR3、RASQGISRWLA(SEQ ID NO：10)所示的VL CDR1、AASSLQS(SEQ ID NO：11)所示的VL CDR2和QQTVSFPIT(SEQ ID NO：12)所示的VL CDR3，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。又在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的SEQ ID NO：2/9的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

在一個實施方案中，該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點均包含SEQ ID NO：17所示的CDR1、SEQ ID NO：18所示的CDR2和SEQ ID NO：19所示的CDR3，或者與該3個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。又在一個實施方案中，該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點均包含SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

又在一個實施方案中，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

ii)在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體是抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體，該抗體能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與T細胞表面的4-1BB結合，活化4-1BB/4-1BB配體的共刺激信號傳導通路，誘導T細胞的活化、增殖及抗凋亡；並以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的PD-L1結合，由此抑制T細胞上的PD-1與腫瘤細胞表面PD-L1的結合，誘導T細胞活化並發揮抗腫瘤作用。

在一個實施方案中，本發明的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗4-1BB抗體BMS-663513的SEQ ID NO：26/28的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗4-1BB抗體BMS-663513的SEQ ID NO：26/28的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：25所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：27所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

又在一個實施方案中，本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：25所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：27所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

iii)在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體是抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體，該抗體能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與T細胞表面的LAG-3結合，抑制T細胞中的LAG-3抑制性信號傳導通路，由此恢復了CD8+效應T細胞並減少了Treg群體；並以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的PD-L1結合，由此抑制T細胞上的PD-1與腫瘤細胞表面PD-L1的結合，誘導T細胞活化並發揮抗腫瘤作用。

在一個實施方案中，本發明的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗LAG-3抗體ADI-31853的GSIYSESYYWG(SEQ ID NO：31)所示的VH CDR1、SIVYSGYTYYNPSLKS(SEQ ID NO：32)所示的VH CDR2、ARVRTWDAAFDI(SEQ ID NO：33)所示的VH CDR3、QASQDISNYLN(SEQ ID NO：36)所示的VL CDR1、DASNLET(SEQ ID NO：37)所示的VL CDR2和QQVLELPPWT(SEQ ID NO：38)所示的VL CDR3，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗LAG-3抗體ADI-31853的SEQ ID NO：30/35的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：29所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：34所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

又在一個實施方案中，本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：29所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：34所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈，或與任一所述序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

在第二方面，本發明提供了編碼本發明三鏈抗體中的第一多肽鏈、第二多肽鏈和/或第三多肽鏈的多核苷酸。

在第三方面，本發明提供了包含編碼本發明三鏈抗體中的第一多肽鏈、第二多肽鏈和/或第三多肽鏈的多核苷酸的載體，較佳地表達載體。

在第四方面，本發明提供了包含本發明多核苷酸或載體的宿主細胞。例如，該宿主細胞是哺乳動物細胞，較佳地是CHO細胞、HEK293細胞；該宿主細胞是原核細胞，較佳地是大腸桿菌細胞。

在第五方面，本發明提供了用於產生本發明三鏈抗體的方法，該方法包括步驟(i)在適於表達該三鏈抗體的條件下培養本發明的宿主細胞，和(ii)從該宿主細胞或該培養基回收該三鏈抗體。

在第六方面，本發明提供了包含本發明三鏈抗體的免疫綴合物和包含該三鏈抗體或其免疫綴合物的醫藥組成物。本文公開的三鏈抗體可以單獨或與其他藥物或其他治療模式聯合用來治療、預防和/或診斷疾病，如自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤等。

在第七方面，本發明提供了本發明的三鏈抗體、免疫綴合物和醫藥組成物的用途，用作在個體中治療和/或預防疾病的藥物或用作疾病的診斷工具，或用於在有需求的受試者中增加造血幹細胞植入。較佳地，該個體是哺乳動物，更較佳地是人。在一個實施方案中，該疾病是自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)、腫瘤。

除非另外限定，否則本文中所用的全部技術與科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。本文所提及的全部出版物、專利申請、專利和其他參考文獻藉由引用的方式完整地併入。此外，本文中所述的材料、方法和例子僅是說明性的並且不意在是限制性的。本發明的其他特徵、目的和優點將從本說明書及圖式並且從後附的權利要求書中顯而易見。

結合以下圖式一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。

第1A圖至第1C圖例示了本發明三鏈抗體的結構。第1A圖例示了一種本發明的三鏈抗體，其中第一多肽鏈與第二多肽鏈配對形成第一抗原結合位點，第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點，且在第三多肽鏈的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間具有柔性連接肽。第1B圖例示了另一種本發明的三鏈抗體，其中第一多肽鏈與第二多肽鏈配對形成第一抗原結合位點，第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點，且在第三多肽鏈的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間不具有柔性連接肽。第1C圖例示了本發明三鏈抗體的各條肽鏈從N端到C端的結構，其中虛線箭頭指示的第三多肽鏈中的柔性連接肽根據需要(例如，根據與特異性結合的表位的親和力、空間位阻的情況)在本發明的三鏈抗體中可以有，也可以沒有。

第2A圖和第2B圖分別顯示了利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測的本發明製備的兩種抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL的純度。

第3圖顯示了藉由動力學結合測定法獲得的本發明抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL、以及作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、抗CD47抗體ADI 29341的動力學結合曲線、以及k_on、k_dis和K_D數據。

第4A圖顯示了藉由FACS檢測的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL、以及作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體與過量表達PD-L1的CHO-S細胞的結合。第4B圖顯示了藉由FACS檢測的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL、以及作為陽性對照的抗CD47抗體ADI 29341、作為陰性對照的IgG1抗體與過量表達CD47的CHO-S細胞的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。

第5圖顯示了藉由PEG沉澱法測定的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL、以及作為陽性對照的抗體修美樂(Humira，也稱為阿達木單抗，是一種抗TNFα的人源化單株抗體)的物理穩定性和可溶性。

第6圖顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL的長期熱穩定性。將該抗體在40℃放置0、1、3、7、10、20、30天後，藉由SEC-HPLC測定了抗體純度。

第7A圖顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL在第0天時和在40℃放置30天時分別與過量表達PD-L1的CHO-S細胞的結合。第7B圖顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL在第0天時和在40℃放置30天時分別與過量表達CD47的CHO-S細胞的結合。橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。

第8圖顯示了基於MOA法檢測的本發明抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL、以及作為陽性對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、作為陰性對照的IgG1抗體對PD-1/PD-L1信號傳導通路的影響。

第9圖顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL、以及作為陽性對照的抗CD47抗體ADI29341促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。

第10圖顯示了抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC、抗CD47抗體Hu5F9(對應於US2015/0183874A1中的“5F9”抗體)和IgG1對照抗體對紅細胞凝集的影響。

第11圖顯示了當腫瘤細胞和人紅細胞共同孵育時，選擇性結合到腫瘤細胞表面的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL比例。

第12圖顯示了利用SEC檢測的本發明製備的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-P4的純度。

第13A圖顯示了藉由FACS檢測的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-P4、以及作為陽性對照的抗4-1BB抗體BMS-663513與過量表達4-1BB的CHO-S細胞的結合。第13B圖顯示了藉由FACS檢測的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-P4、以及作為陽性對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體與過量表達PD-L1的CHO-S細胞的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。

第14圖顯示了利用SEC檢測的本發明製備的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL的純度。

第15A圖顯示了藉由FACS檢測的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL、以及作為陽性對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體與過量表達PD-L1的CHO-S細胞的結合。第15B圖顯示了藉由FACS檢測的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL、以及作為陽性對照的抗LAG-3抗體ADI-31853與過量表達LAG-3的HEK293細胞的結合。圖中橫軸表示抗體濃度、縱軸表示平均螢光強度(MFI)。

第16圖顯示了與抗LAG-3抗體ADI-31853、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、抗LAG-3抗體ADI-31853+抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、IgG4對照抗體比較，抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL體外激活T細胞的作用。

第17圖顯示了與h-IgG相比，抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、抗CD47抗體ADI 29341、抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體與抗CD47抗體ADI 29341聯合用藥、抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC在Raji-PD-L1/NOD-SCID小鼠模型中的腫瘤抑制活性。

發明詳述 I.定義

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。

術語“抗體”在本文中以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、三鏈抗體、完整抗體和抗體片段。

術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。

“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，該指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

然而，應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

術語“抗原結合片段”是比完整或完全抗體的胺基酸殘基數要少的完整或完全抗體的一部分或一段，其能結合抗原或與完整抗體(即與抗原結合片段所來源的完整抗體)競爭結合抗原。可以藉由重組DNA技術、或藉由酶或化學切割完整的抗體製備抗原結合片段。抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、單鏈Fv、雙體抗體(diabody)、單結構域抗體(sdAb)。該Fab片段是一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，例如，藉由木瓜蛋白酶消化完全抗體能夠獲得Fab片段。此外，藉由胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下面消化完全抗體產生F(ab')₂，其為Fab’的二聚體，是二價的抗體片段。F(ab')₂可以在中性條件下藉由破壞鉸鏈區中的二硫鍵而被還原，因此將F(ab')₂二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體基本上是具有鉸鏈區的Fab片段(其它抗體片段的更詳細的描述請參見：基礎免疫學(Fundamental Immunology),W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1993))。該Fv片段由抗體單臂的VL和VH結構域組成。另外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由獨立的基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們藉由能夠使這兩個結構域作為單條蛋白鏈產生的合成性連接肽連接，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區配對以形成單鏈Fv。可以藉由化學方法、重組DNA方法或蛋白酶消化法獲得該抗體片段。

術語“單結構域抗體”(sdAb)或“單可變結構域(SVD)抗體”通常指這樣的抗體，其中單個可變結構域(例如，重鏈可變結構域(VH)或輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、衍生自魚類IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR))即可賦予抗原結合。即，該單個可變結構域不需要與另一可變結構域相互作用以識別靶抗原。單結構域抗體的實例包括源自駱駝科(美洲駝和駱駝)和軟骨魚(例如護士鯊)的單結構域抗體(WO 2005/035572)。

術語“駱駝化的人VH結構域”是指將衍生自駱駝科VHH的關鍵元件轉移到人VH結構域上導致人VH結構域不再需要與VL結構域配對來識別靶抗原，經駱駝化的人VH結構域單獨即可賦予抗原結合特異性。

如本文所用的術語“結合位點”或“抗原結合位點”表示抗體分子中與抗原實際結合的區域，包括由抗體輕鏈可變結構域(VL)和抗體重鏈可變結構域(VH)組成的VH/VL對、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域(v-NAR)、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。在本發明的實施方案中，本發明的三鏈抗體包含至少三個抗原結合位點，例如，包含第一個抗原結合位點(也稱為“第一抗原結合位點”)、第二個抗原結合位點(也稱為“第二抗原結合位點”)、第三個抗原結合位點(也稱為“第三抗原結合位點”)。

術語“單結構域抗原結合位點”表示抗體分子的以單個可變結構域(例如，重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的v-NAR、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域、和它們的經重組的單結構域)與抗原實際結合的區域。在本發明的一個實施方案中，本發明的三鏈抗體包含兩個單結構域抗原結合位點，分別稱為“單結構域第二抗原結合位點”和“單結構域第三抗原結合位點”。

如本文所用，術語“單特異性”抗體指具有一個或多個結合位點的抗體，該位點的每一個與相同抗原的相同表位結合。

如本文所用，術語“多特異性”抗體指具有至少兩個抗原結合位點的抗體，該至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。本文提供的抗體通常是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同抗原表位具有結合特異性的抗體。在一個實施方案中，本文提供了這樣的雙特異性抗體，其具有針對第一抗原和第二抗原的結合特異性。

術語“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗體的結構的蛋白質。例如，IgG類免疫球蛋白是由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。從N端至C端，每條免疫球蛋白重鏈具有一個重鏈可變區(VH)，也稱作重鏈可變結構域，隨後是三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N端至C端，每條免疫球蛋白輕鏈具有一個輕鏈可變區(VL)，也稱作輕鏈可變結構域，隨後是一個輕鏈恆定結構域(CL)。免疫球蛋白的重鏈可以歸屬5個類別之一，稱作α(IgA)、δ(IgD)、 ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些類別可以進一步劃分成亞類，例如γ₁(IgG1)、γ₂(IgG2)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。免疫球蛋白的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列而劃分成兩種類型之一，稱作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和一個Fc結構域組成。

術語“Fc結構域”或“Fc區”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的含有至少一部分恆定區的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然的免疫球蛋白“Fc結構域”包含兩個或三個恆定結構域，即CH2結構域、CH3結構域和可選的CH4結構域。例如，在天然抗體中，免疫球蛋白Fc結構域包含源自IgG、IgA和IgD類抗體的兩條重鏈的第二和第三恆定結構域(CH2結構域和CH3結構域)；或者包含源自IgM和IgE類抗體的兩條重鏈的第二、第三和第四恆定結構域(CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域)。除非本文中另外說明，否則Fc區或重鏈恆定區中的胺基酸殘基編號根據如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU編號體系(也稱作EU索引)進行編號。

術語“效應子功能”指隨免疫球蛋白同種型變動的歸因於免疫球蛋白Fc區的那些生物學活性。免疫球蛋白效應子功能的例子包括：C1q結合和補體依賴的細胞毒性(CDC)、Fc受體結合作用、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞攝取抗原、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)和B細胞活化。

術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恆定區或其部分改變、替換或交換，從而抗原結合位點與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恆定區或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以藉由將其恆定區更換為來自人免疫球蛋白的恆定區進行修飾。由於更換為人類恆定區，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的抗原性。

“人源化抗體”是一種保留非人類抗體(例如小鼠單株抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥對人施用時免疫原性較低的抗體。這可以例如藉由保留非人類抗原結合位點並且抗體的剩餘部分替換成它們的人類相應部分(即，恆定區以及可變區中不參與結合的部分為人類抗體的相應部分)來實現。參見，例如Padlan,Anatomy of the antibody molecule，Mol.Immun.,1994，31：169-217。人類抗體工程化技術的其他例子包括但不限於US 5,766,886中公開的Xoma技術。

術語“...價”抗體指抗體分子中存在的抗原結合位點的數目。“二價”、“三價”和“四價”抗體指抗體分子中分別存在2個抗原結合位點、3個結合位點和4個結合位點。在一個實施方案中，本文中報道的雙特異性抗體是“三價的”。

術語“柔性連接肽”或“連接肽”是指由胺基酸組成的連接肽，例如單獨或組合使用的甘胺酸和/或絲胺酸殘基，以連接抗體中的各個可變結構域。在一個實施方案中，柔性連接肽是Gly/Ser連接肽，包括胺基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等於或大於1的正整數，例如，n是1-7中的正整數。在一個實施方案中，該柔性連接肽是(Gly₄Ser)4(SEQ ID NO：20)。還包括在本發明範圍內的是WO2012/138475中描述的連接肽，其藉由引用併入本文。

如本文所用，術語“結合”或“特異性結合”意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法測定。

“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由解離常數(K_D)代表，解離常數是解離速率常數和締合速率常數(分別是k_dis和k_on)的比例。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。用於測量親和力的一個具體方法是本文中的ForteBio動力學結合測定法。

術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。技術人員將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。在本文的一些實施方案中，第一抗原、第二抗原、第三抗原是三種不同的抗原。

術語“腫瘤相關抗原”或“癌症抗原”可互換地指與正常細胞相比，較佳在癌細胞表面完全或作為片段(例如，MHC/肽)表達的分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質)，並且該分子可用在藥劑對癌細胞的優先靶向中。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原是與正常細胞相比在腫瘤細胞中過表達的細胞表面分子，例如與正常細胞相比1倍過量表達、2倍過量表達、3倍過量表達或更多倍過量表達。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原是在腫瘤細胞中不適當地合成的細胞表面分子，例如與正常細胞上表達的分子相比含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原僅在腫瘤細胞的細胞表面完整表達或作為片段表達，並且不在正常細胞的表面上合成或表達。現有技術中公開了諸多腫瘤相關抗原，例如，表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)、腫瘤相關的糖蛋白72(TAG72)、癌胚抗原(CEA)、上皮細胞黏附分子(EPCAM)、白介素11受體α(IL-11Ra)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、表皮生長因子受體(EGFR)、神經細胞黏附分子(NCAM)、類胰島素生長因子1受體(IGF-I受體)、黑素瘤相關抗原1(MAGE-A1)、CD72、CD47等。

術語“免疫檢查點”意指免疫系統中存在的一類抑制性信號分子，藉由調節外周組織中免疫反應的持續性和強度避免組織損傷，並參與維持對於自身抗原的耐受(Pardoll DM.,The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.Nat Rev Cancer,2012,12(4)：252-264)。研究發現，腫瘤細胞能夠逃避體內免疫系統而失控增殖的原因之一是利用了免疫檢查點的抑制性信號通路，由此抑制T淋巴細胞活性，使得T淋巴細胞不能有效發揮對腫瘤的殺傷效應(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)：130-146)。免疫檢查點分子包括但不限於程序性死亡1(PD-1)、PD-L1、PD-L2、細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)和LAG-3，它們直接抑制免疫細胞。免疫檢查點分子，例如，PD-L1和LAG-3，可以調節(例如，協同地調節)T細胞功能以促進腫瘤免疫逃避。

術語“共刺激分子”是指T細胞上的與共刺激配體特異性結合從而介導T細胞的共刺激反應(例如但不限於增殖)的相應結合配偶體。共刺激分子是除抗原受體或其配體之外的有助於有效免疫應答的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK細胞受體、OX40、CD40、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些實施方案中，“共刺激分子”是4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。

術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子、白介素(IL)，諸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素。如本文中使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物，包括藉由人工合成產生的小分子實體，及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。

“免疫綴合物”是與一個或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)綴合的抗體。

如本文所用，術語“細胞毒性劑”指抑制或阻止細胞功能和/或造成細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化療藥或藥物(例如，甲胺蝶呤、阿黴素、長春鹼類生物鹼(長春新鹼、長春鹼、依託泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如細菌源、真菌源、植物源或動物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；和下文公開的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

胺基酸序列的“同一性百分數(%)”是指將候選序列與本說明書中所示的具體胺基酸序列進行比對並且如有必要的話為達到最大序列同一性百分數而引入空位後，並且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分時，候選序列中與本說明書中所示的具體胺基酸序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分數。

對於多肽序列，“保守性修飾”包括對多肽序列的置換、缺失或添加，它們導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。這類保守性修飾的變體相對於本發明的多態性變體、物種間同源物和等位基因而言是附加的並且不排斥它們。以下8組含有互為保守替換的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)***酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參閱例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些實施方案中，術語“保守序列修飾”用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。

術語“N端”指N端的最末胺基酸，術語“C端”指C端的最末胺基酸。

術語“宿主細胞”指已經向其中引入外源多核苷酸的細胞，包括這類細胞的子代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，這包括原代轉化的細胞和從其衍生的子代。宿主細胞是可以用來產生本發明三鏈抗體的任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，也包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物組織或動物組織內部的細胞。

術語“表達載體”是指包含重組多核苷酸的載體，其包含有效連接要表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包含足夠的用於表達的順式作用元件；用於表達的其它元件可以由宿主細胞提供或在體外表達系統中。表達載體包括本領域已知的所有那些，包括被摻入重組多核苷酸的黏粒、質粒(例如，裸的或包含在脂質體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。

術語“個體”或“受試者”可互換地使用，是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如，奶牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類如猴)、兔和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。特別地，個體是人。

術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。在一些實施方案中，本發明的三鏈抗體用來延緩疾病發展或用來減慢疾病的進展。

術語“抗腫瘤作用”指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。術語“腫瘤”和“癌症”在本文中互換地使用，涵蓋實體瘤和液體腫瘤。

術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。癌症的例子包括但不限於癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體例子包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，***癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，黑素瘤，淺表擴散性黑素瘤，惡性雀斑樣痣黑素瘤，肢端黑素瘤，結節性黑素瘤，多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，毛細胞性白血病，慢性成髓細胞性白血病，和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)，以及與瘢痣病(phakomatoses)，水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖，腦瘤和腦癌，以及頭頸癌，及相關轉移。在某些實施方案中，適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括肺癌(例如非小細胞肺癌)、肝癌、胃癌或結腸癌，包括那些癌症的轉移性形式。

術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”、“癌性”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。

術語“感染性疾病”是指病原體引發的疾病，包括例如病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染或真菌感染。

II. 本發明的三鏈抗體

本發明提供了一種新型的三鏈抗體，其能夠用於多種疾病的免疫治療、預防和/或診斷。本發明的三鏈抗體至少包含3個抗原結合位點，其能夠作為單特異性抗體或多特異性(例如雙特異性)抗體發揮作用，較佳地，其能夠作為多特異性(例如雙特異性)抗體發揮作用。

在產生具有多條多肽鏈的單特異性或多特異性(例如雙特異性)抗體時，通常會發生不希望的鏈間錯配、抗體親和力降低、穩定性降低等問題。本申請構建的三鏈抗體能夠避免這些常見問題。

本申請所構建的三鏈抗體平臺是包含三條多肽鏈的三鏈抗體，其中第一多肽鏈包含第一重鏈可變結構域，第二多肽鏈包含第一輕鏈可變結構域，該第一重鏈可變結構域與第一輕鏈可變結構域配對(VH1/VL1對)形成第一抗原結合位點；且第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第三多肽鏈中的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間不具有連接肽。

在另一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第三多肽鏈中的單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間具有連接肽。不特別地限制該連接肽的類型。在實施方案中，該連接肽是具有1至100個、特別地1至50 個、更特別地1至20個胺基酸長度的胺基酸序列的肽。在一些實施方案中，該肽連接肽是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸並且x=1至4中的任一整數，n=1至7中的任一整數，以及m=0至3中的任一整數。在一個具體實施方案中，該連接肽是(G₄S)₄(SEQ ID：NO：20)。

本發明三鏈抗體的第三多肽鏈中的單結構域抗原結合位點是能夠以較高親和力特異性結合靶抗原表位的單個可變結構域，例如，重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的v-NAR、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域、和它們的經重組的單結構域。在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第三多肽鏈中的兩個單結構域抗原結合位點是衍生自駱駝科重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和/或人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。

現有技術中已經對從駱駝科物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)獲得的抗體蛋白的大小、結構和針對人類受試者的抗原性進行了表徵。在自然界中來自駱駝科哺乳動物家族的某些IgG抗體缺少輕鏈，並且因此在結構上區別於來自其他動物的具有兩條重鏈和兩條輕鏈的常見四鏈抗體結構。參見PCT/EP 93/02214(1994年3月3日公佈的WO 94/04678)。

可以藉由基因工程方法獲得駱駝科重鏈抗體的對靶抗原具有高親和力的重鏈可變結構域(該區域也稱為VHH)。參見1998年6月2日授予的美國專利號5,759,808。與其他非人源抗體片段一樣，駱駝科VHH的胺基酸序列可以重組地改變以獲得更逼真模仿人序列的序列，即，“人源化”，由此降低駱駝科VHH對人類的抗原性。另外，也可以將衍生自駱駝科VHH的關鍵元件轉移到人VH結構域上，獲得駱駝化的人VH結構域。在本發明的一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第三多肽鏈中的單結構域抗原結合位點是人源化VHH，其具有SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。

VHH的分子量是人IgG分子的分子量的十分之一，並且具有僅數奈米的物理直徑。VHH本身具有極高的熱穩定性、對極端pH和蛋白酶解消化穩定和抗原性低，因此，該結構對本發明三鏈抗體的穩定性、對人受試者的低抗原性做出了貢獻。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第一多肽鏈包含第一重鏈可變結構域和免疫球蛋白CH1結構域，第二多肽鏈包含第一輕鏈可變結構域和免疫球蛋白CL結構域；且第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點。不特別地限制CH1結構域、CL結構域所來源的免疫球蛋白的類、亞類、型和亞型。較佳地，該CH1結構域、CL結構域均來自人免疫球蛋白的相應部分或具有與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體還包含具有延長體內半衰期的組分。許多因素可能影響蛋白質的體內半衰期。例如，腎過濾、肝臟中代謝、遭蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性反應(例如，抗體的蛋白質中和作用和被巨噬細胞和樹狀細胞攝取)。多種策略可用於延長本發明三鏈抗體的半衰期。例如，藉由化學連接聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)化、羥乙基澱粉(HES)化、偶聯白蛋白、免疫球蛋白Fc等。

為了使抗體聚乙二醇化，一般使該三鏈抗體與聚乙二醇(PEG)如PEG的活性酯或醛衍生物在其中一個或多個PEG基團變得與該三鏈抗體連接的條件下反應。可以藉由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶聚合物)的醯化反應或烷基化反應實施PEG化。如本文所用，術語“聚乙二醇”包括已經用來衍生化其他蛋白質的任何形式的PEG，如單(C₁-C₁₀)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施方案中，待聚乙二醇化的抗體是無糖基化的抗體。使用導致抗體生物學活性喪失最少的直鏈或分枝PEG衍生化。可以藉由SDS-PAGE和質譜法密切監測綴合程度以確保PEG分子與抗體正確綴合。未反應的PEG可以藉由大小排阻層析或藉由離子交換層析與抗體-PEG綴合物分離。可使用本領域技術人員熟知的方法，測試PEG衍生的抗體的結合活性。聚乙二醇化蛋白質的方法為本領域已知，並可應用於本發明的抗體。見例如，Nishimura等人的EP 0 154 316。

聚唾液酸化是使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)來延長治療性肽和蛋白質的有效壽命並改善其穩定性的另一項技術。PSA是唾液酸(一種糖)的聚合物。當用於蛋白質和治療肽藥物遞送時，聚唾液酸對綴合物提供保護性微環境。這增加治療性蛋白在循環中的有效壽命並防止它被免疫系統識別。

抗體的羥乙基澱粉(“HES”)化也能延長抗體的循環半衰期，導致增加的生物學活性。藉由變動不同參數，如HES的分子量，可以製備廣泛類型的HES免疫綴合物。

也可以向本發明的三鏈抗體引入IgG恆定結構域或免疫球蛋白Fc結構域，產生具有增加的體內半壽期的抗體。參見，例如，國際公開號WO98/23289；國際公開號WO97/34631；和美國專利號6 277 375。

進一步，本發明的三鏈抗體可以與白蛋白(例如，人血清白蛋白；HSA)綴合以使抗體在體內更穩定或具有較長的體內半衰期。這些技術是本領域熟知的，參見，例如，國際公開號WO 01/77137；和歐洲專利號EP 413,622。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體包含Fc區，以延長本發明抗體的體內半衰期。

又在一個具體實施方案中，在本發明三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，第一多肽鏈和第三多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，這也促成了本發明的三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗體使用了“結入扣” 技術(參見例如John B.B.Ridgway等人，‘Knobs-into-holes’engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Engineering,1996.9(7)：p.617-21；Shane Atwell等人，Stable heterodimers form remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library.J.Mol.Biol,1997.270：p.26-35)，該技術可在本發明三鏈抗體的不同鏈之間改造界面，以促進本發明三鏈抗體的各條鏈正確締合。通常，該技術涉及在一條鏈的界面引入“凸起”，在欲與之配對的另一條鏈的界面引入相應的“空穴”，使得凸起可置於空穴中。第一個較佳的界面包含一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域和欲與之配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域。可藉由將來自一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面的小胺基酸側鏈替換為較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)來構建凸起。藉由將大胺基酸側鏈替換為較小的側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)，在欲配對的另一條鏈的重鏈恆定結構域的CH3結構域的界面構建與凸起相同或相似大小的補償性空穴。第二個較佳的界面包含輕鏈的CL結構域和重鏈的CH1結構域，在此處可按如上所述構建凸起-空穴相互作用。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的Fc區包含對Fc受體的結合親和力的修飾。在一個實施方案中，該Fc受體是Fcγ受體，特別地是人Fcγ受體。在一個實施方案中，該Fc受體是活化性Fc受體。在一個實施方案中，該修飾減少本發明三鏈抗體的的效應子功能。在一個具體實施方案中，該效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，該修飾在該免疫球蛋白分子Fc區內，特別地在其CH2區內。在一個實施方案中，該免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重鏈第329位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是P329G。在一個實施方案中，本發明三鏈抗體包含在免疫球蛋白重鏈第234和235位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是L234A和L235A(LALA突變)(Armour KL等人，Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities.Eur J Immunol,1999.29(8)：2613-24)。在一個實施方案中，本發明三鏈抗體包含在免疫球蛋白重鏈第234、235和329位置處(EU編號)的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該免疫球蛋白分子包含免疫球蛋白重鏈中的胺基酸置換L234A、L235A和P329G(EU編號)。

如第1A圖中的示意圖所示，本發明的示例性三鏈抗體是三價三鏈抗體，其中第一多肽鏈中的第一重鏈可變結構域和第二多肽鏈中的第一輕鏈可變結構域配對形成第一抗原結合位點；第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點，且在該單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間具有連接肽。

如第1B圖中的示意圖所示，本發明的示例性三鏈抗體是三價三鏈抗體，其中第一多肽鏈中的第一重鏈可變結構域和第二多肽鏈中的第一輕鏈可變結構域配對形成第一抗原結合位點；第三多肽鏈包含單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點，且在該單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點之間不具有連接肽。

i)在一個實施方案中，三鏈抗體是抗CD47/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體。

PD-L1(也稱作分化抗原簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1))，是40kDa I型跨膜蛋白。PD-L1與活化的T細胞上存在的其受體PD-1結合，下調T細胞活化(Latchman等人，2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32：634-43)。已經在許多癌中發現了PD-L1表達，包括人肺癌、卵巢癌、結腸癌和多種骨髓瘤等，並且PD-L1表達經常與癌的預後不良相關(Iwai等人(2002)PNAS 99：12293-7；Ohigashi等人(2005)Clin Cancer Res 11：2947-53；Okazaki等人(2007)Intern.Immun.19：813-24；Thompson等人(2006)Cancer Res.66：3381-5)。已經提出藉由抑制PD1與PD-L1的局部相互作用可以在一部分腫瘤患者中逆轉免疫抑制。

羅氏(Roche)研發的抗PD-L1抗體Atezolizumab、德國默克(Merck KGaA)和美國輝瑞(Pfizer)合作開發的抗PD-L1抗體Avelumab、阿斯利康研發的Durvalumab顯示了對部分腫瘤患者的治療效果。其它抗PD-L1抗體包括 YW243.55.S70(重鏈和輕鏈可變區顯示在WO2010/077634中的SEQ ID NOs 20和21中)和WO2007/005874中公開的抗PD-L1抗體等。

CD47首先被鑒定為整聯蛋白相關蛋白(integrin-associated protein，IAP)(Brown E.J.等人，Integrin-associated protein(CD47)and its ligands,Trends Cell Biol.,2001,11(3)：130-135)，是一種表達在細胞表面的腫瘤相關抗原。CD47與主要由巨噬細胞和樹突細胞表達的一種作為其配體的細胞表面免疫球蛋白SIRPα相互作用，產生一系列的級聯反應，並由此抑制巨噬細胞和樹突細胞對表達CD47的細胞的攝取和吞噬作用。

在正常組織中普遍存在CD47表達，例如，CD47表達在有活力的紅細胞表面。CD47的一部分功能是保護有活力的紅細胞免受吞噬作用(Oldenborg P.A.等人，Role of CD47 as a marker of self on red blood cells,Science,2000,288(5473)：2051-2054)。此外，在腫瘤中已經觀察到CD47的過度表達。表達的CD47藉由與巨噬細胞表面的SIRPα結合，釋放“不要吃我”的信號，由此抑制腫瘤組織浸潤區的巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。隨後，由於腫瘤細胞被抗原呈遞細胞(APC)的攝取減少，間接導致了T細胞活化下降；此外，幼稚T細胞上的CD47激活促進免疫抑制性的調節T細胞Tregs的形成和抑制Th1效應細胞的形成(AviceM.N.等人，CD47 ligation selectively inhibits the development of human naive T cells into Th1 effectors,J. Immunol.,2000年10月，165(8)：4624-4631)。

目前已經有報道了多個抗CD47抗體，例如美國專利US2015/0183874 A1報道了衍生自B6H12的人IgG1型嵌合單株抗體和藉由CDR移植產生的人源化B6H12抗體。中國專利申請號CN201710759828.9報導了一種可以特異性結合CD47的單株抗體“ADI-29341”。

本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體至少同時靶向CD47和PD-L1的抗體，且三個抗原結合位點分別結合CD47和/或PD-L1分子。如上所述，雖然CD47在癌細胞上過度表達，但是CD47在許多正常組織中的表達導致僅以CD47為靶點的抗體通常與正常血液系統細胞的非特異性結合，引起了抗原沉默(antigen sink)現象。本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體同時靶向CD47和腫瘤細胞上的PD-L1，藉由與腫瘤細胞上PD-L1的特異性結合促進了本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體對腫瘤細胞的選擇性結合，避免了與許多正常組織中表達的CD47結合，由此本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體在增強吞噬作用的同時減少了副作用。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1或CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1或CD47的單結構域第二抗原結合位點和特異性結合PD-L1或CD47的單結構域第三抗原結合位點。在一個實施方案中，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH。在另一個實施方案中，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合CD47的第一VHH和第二VHH。

對於該特異性結合PD-L1或CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，“VH1/VL1對”包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-L1抗體(例如，上文中例舉的抗PD-L1抗體)和將來研發出的抗PD-L1抗體VH1/VL1對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗CD47抗體(例如，上文中例舉的抗CD47抗體)和將來研發出的抗CD47抗體VH1/VL1對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

對於該特異性結合PD-L1或CD47的單結構域抗原結合位點，其包含特異性結合PD-L1或CD47的重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、來自駱駝科血清的天然不含輕鏈的僅由兩條重鏈組成的駱駝抗體中的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點，其中該特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點結合PD-L1上的相同表位或者不同表位。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的GSIEHYYWS(SEQ ID NO：3)所示的VH CDR1、YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)所示的VH CDR2、ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)所示的VH CDR3、RASQGISRWLA(SEQ ID NO：10)所示的VL CDR1、AASSLQS(SEQ ID NO：11)所示的VL CDR2和QQTVSFPIT(SEQ ID NO：12)所示的VL CDR3，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體ADI-29341的SEQ ID NO：2/9的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

不特別地限制本發明三鏈抗體中第一多肽鏈和第三多肽鏈中免疫球蛋白的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體包含用於IgG1(例如，人IgG1)的重鏈恆定區。例如，在三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，第一多肽鏈和第三多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗體的第一多肽鏈和/或第三多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是LALA突變。

在又一個實施方案中，本發明三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈包含κ輕鏈恆定區或者λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區或者人λ輕鏈恆定區。在一個實施方案中，輕鏈恆定區包含在SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈各自的Fc結構域中分別包含“結入扣”的穩定締合。在一個實施方案中，在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈的免疫球蛋白CH1 結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的該凸起或空穴可分別置於CL結構域中的該空穴或凸起中，從而該第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。

本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體能夠同時與PD-L1和CD47蛋白結合，且維持了親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷SIRPα/CD47信號傳導通路和阻斷PD1/PD-L1信號傳導通路。

在一些實施方案中，與SIRPα/CD47信號傳導通路和PD1/PD-L1信號傳導通路相關的病症是各種血液病和實體瘤，包括但不限於急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病，急性淋巴細胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤 (NHL)，多發性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌、食管癌、腸癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、胰腺癌、膀胱癌、神經膠質瘤、黑素瘤和其他實體瘤。另外，藉由阻斷SIRPα/CD47信號傳導通路能夠增進NOD小鼠系中的人幹細胞植入(WO 2009/046541)，因此，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體還具有用於人幹細胞移植中的潛在益處。

中國專利號ZL201080064426.3公開了阻斷SIRPα/CD47信號傳導通路的四價CD47-抗體恆定區融合蛋白能夠治療、預防或診斷由SIRPα+細胞介導的自身免疫病和炎性病症，例如，過敏性哮喘或潰瘍性結腸炎。這些病症包括急性和慢性炎性病症、變態反應和過敏性疾病、自身免疫病、局部缺血性病症、嚴重感染、和細胞或組織或器官移植物排斥，包括非人組織移植物(異種移植物)，因此，本發明的三鏈抗CD47/PD-L1雙特異性抗體預期在這些疾病的治療、預防或診斷也能夠發揮作用。

ii)在一個實施方案中，三鏈抗體是抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體。

PD-L1是一種免疫檢查點抑制分子。腫瘤細胞上表達的PD-L1藉由與T淋巴細胞上的PD-1結合而活化PD-1/PD-L1信號傳導途徑，由此抑制T淋巴細胞活性，使得T淋巴細胞不能有效發揮對腫瘤的殺傷效應，這是腫瘤細胞能夠逃避體內免疫系統而失控增殖的原因之一(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)：130-146)。

4-1BB(也稱為CD137，TNFRSF9)是活化誘導的表達在活化的T細胞和自然殺傷(NK)細胞上的共刺激受體，是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一。4-1BB具有如GenBank登錄號AAA62478.2提供的胺基酸序列，或來自非人類物種例如小鼠、齧齒類動物、猴子、猿等的等同胺基酸序列。在T細胞上4-1BB連接(4-1BB ligation)觸發信號級聯，其導致抗凋亡分子的上調、細胞因子分泌和增強的效應子功能。在具有降低的細胞毒性能力的功能失調的T細胞中，4-1BB連接顯示恢復效應子功能的有效能力(Li SY,Liu Y.Immunotherapy of melanoma with the immune costimulatory monoclonal antibodies targeting CD137.Clin Pharmacol,2013,5(Suppl 1)：47-53)。在NK細胞上，4-1BB信號傳導可以增加抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。

已開發了針對4-1BB的激動性單株抗體，以利用4-1BB信號傳導用於癌症免疫療法(Ye Q,Song DG,Poussin M,Yamamoto T,Best A,Li C等人，CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor.Clin Cancer Res,2014,20(1)：44-55)。多種誘導的腫瘤模型和自發腫瘤模型的臨床前結果表明，用激動性抗體靶向4-1BB可導致腫瘤清除和持久的抗腫瘤免疫性。WO2004010947A2公開了結合人4-1BB並允許人4-1BB結合至人4-1BB配體的人源化抗 4-1BB單株抗體。

WO2016/061142中一般性地提及了將抗PD-L1抗體分子與4-1BB受體靶向劑(例如，刺激經4-1BB(CD-137)的信號傳導的抗體，例如，PF-2566)一起施用。

由於在腫瘤免疫中，靶向多個靶點的治療方案能夠相互協同，對於防止腫瘤的免疫逃逸是有利的，目前靶向腫瘤免疫中的不同靶點的抗體的共施用也進入了臨床試驗中。但是，共施用需要注射兩個獨立的抗體產品或需要單次注射兩種不同抗體的聯合制劑。儘管兩次注射允許給藥量和時程的靈活性，但是它造成了患者不便依從和疼痛。另外，儘管聯合製劑可能提供在給藥量方面的某種靈活性，但通常難以找到在溶液中允許兩種抗體的化學和物理穩定性的配製條件，原因在於兩種抗體的分子特徵不同。何況共施用和聯合製劑兩種不同抗體的療法可能增加患者和/或付款人的額外花費，因此，需要治療腫瘤的備選免疫療法，並且較佳地這類備選免疫療法涉及雙特異性抗體。

本發明的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體是至少同時靶向4-1BB和PD-L1的抗體，且三個抗原結合位點分別結合4-1BB和/或PD-L1分子，能夠藉由阻斷PD-1/PD-L1信號傳導途徑且活化T細胞和自然殺手(NK)細胞中的4-1BB/4-1BB配體信號傳導途徑。在一個實施方案中，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1或4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1或4-1BB的單結構域第二抗原結合位點和特異性結合PD-L1或4-1BB的單結構域第三抗原結合位點。在一個實施方案中，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH。在另一個實施方案中，該三鏈抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合4-1BB的第一VHH和第二VHH。

對於該特異性結合PD-L1或4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，“VH1/VL1對”包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-L1抗體(例如，上文中例舉的抗PD-L1抗體)和將來研發出的抗PD-L1抗體VH1/VL1對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗4-1BB抗體(例如，上文中例舉的抗4-1BB抗體)和將來研發出的抗4-1BB抗體VH1/VL1對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

對於該特異性結合PD-L1或4-1BB的單結構域抗原結合位點，其包含特異性結合PD-L1或4-1BB的重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、來自駱駝科血清的天然不含輕鏈的僅由兩條重鏈組成的駱駝抗體中的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點，其中該特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點結合PD-L1上的相同表位或者不同表位。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗4-1BB抗體BMS-663513的SEQ ID NO：26/28的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部6個重鏈互補決定區(CDR)與輕鏈CDR，或者與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合4-1BB的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗4-1BB抗體BMS-663513的SEQ ID NO：26/28的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

不特別地限制本發明三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體中第一多肽鏈和第三多肽鏈中免疫球蛋白的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體包含用於IgG1(例如，人IgG1)的重鏈恆定區。例如，在三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，第一多肽鏈和第三多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和/或第三多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是LALA突變。

在又一個實施方案中，本發明三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈包含κ輕鏈恆定區或者λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區或者人λ輕鏈恆定區。在一個實施方案中，輕鏈恆定區包含在SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈各自的Fc結構域中分別包含“結入扣”的穩定締合。在一個實施方案中，在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈的免疫球蛋白CH1 結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的該凸起或空穴可分別置於CL結構域中的該空穴或凸起中，從而該第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。

本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體能夠同時與PD-L1和4-1BB蛋白結合，且維持了親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷PD-1/PD-L1信號傳導途徑且活化T細胞和自然殺傷(NK)細胞中的4-1BB/4-1BB配體信號傳導途徑。本發明的三鏈抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體能夠用於與該信號傳導途徑相關的疾病的治療、預防或診斷。

iii)在一個實施方案中，三鏈抗體是抗LAG-3/PD-L1 雙特異性抗體或多特異性抗體。

本實施方案涉及阻斷PD-1/PD-L1信號傳導途徑和作用於LAG-3信號傳導途徑的一種抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體。

LAG-3(淋巴細胞活化基因-3，也稱為CD223)是在活化的T細胞和B細胞上表達的細胞表面分子，是具有免疫抑制活性的細胞消耗標誌物，已經顯示該細胞表面分子在CD8+ T細胞消耗中發揮作用。

II類組織相容性複合體(MHC-II)是LAG-3的配體，也已經確定了LAG-3的其他配體(例如L-選擇素和半乳凝素-3)(Anderson A.C.等人，Lag-3,tim-3,and TIGIT：Co-inhibitory receptors with specialized functions in immune regulation,Immunity,2016,44(5)：989-1004；Kouo T.等人，Galectin-3 shapes antitumor immune responses by suppressing CD8⁺ T cells via LAG-3 and inhibiting expansion of plasmacytoid dendritic cells，Cancer Immunol Res.2015 April；3(4)：412-423)。

在癌症中，表達LAG-3的調節性T細胞(Regulatory T cells，Tregs)具有增強的抑制抗腫瘤活性，而表達LAG-3的細胞毒CD8+ T細胞具有降低的增殖速率和效應細胞因子產生(Scurr M.等人，Highly prevalent colorectal cancer-infiltrating LAP⁺ Foxp3^- T cells exhibit more potent immunosuppressive activity than Foxp3⁺ regulatory T cells,Mucosal Immunol.2014,7(2)：428-439)。由金屬蛋白酶切割並分泌在細胞微環境中的LAG-3的剪接變體與抗原呈遞細胞上的MHC-II結合時具有免疫激活作用(Casati C.等人，Soluble human LAG-3 molecule amplifies the in vitro generation of type 1 tumor-specific immunity,Clinical Cancer Research.American Association for Cancer Research；2006,66(8)：4450-4460)。

在黑素瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、造血癌、頭頸癌患者中已經報導了LAG-3+腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)(Demeure C.E.等人，T Lymphocytes infiltrating various tumour types express the MHC class II ligand lymphocyte activation gene-3(LAG-3)：role of LAG-3/MHC class II interactions in cell-cell contacts,Eur.J.Cancer,2001,37(13)：1709-1718)。在多種癌症小鼠模型中基於抗體的LAG-3阻斷恢復了CD8+效應T細胞並減少了Treg群體。

本發明人已開發了一種抑制LAG-3信號傳導通路的單株抗體，為抗LAG-3抗體ADI-31853，具有SEQ ID NO：30/35的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列。

本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體或多特異性抗體至少同時靶向LAG-3和PD-L1的抗體，且三個抗原結合位點分別結合LAG-3和/或PD-L1分子。在一個實施方案中，該三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1或LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1或LAG-3的單結構域第二抗原結合位點和特異性結合PD-L1或LAG-3的單結構域第三抗原結合位點。在一個實施方案中，該三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH。在另一個實施方案中，該三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合PD-L1的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，以及第三多肽鏈上的特異性結合LAG-3的第一VHH和第二VHH。

對於該特異性結合PD-L1或LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，“VH1/VL1對”包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-L1抗體(例如，上文中例舉的抗PD-L1抗體)和將來研發出的抗PD-L1抗體VH1/VL1對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗LAG-3抗體(例如，上文中例舉的抗LAG-3抗體)和將來研發出的抗LAG-3抗體VH1/VL1對的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、或五個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

對於該特異性結合PD-L1或LAG-3的單結構域抗原結合位點，其包含特異性結合PD-L1或LAG-3的重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、來自駱駝科血清的天然不含輕鏈的僅由兩條重鏈組成的駱駝抗體中的重鏈可變結構域、來自鯊魚科動物的IgNAR的VH樣單結構域、駱駝化的人VH結構域、人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合LAG-3的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點以及第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點，其中該特異性結合PD-L1的單結構域第二和第三抗原結合位點結合PD-L1上的相同表位或者不同表位。

不特別地限制本發明三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體中第一多肽鏈和第三多肽鏈中免疫球蛋白的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含IgG4(例如，人IgG4)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含用於IgG1(例如，人IgG1)的重鏈恆定區。例如，在三鏈抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，第一多肽鏈和第三多肽鏈在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和/或第三多肽鏈在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是LALA突變。

在又一個實施方案中，本發明三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈包含κ輕鏈恆定區或者λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區或者人λ輕鏈恆定區。在一個實施方案中，輕鏈恆定區包含在SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第三多肽鏈各自的Fc結構域中分別包含“結入扣”的穩定締合。在一個實施方案中，在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在該第一多肽鏈和第三多肽鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進第一多肽鏈和第三多肽鏈的正確配對。

在一個實施方案中，本發明三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的第一多肽鏈和第二多肽鏈的免疫球蛋白CH1結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的該凸起或空穴可分別置於CL結構域中的該空穴或凸起中，從而該第一多肽鏈和第二多肽鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。

在一個實施方案中，本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體包含SEQ ID NO：29所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：34所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14所示的第三多肽鏈，或與任一該序列基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更高同一)的序列。

本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體能夠同時與PD-L1和LAG-3蛋白結合，且維持了親本抗體的親和力常數，由此，能夠藉由阻斷PD-1/PD-L1信號傳導途徑且阻斷LAG-3信號傳導途徑。本發明的三鏈抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體能夠用於與該信號傳導途徑相關的疾病的治療、預防或診斷。

III．本發明的三鏈抗體變體

在某些實施方案中，構思了本文例示的雙特異性抗體的胺基酸序列變體。例如，可能想要改善雙特異性抗體的結合親和力和/或其他生物學特性。可以藉由向編碼雙特異性抗體的核苷酸序列引入適宜修飾或藉由肽合成製備雙特異性抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如，從抗體的胺基酸序列內部缺失殘基和/或將殘基***該胺基酸序列中和/或置換該胺基酸序列中的殘基。可以產生缺失、***和置換的任意組合以獲得最終構建體，只要該最終構建體擁有想要的特徵，例如抗原結合作用。

表1中在“保守性置換”標題下顯示保守性置換。表1中在“示例性置換”標題下顯示並且參考胺基酸側鏈類別如下文進一步描述更明顯的變化。可以將胺基酸置換引入目的抗體中並且對產物篩選所需的活性，例如，保留/改善的抗原結合作用或降低的免疫原性。

胺基酸可以根據常見的側鏈特性分組：(1)疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；(2)中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln； (3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守性置換將使這些分類之一的成員交換為另一個分類的成員。

IV.免疫綴合物

本發明的三鏈抗體能夠重組融合於或化學綴合(包括共價和非共價綴合)至異源蛋白或多肽以產生融合蛋白。蛋白質、多肽或肽與抗體融合或綴合的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利號5,336,603、5,622,929和EP 367,166。

另外，本發明的三鏈抗體可以與標記序列(如肽)融合以促進純化。在較佳的實施方案中，標記胺基酸序列是六組胺酸肽，如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)等中提供的標簽，它們中的許多是可商業獲得的。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如，六組胺酸提供融合蛋白的便利純化。用於純化的其他肽標簽包括但不限於血凝素(“HA”)標簽，其對應於源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984,Cell 37：767)和“flag”標簽。

在其他實施方案中，本發明的三鏈抗體與診斷劑或可檢測劑綴合。這類抗體可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力)，用於監測或預測疾病或病症的發作、形成、進展和/或嚴重性。可以藉由將抗體與可檢測物質偶聯實現這類診斷和檢測，該可檢測物質包括但不限於多種酶，如但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，如但不限於鏈黴親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，如但不限於傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質，如但不限於魯米諾；生物發光物質，如但不限於螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；放射性物質，如但不限於碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I和¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、銦(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In和¹¹¹In)、鍀(⁹⁹Tc)、鉈(²⁰¹Ti)、鎵(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、鈀(¹⁰³Pd)、鉬(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、47Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷Tin；和用於各種正電子發射成像術中的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子。

本發明還包括與治療性部分綴合的三鏈抗體的用途。三鏈抗體可綴合到治療性部分，如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或細胞殺傷劑)，治療劑或放射性金屬離子，例如α發射體。術語“細胞毒素”或“細胞毒性劑”包括有害於細胞的任何物質。

另外，三鏈抗體可以與調節給定生物學反應的治療性部分或藥物部分綴合。治療性部分或藥物部分不得解釋為限於經典的化學治療藥。例如，藥物部分可以是擁有所需生物學活性的蛋白質、肽或多肽。這類蛋白質可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素、或白喉毒素；蛋白質如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活物、凋亡劑、抗血管生成劑或生物學反應調節物，例如淋巴因子。

另外，抗體可以綴合至治療性部分如放射性金屬離子，如α-發射體如²¹³Bi或可用於使放射金屬離子(包括但不限於¹³¹In、¹³¹LU、¹³¹Y、¹³¹Ho、¹³¹Sm)綴合至多肽的大環螯合劑。在某些實施方案中，大環螯合劑是1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N’,N”,N'''-四乙酸(DOTA)，其可藉由接頭分子附著到抗體上。這類接頭分子是本領域公知的並且在Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90中描述，該文獻每篇藉由引用的方式完整併入。

用於治療性部分與抗體綴合的技術是熟知的，參見，例如Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，引自Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編著)，第243-256頁(Alan R.Liss,Inc.1985)。

抗體也可以連接至固相支持物，該支持物特別可用於免疫測定法或靶抗原的純化。此類固相支持物包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

V．本發明的三鏈抗體的生產和純化

本發明的三鏈抗體可以例如藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組生產獲得。為了重組生產，將編碼該三鏈抗體的第一多肽鏈的多核苷酸、第二多肽鏈的多核苷酸和/或第三多肽鏈的多核苷酸分離並***一個或多個載體中以便進一步在宿主細胞中克隆和/或表達。使用常規方法，可以輕易地分離該多核苷酸並將其測序。在一個實施方案中，提供了包含本發明的一種或多種多核苷酸的載體，較佳地表達載體。

可以使用本領域技術人員熟知的方法來構建表達載體。表達載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。

一旦已經製備了用於表達的包含本發明的一種或多種多核苷酸的表達載體，則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的，例如，原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質體的轉染或其他常規技術。

在一個實施方案中，提供了包含一種或多種本發明多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，提供了包含本發明表達載體的宿主細胞。如本文所用，術語“宿主細胞”指可以工程化以產生本發明的三鏈抗體的任何種類的細胞系統。適於複製和支持本發明的三鏈抗體表達的宿主細胞是本領域熟知的。根據需要，這類細胞可以用特定表達載體轉染或轉導，並且可以培育大量含有載體的細胞用於接種大規模發酵器以獲得足夠量的本發明三鏈抗體用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物，如大腸桿菌，真核微生物如絲狀真菌或酵母，或各種真核細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞等。可以使用適於懸浮培養的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK 293或293F細胞)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、布法羅大鼠肝臟細胞(BRL 3A)、人肺細胞(W138)、人肝臟細胞(Hep G2)、CHO細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。適於產生蛋白質的哺乳動物宿主細胞系的綜述參見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268頁(2003)。在一個較佳的實施方案中，該宿主細胞是CHO、HEK293或NSO細胞。

本領域已知在這些宿主細胞系統中表達外源基因的標準技術。在一個實施方案中，提供了產生本發明的三鏈抗體的方法，其中該方法包括在適於表達該三鏈抗體的條件下培養如本文中提供的宿主細胞，該宿主細胞包含編碼該三鏈抗體的多核苷酸，並且從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該三鏈抗體。

如本文所述製備的三鏈抗體可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於如淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對本領域技術人員是顯而易見的。

可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的三鏈抗體的純度，該熟知分析方法包括大小排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。可以藉由本領域已知的多種測定法，鑒定、篩選或表徵本文提供的三鏈抗體的物理/化學特性和/或生物學活性。

VI. 醫藥組成物和試劑盒

在另一個方面，本發明提供了組成物，例如，醫藥組成物，該組成物包含與可藥用載體配製在一起的本文該的三鏈抗體。如本文所用，“可藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。本發明的醫藥組成物適於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、直腸、脊髓或表皮施用(例如，藉由注射或輸注)。

本文中還公開了本文該的三鏈抗體與一種以上治療劑組合後獲得的組合物，該治療劑選自以下類別(i)-(iii)中的一個、兩個或全部類別：(i)增強抗原呈遞(例如，腫瘤抗原呈遞)的藥物；(ii)增強效應細胞反應(例如，B細胞和/或T細胞活化和/或動員)的藥物；或(iii)減少免疫抑制的藥物。

本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、分散體劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。常見的較佳組成物處於可注射用溶液劑或可輸注溶液劑形式。較佳的施用模式是腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹腔(i.p.)、肌內)注射。在一個較佳實施方案中，藉由靜脈內輸注或注射施用三鏈抗體。在另一個較佳實施方案中，藉由肌內、腹腔或皮下注射施用三鏈抗體。

如本文所用的短語“腸胃外施用“和“腸胃外方式施用”意指除了腸施用和局部施用之外的施用模式，通常藉由注射施用，並且包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、皮內、腹腔、經氣管、皮下注射和輸注。

治療性組成物一般應當是無菌的並且在製造和儲存條件下穩定。可以將組成物配製為溶液、微乳液、分散體、脂質體或凍乾形式。可以藉由將活性化合物(即三鏈抗體)以要求的量加入適宜的溶劑中，隨後過濾消毒，製備無菌可注射溶液劑。通常，藉由將該活性化合物併入無菌溶媒中來製備分散體，該無菌溶媒含有基礎分散介質和其他成分。可以使用包衣劑如卵磷脂等。在分散體的情況下，可以藉由使用表面活性劑來維持溶液劑的適宜流動性。可以藉由在組成物中包含延遲吸收的物質例如單硬脂酸鹽和明膠而引起可注射組成物的延長吸收。

在某些實施方案中，可以口服施用本發明的三鏈抗體，例如隨惰性稀釋劑或可食用載體一起經口施用。本發明的三鏈抗體也可以封閉在硬殼或軟殼明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接摻入受試者的膳食中。對於口服治療施用，該化合物可以隨賦形劑一起摻入並且以可攝取的片劑、頰用片劑、錠劑(troche)、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑(wafer)等形式使用。為了藉由非腸胃外施用方法施用本發明的三鏈抗體，可能需要將該三鏈抗體與防止其失活的材料包衣或隨這種材料共施用。還可以用本領域已知的醫療裝置施用治療組合物。

本發明的醫藥組成物可以包含“治療有效量”或“預防有效量”的本發明所述三鏈抗體。“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量等變動治療有效量。治療有效量是任何有毒或有害作用不及治療有益作用的量。相對於未治療的受試者，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率)至少約20%、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約60%和仍更佳地至少約80%。可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價本發明的三鏈抗體抑制可度量參數(例如，腫瘤體積)的能力。

“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在受試者中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量小於治療有效量。

包含本文所述三鏈抗體的試劑盒也處於本發明的範圍內。試劑盒可以包含一個或多個其他要素，例如包括：使用說明書；其他試劑，例如標記物或用於偶聯的試劑；可藥用載體；和用於施用至受試者的裝置或其他材料。

VII. 三鏈抗體的用途

本文公開的三鏈抗體具有體外和體內診斷用途以及治療性和預防性用途。例如，可以將這些分子施用至體外或離體的培養細胞或施用至受試者，例如，人類受試者，以治療、預防和/或診斷多種抗原相關的疾病，例如癌症、自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)。

在一個方面，本發明提供了體外或體內檢測生物樣品，例如血清、***或尿或組織活檢樣品(例如，來自過度增生性或癌性病灶)中存在相關抗原的診斷方法。該診斷方法包括：(i)在允許相互作用發生的條件下使樣品(和任選地，對照樣品)與如本文所述的三鏈抗體接觸或向受試者施用該三鏈抗體和(ii)檢測該三鏈抗體和樣品(和任選地，對照樣品)之間複合物的形成。複合物的形成表示存在相關抗原，並且可以顯示本文所述治療和/或預防的適用性或需求。

在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測相關抗原。可以使用的檢測方法包括免疫組織化學、免疫細胞化學、FACS、ELISA測定、PCR技術(例如，RT-PCR)或體內成像技術。一般地，體內和體外檢測方法中所用的三鏈抗體直接或間接地用可檢測物質標記以促進檢測結合的或未結合的結合物。合適的可檢測物質包括多種生物學活性酶、輔基、螢光物質、發光物質、順磁(例如，核磁共振活性)物質和放射性物質。

在一些實施方案中，體內確定相關抗原的水平和/或分佈，例如，以非侵入方式確定(例如，藉由使用合適的成像技術(例如，正電子發射斷層攝影術(PET)掃描)檢測可檢測物標記的本發明三鏈抗體。在一個實施方案中，例如，藉由檢測用PET試劑(例如，¹⁸F-氟脫氧葡萄糖(FDG))以可檢測方式標記的本發明三鏈抗體，體內測定相關抗原的水平和/或分佈。

在一個實施方案中，本發明提供了包含本文所述三鏈抗體和使用說明書的診斷試劑盒。

在另一個方面，本發明涉及使用三鏈抗體體內用來治療或預防需要在受試者中調節免疫應答的疾病，從而抑制或減少相關疾病如癌性腫瘤、自身免疫病、急性和慢性炎性疾病、感染性疾病(例如，慢性傳染病或敗血症)的出現或復發。可以單獨使用本發明的三鏈抗體。備選地，三鏈抗體可以與其他癌症治療劑/預防劑組合施用。當本發明的三鏈抗體與一種或多種其他藥物組合施用時，這種組合可以按任何順序施用或者同時施用。

因此，在一個實施方案中，本發明提供一種調節受試者中免疫應答的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的三鏈抗體。在另一個實施方案中，本發明提供一種防止受試者中疾病出現或者復發的方法，該方法包括向受試者施用預防有效量的本文所述的三鏈抗體。

在一些實施方案中，用三鏈抗體治療和/或預防的癌包括但不限於實體瘤、血液學癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如，多發性骨髓瘤)及轉移性病灶。在一個實施方案中，癌是實體瘤。實體瘤的例子包括惡性腫瘤，例如，多個器官系統的肉瘤和癌，如侵襲肺、***、卵巢、淋巴樣、胃腸道的(例如，結腸)、肛門、生殖器和生殖泌尿道(例如，腎、膀胱上皮、膀胱細胞、***)、咽、CNS(例如，腦、神經的或神經膠質細胞)、頭和頸、皮膚(例如，黑素瘤)、鼻咽(例如，分化或未分化的轉移性或局部復發性鼻咽癌)和胰的那些癌、以及腺癌，包括惡性腫瘤，如結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌和食道癌。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。

在一些實施方案中，癌選自黑素瘤、乳腺癌、結腸癌、食管癌、胃腸道間質腫瘤(GIST)、腎癌(例如，腎細胞癌)、肝癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、***癌、頭頸部腫瘤、胃癌、血液學惡性病(例如，淋巴瘤)。

在一些實施方案中，用三鏈抗體治療和/或預防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原體或常規疫苗對其未及完全有效的病原體。這些包括但不限於HIV、(甲型、乙型和丙型)肝炎、流感、皰疹、賈弟鞭毛蟲(Giardia)、瘧疾、利什曼原蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。本發明例示的三鏈抗體對PD-L1阻斷作用特別可用來對抗隨感染過程推移出現變異抗原的病原體(如HIV)所建立的感染。這些變異抗原在施用抗人PD-L1抗體時能夠被視為外來抗原，由此，本發明例示的三鏈抗體能夠藉由PD-L1激發不受負向信號抑制的強烈T細胞反應。

在一些實施方案中，用本發明的三鏈抗體治療和/或預防炎性和自身免疫性疾病及移植物抗宿主病(GvHD)，來下調免疫系統。可以藉由施用本發明三鏈抗體治療和/或預防的自身免疫疾病的例子包括但不限於斑禿、僵直性脊柱炎、自身免疫性肝炎節段性回腸炎、紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎等。可以藉由施用本發明三鏈抗體治療和/或預防的炎性疾病的例子包括但不限於哮喘、腦炎、炎性腸病、過敏性疾病、敗血性休克、肺纖維化、關節炎和因慢性病毒性或細菌性感染產生的慢性炎症。

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

[實施例]

實施例1. 抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的構建、表達、純化、性質鑒定及藥效試驗

實施例1.1. 抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的構建

在本實施例中，構建了2種抗CD47/PD-L1雙特異性抗體，分別命名為(1)雙特異性抗體Kh2NF-PC，其結構示意圖如第1A圖所示；和(2)雙特異性抗體Kh2NF-PC-NL，其結構示意圖如第1B圖所示。

從第1A圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Kh2NF-PC由3條多肽鏈組成，肽鏈#1具有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，其包含衍生自抗CD47抗體ADI29341的SEQ ID NO：2所示的VH胺基酸序列、在該VH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：6所示CH1胺基酸序列、以及在該CH1胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：7所示Fc區胺基酸序列；肽鏈#2具有SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，其包含衍生自抗CD47抗體ADI29341的SEQ ID NO：9所示VL胺基酸序列、以及在該VL胺基酸序列C端的SEQ ID NO：13所示人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列；且肽鏈#3具有SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：16所示的第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列、在該第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列之間的SEQ ID NO：20所示連接肽胺基酸序列、以及在該第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：21所示Fc區胺基酸序列。

從第1B圖的結構示意圖可見，Kh2NF-PC-NL也由3條多肽鏈組成，肽鏈#1具有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，肽鏈#2具有SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，且肽鏈#3從N端至C端具有SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，該肽鏈#3包含SEQ ID NO：16所示的第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列(在該第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列之間無連接肽)：以及在該第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列C端的衍生自IgG1的SEQ ID NO：21所示的Fc區胺基酸序列。

如下構建抗CD47/PD-L1的雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL的三條鏈：將CD47抗體ADI-29341的VH C端連接於人IgG1的恆定區N端獲得肽鏈#1，其中Fc區包含LALA突變，以減弱本發明抗體的效應子功能，且包含“結入扣”突變，以與肽鏈#3穩定締合；肽鏈#2衍生自ADI-29341的VL和人κ輕鏈恆定區；肽鏈#3包含串聯的第一和第二抗PD-L1 VHH，在該兩個抗PD-L1 VHH之間無連接肽(在雙特異性抗體Kh2NF-PC-NL的情形)或以20個胺基酸殘基(G₄S)₄的柔性肽連接(在雙特異性抗體Kh2NF-PC的情形)，將第二抗PD-L1 VHH C端連接至衍生自IgG1的Fc區胺基酸序列N端獲得肽鏈#3，其中Fc區包含LALA突變，以減弱本發明抗體的效應子功能，且包含“結入扣”突變，以與肽鏈#1穩定締合。

實施例1.2. 抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的表達和純化

在本實施例中，將編碼實施例1.1中構建的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL的各三條鏈的核苷酸序列均藉由多克隆位點連接入市售的真核表達載體pTT5，在真核細胞中進行表達和純化，獲得了雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL。具體操作如下。

委託蘇州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL的上述各三條鏈的編碼核苷酸序列。分別將所合成的三條鏈的編碼核苷酸序列用限制性內切酶XbaI(New England Biolabs)和NotI(New England Biolabs)酶切，然後在T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的作用下分別與同樣經XbaI和NotI雙酶切的載體pTT5連接，獲得三個分別含有該三條編碼核苷酸序列的重組載體。

該三個重組載體經測序驗證正確後用於隨後的表達。

將HEK293細胞(購自Invitrogen公司)傳代培養於Expi293細胞培養液(購自Invitrogen公司)中。轉染前一天離心細胞培養物，獲得細胞沉澱，用新鮮的Expi293細胞培養液懸浮細胞，將細胞密度調整為1×10⁶個細胞/ml。繼續培養HEK293細胞，使得轉染當天的培養物中細胞密度約為2×10⁶個細胞/ml。取HEK293細胞懸浮液終體積1/10的F17培養基(購自Gibco公司，產品目錄號A13835-01)作為轉染緩衝液。向每毫升轉染緩衝液中加入10μg的1：1：1摩爾比率的上述製備的分別包含編碼肽鏈#1、肽鏈#2或肽鏈#3的核苷酸序列的重組質粒，混勻，再加入聚乙烯亞胺(polyethylenimine(PEI))(Polysciences，目錄號：23966)30ug，混勻，室溫溫育10分鐘後，將PEI/DNA混合物輕柔倒入HEK293細胞懸浮液中。輕輕混勻，置於8%CO₂、36.5℃過夜培養。

過夜培養後，向培養瓶中補加轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L的FEED(Sigma，目錄號：H6784-100G)和轉染後培養物體積1/50的濃度為200g/L的葡萄糖溶液，輕輕混勻，置於8%CO₂、36.5℃繼續培養。20小時後，加入VPA(Gibco，目錄號：11140-050)至終濃度為2mM/L。連續培養至第7天或者細胞活力

60%時，收集培養物，以7500轉/分鐘離心30分鐘，取細胞上清，使用SARTOPORE(Sartorius，目錄號：5441307H4)過濾後，在AKTApure系統(GE Healthcare)上藉由親和層析和離子交換層析進行純化。

具體的親和層析純化操作步驟為：選用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目錄號：17-5438-03)親和層析管柱，並置於AKTApure系統內。用0.1M NaOH對裝備有MabSelect SuRe親和層析管柱的AKTApure系統過夜除內毒，然後用5倍柱體積的結合緩衝液(Tris 20mM，NaCl 150mM，pH 7.2)清洗系統以及平衡管柱。將上述過濾後的細胞上清通過管柱。用5至10倍管柱體積的結合緩衝液再平衡，使用AKTApure系統配備的紫外檢測裝置監測至紫外走平。然後，用洗脫緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉100mM，pH 3.5)洗脫抗體，根據紫外吸收值來收集樣品。每1ml的收集液加80ul的中和緩衝液(Tris-HCl 2M)中和備用於進一步的離子交換層析。

具體的離子交換層析純化操作步驟為：選用Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare，目錄號：10245605)離子交換層析管柱，並置於AKTApure系統內。用0.1M NaOH對裝備有Superdex 200 Increase 10/300 GL離子交換層析管柱的AKTApure系統過夜除內毒。然後，用蒸餾水清洗系統以及管柱。使用5製10倍管柱體積的上樣緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉100mM,pH 5.0)平衡管柱，直至電導以及pH穩定。將所獲得的置有樣品的中和緩衝液(Tris-HCl 2M)進行緩衝液交換，交換為上樣緩衝液，然後上樣；使用5倍管柱體積的上樣緩衝液再平衡。以洗脫緩衝液2(檸檬酸+檸檬酸鈉100mM,NaCl 1M,pH 5.0)的含量為0製100%的梯度進行線性洗脫，共洗脫20個管柱體積，根據紫外吸收值來收集樣品。

利用大小排阻層析(size exclusion chromatography；SEC)檢測收集的各級分管中樣品的純度。根據SEC結果將純度大於95%的級分管中的樣品合併。SEC結果如第2A圖和第2B圖所示，雙特異性抗體Kh2NF-PC純度為97.76%，Kh2NF-PC-NL純度為97.86%。

將純化後的雙特異性抗體溶液使用15ml超濾離心管，4500轉/分鐘離心30分鐘。使用PBS將蛋白稀釋後繼續離心，4500轉/分鐘離心30分鐘，重複該操作2次，以更換緩衝液。將更換緩衝液後的抗體合併，測抗體濃度。

實施例1.3. 測定抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的解離常數

使用Octet系統(ForteBio公司生產)藉由動力學結合測定法確定本發明上述兩種示例性抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL結合CD47和PD-L1的平衡解離常數(K_D)。按照文獻中報導的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013，5(2)：p.270-278)進行ForteBio親和力測定。簡言之，在實驗開始前半個小時，將AHC傳感器(Pall，目錄號：1506091)浸泡於SD緩衝液(PBS 1×，BSA 0.1%，吐溫20 0.05%)中於室溫平衡。向96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner) 的孔中分別加入100μl的SD緩衝液作為空白對照(用於扣除背景)、100μl 100nM純化的雙特異性抗體Kh2NF-PC、Kh2NF-PC-NL和作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體(PCT/CN2017/095884)、抗CD47抗體ADI 29341、100μl稀釋於SD緩衝液中作為抗原的rh PD-L1(100nM)和h CD47(100nM)(Acrobiosystems)的溶液。將抗人IgG Fc生物傳感器AHC浸沒於分別含該抗體溶液的孔中，在室溫浸沒600秒上樣。隨後將傳感器在SD緩衝液中洗滌至達到基線，然後浸沒於含100ul抗原溶液的孔中，監測抗體與抗原的締合。隨後將傳感器轉移至含有100ul SD緩衝液的孔，監測抗體解離。轉速為400轉/分鐘，溫度為30℃。藉由Octet分析軟件(ForteBio)擬合經背景校正的締合曲線和解離曲線，產生締合(k_on)和解離(k_dis)速率常數，它們隨後用來計算平衡解離常數(K_D)。表2、表3和第3圖中顯示了抗體的k_on、k_dis和K_D數據。

藉由以上數據可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL能夠同時和溶液中的PD-L1和CD47蛋白結合，且維持了親本抗體的親和力常數。

實施例1.4. 本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體與過量表達CD47或PD-L1的CHO細胞的結合分析

藉由FACS測量本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL與過量表達CD47或PD-L1的CHO細胞的結合。

簡而言之，使用ExpiCHO^TM Expression System Kit(Invitrogen，目錄號：A29133)，根據製造商的說明書實施如下操作：將攜帶純株至多選殖位點MCS的人PD-L1 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO-S)(Invitrogen)，產生過量表達人PD-L1的CHO細胞(CHO-S-PD-L1細胞)。將CHO-S-PD-L1細胞計數，用細胞培養基稀釋至1×10⁶個細胞/ml,，向 U型底96孔板中以100μl/孔加入。在離心機上以400g離心5分鐘，去除細胞培養基。分別將100μl系列稀釋的本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PC、Kh2NF-PC-NL和作為對照的人源化Nb-Fc加入U型板並重懸細胞，冰上靜置30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清，藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的抗體。400g離心5分鐘，去除PBS。每孔加入100μl 1：200稀釋的PE綴合的抗人Fc抗體(Jackson Immuno Research)，冰上避光孵育30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清。藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的PE綴合的抗人Fc抗體。用100μl PBS重懸細胞，藉由FACS檢測抗體與細胞的結合。結果見第4A圖。

由第4A圖可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL均能夠與細胞表面表達的PD-L1相結合，並維持了親本抗體的結合EC50。

同樣地，藉由將攜帶純株至多選殖位點MCS的人CD47 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO-S)(Invitrogen)，產生過量表達人CD47的CHO-S細胞(CHO-S-CD47細胞)。

對CHO-CD47實施FACS檢測，除了使用的細胞不同和使用ADI 29341抗體作為陽性對照抗體、IgG1作為陰性對照抗體之外，其餘實驗操作均與上述CHO-S-PD-L1細胞的FACS檢測一樣。本申請中使用的IgG1陰性對照具有SEQ ID NO：23所示的重鏈(HC)胺基酸序列和SEQ ID NO：24所示的輕鏈(LC)胺基酸序列。

結果如第4B圖所示。由第4B圖可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL均能夠與細胞表面表達的CD47相結合，並維持了親本抗體的結合EC50。

實施例1.5. 本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的可溶性檢測

聚乙二醇(PEG)是一種極性非離子型沉澱劑。藉由PEG沉澱法(Li li等人，Application of a PEG precipitation method for solubility screening：A tool for developing high protein concentration formulations.Protein Science,2013.22：p.1118-23)，檢測了本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體在不同濃度的PEG中的溶解情況。

將本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL溶液分別濃縮至5mg/ml濃度。向96孔細胞培養板中加入40μl/孔的該雙特異性抗體。使用修美樂(Humira)作為陽性對照。在96孔細胞培養板從左到右的第1至11縱列中分別加入30%PEG6000(Sigma，目錄號：81255-250G)26.7μl、40μl、46.7μl、53.3μl、60μl、66.7μl、73.3μl、80μl、86.7μl、93.3μl、100μl。將每孔用PBS補足至總體積200μl，由此，每孔中抗體的終濃度均為1mg/ml，且96孔細胞培養板從左到右的第1至11縱列中PEG濃度梯度分別為4%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%。室溫放置1小時。測定OD500 nm處的吸光度。實驗結果如第5圖所示。

由第5圖可見，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC與修美樂具有相似的可溶性。

實施例1.6 本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的熱穩定性檢測

差示掃描螢光法(differential scanning fluorimetry；DSF)能夠根據蛋白質圖譜中的螢光變化過程提供有關蛋白質結構穩定性的信息，檢測蛋白的構型變化，獲得蛋白質的熔解溫度(T_m)。本實施例採用DSF法測定了本發明抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的T_m值。

將本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL溶液分別用PBS溶液稀釋至1mg/ml。

向4μl SYPRO Orange Protein Gel Stain(Gibco，目錄號：S6650)中加入196μl PBS，將SYPRO Orange Protein Gel Stain稀釋50倍。

向96孔PCR板(Nunc)中加入50μl的上述濃度為1mg/ml的雙特異性抗體，並加入10μl的上述50倍稀釋的SYPRO Orange Protein Gel Stain，然後加入40μl水。置於7500Real Time PCR系統(Themro Fisher)進行檢測。設置系統溫度為每分鐘升高0.5度，螢光曲線絕對值出現峰值時對應的溫度即為該蛋白質的Tm。

實驗結果如下表4所示。本發明的雙特異性抗體出現三個T_m值，且均>55℃，因此，具有較好的熱穩定性。

進一步地，將本發明的雙特異性抗體在40℃放置10、20、30天之後，研究了其純度及生物學活性的變化，進行了抗體的長期熱穩定性評價。具體而言，將本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL溶液在PBS中分別濃縮至5mg/ml濃度，然後以200μl/管分裝於EP管中，避光置於40℃。

於第0、1、3、7、10、20、30天各取一管進行SEC-HPLC測定本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體在40℃放置後的純度。實驗結果如第6圖所示。本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體即使在40℃放置長達30天，依然具有高的抗體純度。

此外，如上述實施例1.4該的那樣，檢測第0天和30天時本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體與表達CD47或PD-L1的CHO-S細胞的結合活性。實驗結果如第7A圖和第7B圖所示。

由第6圖、第7A圖和第7B圖可見，本發明的雙特異性抗體具有較好的長期熱穩定性，且保持了生物學活性。

實施例1.7. 基於MOA法檢測本發明雙特異性抗體的抗PD-L1活性

考慮到對抗體的探索應該建立在對其作用機制(mechanisms of action；MOA)的瞭解和生物學活性的基礎上，本實施例使用PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay,Cell Propagation Model(Promega公司)，研究了本發明的雙特異性抗體的抗PD-L1生物學活性。

Promega公司的PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay是一種生物學相關的基於MOA的測定法，用於測定能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用的抗體的效力和穩定性。該測定法由兩種基因工程細胞系組成：

˙PD-1效應細胞：穩定表達人PD-1和由活化的T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cells；NFAT)誘導表達螢光素酶的Jurkat T細胞。

˙PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞：穩定表達人PD-L1的CHO-K1細胞和以抗原非依賴性方式活化相應TCR的細胞表面蛋白。

PD-1與PD-L1結合可以阻斷NFAT下游信號的轉導，從而抑制螢光素酶的表達，當加入PD-1抗體或者PD-L1抗體時，這種阻斷效應被反轉，螢光素酶表達，從而檢測到螢光信號。該檢測法靈敏度、特異性、準確度都很好，且穩定性很好。

根據製造商的產品說明書進行檢測。在實施MOA法前1至2天傳代培養PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞。棄培養上清，PBS(Gibco)洗細胞。加入適量胰蛋白酶(Gibco)於37℃/5% CO₂消化3至5分鐘。然後，加入4倍胰蛋白酶體積的培養基，將細胞轉移至50ml離心管並計數。取所需體積細胞，230g離心10分鐘。加入RPMI 1640培養基(Gibco)，重懸細胞至4×10⁵個細胞/ml。以100μl/孔將細胞懸液加入96孔白色細胞培養板(Nunclon)，加入PBS溶液補充至200μl/孔。細胞於37℃/5% CO₂培養箱中培養過夜。

同樣地，在實施MOA法前1至2天傳代培養PD-1效應細胞。計數後取所需體積細胞，170g離心5分鐘。用測試緩衝液(RPMI 1640培養基+1%FBS)重懸細胞至1.25×10⁶個細胞/ml。

棄去95μl/孔PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞培養上清。然後，分別加入40μl各受試抗體、作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體、IgG1陰性對照。加入40μl上述製備的PD-1效應細胞至檢測板的孔中。於37℃/5% CO₂培養箱中培養6小時。

將Bio-Glo^TM緩衝液(Promega公司)融化，加入Bio-Glo^TM底物，混勻。將所獲得的Bio-Glo^TM試劑以80μl/孔加入上述培養6小時後的檢測板的孔中。室溫放置5至10分鐘，讀取螢光信號值。

結果如第8圖所示，本發明的雙特異性抗體可以解除PD-1/PD-L1相互作用對NFAT信號通路的抑制作用，且活性優於作為抗PD-L1抗體的人源化Nb-Fc抗體單獨使用。

實施例1.8. 本發明的雙特異性抗體促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力檢測

在基於流式細胞術的測定法中測量本發明的抗體Kh2NF-PC和Kh2NF-PC-NL促進巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。

對取自捐贈者的新鮮血液進行密度梯度離心，得到外周血單個核細胞(PBMC)。從分離的PBMC中按照EasySep^TM Human CD14 Positive Selection Kit(美國Stemcell公司)說明書的方案，純化得到CD14陽性的單個核細胞。簡言之，加入10ng/mL粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D Systems)貼壁培養連續7天；其中在第5天加入20ng/mL干擾素-γ(IFN-γ，AcroBiosystem)刺激1小時，隨後再加入100ng/mL脂多糖(LPS，Sigma)刺激48小時，將外周血單個核細胞中的前體細胞誘導分化為巨噬細胞。

將人PD-L1藉由電穿孔法轉入腫瘤細胞CCRF-CEM(購自ATCC)中構建成為靶腫瘤細胞CCRF-CEM-PD-L1。將靶腫瘤細胞CCRF-CEM-PD-L1按照CellTrace^TM CFSE Cell Proliferation Kit(Invitrogen，目錄號：C34554)的說明，用螢光染料羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester，CFSE)進行螢光標記。將標記好的腫瘤細胞與上述已經完成誘導分化的巨噬細胞按照4：1的細胞數比例共培養，同時加入不同濃度的受試抗體在37℃孵育3小時。然後將細胞洗滌至少兩次，加入別藻青蛋白(allophycocyanin，APC)標記的CD14抗體(購自BD)，在含0.1%BSA的PBS中冰上(避光) 孵育30分鐘。將細胞用PBS洗滌至少兩次並藉由流式細胞術進行分析。被吞噬的細胞群體為活細胞中CD14陽性並且螢光染料CFSE也為陽性的細胞群體。實驗結果如第9圖所示。

從第9圖可見，抗CD47/PD-L1雙特異性抗體可以有效誘導巨噬細胞對CD47和PD-L1共表達的靶細胞發揮吞噬作用，其誘導活性和抗CD47單株抗體相似。

實施例1.9 本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體促進紅細胞凝集活性的檢測

現有技術已知大多數的抗CD47抗體具有促進紅細胞凝集的副作用，因而這些抗CD47抗體的治療應用受到限制。為此，發明人進一步研究了本發明抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的紅細胞凝集作用。具體檢測方法如下：

採集新鮮人類血液，用PBS洗三次後製備成10%人類紅細胞懸液，將人類紅細胞與受試抗體(最高濃度為60ug/ml，三倍系列稀釋，總共獲得11個稀釋後濃度)在37℃孵育2-6小時，該反應在96孔圓底板中進行。反應結束後拍照並判斷結果。結果判定標準為如果紅細胞沉於孔底，平鋪呈網狀，則發生了紅細胞凝集反應(參見第10圖中Hu5F9(US2015/0183874 A1中的“5F9”抗體)的結果)，如果紅細胞未發生凝集反應，則紅細胞將呈點狀沉於孔底(參見第10圖中的IgG1對照)。

在如以上測定法該進行的實驗中，血凝反應結果如第10圖所示。本發明抗體Kh2NF-PC的紅細胞凝集活性很弱，其促進紅細胞凝集的活性明顯低於對照組Hu5F9。可見，本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體具有顯著降低的紅細胞凝集作用，因此在臨床治療中具有顯著降低的副作用，可以廣泛應用於多種癌症的治療中。

實施例1.10 本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體對腫瘤細胞的選擇性結合活性研究

人體內正常紅細胞表面表達CD47蛋白，大多數抗CD47單株抗體會結合到正常紅細胞上，這是造成抗CD47單株抗體副作用的主要原因之一。本實施例將腫瘤細胞和人紅細胞共同孵育，檢測了本發明的雙特異性抗體對腫瘤細胞的選擇性結合性質。具體實驗過程如下：

取捐贈者新鮮血液50ml，添加2.5倍體積的PBS溶液，然後輕輕加入到FiColl(Thermo)12.5ml中，分成4管，400g離心30分鐘，以零減速度停止離心。去除上層血清及PBMC，獲得最下層的紅細胞。

將腫瘤細胞H292(ATCC)按照CellTrace^TM CFSE Cell Proliferation Kit(Invitrogen，目錄號：C34554)的說明，用螢光染料CFSE進行螢光標記。將標記好的腫瘤細胞與上述分離出來的人紅細胞按照1：20的細胞數比例共培養，同時加入不同濃度的受試抗體在4℃孵育30分鐘。然後將細胞用PBS洗滌至少兩次，加入別藻青蛋白(APC)標記的人Fc抗體(購自Biolegend，目錄號：409306)，在含0.1%BSA的PBS中冰上(避光)孵育30分鐘。將細胞用PBS洗滌至少兩次並藉由流式細胞術進行分析。

實驗結果如表5和第11圖所示，在1.111nM至0.041nM的抗體濃度下，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PC及Kh2NF-PC-NL相比較抗CD47單株抗體ADI-29341更傾向於結合腫瘤細胞(在0.12nM時，Kh2NF-PC及Kh2NF-PC-NL分別有88.51%及83.24%結合於H292細胞表面，而ADI-29341只有5.74%結合於H292細胞表面)。

實施例1.11 本發明的抗CD47/PD-L1雙特異性抗體的體內抗腫瘤作用

在本實施例中，藉由使用Raji-PD-L1細胞接種NOD-SCID小鼠來產生荷瘤小鼠，並測定了本發明的CD47/PD-L1抗體的抗腫瘤作用。

NOD-SCID小鼠：

雌性NOD-SCID小鼠(42-62天齡)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。等級為SPF級，數量為100隻，質檢單位為北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號為NO.11400700284978。該小鼠在到達後馴化7天，隨後開始研究。

培養細胞和接種小鼠：

將攜帶純株至多選殖位點MCS的人PD-L1 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染入購自ATCC的Raji宿主細胞，經壓力篩選獲得穩定表達人PD-L1的Raji細胞(Raji-PD-L1細胞)。將Raji-PD-L1細胞進行常規傳代培養，以用於後續的小鼠體內實驗。

離心收集培養的Raji-PD-L1細胞，用1×PBS分散細胞，將細胞密度為10×10⁶個/ml的Raji-PD-L1細胞與Matrigel膠(Corning，目錄號：356231)1：1混合，製備成細胞密度為5×10⁶個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOD-SCID小鼠右側腹部區域中來建立Raji-PD-L1荷瘤小鼠模型。

荷瘤小鼠的分組和給藥：

腫瘤細胞接種8天後檢測各隻小鼠的荷瘤體積，挑選出荷瘤體積在50.56mm³~115.39mm³範圍內的小鼠並按荷瘤體積大小蛇形分組(每組6隻小鼠)，給藥劑量和給藥方式如表6所示。使用h-IgG(購自Equitech-Bio，批號：160308-02，規格為1g/瓶，用PBS配製成10mg/ml)用作陰性對照。具體而言，分別在Raji-PD-L1細胞接種後第8、10、12、14、16、18、20天給藥，每週2至3次監測小鼠瘤體積和小鼠體重。監測至33天後結束。接種後第33天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：TGI%=100% *(h-IgG對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(h-IgG對照組腫瘤體積-h-IgG對照組給藥前腫瘤體積)。h-IgG對照組給藥前腫瘤平均體積為80.86mm³。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。採用電子天平測定體重。

腫瘤抑制率結果如第17圖和表7所示：在接種後第33天，與h-IgG對比，ADI-29341 0.1mg/kg單藥腫瘤抑制率為88%；ADI-29341 0.1mg/kg與人源化Nb-Fc 0.1mg/kg聯合用藥的腫瘤抑制率為107%；抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC 0.17mg/kg的腫瘤抑制率為111%，腫瘤抑制效果均明顯優於人源化Nb-Fc 0.1mg/kg的10%腫瘤抑制率，且抗CD47/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PC具有最佳的腫瘤抑制效果。對小鼠體重檢測的結果是各組小鼠的體重之間無顯著性差異。

實施例2.抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的構建、表達、純化及性質鑒定

實施例2.1.抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的構建

在本實施例中，構建了抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體，命名為雙特異性抗體Kh2NF-P4，其結構示意圖如第1A圖所示。

從第1A圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Kh2NF-P4由3條多肽鏈組成，肽鏈#1具有SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，其包含衍生自抗4-1BB抗體BMS-663513的SEQ ID NO：26所示VH胺基酸序列、在該VH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：6所示的CH1胺基酸序列；以及在該CH1胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：7所示的Fc區胺基酸序列；肽鏈#2具有SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，其包含衍生自抗4-1BB抗體BMS-663513的SEQ ID NO：28所示VL胺基酸序列、以及在該VL胺基酸序列C端的SEQ ID NO：13所示的人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列；且肽鏈#3具有SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：16所示的第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列；在該第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列之間的SEQ ID NO：20所示的連接肽胺基酸序列；以及在該第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：21所示的Fc區胺基酸序列。

如下構建抗4-1BB/PD-L1的雙特異性抗體Kh2NF-P4的三條鏈：將4-1BB抗體BMS-663513的VH C端連接於人IgG1的恆定區N端獲得肽鏈#1，其中Fc區包含LALA突變，以減弱本發明抗體的效應子功能，且包含“結入扣”突變，以與肽鏈#3穩定締合；肽鏈#2衍生自BMS-663513的VL和人κ輕鏈恆定區；肽鏈#3包含串聯的第一和第二抗PD-L1 VHH，在該兩個抗PD-L1 VHH之間以20個胺基酸殘基(G₄S)₄的柔性肽連接，將第二抗PD-L1 VHH C端連接至衍生自IgG1的Fc區胺基酸序列N端獲得肽鏈#3，其中Fc區包含LALA突變，以減弱本發明抗體的效應子功能，且包含“結入扣”突變，以與肽鏈#1穩定締合。

實施例2.2. 抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體的表達和純化

在本實施例中，將編碼實施例2.1中構建的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-P4的各三條鏈的核苷酸序列均藉由多選殖位點連接入真核表達載體pTT5(Biotechnology Research Institute；Montreal,Canada)，在真核細胞中進行表達和純化，獲得了雙特異性抗體Kh2NF-P4。

質粒轉染、抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-P4的表達和純化操作同上述實施例1.2。雙特異性抗體Kh2NF-P4的SEC結果如第12圖所示，純度為98.42%。

實施例2.3. 本發明的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體與表達4-1BB或PD-L1的CHO細胞的結合分析

基本如上述實施例1.4該，藉由FACS測量本發明的抗4-1BB/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-P4與表達4-1BB或PD-L1的CHO細胞的結合。簡而言之，將CHO-S-PD-L1細胞計數，用細胞培養基稀釋至1×10⁶個細胞/ml,，向U型底96孔板中以100μl/孔加入。在離心機上以400g離心5分鐘，去除細胞培養基。分別將100μl系列稀釋的本發明的雙特異性抗體Kh2NF-P4和作為對照的人源化Nb-Fc加入U型板並重懸細胞，冰上靜置30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清，藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的抗體。400g離心5分鐘，去除PBS。每孔加入100μl 1：200稀釋的PE綴合的抗人Fc抗體(Jackson Immuno Research)，冰上避光孵育30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清。藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的PE綴合的抗人Fc抗體。用100μl PBS重懸細胞，藉由FACS檢測抗體與細胞的結合。結果見第13B圖。

由第13B圖可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-P4能夠與細胞表面表達的PD-L1相結合，且結合能力和親本抗體相似。

同樣地，藉由將攜帶純株至多選殖位點MCS的人4-1BB cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染入中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO-S)(Invitrogen)，產生過量表達人4-1BB的CHO-S細胞(CHO-S-4-1BB細胞)。對CHO-S-4-1BB實施FACS檢測，除了使用的細胞不同和使用的抗體對照是BMS-663513抗體之外，其餘實驗操作均與上述CHO-S-PD-L1細胞的FACS檢測一樣。結果見第13A圖。

由第13A圖可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-P4能夠與細胞表面表達的4-1BB相結合，且結合能力和親本抗體相似。

實施例3. 抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的構建、表達、純化及性質鑒定

實施例3.1. 抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的構建

在本實施例中，構建了抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體，命名為雙特異性抗體Kh2NF-PL，其結構示意圖如第1B圖所示。

從第1B圖的結構示意圖可見，雙特異性抗體Kh2NF-PL由3條多肽鏈組成，肽鏈#1具有SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，其包含衍生自抗LAG-3抗體ADI-31853的SEQ ID NO：30所示VH胺基酸序列、在該 VH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：6所示的CH1胺基酸序列、以及在該CH1胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：7所示的Fc區胺基酸序列；肽鏈#2具有SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，其包含衍生自抗LAG-3抗體ADI-31853的SEQ ID NO：35所示VL胺基酸序列、以及在該VL胺基酸序列C端的SEQ ID NO：13所示的人κ輕鏈恆定區(CL)胺基酸序列；且肽鏈#3具有SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，其包含SEQ ID NO：16所示的第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列，在該第一和第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列之間無連接肽胺基酸序列；以及在該第二抗PD-L1 VHH胺基酸序列C端的衍生自人IgG1的SEQ ID NO：21所示的Fc區胺基酸序列。

如下構建本發明抗LAG-3/PD-L1的雙特異性抗體Kh2NF-PL的三條鏈：將LAG-3抗體ADI-31853的VH C端連接於人IgG1的恆定區N端獲得肽鏈#1，其中Fc區包含LALA突變，以減弱本發明抗體的效應子功能，且包含“結入扣”突變，以與肽鏈#3穩定締合；肽鏈#2衍生自ADI-31853的VL和人κ輕鏈恆定區；肽鏈#3包含串聯的第一和第二抗PD-L1 VHH，在該兩個抗PD-L1 VHH之間無連接肽，將第二抗PD-L1 VHH C端連接至衍生自IgG1的Fc區胺基酸序列N端獲得肽鏈#3，其中Fc區包含LALA突變，以減弱本發明抗體的效應子功能，且包含“結入扣”突變，以與肽鏈#1穩定締合。

實施例3.2. 抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的表達和純化

在本實施例中，將編碼實施例3.1中構建的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL的各三條鏈的核苷酸序列均藉由多選殖位點連接入真核表達載體pTT5(Biotechnology Research Institute；Montreal,Canada)，在真核細胞中進行表達和純化，獲得了雙特異性抗體Kh2NF-PL。

質粒轉染、抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL的表達和純化操作同上述實施例1.2。雙特異性抗體Kh2NF-PL的SEC結果如第14圖所示，純度為97.84%。

實施例3.3. 本發明的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體與表達LAG-3或PD-L1的細胞的結合分析

基本如上述實施例1.4該，藉由FACS測量本發明的抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體Kh2NF-PL與表達LAG-3或PD-L1的細胞的結合。簡而言之，將CHO-S-PD-L1細胞計數，用細胞培養基稀釋至1×10⁶個細胞/ml,，向U型底96孔板中以100μl/孔加入。在離心機上以400g離心5分鐘，去除細胞培養基。分別將100μl系列稀釋的本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PL和作為對照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗體加入U型板並重懸細胞，冰上靜置30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清，藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的抗體。400g離心5分鐘，去除PBS。每孔加入100μl 1：200稀釋的PE綴合的抗人Fc抗體(Jackson Immuno Research)，冰上避光孵育30分鐘。400g離心5分鐘，去除上清。藉由用PBS洗滌細胞，移除未結合的PE綴合的抗人Fc抗體。用100μl PBS重懸細胞，藉由FACS檢測抗體與細胞的結合。結果見第15A圖。

由第15A圖可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PL能夠與細胞表面表達的PD-L1相結合，且結合能力和親本抗體相似。

藉由將攜帶純株至多選殖位點MCS的人LAG-3 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染至HEK293細胞中(Invitrogen)，產生過量表達人LAG-3的HEK293細胞(293-LAG-3細胞)。

同樣地，對293-LAG-3細胞實施FACS檢測，除了使用的細胞不同和使用的抗體對照是抗LAG-3抗體ADI-31853之外，其餘實驗操作均與上述CHO-S-PD-L1細胞的FACS檢測一樣。結果見第15B圖。

由第15B圖可見，本發明的雙特異性抗體Kh2NF-PL能夠與細胞表面表達的LAG-3相結合，且結合能力和親本抗體相似。

實施例3.4 本發明的抗LAG-3/PD-L1雙特異抗體對人T細胞的激活實驗

本實施例使用混合淋巴細胞實驗檢測了本發明的抗LAG-3/PD-L1雙特異抗體對人T細胞的激活作用，具體實驗過程如下。

取捐贈者新鮮血液50ml，添加2.5倍體積的PBS溶液，然後輕輕加入到FiColl(Thermo)12.5ml中，分成4管， 400g離心30分鐘，以零減速度停止離心。吸取中間白色條帶至PBS中，用PBS洗2次，獲得分離的PBMC。

向50ml分離的PBMC細胞添加5ml T細胞培養基X-VIVO 15(LONZA)，在培養箱中37℃、6% CO₂貼壁培養2小時，吸取懸浮細胞液用於實施CD4+細胞分離。另外，對於吸取懸浮細胞液後剩下的細胞，向其添加3ml樹狀細胞(DC)培養基(X-VIVO 15(Lonza)99%，人AB血清(Access)1%，HEPES 10mM，β-Me 50μM，IL-4(R&D Systems)1000U/ml，GM-CSF(R&D Systems)1000U/ml)，培養2天後再添加3ml DC培養基，培養到第5天時，添加rTNFα(R&D Systems)(1000U/ml)，IL-1β(R&D Systems)(5ng/ml)，IL-6(R&D Systems)(10ng/ml)和1μM PGE2(R&D Systems)培養2天，獲得分離的DC細胞，用作混合淋巴細胞反應(MLR)中使用的DC細胞。

按照Untouched CD4+ T cell Isolation Kit(Invitrogen，目錄號11346D)的說明書，實施CD4+細胞分離。簡而言之，上述將PBMC靜置培養2小時後吸取的懸浮細胞液置於20ml離心管中，200g離心10分鐘，向細胞沉澱物中加入500μl分離液、100μl AB型血清、100μl試劑盒中配備的純化抗體，4℃孵育20分鐘，用分離液清洗一次，再加入500μl珠緩衝液孵育15分鐘，磁場去除珠，用T細胞培養基洗一次，使用8ml培養基重懸細胞，37℃、6% CO₂培養獲得的CD4+細胞。

將1×10⁷個CD4+細胞重懸於4ml X-VIVO 15培養基 (LONZA)中，以1：1加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)，培養三天，對CD4+細胞實施珠刺激。

如下實施混合淋巴細胞反應(MLR)。在96孔細胞培養板(Nunc)中，將上述分離的DC細胞與經珠刺激的CD4+細胞混合，每孔體積200μl，DC細胞10000個，CD4+細胞100000個，加入系列稀釋的抗體和1nM SEE(Toxin technology)，使用本機構內自製的IgG4抗體作為陰性對照，混合培養3天，使用IL2試劑盒(Cisbio公司)檢測IL2濃度。該IgG4對照抗體具有SEQ ID NO：39所示的重鏈(HC)胺基酸序列和SEQ ID NO：40所示的輕鏈(LC)胺基酸序列。

實驗結果如第16圖所示，本發明的雙特異性抗體可以在體外激活T細胞，其激活效果比抗PD-L1或抗LAG-3抗體單獨使用更強。本發明的雙特異性抗體體外對T細胞的激活作用與抗PD-L1和抗LAG-3抗體聯合使用相似。

儘管已經出於說明本發明的目的顯示了某些代表性實施方案和細節，但是本領域技術人員顯而易見的是可以對它們進行多種變化和修改而不脫離主題發明的範圍。在這個方面，本發明範圍僅由以下權利要求限定。

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司

<120> 三鏈抗體、其製備方法及其用途

<160> 40

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47/PDL1雙特異性抗體的第一多肽鏈

<400> 1

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VH

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VH CDR1

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VH CDR2

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VH CDR3

<400> 5

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自人IgG1 CH1

<400> 6

<210> 7

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自人IgG1 Fc區

<400> 7

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47/PDL1雙特異性抗體的第二多肽鏈

<400> 8

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VL

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VL CDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VL CDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD47抗體ADI29341 VL CDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 秷人

<220>

<223> 人κ輕鏈CL胺基酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 雙特異性抗體的第三多肽鏈(VHH之間具連接肽)

<400> 14

<210> 15

<211> 132

<212> PRT

<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)

<220>

<223> 駱駝VHH

<400> 15

<210> 16

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化VHH

<400> 16

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)

<400> 17

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)

<400> 18

<210> 19

<211> 26

<212> PRT

<213> 駱駝(Camelus Linnaeus)

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

<210> 21

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自人IgG1 Fc區

<400> 21

<210> 22

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 雙特異性抗體的第三多肽鏈(VHH之間不具連接肽)

<400> 22

<210> 23

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 HC

<400> 23

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 LC

<400> 24

<210> 25

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗4-1BB/PDL1雙特異性抗體的第一多肽鏈

<400> 25

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗4-1BB抗體BMS-663513 VH

<400> 26

<210> 27

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗4-1BB/PDL1雙特異性抗體的第二多肽鏈

<400> 27

<210> 28

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗4-1BB抗體BMS-663513 VL

<400> 28

<210> 29

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3/PD-L1的第一多肽鏈

<400> 29

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VH

<400> 30

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VH CDR1

<400> 31

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VH CDR2

<400> 32

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VH CDR3

<400> 33

<210> 34

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3/PD-L1雙特異性抗體的第二多肽鏈

<400> 34

<210> 35

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VL

<400> 35

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VL CDR1

<400> 36

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VL CDR2

<400> 37

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗LAG-3抗體ADI-31853 VL CDR3

<400> 38

<210> 39

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 HC

<400> 39

<210> 40

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 LC

<400> 40

Claims

一種包含三條多肽鏈的三鏈抗體，其中第一多肽鏈從N端至C端包含第一重鏈可變結構域、免疫球蛋白CH1結構域和Fc結構域，第二多肽鏈從N端至C端包含第一輕鏈可變結構域和免疫球蛋白CL結構域，其中該第一重鏈可變結構域與該第一輕鏈可變結構域配對形成第一抗原結合位點；且第三多肽鏈從N端至C端包含單結構域第二抗原結合位點、單結構域第三抗原結合位點和Fc結構域，其中，該單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點分別選自駱駝科物種中天然存在的重鏈抗體的重鏈可變結構域、駱駝化的人VH結構域和人源化的駱駝科抗體重鏈可變結構域，它們也簡稱為“VHH”，由此，該單結構域第二抗原結合位點和單結構域第三抗原結合位點分別是第一VHH和第二VHH，該第一VHH和第二VHH的序列相同或者不同，且結合相同的抗原表位，其中，該三鏈抗體是抗CD47/PD-L1雙特異性抗體，其包含：該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點，該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點包含衍生自抗CD47抗體的GSIEHYYWS(SEQ ID NO：3)所示的VH CDR1、YIYYSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：4)所示的VH CDR2、 ARGKTGSAA(SEQ ID NO：5)所示的VH CDR3、RASQGISRWLA(SEQ ID NO：10)所示的VL CDR1、AASSLQS(SEQ ID NO：11)所示的VL CDR2和QQTVSFPIT(SEQ ID NO：12)所示的VL CDR3；以及該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH，該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH均包含SEQ ID NO：17所示的CDR1、SEQ ID NO：18所示的CDR2和SEQ ID NO：19所示的CDR3。
如申請專利範圍第1項所述的三鏈抗體，其中該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH之間具有或者不具有連接肽。
如申請專利範圍第1項所述的三鏈抗體，其中該免疫球蛋白是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白。
如申請專利範圍第1項所述的三鏈抗體，其中該第一多肽鏈和第三多肽鏈在各自的Fc結構域中分別包含凸起或空穴，並且第一多肽鏈Fc結構域中的該凸起或空穴可分別置於第三多肽鏈Fc結構域中的該空穴或凸起中，由此該第一多肽鏈和第三多肽鏈彼此形成“結入扣”的穩定締合。
如申請專利範圍第2項所述的三鏈抗體，其中該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH之間具有連接肽，且該連接肽包含甘胺酸(G)和絲胺酸(S) 殘基。
如申請專利範圍第5項所述的三鏈抗體，其中該連接肽包含GGGGS重複。
如申請專利範圍第6項所述的三鏈抗體，其中該連接肽包含4個GGGGS重複。
如申請專利範圍第1項所述的三鏈抗體，其中該第一多肽鏈和第二多肽鏈上的特異性結合CD47的含VH1/VL1對的第一抗原結合位點是衍生自抗CD47抗體的SEQ ID NO：2/9的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，該第三多肽鏈上的特異性結合PD-L1的第一VHH和第二VHH是SEQ ID NO：15和/或SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
如申請專利範圍第8項所述的三鏈抗體，其中該三鏈抗體包含SEQ ID NO：1所示的第一多肽鏈、SEQ ID NO：8所示的第二多肽鏈、和SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：22所示的第三多肽鏈。
一種多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的三鏈抗體中的第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈。
一種載體，其包含編碼如申請專利範圍第1至9項中任一項該的三鏈抗體中的第一多肽鏈、第二多肽鏈和第三多肽鏈的多核苷酸。
如申請專利範圍第11項所述的載體，其是表達載體。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第10項所述的多核苷酸或如申請專利範圍第11或12項所述的載體。
一種用於生產如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的三鏈抗體的方法，該方法包括步驟(i)在適於表達該三鏈抗體的條件下培養如申請專利範圍第13項所述的宿主細胞，和(ii)從該宿主細胞或該培養基回收該三鏈抗體。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項該的三鏈抗體和可藥用載體。
一種申請專利範圍第1至9項中任一項該的三鏈抗體或如申請專利範圍第15項所述的醫藥組成物的用途，用於製備用作在個體中治療腫瘤的藥物。
如申請專利範圍第16項所述的用途，其中，該個體是哺乳動物。
如申請專利範圍第16項所述的用途，其中，該個體是人。