CN105349590B - 微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法 - Google Patents

微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法，利用谷氨酸棒杆菌作为发酵菌株，通过在发酵过程中向发酵液中补加营养成分，来提高谷氨酰胺的发酵水平，所述营养成分为硫酸铵、麸皮水解液。该方法简单易行，谷氨酰胺的发酵水平能得到显著提高，发酵液中谷氨酰胺含量可达40g/L以上。

Description

微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法。
背景技术
谷氨酰胺(Gln)是由L-谷氨酸和氨化合而成的，属于20种氨基酸中的一种。1883年Schulze从甜菜汁中发现了Gln，随后又从发芽种子及蛋白质中检出。1935年，Hans Kerbs首次发现哺乳动物肾脏合成和分解L-Gln的能力,人们开始逐渐了解它的作用。在随后的研究中,Kerbs强调多数氨基酸具有多种功能，但L-Gln的功能是最丰富的。1955年，Harry Eagle综述了哺乳动物细胞对Gln的营养需要，并强调它是一种很重要的营养素。近年来，随着人们对L-Gln的生理、生化、临床等方面研究的深入和发展，Gln被认为是迄今为止人类发现的最重要的氨基酸之一，被称为条件性必需氨基酸，药用前景广阔。
然而，目前通过微生物发酵制备谷氨酰胺的结果不理想，因此改变现有发酵方法从而使发酵水平提高成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法，是以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为发酵菌株，通过补料批式发酵生产谷氨酰胺；其中，在发酵过程中向发酵液中补加的营养成分为硫酸铵、麸皮水解液。
本发明中涉及的麸皮水解液的制备方法为：将干麸皮和水按1:20的重量比混合置于发酵罐中，用盐酸调pH值1.0，在0.25Mpa，90-121℃的条件下水解20min，放罐后降至室温，过滤取上清液，即得。
发酵所用的培养基组成为：葡萄糖10-15g/L、玉米浆水解液1-1.5g/L、氯化铵3-6g/L、磷酸二氢钾0.02-0.04g/L、磷酸氢二钾0.02-0.04g/L、维生素B1 20-25μg/L、硫酸锌4-8mg/L、硫酸亚铁4-8mg/L、生物素4-7μg/L、泡敌0.3g/L。
发酵条件为：29-32℃，通气量0.5-1.5VVM，溶氧量控制在30％以上，罐压0.01-0.05Mpa，pH6.5-7.5，发酵周期60-72h。
发酵时按8-10％(v/v)的接种量将种子液接种于发酵罐中，发酵罐容积为50L，装液量为35L，补加硫酸铵和麸皮水解液的量分别为900g-1500g、3000-4500mL，将补加的营养成分加水配制成6kg-9kg，蒸汽灭菌后流加至发酵罐中。自发酵10-16h开始补加营养成分至发酵50-65h时停止。
其中，种子液的制备方法如下：
i)斜面培养：用接种环挑取谷氨酸棒杆菌接种于斜面培养基上，29-37℃培养8-20h；斜面培养基的组成为：蛋白胨4-6g/L、牛肉浸取物2-4g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂14-16g/L，pH为6.8-7.0；
ii)种子液的制备：刮取斜面培养基上的菌种接种于种子培养基中，29-37℃培养10-18h，即得OD562nm大于0.8的种子液；种子培养基的组成为：葡萄糖20-30g/L，尿素3-7g/L，硫酸镁0.3-0.5g/L，磷酸二氢钾0.8-1.6g/L，玉米浆25-35g/L，硫酸亚铁1.5-2.5ppm，硫酸锰1.5-2.5ppm，pH6.5-7.0。
本发明使用的发酵菌株为保藏编号CICC 20973的谷氨酸棒杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
本发明利用谷氨酸棒杆菌作为发酵菌株，通过在发酵过程中向发酵液中补加营养成分，来提高谷氨酰胺的发酵水平，该方法简单易行，谷氨酰胺的发酵水平能得到显著提高，发酵液中谷氨酰胺含量可达40g/L以上。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的麸皮水解液的制备方法如下：将干麸皮和水按1:20的重量比混合置于发酵罐中，用盐酸调pH值1.0，在0.25Mpa，90-121℃的条件下水解20min，放罐后降至室温，过滤取上清液，即得。
实施例1微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法
1、制备保藏编号为CICC 20973的谷氨酸棒杆菌种子液
①在无菌条件下用接种环挑取谷氨酸棒杆菌接种于固体斜面培养基上，37℃恒温培养8小时。
斜面培养基的组成为：蛋白胨5g/L、牛肉浸取物3g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L，pH为6.9。
②刮取斜面培养基上的菌种接种于种子培养基中，37℃培养18h，即得OD562nm为1.75的种子液。
种子培养基的组成为：葡萄糖25g/L，尿素5g/L，硫酸镁0.4g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，玉米浆30g/L，硫酸亚铁2.5ppm，硫酸锰2.5ppm，pH6.5-7.0。
2、补料分批式发酵生产谷氨酰胺
按10％(v/v)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐容积为50L，装液量为35L，补加硫酸铵和麸皮水解液的量分别为1000g、4000mL，将补加的营养成分加水配制成8kg，115℃蒸汽灭菌20分钟后流加至发酵罐中。自发酵15h开始补加营养成分至发酵60h时停止。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中谷氨酰胺含量达到45g/L。
发酵所用的培养基组成为：葡萄糖12g/L、玉米浆水解液1g/L、氯化铵5g/L、磷酸二氢钾0.03g/L、磷酸氢二钾0.03g/L、维生素B1 25μg/L、硫酸锌5mg/L、硫酸亚铁5mg/L、生物素5μg/L、泡敌0.3g/L。
发酵条件为：30℃，通气量1.0VVM，溶氧量控制在30％以上，罐压0.03Mpa，pH6.9，发酵周期65h。
实施例2微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法
1、制备保藏编号为CICC 20973的谷氨酸棒杆菌种子液
①在无菌条件下用接种环挑取谷氨酸棒杆菌接种于固体斜面培养基上，29℃恒温培养20小时。
斜面培养基的组成为：蛋白胨4g/L、牛肉浸取物2g/L、氯化钠4g/L、琼脂14g/L，pH为6.8。
②刮取斜面培养基上的菌种接种于种子培养基中，29℃培养10h即得OD562nm为1.23的种子液。
种子培养基的组成为：葡萄糖30g/L，尿素7g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，玉米浆35g/L，硫酸亚铁2.5ppm，硫酸锰2.5ppm，pH6.5-7.0。
2、补料批式发酵生产谷氨酰胺
按8％(v/v)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐容积为50L，装液量为35L，补加硫酸铵和麸皮水解液的量分别为900g、3000mL，将补加的营养成分加水配制成6kg，115℃蒸汽灭菌20分钟后流加至发酵罐中。自发酵13h开始补加营养成分至发酵50h时停止。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中谷氨酰胺含量达到40g/L。
发酵所用的培养基组成为：葡萄糖10g/L、玉米浆水解液1g/L、氯化铵3g/L、磷酸二氢钾0.02g/L、磷酸氢二钾0.02g/L、维生素B120μg/L、硫酸锌4mg/L、硫酸亚铁4mg/L、生物素4μg/L、泡敌0.3g/L。
发酵条件为：29℃，通气量0.5VVM，溶氧量控制在30％以上，罐压0.01Mpa，pH6.5，发酵周期65h。
实施例3微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法
1、制备保藏编号为CICC 20973的谷氨酸棒杆菌种子液
①在无菌条件下用接种环挑取谷氨酸棒杆菌接种于固体斜面培养基上，33℃恒温培养20小时。
斜面培养基的组成为：蛋白胨6g/L、牛肉浸取物4g/L、氯化钠6g/L、琼脂16g/L，pH为7.0。
②刮取斜面培养基上的菌种接种于种子培养基中，33℃培养16h，即得OD562nm为2.1的种子液。
种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L，尿素3g/L，硫酸镁0.3g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，玉米浆25g/L，硫酸亚铁2ppm，硫酸锰2ppm，pH6.5-7.0。
2、补料分批式发酵生产谷氨酰胺
按10％(v/v)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐容积为50L，装液量为35L，补加硫酸铵和麸皮水解液的量分别为1500g、4500mL，将补加的营养成分加水配制成9kg，115℃蒸汽灭菌20分钟后流加至发酵罐中。自发酵10h开始补加营养成分至发酵65h时停止。
发酵结束后，取样进行HPLC测定，发酵液中谷氨酰胺含量达到43g/L。
发酵所用的培养基组成为：葡萄糖15g/L、玉米浆水解液1.5g/L、氯化铵6g/L、磷酸二氢钾0.04g/L、磷酸氢二钾0.04g/L、维生素B125μg/L、硫酸锌8mg/L、硫酸亚铁8mg/L、生物素7μg/L、泡敌0.3g/L。
发酵条件为：32℃，通气量1.5VVM，溶氧量控制在30％以上，罐压0.05Mpa，pH7.5，发酵周期65h。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.微生物发酵补料生产谷氨酰胺的方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为发酵菌株，通过补料批式发酵生产谷氨酰胺；其中，在发酵过程中向发酵液中补加的营养成分为硫酸铵、麸皮水解液；
所述麸皮水解液的制备方法为：将干麸皮和水按1:20的重量比混合置于发酵罐中，用盐酸调pH值1.0，在0.25Mpa，90-121℃的条件下水解20min，放罐后降至室温，过滤取上清液，即得；
发酵所用的培养基组成为：葡萄糖10-15g/L、玉米浆水解液1-1.5g/L、氯化铵3-6g/L、磷酸二氢钾0.02-0.04g/L、磷酸氢二钾0.02-0.04g/L、维生素B1 20-25μg/L、硫酸锌4-8mg/L、硫酸亚铁4-8mg/L、生物素4-7μg/L、泡敌0.3g/L；
发酵条件为：29-32℃，通气量0.5-1.5VVM，溶氧量控制在30％以上，罐压0.01-0.05Mpa，pH6.5-7.5，发酵周期60-72h；
发酵时按8-10％的接种量将种子液接种于发酵罐中，发酵罐容积为50L，装液量为35L，补加硫酸铵和麸皮水解液的量分别为900g-1500g、3000-4500mL，将补加的营养成分加水配制成6kg-9kg，蒸汽灭菌后流加至发酵罐中；
自发酵10-16h开始补加营养成分至发酵50-65h时停止；
发酵所用的菌株为保藏编号CICC 20973的谷氨酸棒杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子液的制备方法如下：
i)斜面培养：用接种环挑取谷氨酸棒杆菌接种于斜面培养基上，29-37℃培养8-20h；斜面培养基的组成为：蛋白胨4-6g/L、牛肉浸取物2-4g/L、氯化钠4-6g/L、琼脂14-16g/L，pH为6.8-7.0；
ii)种子液的制备：刮取斜面培养基上的菌种接种于种子培养基中，29-37℃培养10-18h，即得OD562nm大于0.8的种子液；种子培养基的组成为：葡萄糖20-30g/L，尿素3-7g/L，硫酸镁0.3-0.5g/L，磷酸二氢钾0.8-1.6g/L，玉米浆25-35g/L，硫酸亚铁1.5-2.5ppm，硫酸锰1.5-2.5ppm，pH6.5-7.0。
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