CN105324481A - 新颖噬菌体和包括所述新颖噬菌体的抗细菌组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新颖噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)。另外，本发明涉及一种抗细菌组成物，其包含所述噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。此外，本发明是一种使用所述噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)或含有所述噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分的所述抗细菌组成物来预防和/或治疗除人类以外的动物的由肠毒性大肠杆菌(Escherichia？coli)导致的传染病的方法。

Description

新颖噬菌体和包括所述新颖噬菌体的抗细菌组成物
技术领域
本发明涉及一种具有针对肠毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli；ETEC)的特异性杀菌活性的新颖噬菌体以及包括所述新颖噬菌体的抗细菌组成物。另外，本发明涉及一种使用所述新颖噬菌体或所述抗细菌组成物来预防或治疗动物疾病的方法。
背景技术
大肠杆菌(下文称为“大肠杆菌(E.coli)”)是一种属于埃希氏菌属(Escherichia)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性(Gram-negative)、短杆状细菌，并且是存在于各种动物(包含哺乳动物)的肠中的正常菌丛中的一种。已知大部分大肠杆菌的菌株是非致病性的并且可能导致机会性感染，但一些高度致病性菌株在动物(包含人类)中导致多种肠疾病和败血症。
大肠杆菌的实例可以包含肠毒性大肠杆菌(ETEC)、致肠病大肠杆菌(enteropathogenicE.coli；EPEC)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli；EHEC)、肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregativeE.coli；EAEC)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvaciveE.coli；EIEC)、产坏死性大肠杆菌(necrotoxigenicE.coli；NTEC)等等。已知在以上各种中，ETEC尤其在猪体内导致与大肠杆菌相关联的传染病。
当前，随着在猪肉行业中大量的猪被集体地饲养，猪中的大肠杆菌病(colibacillosis)已经作为最频繁并且棘手的疾病而成为焦点(非专利文献1)。最近，猪大肠杆菌病的发生率在韩国(Korea)已经增加，其已经由于腹泻而导致幼龄猪的生长迟缓和死亡，从而导致农民的巨大经济损失(非专利文献2)。
为了预防和治疗猪体内的大肠杆菌病，在现有技术中已经向猪投予多种抗生素，但当抗生素被误用或滥用时，误用或滥用的抗生素可能产生抗药性并且残留在猪体内。因此，当前，抗生素的使用已经在全世界受到限制(非专利文献3)。
同时，噬菌体是一种仅感染并且破坏细菌，并且可以仅在宿主细菌内自我复制的特定病毒类型。噬菌体与抗生素相比具有强宿主特异性，并且最近，针对抗生素的菌株耐受性的出现问题较为严重，以使得对噬菌体的实际使用的兴趣已经增加(非专利文献4和非专利文献5)。
因此，对噬菌体的研究已经在全世界的多个国家中积极地进行，并且除了针对噬菌体的专利申请之外，获得对含有噬菌体的组成物的食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration；FDA)批准的尝试已经逐渐增多。
作为噬菌体的现有技术，专利文献1中已经公开7种用于控制大肠杆菌0157：H的噬菌体，并且专利文献2中已经公开一种具有针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的特异性杀菌活性的噬菌体。此外，专利文献3中已经公开衍生自特异性地破坏细菌细胞膜的肽聚糖结构的噬菌体的溶解蛋白，以及由所述溶解蛋白产生的细菌溶解物。
然而，尽管存在以下现有技术，但与噬菌体相关联的用于预防和/或治疗由ETEC导致的传染病(其在家畜行业，包含猪肉行业中仍然是重要的问题)的技术仍然不充足，以使得应该开发噬菌体和与噬菌体相关联的技术。
[现有技术文献]
[专利文献]
(专利文献1)美国专利第6,485,902号
(专利文献2)韩国专利登记号10-0910961B1
(专利文献3)韩国专利特许公开公开号10-2009-0021475A
[非专利文献]
(非专利文献1)朴杨Il(YoungIlPark)，猪饲养科学(Swineproductionscience)，先进出版集团(SunjinPublishinggroup)，353-359，1998
(非专利文献2)洪欧澈(EuChulHong)，硕士毕业论文，檀国大学(DankookUniversity)，卵黄在早期断奶仔猪中的加成作用(AdditionEffectofEggYolkinEarlyWeanedPiglets)，2001
(非专利文献3)梅森HS(MasonHS)等人，生物技术趋势(TrendsinBiotech)，13：388-392，1995
(非专利文献4)西斯罗M(CisloM)等人，免疫与治疗学实验文献(Arch.Immunol.Ther.Exp.)2：175-183，1987免疫与治疗学实验文献2：175-183，1987
(非专利文献5)金胜勋(SungHunKim)等人，噬菌体，新颖替代抗生素(Bacteriophage，novelalternativeantibiotics)，生物波(BioWave)第7卷第15期，2005，BRIC
发明内容
技术问题
本发明人进行了研究以便解决如在使用抗生素之后出现的耐受性细菌、残留在肉中的抗生素等等的问题，并且有效地预防和治疗由致病性大肠杆菌导致的传染病，并且因此，本发明人从自然中分离出了具有针对ETEC的特异性杀菌活性的新型噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)。
另外，本发明人鉴别了新颖噬菌体的形态、生物化学以及遗传特征，并且确认了所述噬菌体具有极好的耐酸性、耐热性等等，从而使用所述新颖噬菌体开发抗生素、消毒剂、饲料添加剂以及其它组成物。此外，本发明人开发了一种用于预防或治疗由大肠杆菌导致的传染病的组成物，和使用所述组成物预防或治疗所述疾病的方法。
本发明提供一种具有针对ETEC的特异性杀菌活性的新颖噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)。
另外，本发明提供一种用于预防和/或治疗由ETEC导致的传染病的组成物，其含有噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。
此外，本发明提供一种含有噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
此外，本发明提供一种使用噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)或含有噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分的组成物来预防和/或治疗除人类以外的动物的由ETEC导致的传染病的方法。
问题的解决方案
根据本发明的一个示范性实施例，提供一种具有针对肠毒性大肠杆菌(ETEC)的特异性杀菌活性的新颖噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种用于预防或治疗由ETEC导致的传染病的组成物，所述组成物含有如上文所描述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供含有如上文所描述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分的抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂或清洁剂。
根据本发明的另一个示范性实施例，提供一种预防或治疗由ETEC导致的传染病的方法，其包括向除人类以外的动物投予如上文所描述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物。
本发明的有利作用
根据本发明的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)具有特异性地杀死肠毒性大肠杆菌(ETEC)的作用。
另外，根据本发明的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)具有极好的耐酸性和耐热性，以使得噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)可以用作用于在各种温度或pH范围中预防或治疗由ETEC导致的传染病的物质并且用作抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂、清洁剂等等。
此外，根据本发明，由ETEC导致的传染病可以通过向除人类以外的动物投予噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)或含有噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分的组成物加以预防或治疗。
附图说明
图1是新颖噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P，下文称作“ΦCJ20”)的电子显微镜照片。
图2示出新颖噬菌体ΦCJ20的脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis；PFGE)的结果。
图3示出新颖噬菌体ΦCJ20的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis；SDS-PAGE)结果。
图4是示出新颖噬菌体ΦCJ20的耐酸性测试结果的曲线图。
图5是示出新颖噬菌体ΦCJ20的耐热性测试结果的曲线图。
具体实施方式
在下文中，将对本发明进行详细描述。因为所属领域或类似领域的技术人员可以充分认识和推断出本说明书中未描述的内容，所以将省略其描述。
详细地说，一个大体方面，本发明提供一种具有针对肠毒性大肠杆菌(ETEC)的特异性杀菌活性的新颖噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)。
革兰氏阴性、杆状细菌ETEC是好氧或兼性厌氧的细菌，其分解乳糖或果糖以产生酸和气体。ETEC在通用培养基中良好地生长并且可以在约7℃到48℃下生长，并且最佳生长温度是约35℃到37℃。另外，ETEC可以在4.5到9的pH范围中生长。
因为ETEC产生类似于霍乱弧菌(Vibriocholerae)的肠毒素的肠毒素，所以在ETEC感染的情况下，将展现类似于霍乱的疾病症状的疾病症状。所产生的毒素分成两种，即热不稳定肠毒素(heat-labileenterotoxin；LT)和热稳定肠毒素(heat-stableenterotoxin；ST)。热不稳定肠毒素意指在于60℃下加热10分钟的情况下失去其活性的肠毒素，并且热稳定肠毒素意指即使在于100℃下加热30分钟的情况下仍然不失去其活性与耐受性(doesnotloseitsactivitybuthasresistance)的肠毒素。
在ETEC浓度达到每单位体积(1毫升)浆液为107cfu(菌落形成单位(colonyformationunit))到108cfu，同时ETEC在肠的上部增殖的情况下，ETEC导致由大肠杆菌导致的传染病，如大肠杆菌病。
噬菌体是遏制并且抑制细菌生长的细菌特异性病毒感染特异性细菌，并且意指包含单股或双股脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid；DNA)或核糖核酸(ribonucleicacid；RNA)作为遗传物质的病毒。
根据本发明的噬菌体ΦCJ20，其为选择性感染ETEC的噬菌体物种(bacteriophagespecies-selectivelyinfectingETEC)，具有等距衣壳的结构但未观察到尾部(图1)，并且在形态上属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。
噬菌体ΦCJ20，其为由本发明人新分离的噬菌体，是在韩国微生物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)(韩国首尔市西大门区弘济洞361-221号(361-221，Hongjedong，Seodamun-gu，Seoul，Korea))以保藏编号KCCM11362P于2013年1月30日保藏。
在另一个大体方面中，本发明提供一种用于预防或治疗由ETEC导致的传染病的组成物，其含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分。
因为噬菌体ΦCJ20具有能够特异性地杀死ETEC的抗细菌活性，所以噬菌体ΦCJ20可以用于预防或治疗由ETEC感染产生的疾病。由ETEC导致的传染病的实例可以包含优选地大肠杆菌病，更优选地猪体内的大肠杆菌病，但不限于此。
如本文所用的术语“大肠杆菌病”意指由动物的致病性大肠杆菌感染所导致的疾病，并且其示出如败血症、腹泻(新生腹泻和断奶后腹泻)、毒血症(水肿和脑脊髓血管病)等等的症状。其中，败血症是急性全身性感染，其频繁地在出生之后2天到3天中发生并且具有高死亡率。腹泻是胃肠道感染的最常见结果，其在出生之后1周到2周内的哺乳期期间以及紧接着断奶期之后发生，并且导致死亡或生长迟缓。毒血症主要在断奶期之后在8周龄到12周龄的仔猪中发生，并且频繁地伴随有水肿和神经征象，接着是猝死。
如本文所用的术语“预防”是指向除人类以外的动物提供噬菌体ΦCJ20和/或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物以遏制对应疾病或延迟疾病出现的所有动作。
如本文所用的术语“治疗”是指向除人类以外的动物提供噬菌体ΦCJ20和/或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物从而使得由感染导致的对应疾病的症状好转或减轻的所有动作。
根据本发明的用于预防或治疗由ETEC导致的传染病的组成物可以以优选地5×102pfu/ml(空斑形成单位/毫升)到5×1012pfu/ml、更优选地1×106pfu/ml到1×1010pfu/ml的量含有噬菌体ΦCJ20。
根据本发明的用于预防或治疗由ETEC导致的传染病的组成物可以进一步含有药学上可接受的载剂并且与所述载剂一起配制从而以食物、药物、饲料添加剂、饮用水添加剂等等的形式提供。如本文所用的术语“药学上可接受的载剂”意指既不刺激活有机体也不抑制所投予的化合物的生物活性和特性的载剂或稀释剂。
本发明中可用的载剂种类不受特定限制，并且可以使用任何载剂，只要其通常用于所属领域并且是药学上可接受的。作为载剂的非限制性实例，有生理盐水、无菌水、缓冲盐水、林格氏(Ringer’s)溶液、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇等等。可以使用这些载剂中的一种或至少两种的混合物。
另外，必要时，可以进一步添加并且使用另一种通用添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和/或其类似物，并且组成物可以通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或其类似物来配制成注射配制品(如水溶液、悬浮液、乳液等等)、丸剂、胶囊、粒剂、片剂等等，并且接着被使用。
用于预防或治疗由ETEC导致的传染病的组成物的投予方法不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的任何方法。作为投予方法的非限制性实例，组成物可以经口或肠胃外投予。
作为用于经口投予的配制品的非限制性实例，有糖衣片、***片、片剂、水性悬浮液、油状悬浮液、制备的粉剂、粒剂、乳液、硬胶囊、软胶囊、糖浆、酏剂等等。
为了将根据本发明的组成物配制成配制品，如片剂、胶囊等等，配制品可以进一步含有粘合剂，如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素、明胶；赋形剂，如磷酸二钙等等；崩解剂，如玉米淀粉、甘薯淀粉等等；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰反丁烯二酸钠、聚乙二醇蜡等等。在胶囊配制品的情况下，所述配制品可以另外含有除了上文所提到的物质之外的液体载剂，如脂肪油。
作为肠胃外投予方法，可以使用静脉内投予方法、腹膜内投予方法、肌肉内投予方法、皮下投予方法、局部投予方法等等。另外，还可以使用将组成物施加或喷涂到疾病部位上的方法，但本发明不限于此。
用于肠胃外投予的配制品的实例可以包含用于皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等等的注射配制品；栓剂配制品；喷雾配制品，如能够通过呼吸***被吸入的气雾剂配制品等等，但本发明不限于此。为了将组成物配制成注射配制品，根据本发明的组成物可以与稳定剂或缓冲剂在水中混合从而制备溶液或悬浮液，并且接着，所制备的溶液或悬浮液可以以用于安瓿或小瓶的单位剂量配制。在将组成物配制成喷雾配制品(如气雾剂配制品等等)的情况下，推进剂等等可以与添加剂混合以使经水分散的凝结物或湿粉剂分散。
用于预防或治疗由ETEC导致的传染病的组成物的合适的施加、喷涂或投予剂量可以取决于如年龄、体重、性别、疾病症状的程度、食物的种类、投予标靶动物的***速率等等，以及配制所述组成物的方法、投予方法、投予时间和/或途径的因素来不同地确定。一般来说，在所属领域中具有一般技术的兽医可以容易地确定并且规定用于所需治疗的有效剂量。
在另一个大体方面中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的抗生素。
如本文所用的术语“抗生素”意指能够以药物形式向动物(包含人类)提供从而杀死细菌的药剂，并且对应于总体而言指示防腐剂、消毒剂以及抗菌剂的概念。
含有根据本发明的噬菌体ΦCJ20作为活性成分的抗生素可以具有与根据现有技术的抗生素相比对ETEC的高特异性从而不杀死有益细菌但杀死特异性致病性细菌，并且不诱发抗药性，以使得根据本发明的抗生素可以作为具有与根据现有技术的抗生素相比延长的生命期的新颖抗生素提供。
在另一个大体方面中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂。
根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂可以以其中噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20的组成物以饲料添加剂或饮用水添加剂形式单独地制备并且接着与饲料或饮用水混合的方式使用，或以其中噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20的组成物在制备饲料或饮用水时直接添加的方式使用。
用作根据本发明的饲料添加剂或饮用水添加剂的噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20的组成物可以处于液态或干燥状态，并且优选地呈干燥粉剂形式。
用于制备呈干燥粉剂形式的根据本发明的饲料添加剂和饮用水添加剂的干燥方法不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的方法。作为干燥方法的非限制性实例，有天然空气干燥方法、天然干燥方法、喷雾干燥方法、冷冻干燥方法等等。可以单独使用这些方法中的一种方法或至少两种方法可以彼此一起使用。
另一种非致病性微生物可以另外添加到饲料添加剂或饮用水添加剂中。能够添加的微生物的非限制性实例可以由以下各者组成的族群中选出：能够产生蛋白酶、脂肪酶和/或糖转化酶的芽孢杆菌属(bacillussp.)，如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等等；在厌氧条件(如牛的胃)下具有针对有机物质的生理活性和降解活性的乳杆菌属(Lactobacillussp.)；具有增加家畜体重、乳产量以及饲料消化率的作用的霉菌真菌，如米曲菌(Aspergillusoryzae)等等；以及酵母，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等等。可以使用这些微生物中的一种或至少两种的混合物。
视需要，含有根据本发明的噬菌体ΦCJ20作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂可以进一步含有其它添加剂。作为可用添加剂的非限制性实例，有粘合剂、乳化剂、防腐剂等等，其经添加以便预防饲料或驱动水的质量退化；氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮化合物、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取剂、寡糖等等，其经添加以便增加饲料或饮用水的效用。另外，添加剂可以进一步包含饲料混合剂等等。可以使用这些添加剂中的一种或至少两种的混合物。
以饲料的100重量份计，可以以0.05重量份到10重量份、更优选地0.1重量份到2重量份的含量含有饲料添加剂。以饮用水的100重量份计，可以以0.0001重量份到0.01重量份、更优选地0.001重量份到0.005重量份的含量含有饮用水添加剂。在上文所提到的范围内，噬菌体ΦCJ20针对ETEC的活性可以充分展现。
在另一个大体方面中，本发明提供一种饲料或饮用水，其是通过添加含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的饲料添加剂或饮用水添加剂或直接添加噬菌体ΦCJ20而制备。
用于本发明的饲料不受特定限制，而可以使用通常用于所属领域的任何饲料。饲料的非限制性实例可以包含植物饲料，如谷物、根部以及果实、食物加工副产物、藻类、纤维、药学副产物、脂肪、淀粉、葫芦科或谷物副产物；以及动物饲料，如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物质、单细胞蛋白质、动物浮游生物或食物。可以使用这些饲料中的一种或至少两种的混合物。
用于本发明的饮用水不受特定限制，而可以使用通常用于本发明的任何饮用水。
在另一个大体方面中，本发明可以提供一种含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的消毒剂或清洁剂。消毒剂或清洁剂的配制品不受特定限制，而可以将所述消毒剂或清洁剂配制成所属领域中已知的任何配制品。
可以将消毒剂喷洒到动物生活的区域、屠宰场、死亡产生区域(mortalitygenerationarea)、烹饪场所或烹饪设备等等以便去除ETEC，但本发明不限于此。
清洁剂可以用于洗涤动物身体暴露于或将暴露于ETEC的皮肤表面或部位中的每一个，但本发明不限于此。
在另一个大体方面中，本发明提供一种通过使用噬菌体ΦCJ20或包括噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物来预防或治疗传染病的方法。
详细地说，根据本发明的预防或治疗传染病的方法可以包含向感染ETEC或处于感染ETEC风险下的除人类以外的标靶以药学上有效的剂量投予噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物。所属领域的技术人员将显而易见，当向患者投予药学组成物时，合适的总日剂量(totaldailydose)可以由主治医生或兽医在合理的医学判断范围内确定。
对于特定动物，噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物的特定药学上有效剂量可以通过考虑噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20的组成物的投予时间和投予途径；组成物的分泌速率；治疗持续时间段等等；以及所需反应的种类和程度；对应个体的年龄、体重、大体健康状态、性别或饮食来确定。另外，药学上有效剂量可以根据各种因素不同地改变，如同时或独立地使用的药物或其它组成物的成分，以及在医学领域中熟知的类似因素。
根据本发明的噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物可以以药学形式(经鼻喷雾)向动物投予，或以直接添加到动物的饲料或饮用水并且接着饲喂所述饲料或饮用水的方法投予。另外，噬菌体ΦCJ20或含有所述噬菌体ΦCJ20的组成物可以以饲料添加剂或饮用水添加剂的形式混合在饲料或饮用水中并且接着投予。
根据本发明的噬菌体ΦCJ20或含有噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物的投予途径和投予方法不受特定限制，而可以使用任何投予途径和投予方法，只要噬菌体ΦCJ20或含有所述噬菌体ΦCJ20的组成物可以到达对应的标靶组织。即，噬菌体ΦCJ20或含有所述噬菌体ΦCJ20作为活性成分的组成物可以通过各种经口或肠胃外途径投予。作为投予途径的非限制性实例，可以进行经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下以及经鼻投予、吸入等等。
在下文中，将通过实例详细描述本发明。然而，这些实例仅为了说明本发明，并且本发明的范围不限于这些实例。
[实例1]-感染ETEC的噬菌体的分离
<实例1-1>
噬菌体的筛分和单个噬菌体的分离
在4,000转/分钟下离心从猪粪便获得的50毫升样品以及忠清道洪城郡广川区(Gwangcheonarea，Hongseong-gun，ChungchongProvince)的三合Gps.育种农业(SamwhawGps.BreedingAgri.)的环境样品10分钟之后，用0.45微米过滤器过滤上清液以制备样品溶液，并且接着使用所制备的样品溶液进行软琼脂覆盖方法。软琼脂覆盖方法是使用生长在顶部琼脂中的宿主细胞(使用0.7％琼脂附着到固体培养基上)观察噬菌体溶解作用的方法。
详细地说，将18毫升样品滤液与从首尔国立大学兽医学院(CollegeofVeterinaryMedicine，SeoulNationalUniversity)获得的ETEC(SNU105)的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)和2毫升10×卢里亚贝尔塔尼(LuriaBertani；LB)培养基(胰蛋白胨10克/升；酵母提取物5克/升；以及NaCl10克/升)混合，并且在30℃下培养18小时。接着，在4,000转/分钟下离心培养物溶液10分钟，并且用0.45微米过滤器过滤上清液。接着，在将3毫升0.7％(w/v)琼脂与150微升ETEC(SNU105)摇晃培养物溶液(OD600＝2)的混合溶液倾倒并且硬化到LB平板培养基上之后，将10微升样品溶液滴落到其上，接着在30℃下培养18小时。接着，确认形成空斑。
因为已知一种噬菌体存在于单个空斑中，所以试图从所形成的空斑分离单一噬菌体。详细地说，将空斑添加到400微升SM溶液(NaCl(5.8克/升)；MgSO47H2O(2克/升)；1MTris-Cl(pH7.5，50毫升))并且保持在室温下4小时，从而获得噬菌体溶液。在其之后，将100微升噬菌体溶液与5毫升0.7％(w/v)琼脂和150微升ETEC(SNU105)摇晃培养物溶液(OD600＝2)混合，接着使用直径为150米的LB培养基进行软琼脂覆盖方法。进行培养直到ETEC完全溶解。在培养终止之后，将5毫升SM溶液添加到LB平板培养基上并且保持在室温下4小时，从而获得噬菌体溶液。
在回收溶液并且向其中添加1％(v/v)氯仿之后，混合混合物10分钟，接着在4,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。用0.45微米过滤器过滤所获得的上清液，从而获得最终样品。
<实例1-2>
噬菌体的大规模培养和纯化
使用ETEC(SNU105)大规模培养在实例1-1中获得的噬菌体，并且接着自其纯化噬菌体。
详细地说，在摇晃培养ETEC(SNU105)之后，并且在4000转/分钟下离心1.51010cfu的等分试样10分钟并且接着使其再悬浮于4毫升SM溶液中。向其接种1.5×106pfu的噬菌体(感染复数(multiplicityofinfection；MOI)＝0.0001)，并且保持在室温下20分钟。在其之后，将溶液接种到150毫升LB培养基中并且在30℃下培养5小时。
在培养终止之后，以最终体积的1％(v/v)的量添加氯仿并且搅拌20分钟。接着，添加限制酶DNaseI和RNaseA以便分别具有1微克/毫升的最终浓度，并且溶液保持在30℃下30分钟。接着，添加NaCl和聚乙二醇(polyethyleneglycol；PEG)以便分别具有1M和10％(w/v)的最终浓度，并且进一步保持在4℃下3小时，接着在4℃和12,000转/分钟下离心20分钟，从而获得沉淀物。
使所获得的沉淀物悬浮于5毫升SM溶液中并且保持在室温下20分钟。接着，向其添加1毫升氯仿并且搅拌，接着在4℃和4,000转/分钟下离心20分钟，从而获得上清液。在其之后，用0.45微米过滤器过滤上清液，并且进行使用甘油密度梯度方法(密度：40％，5％甘油)的超速离心法(35,000转/分钟，1小时，4℃)，从而纯化噬菌体。
本发明人将通过从猪粪便提取样品而获得的具有针对ETEC的特异性杀菌活性的噬菌体指定为“噬菌体ΦCJ20”，并且于2013年1月30日以保藏编号KCCM11362P将所述噬菌体保藏在韩国微生物保藏中心(韩国首尔市西大门区弘济洞361-221号)。
<实例2>
检查对大肠杆菌的ΦCJ20感染
为了确认在实例1中纯化的噬菌体ΦCJ20是否对除ETEC(SNU105)以外的大肠杆菌物种具有溶解活性，进行与其它大肠杆菌物种的交叉感染。
详细地说，培养2种ETEC(SNUJG280和SNU105)菌株和11种非致病性大肠杆菌菌株(MC4100、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、2616、281、1917、DH5a、GM2929、Tuner(DE3)、W3110以及K12G)，从而分别获得培养物溶液。接着，使用培养物溶液和纯化的噬菌体ΦCJ20中的每一个以进行软琼脂覆盖方法，并且确认是否形成空斑。
结果在下表1中示出。
表1
[表1]
如表1中示出，可以确认，在非致病性大肠杆菌菌株中，在实例1中纯化的噬菌体ΦCJ20对于9种非致病性大肠杆菌菌株(MC4100、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、1917、DH5a、GM2929、Tuner(DE3)、W3110以及K12G)具有溶解活性，但对于剩余的2种非致病性大肠杆菌菌株(2616和281)不具有溶解活性。
<实例3>
观察ΦCJ20的形态
将在实例1中纯化的噬菌体ΦCJ20稀释于0.01％明胶溶液中，并且接着固定在2.5％戊二醛溶液中。将固定的噬菌体滴落到碳涂布云母培养板(约2.5×2.5毫米)上，对其进行适应10分钟，并且用无菌蒸馏水洗涤。将碳膜安放在铜栅格上，用2％乙酸铀酰染色30到60秒，将其干燥，并且使用透射电子显微镜(JEM-1011，80千伏，放大率：×120,000到×200,000)研究(图1)。
图1是噬菌体ΦCJ20的电子显微镜照片。可以了解，噬菌体ΦCJ20具有等距衣壳但不具有尾部，以使得所述噬菌体ΦCJ20在形态上属于短尾噬菌体科。
<实例4>
ΦCJ20的基因组DNA大小分析
从实例1中所纯化的噬菌体ΦCJ20提取基因组DNA。
详细地说，向纯化噬菌体ΦCJ20的培养物溶液添加20mM乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid；EDTA)、50微克/毫升蛋白酶K以及0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate；SDS)，并且保持在50℃下1小时。添加等体积的苯酚(pH8.0)并且搅拌，接着在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。
将所述上清液与等体积的PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合并且在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。将所述上清液与等体积的氯仿混合并且在室温和12,000转/分钟下离心10分钟，从而获得上清液。以上清液总体积计，将所获得的上清液依次与10％(v/v)3M乙酸钠和双倍体积的冷95％乙醇混合，并且保持在-20℃下1小时。接着，在0℃和12,000转/分钟下进行离心10分钟，并且通过去除上清液来获得沉淀物。接着，向其添加50微升Tris-EDTA(Tris-EDTA；TE)缓冲液(pH8.0)从而使所获得的沉淀物溶解。将所提取的DNA稀释10次，并且通过测量在OD260下的吸光度来测量浓度。
接着，将1微克DNA装载到1％脉冲场凝胶电泳(PFGE)琼脂糖凝胶上，并且使用伯乐(BIORAD)PFGE***程序7(大小范围：25kb到100kb；切换时间斜坡：0.4到2.0秒，线性形状；正向电压：180伏；反向电压：120伏)在室温下进行电泳20小时(图2)。
图2是噬菌体ΦCJ20的基因组DNA的脉冲场凝胶电泳(PFGE)照片，并且可以确认噬菌体ΦCJ20的基因组DNA具有约40kb的大小。在图2中，M是变成用于测量分子量的标准的DNA。
<实例5>
ΦCJ20的蛋白质图谱分析
将在1010pfu/ml效价下的15微升纯化噬菌体ΦCJ20溶液与3微升5×SDS样品溶液混合，并且加热5分钟。接着，进行12％SDS-PAGE(图3)。
图3是示出对噬菌体ΦCJ20进行的SDS-PAGE的结果的电泳照片，并且观察到具有约46.5kDa(千道尔顿)、43kDa、39.5kDa以及17.1kDa大小的主要蛋白质。
<实例6>
ΦCJ20的遗传特征分析
为了确认实例1中所纯化的噬菌体ΦCJ20的遗传特征，使用基因分析设备FLX钛定序器(罗氏(Roche))分析噬菌体ΦCJ20的DNA。基因是在千年基因公司(MacrogenINC.)使用GS和重新装配软件(罗氏)装配。开放阅读框的序列分析是使用GeneMArk.hmm、Glimmerv3.02以及FGENESB软件来进行。开放阅读框的鉴别是使用BLASTP和InterProScan程序来进行。
噬菌体的基因组序列与现存经报告的噬菌体的基因组序列具有各种类似性，但确认了不存在所有碎片都与本发明噬菌体的碎片(fractions)完全(100％)相同的噬菌体。因此，可以确认所述噬菌体是新分离的噬菌体。
下表2示出通过比较ΦCJ20的基因组序列与其它噬菌体的经解码基因组序列的同系物所获得的结果，并且以下示出ΦCJ20的部分基因组序列。
表2
[表2]
请参见附件中的[ΦCJ20的部分基因组序列]。
<实例7>
取决于pH的ΦCJ20的稳定性测试
为了确认噬菌体ΦCJ20是否可以在胃中的低pH环境中具有稳定性，在宽pH范围(pH3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、7.5、8.3、9.2以及11.0)内进行稳定性测试。
为了测试，分别以0.2M的浓度制备各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH4.0、pH5.5以及pH6.4)、柠檬酸钠缓冲液(pH3.0和pH3.5)、磷酸钠缓冲液(pH6.9和pH7.4)以及Tris-HCl溶液(pH8.2、pH9.0、pH9.8以及pH11.0))。
在将180微升所述pH溶液中的每一个与效价为2.1×1010pfu/ml的20微升噬菌体溶液混合以使得pH溶液中的每一个的浓度都变为1M之后，并且将所述pH溶液中的每一个都保持在室温下2小时。在对照组中，将20微升噬菌体溶液(2.1×1010pfu/ml)与180微升SM溶液混合并且接着保持在室温下2小时。接着，逐步稀释反应溶液，在每个步骤滴落10微升经稀释的溶液并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价(图4)。
图4示出噬菌体ΦCJ20的耐酸性测试的结果。如图4中示出，可以确认，与对照组相比，噬菌体ΦCJ20在5.0到11.0的pH范围中未失去其活性并且是稳定的。
<实例8>
取决于温度的ΦCJ20的稳定性测试
进行测试，其用于确认在使用噬菌体作为所述噬菌体的配制品中的饲料添加剂配制品的情况下，针对在所述噬菌体的配制过程期间产生的热的稳定性。
详细地说，将浓度为2.0×1010pfu/ml的100微升噬菌体ΦCJ20溶液分别保持在37℃、42℃、53℃以及60℃下0分钟、30分钟、60分钟以及120分钟。接着，逐步稀释以上溶液，在所述步骤中的每一个中滴落10微升经稀释的溶液并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时，并且在存在或不存在溶解的情况下测量效价(图5)。
图5示出噬菌体ΦCJ20的耐热性测试的结果。如图5中示出，噬菌体ΦCJ20即使暴露于53℃高达2小时仍然维持其活性，但当暴露于60℃时，其活性根据暴露时间而减小。
<实例9>
在ETEC的野生型菌株上的ΦCJ20感染谱测试
除用于实验的ETEC(SNU105)以外，还在从首尔国立大学兽医学院和加拿大(Canada)的圭尔夫大学(UniversityofGuelph)获得的15个ETEC野生型菌株上测试了噬菌体ΦCJ20是否具有溶解活性。
详细地说，滴落效价为109pfu/ml并且与所述菌株中的每一个的150微升摇晃培养物溶液(OD600＝2)混合的10微升噬菌体ΦCJ20溶液，并且通过软琼脂覆盖方法在30℃下培养18小时。接着，观察是否形成空斑。
结果在下表3中示出。
表3
[表3]
如表3中示出，噬菌体对于F血清型K88(SNU105、SNU107、SNU160、SNU162、SNUF4、SNU3220、CANR08以及SNUJG280)以及ETECO血清型O149(SNU107、SNUF4、SNUJG280、SNU3220、CANR08以及SNU0149)(其为在一般农场中猪腹泻的最常见病因)示出感染性。因此，可以预期，噬菌体将在实际上施加所述噬菌体时示出极好的效率。
申请人或代理人的文件参考号P13-5115 国际申请编号
涉及保藏微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
PCT/RO/134表

Claims (8)

1.一种新颖噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)，其具有针对肠毒性大肠杆菌(ETEC)的特异性杀菌活性。
2.一种组成物，用于预防或治疗由ETEC导致的传染病，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。
3.根据权利要求2所述的组成物，其中所述传染病是大肠杆菌病。
4.一种抗生素，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。
5.一种饲料添加剂或饮用水添加剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。
6.一种消毒剂或清洁剂，其包括根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)作为活性成分。
7.一种预防或治疗由ETEC导致的传染病的方法，其包括向除人类以外的动物投予根据权利要求1所述的噬菌体ΦCJ20(KCCM11362P)或根据权利要求2所述的组成物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述传染病是大肠杆菌病。
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