CN110951766B - 利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成l-鸟氨酸的方法 - Google Patents

利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成l-鸟氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L‑鸟氨酸的方法，属于属于生物化工领域。该方法包括以下步骤：（1）重组谷氨酸棒杆菌：在谷氨酸棒杆菌中敲除MtlR的编码基因，然后在谷氨酸棒杆菌中通过***强启动子P NCgl0824 的策略过表达甘露醇脱氢酶的编码基因mtlD，获得重组谷氨酸棒杆菌；（2）好氧发酵合成L‑鸟氨酸：将步骤（1）获得的重组谷氨酸棒杆菌接种于含有甘露醇、玉米浆等成分的发酵培养基中进行好氧发酵生产L‑鸟氨酸。本发明所提供的方法采用了谷氨酸棒杆菌为生产菌株，以海藻水解液的主要成分甘露醇为底物合成L‑鸟氨酸，有潜力代替葡萄糖成为发酵L‑鸟氨酸的主要碳源，缓解L‑鸟氨酸工业规模化生产与人类竞争粮食的问题。

Description

利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法。
背景技术
L-鸟氨酸是尿素循环的中间代谢产物，对体内氨的***具有重要的作用。L-鸟氨酸虽然不编码蛋白质，但存在于短杆菌酪肽、短杆菌肽S等抗菌肽中，具有保护肝脏、增强免疫力等功能。
L-鸟氨酸还被广泛应用于食品、医疗、化工等领域：食品方面，L-鸟氨酸是食品添加剂的主要成分之一，可用于制备乳制食品、肉制食品、烘焙食品、面制食品等；医疗方面，L-鸟氨酸可用于制备保肝护肝药物门冬氨酸鸟氨酸、天冬氨酸鸟氨酸等；化工方面，L-鸟氨酸可代替甘油用于烟丝的加香、防冻保湿剂，用作洗面奶、洗发水、美容霜等的添加剂；饲料方面，L-鸟氨酸可用于制备宠物罐头、动物饲料、水产饲料、兽药产品等。
目前国际市场对L-鸟氨酸总需求量超过5000吨，而主要生产厂家有味之素、田道制药和协和发酵三家企业，产量供不应求。市场上，医药级L-鸟氨酸的单价为35-40万元/吨，价格昂贵。
工业上生产L-鸟氨酸主要有化学法、酶法及工业发酵法，其中，化学法合成L-鸟氨酸存在操作工艺复杂、反应条件要求苛刻及破坏环境等缺点，酶法需要以价格昂贵的精氨酸和精氨酸酶为原料，生产成本受制于精氨酸的价格。而发酵法则是以葡萄糖为底物，通过工程菌种自身体内的生物代谢途径将葡萄糖转化为L-鸟氨酸。与化学法、酶法相比，利用微生物发酵法合成L-鸟氨酸因具备生产成本低、环境污染小等优势而日益成为研究者们关注的焦点。
虽然利用微生物发酵法合成L-鸟氨酸具有广阔的应用前景，但是这种方法需要消耗大量的底物葡萄糖，而工业用葡萄糖主要的来源是淀粉的水解。在地球耕地面积不断减少，人口数量又不断增加的大环境下，以葡萄糖为原料合成L-鸟氨酸显然面临着与人类竞争粮食的问题，并且这个问题所带来的负面影响将与日俱增。
因此有必要提供一种新的L-鸟氨酸发酵生产方法，利用其他碳源替代葡萄糖进行发酵合成L-鸟氨酸，缓解L-鸟氨酸规模化生产与人类竞争粮食的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种新的利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法。
为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：
利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）重组谷氨酸棒杆菌：构建含有敲除负调控蛋白MtlR同源上下臂的重组质粒，导入谷氨酸棒杆菌，敲除负调控蛋白MtlR的编码基因mtlR；然后将强启动子为P NCgl0824 启动子***在mtlD基因上游非编码区，强化表达甘露醇脱氢酶的编码基因mtlD，获得重组谷氨酸棒杆菌；
（2）好氧发酵合成L-鸟氨酸：将步骤（1）中获得的重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中进行好氧发酵合成L-鸟氨酸，谷氨酸棒杆菌的接种量为1-20体积％，发酵温度为30℃；控制摇床转速为250 rpm，发酵时间：72 h；发酵结束后收集发酵液，对所述发酵液的OD600测定与L-鸟氨酸浓度测定。
所述发酵培养基包含甘露醇、玉米浆、硫酸铵、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、MnSO4、FeSO4、CaCO3；
为了获得更好的技术效果，进一步提高L-鸟氨酸的产量，需要优化发酵培养基中甘露醇的浓度；
优选的，所述发酵培养基中各组分的含量为：甘露醇 20-100 g/L、玉米浆 5-25g/L、硫酸铵 10-60g/L、MgSO4 0.2-5 g/L、KH2PO4 0.5-5 g/L、Na2HPO4 0.5-5 g/L、K2HPO4 0.5-5 g/L、MnSO4 0.001-1 g/L、FeSO4 0.001-1 g/L、CaCO3 10-30 g/L；
优选的，所述发酵培养基中各组分的含量为：甘露醇80 g/L、玉米浆20 g/L、硫酸铵50g/L、MgSO42.5 g/L、KH2PO41 g/L、Na2HPO4 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MnSO40.02 g/L、FeSO4 0.02 g/L、CaCO3 10 g/L。
本发明所提供的方法的有益效果在于：
(1) 改变了谷氨酸棒杆菌的发酵底物，由甘露醇代替葡萄糖，甘露醇可从海藻水解液中经过简单的处理得到。
(2) 通过***强启动子的遗传操作手段强化表达甘露醇脱氢酶的编码基因，可加速甘露醇的利用，提高L-鸟氨酸的产量。
附图说明
图1：mtlR基因敲除同源臂mtlR-up和mtlR-down的分别PCR扩增；
图2：mtlR基因敲除同源臂mtlR-up-down的融合PCR扩增；
图3pk18-ΔmtlR重组质粒的菌落PCR验证；
图4：C.glutamicumSO26 ΔmtlR的PCR筛选；
图5：C.glutamicumSO26 和C.glutamicumSO26ΔmtlR的摇瓶发酵产L-鸟氨酸浓度折线图；
图6：mtlD基因过表达同源臂mtlD-up和mtlD-down以及强启动子P NCgl0824 的PCR扩增；
图7：mtlD基因过表达同源臂mtlD-up-P NCgl0824 -down的融合；
图8：C.glutamicumSO26 ΔmtlRP NCgl0824 -mtlD的鉴定；
图9：重组菌C.glutamicumSO26 ΔmtlR和C.glutamicumSO26 ΔmtlRP NCgl0824 -mtlD发酵产L-鸟氨酸折线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
谷氨酸棒杆菌mtlR基因敲除质粒的构建。
以谷氨酸棒杆菌S9114的基因组为模板，以引物mtlR-up-F(aacgacggccagtgccaagctAAATGGTGGCAACCAGCGCAC)和mtlR-up-R(CGCATATGGAATTCGATATCGAGCGGGAATCACTTGGGACATGTG)为引物进行PCR，获得mtlR上游约800bp的同源片段mtlR-up并利用PCR产物回收试剂盒进行纯化（图1）。以谷氨酸棒杆菌S9114的基因组为模板，以引物mtlR-down-F(GCTCGATATCGAATTCCATATGCGTTTTGAGGTCAGCGCAATGAC)和mtlR-down-R(cggtacccggggatcctctagACAAGCAAAGCCTTGCAGGAT)为引物进行PCR扩增，获得mtlR下游约800bp的同源片段mtlR-down使用PCR产物回收试剂进行纯化（图1）。以mtlR-up和mtlR-down片段为模板，以mtlR-up-F和mtlR-down-R为引物进行重叠PCR扩增，获得mtlR-up-down片段（图2）。将谷氨酸棒杆菌***性质粒pK18mobsacB用HindI和XbaI进行双酶切，利用一步法克隆试剂盒(诺唯赞)将mtlR-up-down片段一步连接到pK18mobsacB上，利用M13引物进行PCR验证阳性克隆（图3），获得的重组质粒命名为pK18-ΔmtlR。
实施例2
MtlR基因敲除菌的构建。
利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-ΔmtlR通过电转化转入到产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌SO26中，电击条件为电压3000 V，4ms(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里培养2h，之后涂布于含有10 g/L蔗糖的LB平板上进行二次筛选。利用mtlR-up-F和mtlR-down-R为引物进行菌落PCR，敲除mtlR基因的重组子克隆出来的片段为1.6 Kb，其中筛选到的阳性克隆子，再次利用引物mtlR-check-F（ACCCGTCATGGATTCGCTCGT）和mtlR-down-R进行PCR再次验证，以原始菌作对照，如未能扩增到800左右条带（图4），则认为mtlR基因敲除成功，该重组菌命名为C.glutamicumΔmtlR。
实施例3
原始菌谷氨酸棒杆菌C. glutamicum SO26和重组谷氨酸棒杆菌C. glutamicumSO26 ΔmtlR的发酵培养。
原始菌谷氨酸棒杆菌C. glutamicum SO26和重组谷氨酸棒杆菌C. glutamicumSO26 ΔmtlR在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有10 mL种子培养基的100 mL三角摇瓶中，32℃，220rpm培养12h。
种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖30、玉米浆10、酵母粉10、(NH4)2SO4 15、MgSO42.5、KH2PO4 1、K2HPO4 0.5、Na2HPO4 0.5、CaCO310。
以10％的接种量将种子培养液接种到20 mL发酵培养基当中，发酵采用250 mL三角瓶，温度为32℃，转速控制为250 rpm。
发酵培养基配方包括(g/L)：甘露醇80 g/L、玉米浆20 g/L、硫酸铵50g/L、MgSO42.5 g/L、KH2PO41 g/L、Na2HPO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MnSO4 0.02 g/L、FeSO4 0.02g/L、CaCO3 10 g/L。
发酵72h结束。重组谷氨酸棒杆菌菌株C.glutamicumSO26 ΔmtlR的OD600达到11，L-鸟氨酸产量达到22 g/L（图5）。而原始菌谷氨酸棒杆菌菌株C. glutamicumSO26的OD600为7，L-鸟氨酸产量也只有2.3 g/L。
说明原始菌谷氨酸棒杆菌SO26消耗甘露醇合成L-鸟氨酸的效率较低。敲除mtlR基因可以显著提升谷氨酸棒杆菌利用甘露醇发酵合成L-鸟氨酸的产量。
实施例4
重组谷氨酸棒杆菌C. glutamicumSO26 ΔmtlR发酵培养基甘露醇浓度的优化。
谷氨酸棒杆菌C. glutamicumSO26 ΔmtlR在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有10 mL种子培养基的100 mL三角摇瓶中，32℃，220rpm 培养12h。
种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖30、玉米浆10、酵母粉10、(NH4)2SO4 15、MgSO42.5、KH2PO4 1、K2HPO4 0.5、Na2HPO4 0.5、CaCO310。
以10％的接种量将种子培养液接种到20 mL发酵培养基当中，发酵采用250 mL三角瓶，温度为32℃，转速控制为250 rpm。
发酵培养基配方包括(g/L)：甘露醇20-100 g/L、玉米浆20 g/L、硫酸铵50g/L、MgSO42.5 g/L、KH2PO41 g/L、Na2HPO4 0.5 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、MnSO4 0.02 g/L、FeSO4 0.02g/L、CaCO3 10 g/L。
发酵72 h结束。如图所示，重组谷氨酸棒杆菌菌株C. glutamicumSO26 ΔmtlR于80 g/L甘露醇为碳源的培养基的L-鸟氨酸产量最高（图5）。
实施例5
谷氨酸棒杆菌P NCgl0824 强启动子***mtlD基因重组质粒的构建。
以谷氨酸棒杆菌S9114的基因组为模板，以引物mtlD-up-F(aacgacggccagtgccaagctAACGTTGTGGGTTTCCCTCGT)和mtlD-up-R(GTTTAGCTCGAAAAACAGTTAGG)为引物进行PCR，获得mtlD上游约800bp的同源片段mtlD-up并利用PCR产物回收试剂盒进行纯化（图6，泳道1）。以谷氨酸棒杆菌S9114的基因组为模板，以引物P-F(mtlD)(CCTAACTGTTTTTCGAGCTAAACAACTGTGCCACTAATACGGATAG)和P-R(mtlD)(GGAAAAGATCCTTTCAAGGATGGCAATTTCGCCTGCTTCCGATT)为引物进行PCR扩增，获得200 bp左右的P NCgl0824 强启动子DNA片段，使用PCR产物回收试剂进行纯化（图6，泳道2）。以谷氨酸棒杆菌S9114的基因组为模板，以引物mtlD-down-F(CCATCCTTGAAAGGATCTTTTCC)和mtlD-down-R(cggtacccggggatcctctagCCCATTGGGTGAAATCTTCAG)为引物进行PCR扩增，获得mtlD下游约800bp的同源片段mtlD-down使用PCR产物回收试剂进行纯化（图6，泳道3）。以mtlD-up、P NCgl0824 强启动子和mtlD-down片段为模板，以mtlD-up-F和mtlD-down-R为引物进行重叠PCR扩增，获得mtlD-up-P NCgl0824 -down片段（图7）。将谷氨酸棒杆菌***性质粒 pK18mobsacB用HindI和XbaI进行双酶切，利用一步法克隆试剂盒(诺唯赞)将mtlD-up-P NCgl0824 -down片段一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-P NCgl0824 -mtlD。
实施例6
利用强启动子***策略过表达mtlD基因重组菌的构建。
利用电穿孔仪(伯乐)将pK18-P NCgl0824 -mtlD通过电转化转入到产L-鸟氨酸的C. glutamicumΔmtlR中，电击条件为电压3000 V，4ms(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选。该重组菌进一步在液体LB培养基里培养2h，之后涂布于含有10 g/L蔗糖的LB平板上进行二次筛选。利用P-F(mtlD)和mtlD-down-R为引物进行菌落PCR，如若能扩增到1000左右条带（图8），则认为P NCgl0824 启动子成功***mtlD基因上游，该重组菌命名为C. glutamicumΔmtlRP NCgl0824 -mtlD。
实施例7
重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumSO26 ΔmtlR和C. glutamicumΔmtlRP NCgl0824 -mtlD发酵培养。
重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumSO26 ΔmtlR和C. glutamicumΔmtlRP NCgl0824 -mtlD在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有10 mL种子培养基的100 mL三角摇瓶中，32℃，220rpm 培养12小时。
种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖30、玉米浆10、酵母粉10、(NH4)2SO4 15、MgSO42.5、KH2PO4 1、K2HPO4 0.5、Na2HPO4 0.5、CaCO310。
以10％的接种量将种子培养液接种到20 mL发酵培养基当中，发酵采用250 mL三角瓶，温度为32℃，转速控制为250 rpm。
发酵培养基配方包括(g/L)：甘露醇80 g/L、玉米浆20 g/L、硫酸铵50g/L、MgSO42.5 g/L、KH2PO41 g/L、Na2HPO4 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MnSO40.02 g/L、FeSO4 0.02g/L、CaCO3 10 g/L。
发酵72h结束。谷氨酸棒杆菌菌株C. glutamicumSO26 ΔmtlRP NCgl0824 -mtlD的L-鸟氨酸产量达到27 g/L（图9）。较C. glutamicumSO26 ΔmtlR提高了22.5%。
说明在mtlR基因敲除菌的基础上过表达mtlD可以显著提升谷氨酸棒杆菌利用甘露醇发酵合成L-鸟氨酸的产量。

Claims (3)

1.利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）重组谷氨酸棒杆菌：构建含有敲除负调控蛋白MtlR同源上下臂的重组质粒，导入谷氨酸棒杆菌，敲除负调控蛋白MtlR的编码基因mtlR；然后将强启动子为P NCgl0824 启动子***在mtlD基因上游非编码区，强化表达甘露醇脱氢酶的编码基因mtlD，获得重组谷氨酸棒杆菌；
（2）好氧发酵合成L-鸟氨酸：将步骤（1）中获得的重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中进行好氧发酵合成L-鸟氨酸，谷氨酸棒杆菌的接种量为1-20体积％，发酵温度为30℃；控制摇床转速为250 rpm，发酵时间：72 h；发酵结束后收集发酵液，对所述发酵液的OD600测定与L-鸟氨酸浓度测定；
所述发酵培养基包含甘露醇、玉米浆、硫酸铵、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4、MnSO4、FeSO4、CaCO3。
2.根据权利要求1所述利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述发酵培养基中各组分的含量为：甘露醇 20-100 g/L、玉米浆 5-25 g/L、硫酸铵10-60g/L、MgSO4 0.2-5 g/L、KH2PO4 0.5-5 g/L、Na2HPO4 0.5-5 g/L、K2HPO4 0.5-5 g/L、MnSO4 0.001-1 g/L、FeSO4 0.001-1 g/L、CaCO3 10-30 g/L。
3.根据权利要求1所述利用重组谷氨酸棒杆菌代谢甘露醇合成L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述发酵培养基中各组分的含量为：甘露醇80 g/L、玉米浆20 g/L、硫酸铵50g/L、MgSO42.5 g/L、KH2PO41 g/L、Na2HPO4 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MnSO40.02 g/L、FeSO4 0.02g/L、CaCO3 10 g/L。
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