KR100974185B1 - 박테리오파지 유래 용균단백질 작용에 의해 제조된세균파쇄물 및 이를 포함하는 동물질병 예방용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세균에 원인한 동물의 감염성 질병 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균 세포막의 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시키는 박테리오파지 유래 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 사멸된 세균파쇄물을 포함하는 질병 예방용 백신조성물에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소의 작용으로 사멸시킨 세균파쇄물은 독성이 있는 균주로 전환되지 않아 생균백신이나 약독생균 백신에 비하여 사용상 안전하면서 면역을 유도하기 위한 항원성이 생균백신과 유사해 세균에 대한 방어능이 뛰어난 조성물로서, 세균에 원인한 동물의 감염성 질병 예방용 백신 또는 사료첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

펩티도글리칸, 박테리오파지, 용균단백질, 리신효소, 세균파쇄물, 백신

Description

박테리오파지 유래 용균단백질 작용에 의해 제조된 세균파쇄물 및 이를 포함하는 동물질병 예방용 백신 조성물 {Bacteria lysates prepared by bacteriolytic lysin enzyme, and vaccine composition for preventing animal disease comprising the same}

본 발명은 세균(bacteria)에 원인한 동물의 감염성 질병 예방용 백신(vaccine) 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세균의 세포막에 존재하는 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시키는 박테리오파지 유래 용균단백질(bacteriolytic protein; lytic protein)인 리신(lysin) 효소(enzyme)작용에 의해 사멸된 세균파쇄물(bacterial lysate; whole cell lysate; whole cell homogenate)을 유효성분으로 포함하는 질병 예방용 백신조성물에 관한 것이다. 본 발명의 용균단백질인 리신효소의 작용으로 사멸된 세균파쇄물은 독성이 있는 균주로 전환되지 않아 생균백신이나 약독생균 백신에 비하여 사용상 안전하면서 면역을 유도하기 위한 항원성(이를 면역원성, 또는 백신의 효능이라고도 함)은 생균백신과 유사하다. 따라서 본 발명에서 개시한 세균파쇄물은 세균에 대한 방어능이 뛰어난 조성물로서, 세균에 원인한 동물의 감염성 질병 예방용 백신 또는 사료첨가제로 유 용하게 사용될 수 있다.

백신이란 감염증의 예방을 위하여 동물을 능동적으로 면역하기 위하여 쓰이는 항원(抗原; antigen), 또는 항원을 유효성분으로 함유한 생물학적 제제로서 프랑스의 미생물학자 L.파스퇴르에 의하여 제창되었다. 특히 생물학 제제로서의 백신은 감염성 질병 예방을 목적으로 동물에게 투여되어 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 지칭한다. 통상 백신을 투여하면 생체에서는 해당 항체가 만들어져 면역이 획득되며, 일단 생성된 항체는 비교적 오랫동안 생체 안에 남아있게 되어, 해당 질병의 원인균에 의한 감염이 발생하더라도 이에 대한 방어가 가능하여 결과적으로 질병을 예방할 수 있는 것이다. 이러한 백신은 인간, 가축 등을 포함한 대부분의 동물에 있어서 폭넓게 활용되고 있다.

통상적으로 백신제제에는 세균을 사멸시켜 사용하는 사균백신(killed vaccine), 불활성 백신(inactivated vaccine), 살아있는 세균을 그대로 사용하는 생균백신(live vaccine), 생균을 약화시킨 약독균주 (attenuated strain)를 사용하는 약독화 백신 (attenuated vaccine), 세균의 톡소이드(toxoid) 또는 이것의 유도체 등 다양한 종류가 존재한다. 더불어, 최근 분자생물학 및 생명공학의 급속한 발전으로 인하여 유전자재조합 방법을 통해 병원균의 특정 유전자를 이용하는 DNA 백신 등 새로운 형태의 백신제제 기술이 개발되고 있다.

효과적인 백신개발에 있어서 중요한 점은, 백신이 면역을 유도하기 위한 충분한 항원성을 가지고 있어야 한다는 것이며, 이를 위해서는 질병을 일으키는 원인체에 대해 항체의 형성을 원활하게 하여 생체 내 면역반응이 적절히 유도되도록 해야 하기 때문에, 가능한 질병 원인체에 유사한 형태로 개발되는 것이 바람직하다. 즉, 백신제제의 제조 시에 항원 부위가 최대한 보존되어야 한다. 이 때문에 아무 처리도 하지 않고 생균을 그대로 사용하는 생균백신이 백신으로서는 가장 좋은 효과를 나타낼 수 있다. 하지만, 생균백신의 경우 질병을 야기하는 질병 원인체를 살아 있는 채로 이용하는 것이기 때문에, 향후 독성이 있는 균주로 전환되어 오히려 질병을 유발할 수 있는 위험성을 가지고 있어 극히 일부 감염성 질환에 있어서만 사용되고 있는 실정이다. 이런 단점을 극복하기 위한 대안으로 생균을 약독화시킨 약독화백신이 개발되어 사용되어지고 있지만, 이 경우 일반적으로 항원성이 생균백신에 비해 약화되어 백신으로서의 효과가 떨어지고, 또한 여전히 안전하다고도 할 수 없는 문제점을 가지고 있다. 사용상 안전성 때문에 개발된 사균백신은 비록 상기의 안전성 관점에서의 문제점을 해결할 수는 있지만 항원성이 생균백신이나 약독백신에 비해 크게 떨어지는 것이 일반적이다. 이에 따라, 사균백신처럼 사용상 안전하면서도 생균백신처럼 항원성이 뛰어난 이상적인 새로운 백신제제의 개발이 요청되어 왔었다.

사균백신의 낮은 항원성은 사독백신의 제조방법에 기인한 것으로 추정된다. 기존의 사균백신 제조에서는 세균을 56~60℃로 30~60분 정도 가열하거나, 포르말린, 페놀, 마조닌 등의 화학약품을 첨가하거나, 또는 자외선의 조사 등의 방법으로 세균을 죽여 제조한다. 이러한 제조방법에서는 항원성에 관련된 항원부위가 제조 공정 중에 가해진 물리, 화학적 자극에 의해 변성되어 결과적으로 생균백신에 비해 상당히 감소된 항원성을 가진 백신이 얻어지게 된다. 따라서 항원부위의 변성을 가급적 적게 초래하는 온화한 제조법의 개발도 요청되고 있다.

한편, 사균백신의 한 형태라고 할 수 있는 세균파쇄물을 백신으로 사용하는 경우는 일반적이지는 않지만, 일부 사례가 보고되고 있다 (FEMS Immunology & Medical Microbiology 50: 249-256, 2007; J Med Microbiol 52: 217-222, 2003; 미국특허 6787146). 이들 사례에서, 세균을 파쇄하는 방법으로 동결-해동의 반복(freeze-thawing), 삼투적 파괴(osmotic bursting), 미세하게 갈기(grinding), 초음파 분쇄(sonication), 폴리트론(polytron)의 사용, 믹서(blender)의 사용, 조직파쇄기(tissue homogenizer)의 사용, 및 이들을 혼합한 방법이 이용되고 있다. 이들 방법은 대부분 과격한 자극을 주어 세균을 파쇄하는 방법이기 때문에 이를 통하여 얻어진 세균파쇄 산물의 항원부위가 물리적 또는 화학적으로 변성될 수 있으므로 백신의 항원성의 약화를 초래한다. 또한 이들 방법은 일정한 형태없이 무작위적으로 세균을 파쇄하기 때문에 정형화된 형태의 세균파쇄물을 제공하지 않는다. 따라서, 효능이 극대화된 사균백신을 얻으려면 이들 기존방법에 비해 온화한 조건에서 세균파쇄가 가능하고, 또 그 세균파쇄 양상이 일정한 정형화된 세균파쇄가 가 능한 방법이 필요하다.

박테리오파지는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 보통 파지라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 박테리오파지는 생존에 숙주가 반드시 필요하며 모든 세균에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다.

박테리오파지는 숙주에 침투하여 복제 과정을 끝낸 다음, 숙주인 세균의 세포벽을 분해하기 위해 필요한 일군의 효소를 발현시킨다. 이들 효소는 세포벽의 경직성(rigidity) 및 기계적 강도 (mechanical strength)를 담당하는 세포벽의 펩티도글리칸 (peptidoglycan) 층을 공격하여 세포벽을 파괴한다. 즉, 이러한 박테리오파지의 용균단백질은 박테리오파지가 숙주로부터 밖으로 나올 때, 숙주의 세포벽을 파괴하는 역할을 하는 단백질이다. 이러한 박테리오파지의 용균단백질을 보통 리신이라고 부르기도 한다. 특히, 리신효소의 경우, 바이오테러에 있어서 생화학무기로 사용될 수 있는 탄저균을 사멸하는데 이용된 사례 (Nature 418: 884-889, 2002)가 보고되면서, 세균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 리신효소 및 그 작용에 대한 연구가 활발해 지고 있다.

결론적으로, 종래부터 요청되어온 기술의 개발을 통하여, 세균에 원인한 감염성 질환을 효과적으로 예방할 수 있는 안전한 백신제제의 개발은 매우 중대한 문제라 할 수 있다. 특히 생균백신처럼 생체 내 면역반응을 효과적으로 유도시킬 수 있으면서도 향후 독성이 있는 균주로 전환되지 아니하여 사용상 위험성이 없는 백신제제의 개발은 항상 요구되어 왔으며 이것에 관련된 기술의 개발은 사회적 및 경제적으로 파급효과가 매우 크다고 할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 세균에 의해 유발되는 동물 감염성 질병을 예방하기 위한 백신제제로서, 생균백신에 가능한 최대로 유사한 정도의 항원성을 보유하면서, 사균백신처럼 사용상 안전한, 세균감염성 질환의 예방 및 치료에 효과적인 백신을 개발코자 하였다.

특히 박테리오파지 유래 용균단백질인 리신효소가 세균의 세포막에 있는 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시킨다는 점에 착안하여, 이 특성을 활용한 백신조성물을 개발하고자 노력한 결과, 독성이 있는 균주로 전환되지 않아 사용상 안전하면서도 항원성이 뛰어난 백신조성물 제조기술을 개발할 수 있었고, 여러 감염성 질환의 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 모델 세균으로 선택하여 본 발명의 백신조성물이 유용하게 세균감염 예방에 사용될 수 있음을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 박테리오파지 유래 용균단백질인 리신효소를 이용하여 세균 세포막 펩티도글리칸 구조물을 파괴시켜 세균을 사멸시킨 후 얻어진 세균파쇄물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 백신조성물을 제공하여 동물의 감염성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용케 하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 세균파쇄물을 동물에 투여한 후 생성되는 항체를 유효성분으로 포함한 동물 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 기존 사균백신의 제조방법을 탈피하여 전혀 새로운 사균백신의 제조방법을 고안하였다. 기존 제조법에서 빈번하게 발생하는 과격한 조건에 의한 항원부위의 변성을 줄이기 위해, 본 발명자들은 좀더 온화한 사균백신 제조방법을 고안하고자 노력하였으며 결과적으로 박테리오파지 유래의 용균단백질을 이용함으로써 이를 가능하게 하였다.

본 발명은 세균 세포막의 펩티도글리칸 구조물을 파괴하는 박테리오파지 유래의 용균 단백질인 리신효소를 이용하여 세균을 특이적으로 사멸시켜 제조한 세균파쇄물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 백신조성물 및 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세균파쇄물을 동물에 투여한 후 생성되는 항체를 유효성분으로 포함하는 동물 감염성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은, 본 발명의 모델 대상 세균인 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규 박테리오파지를 분리하였으며, 이렇게 선별된 박테리오파지를 2006년 6월 14일자로 농업생명공학연구원(기탁번호 KACC 97001P)과 2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (기탁번호 KCTC 11153BP)에 재차 기탁하였으며, 관련 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2006-55461호). 이에 더하여 본 발명자들은, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 상기 박테리오파지의 유전정보를 이용하여, 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지 유래의 신규 항균단백질을 제공하는 발명을 개시한 바도 있다 (대한민국 특허출원 제2006-73562호).

박테리오파지 및 리신효소와 관련한 연구는 전세계적으로 활발히 연구되고 있으며, 이는 항생제 사용의 문제점이 부각되면서 기존 항생제에 관련된 문제를 해결할 수 있는 새로운 소재로 인식되어, 여러 국가에서 박테리오파지 및 리신효소에 대한 연구가 최근 활발히 진행 중에 있다.

하지만, 이러한 리신효소와 관련한 연구는 주로 항생제 대체제로서의 연구 내지, 또는 세균 사멸능을 갖는 리신효소 자체를 주사제 또는 치료제로 사용하여 특정세균을 제거시키고자 하는 노력이 주를 이루고 있는 상황으로, 본 발명과 같이 리신효소의 세균 파쇄능을 활용하여 제조한 세균파쇄물을 백신조성물 등 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용한 경우는 현재까지 보고되어 있지 않다.

본 발명자들은 통상적으로 알려진 바대로, 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소가 세균 세포벽의 펩티도글리칸 구조물 및 세균 세포벽의 바깥 세포벽만을 특이적으로 파괴시킨다는 점에 착안하여, 특정 세균이 리신효소 작용으로 사멸된 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 백신조성물을 개발하게 되었으며, 본 백신조성물에 포함된 세균파쇄물은 세포벽이 완전히 파괴되어 있어 더 이상 독성이 있는 균주로 전환되지 못해 기존 생균백신의 단점이라 할 수 있는 향후 독성이 있는 균주로 전환되어 질병을 초래하는 것이 불가능하다는 장점을 가지면서도, 항원부위가 생균백신의 원형 그대로에 가장 부합하는 형태를 제공한다.

본 발명자들은 가장 부합하는 백신 형태를 사균백신에서 찾고자 했으며, 사균백신 중에도 세균파쇄물에 근거한 백신 형태를 본 발명의 출발점으로 하였다. 기존 세균파쇄물에 기반한 백신 제조에서 세균 파쇄 시 이용되던 방법이 다소 과격한 조건이라 얻어진 세균파쇄물의 항원부위가 물리적 또는 화학적으로 변성될 수 있고 또한 이들 방법은 일정한 형태없이 무작위적으로 세균을 파쇄하기 때문에 정형화된 형태의 세균파쇄물을 제공하지 않아, 결국 백신의 항원성의 약화를 초래하는 점을 주시하고 온화한 조건에서 세균파쇄가 가능하고, 또 그 세균파쇄 양상이 일정한 정형화된 세균파쇄가 가능한 방법을 고안하고자 노력하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서는 세균파쇄물을 얻기 위해 박테리오파지 유래의 용균단백질을 이용한다. 박테리오파지 유래의 용균단백질에 의한 세균 파쇄는 생물학적 반응으로 기존 방법에 비하여 상대적으로 매우 완화한 조건이고, 용균단백질이 세균을 무작위로 파괴하지 않고 특정 부위를 규칙적으로 절단하여 세균을 파괴하기 때문에 기존 방법에 비하여 상대적으로 일정한 세균파쇄물의 양상을 제공한다.

비록 똑같은 잠재적 항원(potential antigen)을 갖고 있다 하더라도 그것의 구현 형태에 따라 실제 백신 효과에서는 큰 차이가 날 수 있다(The Journal of Immunology 178: 48.16,2007). 이는 실제 면역시스템의 반응이 구현 형태에 따라 각기 제각각이기 때문이다. 따라서 백신 제조법의 미세한 차이가 실제 백신의 효능에서는 큰 차이로 나타날 수 있다.

본 발명에서는 세균파쇄물의 이용에 관하여 개시하고 있다. 그러나 이 세균파쇄물은 추가로 처리되어 같은 용도로 사용되어질 수 있다. 크기에 의한 분획(fraction)의 사용, 특이항원 백신(subunit vaccine)으로의 사용 등 특정 부분 또는 성분만을 백신의 목적으로 사용하는 것은 당분야에서는 일반적이다 (J Med Microbiol 52: 217-222, 2003). 따라서 이에 대한 상세한 설명은 하지 않지만 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다 할 것이다. 통상 이용할 수 있는 분획화(fractionation) 방법으로는, 원심분리(centrifugation), 여과(filtration), 투석(dialysis), 전기영동(electrophoresis), 흡착 크로마토그라피(affinity chromatography), 이온교환 크로마토그라피(ion exchange chromatography), 크기배제 크로마토그라피(size exclusion chromatography), 황화암모늄 침전법(ammonium sulfate precipitation) 등이 있다. 참고로 세균파쇄물에서 세균파쇄에 이용한 박테리오파지 유래의 용균단백질도 제거할 수 있지만, 이는 추가적 정제 비용을 유발하고 또한 백신조성물의 투여 초기에 세균파쇄물에 포함된 용균단백질에 의한 해당 세균의 사멸 효과를 제거하게 된다. 따라서 이는 전적으로 주관적 판단의 문제이다.

본 발명에서는, 본 발명의 적용 가능한 일례로 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키는 리신효소의 작용에 의해 얻어진 세균파쇄물을 이용한 백신조성물이 개시되어 있다. 황색포도상구균은 병원성 세균의 대표로 선택된 것이며 적리균(Shigella disentriae), 고초균(Bacillus subtilis), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 코아굴레이스 음성 포도상구균(coagulase negative Staphylococcus), 연쇄상구균(Streptococcus), 대장균형 박테리아(Coliform bacteria), 대장균, 이질균, 장티푸스균, 콜레라균, 장구균 등을 포함하는 다양한 병원성 세균이 본 발명의 적용 대상이 될 수 있다. 물론 각 세균에 대하여 본 발명을 적용할 시에는 각 세균을 특이적으로 파쇄시킬 수 있는 적절한 용균단백질이 적용되어야 한다. 황색포도 상구균은 그램 양성(Gram positive) 세균으로서 화농, 농양형성, 다양한 화농성 감염, 패혈증을 유발하는 병원성 미생물이다. 또한, 황색포도상구균은 소유방염의 주된 원인균이라 할 수 있는데, 젖소의 체내에 상재하면서 유두를 통해 유방 내에 침입하여 유즙 내에 백혈구에 의해 탐식되더라도 백혈구 내에서 계속 생존하며, 바이오필름(biofilm)을 생성하는 경우 유선조직 내에서 섬유조직으로 캡슐화된 다양한 크기의 막을 형성함으로써 한번 감염되면 약물 침투가 불가능하여 고질적인 감염 양상을 나타낸다. 이러한 황색포도상구균에 대한 감염성 질환을 예방하고자 현재까지 알려진 백신으로는 황색포도상구균으로부터 얻어진 다당류 또는 글리코펩티드 표면항원의 결합체 및 면역운반체를 포함한 당결합체 백신, 황색포도상구균의 결합단백질과 이들 단편들에 대한 항체들의 조합을 통한 다성분백신, 황색포도상구균의 DPNAG (탈아세틸화 폴리 N-아세틸화 글루코사민) 다당류백신, 황색포도상구균의 독소의 특정 아미노산 서열을 변형시킨 변이독소 백신 등이 개발되었으나, 아직까지 효과적인 백신조성물이 얻어지고 있지 않은 실정이다.

본 발명에서 사용되는 백신조성물의 면역학적 유효 용량으로는 면역반응 도출에 적당한 용량이 사용될 수 있다. 특정 용량은 치료하고자 하는 동물의 일령, 체중 및 임상 증상과 투여방법에 의해 좌우된다. 이러한 적정용량은 보통으로 숙련된 의사가 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 백신조성물의 조성은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식 을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 생리 식염수 또는 인산완충식염수 또는 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 같은 에탄올 폴리올을 이용하여 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 매체(vehicle)에 의해 임의로 투여될 수 있다. 소량의 계면활성제도 본 발명의 백신조성물의 안정성 증강을 위해 포함시킬 수 있다.

본 발명의 백신조성물은 식물성 오일 또는 이의 에멀션; 계면활성제, 예를 들면 헥사데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 옥타데실아민, 라이소레시틴, 디메틸-디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N′-N′비스(2-하이드록시에틸-프로판디아민), 메톡시헥사데실글리세롤, 및 플루로닉 폴리올; 폴리아민, 예를 들면, 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카보폴; 펩타이드, 예를 들면, 뮤라밀 디펩타이드, 디메틸글라이신, 터프트신; 면역자극복합체; 리포폴리사카라이드, 예를 들면 MPLR(3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana); 및 미네럴 겔 같은 부가적인 보조제를 임의로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신조성물의 유효성분인 상기 세균파쇄물은 리포솜, 와우상(cochleates), 생분해성 중합체, 예를 들면 폴리-락타이드, 폴리-글리콜라이드 및 폴리-락타이드-코-글리콜라이드, 또는 ISCOMS(면역자극복합체) 중으로 혼입될 수 있고, 보충성 활성성분이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 세균파쇄물은 세균 독소 및 이의 약독화유도체와 함께 투여될 수도 있다.

본 발명의 백신조성물은 비경구, 동맥내, 피내, 경피(서방형 중합체의 사용 등에 의해), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구 및 비강내 투여경로(이에 국한되지 않음)를 포함하여 다양한 경로에 의해 동물에 투여될 수 있다. 이러한 백신조 성물에 사용되는 상기 세균파쇄물의 적용양은 제조된 세균파쇄물의 성질에 따라 다소 변동될 수 있다. 본 발명의 백신조성물에 적용되기 위한 통상의 캐리어 항원과 함께 사용되는 설정용량 범위의 조정과 조작은 당업자의 역량 안에 있다. 본 발명의 백신조성물은 미숙 및 성체 동물에 사용되기 위한 것이다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (ⅰ) 세균에 의해 유발된 감염성 질환의 예방; (ⅱ) 세균에 의해 유발된 감염성 질환의 억제; 및 (ⅲ) 세균에 의해 유발된 감염성 질환의 경감을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 세균파쇄물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 사료첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 효소제제를 첨가할 수도 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose) 로 가수분해하는 말타제(maltase), 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서의 세균파쇄물을 포함하는 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(J Animal Sci 43: 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(J Anim Sci 56: 735-739, 1983)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 리신효소 작용을 통해 제조된 세균파쇄물을 동물에 투여한 후, 생성되는 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 이 세균파쇄물 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 세균감염에 의해 유발되는 감염성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

에드워드 제너 (Edward Jennner) 등에 의하여 천연두 백신이 처음 개발된 이후, 초기 백신조성물은 감염성 세균 자체를 그대로 또는 사균의 형태 등으로 사용하거나, 또는 전염병의 병원균 자체 또는 그 일부를 사용하여 동물에 면역을 시킨 후, 면역된 동물로부터 생성된 항체 등 면역성분을 유효성분으로 하는 혈청 등의 백신조성물을 제조하여 이를 비감염동물에게 면역시키는 방식으로 개발되어졌다.

이는 감염성 세균에 의해 면역된 동물로부터의 혈청 등에는 해당 세균에 대한 항체 등 면역물질이 포함되어 있기 때문에, 이것이 효과적인 백신제제로 사용될 수 있었다. 하지만, 이는 주로 세균 자체를 동물에 투여한 후, 생성된 항체 등의 면역물질을 유효성분으로 한 것이었다면, 본 발명은, 세균 자체가 아니라 박테리오파지 유래의 리신효소 작용에 의해 제조된 세균파쇄물을 동물에 투여하여 면역시킨 후, 생성된 항체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 세균 감염성 질환을 예방 및 치료하기 위해 사용한 것이며 이러한 시도는 지금까지 없었다. 비록 효과는 같지 않지만 비슷한 시도로 본 발명과 다른 방법으로 제조된 세균파쇄물을 동물에 투여하여 항체를 획득한 사례 보고는 있다(Clin Vaccine Immunol 14: 518-526, 2007; J Med microbiol 52: 217-222, 2003). 그러나 앞에서 설명했듯이 세균파쇄에 적용한 방법에 따라 제조된 세균파쇄물의 항원성에는 큰 차이가 있으므로 이는 본 발명과 구분된다 할 것이다.

본 발명은 박테리오파지 유래의 용균단백질을 이용하여 온화한 조건으로 제 조한 세균파쇄물을 제공한다. 또한 본 발명에서 개시한 세균파쇄물의 제조방법은 특정부위의 선택적 절단이 가능한 박테리오파지 유래의 용균단백질의 고유한 기능에 기반하고 있으므로 기타의 방법처럼 무작위적이지 않고 비교적 규칙적인 정형화된 양태의 세균파쇄물을 제공한다.

본 발명에서 개시한 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소를 이용해 세균을 특이적으로 사멸시켜 제조한 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 백신조성물은, 세균이 완전히 파괴되어 독성이 있는 세균으로 전환되지 않아 생균백신이나 약독생균 백신에 비하여 사용상 안전하고, 또, 제조상 항원부위가 잘 보존되어 면역을 유도하기 위한 항원성이 생균백신과 유사하다.

이러한 상기 백신조성물은 세균에 원인한 동물의 감염성 질병 예방에 효과적인 백신 또는 사료첨가제로 유용하게 활용될 수 있다.

또한 상기 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 제조된 세균파쇄물을 동물에 투여하여 얻어진 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 기존의 불활성화 시킨 세균의 투여나 일반적인 방법으로 제조한 세균파쇄액의 투여로 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물에 비해 세균감염에 대한 방어 효과가 더 우수하다. 이러한 조성물은 세균에 원인한 동물의 감염성 질병 예방용 및 치료용 제제로 활용이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용 및 범위가 아래의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예는 황색포도상구균과 그것에 특이적인 박테리오파지 유래의 용균단백질 조합에 대하여 본 발명의 유효성을 제시하고 있으나, 본 발명은 이에 국한되지 않고 세포벽을 가진 다양한 세균과 그 해당 용균단백질의 조합에도 적용 가능함은 당업자에게는 너무나 당연하다 할 것이다. 이미 세균과 그 해당 세균에 특이적인 박테리오파지 유래의 용균단백질의 효과적 조합은 여러 사례가 보고되었다(Nature 418: 884-889, 2002; PNAS 98: 4107-4110, 2001; Journal of Bacteriology 182: 5823-5831, 2000). 이 보고와 같이 통상 세균에는 각 세균에 효과적인 박테리오파지가 존재하고 또한 해당 박테리오파지 유래의 용균단백질이 존재한다. 설령 해당 박테리오파지가 현재까지 찾아지지 않았다 하더라도 자연계 어딘가에는 반드시 존재하고 있다고 관련된 연구자들은 확신하고 있다(Nature 418: 884-889, 2002).

실시예 1: 리신효소 작용에 의한 동물 감염성질환 원인 세균의 사멸효과

본 실시예에서는 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소가 동물 감염성 질환을 일으키는 세균을 특이적으로 사멸시키는가에 대하여 확인하였으며, 모델 세균으로 선정된 황색포도상구균을 대상으로 사멸효과 검증을 실시하였다.

본 발명자들은 황색포도상구균 특이적인 박테리오파지의 유전체로부터 용균 단백질인 리신의 유전자를 클로닝 하고 이를 이용하여 재조합 단백질 형태로 리신효소를 제조하여 황색포도상구균에 대한 사멸효과 등 항균활성이 있음을 확인하였으며 관련 내용을 특허 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제2006-73562호). 본 실시예에 있어서 이를 참조자료로 한다. 본 실시예에 사용한 황색포도상구균 특이 박테리오파지 유래의 용균단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다. 물론 본 발명이 황색포도상구균에만 한정되지 않듯이 서열번호 1로 특정되는 용균단백질에만 한정되지 않음도 당연하다.

본 발명자들에 의해 개시된 발명(대한민국 특허출원 제2006-73562호)에 따라, 박테리오파지 유래의 용균단백질의 생산균주(2007년 7월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁, 기탁번호 KCTC 11151BP)를 이용하여 용균단백질을 생산하여 분리정제한 후 이를 이용하여 세균에 대한 사멸효과를 조사하였다. 실험방법은 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/ℓ; 소이빈 다이제스트, 3 g/ℓ; 덱스트로스, 2.5 g/ℓ; NaCl, 5 g/ℓ; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/ℓ)에서 배양된 600 ㎚에서 흡광도가 1 정도 되는 황색포도상구균 배양액 1 ㎖을 평판배지에 도말하여 말린 후, 용균단백질을 포함한 단백질액 5 ㎕를 떨어뜨린 다음 37℃ 배양기에서 밤새도록 배양하여 황색포도상구균의 용균 정도를 조사하였다. 리신효소의 세균사멸효과 조사에는 황색포도상구균과 기타 세균을 포함하여 총 60종의 세균이 대상 세균으로 사용되었다. 이들 대상 세균은 항생제내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes; 서울시 노원구 공릉 2동 126 서울여자대학교 제 1 과학관 429호)이 보유하고 있는 것이다. 사용된 대상 균주의 목록은 도 1에 제시되어 있다.

그 결과, 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소로 처리한 다음 일정시간이 경과하면 황색포도상구균의 사멸이 일어나고, 결과적으로 투명한 용균반이 생긴다. 도 2에는 형성된 용균반의 크기가 제시되어 있다. 이 결과로부터, 통상적으로 알려진 바와 같이, 감염성 질환을 일으키는 세균이 이에 특이적인 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소의 작용에 의해 특이적으로 사멸됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 복강 내 시험감염 후 생쥐의 생존 시간

본 발명자들은 먼저 10마리의 BALB/c(5주령, 체중16.5g, 암컷) 생쥐군에 약 3×10⁸cfu 황색포도상구균을 복강 내 주사하여 감염시킨 후 생존 시간을 측정하였다. 이를 설명하면, 본 발명의 백신조성물의 효능을 조사하기 위한 대상세균으로는 SA3(항생제내성균주은행 균주번호 CCARM 3095, 메티실린-내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus; MRSA)임; 인체임상분리주(clinical isolate from human)임)을 선정하였다. 투여하는 세균액의 준비는 세균배양액을 4℃에서 14,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 세균을 회수하였고 회수된 세균을 인산생리식염수(PBS)로 2회 세척해 준 다음 최종적으로 인산생리식염수에 세균을 부유시켜 생쥐에 복강 내 주사하였다.

이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 각 데이터 포인트는 생쥐 한 마리를 표시한다. 황색포도상구균 SA3를 복강 내 주사하여 감염시킨 후 총 5일 동안 매 6시간 마다 관찰하였으며 이후 9일 동안은 매 12시간마다 관찰하였다. 그 결과 황색포도상구균을 감염시킨 생쥐의 중간 생존 시간은 약 55시간이었으며 대조실험군으로 인산생리식염수를 복강 투여한 생쥐의 경우 관찰기간 내에 모두 생존하였다.

실시예 3: 리신효소 작용으로 제조된 세균파쇄물을 이용한 생쥐의 능동 면역화 및 이로 인한 세균감염 방어능 시험

본 실시예에서는 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 세균이 사멸된 형태인 세균파쇄물이 세균 감염에 대한 방어능을 갖고 있는지를 조사하였다. 이는 리신효소에 의해 특이적으로 사멸된 세균파쇄물이 세균 감염성 질환에 대한 예방용 백신조성물로 활용가능한지를 알아보는데 의의가 있다.

본 발명에서 개시한 세균파쇄물이 세균감염에 대한 백신조성물로서의 세균감염에 대한 방어능이 있는지 조사하기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건의 BALB/c 생쥐로 구성된 4개군(군당 10마리)을 인산생리식염수와 황색포도상구균 특이 리신효소로 유도된 세균사멸로 인한 세균파쇄액을 복강 내 면역시켰으며 이를 요약하여 설명하면 다음과 같다. 먼저 면역에 사용한 백신조성물은 다음과 같이 준 비하였다. 약 3*10⁸cfu의 세균부유액 1 ㎖에 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소액을 최종 20 ㎍이 되도록 첨가한 다음 37℃에서 1시간동안 정치하여 세균 사멸이 일어나게 하여 세균파쇄물을 얻었고 (도 4), 이 얻어진 세균파쇄물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 백신조성물을 준비하였다. 참고로, 제조된 세균파쇄물을 TSB 배지에 도말한 다음 37℃에서 한밤 배양한 경우 황색포도상구균의 콜로니가 전혀 형성되지 않았다. 이는 세균파쇄물에 존재하는 생균이 전혀 없음을 나타낸다. 이렇게 준비된 백신조성물은 실험군당 10마리씩의 BALB/c 생쥐에 1회당 200 ㎕씩 복강 투여하였다. 대조실험군에서는 백신조성물 대신 인산생리식염수를 동량 및 동일방법으로 투여하였다. 백신조성물을 투여한 실험군은 최초 1회 투여만 한 군, 최초 1회 투여 후 7일 후 항원이 되는 세균파쇄물을 1회 추가 투여한 군과 7일 간격으로 2회 추가 투여한 군으로 구성된다. 각 실험군 및 대조군 모두에 대하여, 최종 투여 후 7일째가 되는 날, 1*10⁷cfu 수준의 SA3 세균부유액을 복강 투여하였다. 세균부유액을 투여한 3일 후 쥐로부터 혈액을 채취하여 그 중 500 ㎕를 십진 희석하여 뮤엘러-힌톤(Mueller-Hinton) 아가 배지에 도말하였고, 이를 37℃에서 한밤 배양한 다음 최종적으로 살아있는 세균수를 조사하였다. 그 결과, 백신조성물을 투여한 모든 경우가 대조실험군에 비하여 세균감염 방어 능력이 있었으며, 생균수를 비교하였을 때 최초 백신조성물 투여 후 7일 간격으로 1회 추가 부스팅(boosting)한 경우가 1회만 백신조성물을 투여한 경우에 비하여 세균감염 방어 능력이 평균 100배 증가되었고, 최초 백신조성물 투여 후 7일 간격으로 추가 2회 부스팅한 경우 10000배 증가되었음을 확인할 수 있었다 (도 5).

본 결과는, 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 제조된 세균파쇄물이 세균감염에 대해 방어 효과(protective effect)를 갖는다는 것을 보여주는 것이며, 이는 본 발명에서 개시한 세균파쇄물을 유효성분으로 포함한 백신조성물이 세균에 의한 동물의 감염성 질환 예방용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있다.

실시예 4: 세균파쇄물의 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 하는 조성물 분석

통상적으로 백신조성물을 동물에 투여하게 되면 항체가 생기게 된다. 이에, 본 발명자들은 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 얻어진 세균파쇄물을 동물에 투여한 후, 이로부터 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 항-리신효소작용에 의한 황색포도상구균 세균파쇄물 혈청 항체(이하 항-SA3)역가를 확인하기 위해, 실시예 3에서 제조한 세균파쇄물을 동물에 투여하여 얻은 초면역 혈청(hyperimmune serum)의 항체역가 발생정도를 표준 효소관련 면역흡착 방법(ELISA)을 이용하여 조사하였다.

이를 상세히 설명하면, 우선 초면역 혈청을 얻기 위해 실시예 3에서 설명한 바와 동일한 방법으로 세균파쇄물을 제조한 후 실시예 3과 동일한 방식으로 생쥐에 복강 내 주사하여 면역시켰다. 즉, 인산생리식염수를 사용한 대조군 및 최초 1회 투여만 한 군, 최초 1회 투여 후 7일 후 항원이 되는 세균파쇄물을 1회 추가 투여 한 군과 7일 간격으로 2회 추가 투여한 군으로 구성되는 각 실험군 모두에 대하여 최종 면역 후 7일째 되는 날 안와후방 출혈에 의해 생쥐로부터 혈청을 채취하여 특이적인 항-SA3 항체역가의 발생정도를 측정하였다. 즉, 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰 내에 실시예 3과 같이 제조된 황색포도상구균 세균파쇄액을 100 ㎕씩 가한 후 4℃에서 하룻밤동안 정치시킨 후, 트리톤 X-100(Triton X 100)이 포함된 PBS로 2회 씻어주고 5% 우태아혈청(BSA)을 가해 상온에서 30분~1시간 동안 정치시켰다. 이를 앞과 동일한 방법으로 2회 더 세척한 뒤 공기 중에서 건조시킨 후, 일련의 희석배수로 희석시킨 항-SA3 항체를 포함한 혈청을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 각 웰에 2차 항체 콘쥬게이트 (양 항-생쥐 IgG; HRP-conjugated)를 희석시켜 첨가한 후 37℃에서 1시간 항온처리시키고 다시 1회 세척하였다. 각 웰에 소듐아세테이트/시트르산 완충액에 녹여진 우레아퍼록사이드 용액 1.5 ㎖와 DMSO에 녹여진 0.6% TMB용액 0.2 ㎖을 가하여 착색정도를 측정하여 정량하였다. 빛이 차단된 상태에서 10분정도 반응 후, 4N HSO를 가하여 종료시키고 ELISA 판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 다음과 같다. 표 1의 수치는 생쥐의 항체 생산 정도를 나타내며 평균 로그값으로 표시되어 있다.

(A)	(B)	(C)	(D)
인산생리식염수	세균파쇄물을 1회 복강 내 주사한 생쥐의 혈청	세균파쇄물을 2회 복강 내 주사한 생쥐의 혈청	세균파쇄물을 3회 복강 내 주사한 생쥐의 혈청
< 0.5(±0.37)	3.01(±0.28)	4.67(±0.41)	5.88(±0.31)

상기 표 1에서,

(A): 인산생리식염수를 복강 내 주사시킨 생쥐의 혈청 샘플로 측정한 ELISA 역가의 평균 로그값(± SD);

(B): 리신효소 작용에 의해 얻어진 황색포도상구균 세균파쇄물을 복강 내 1회 주사시킨 뒤 7일 지난 생쥐의 혈청 샘플로 측정한 ELISA 역가의 평균 로그값(± SD);

(C): 리신효소 작용에 의해 얻어진 황색포도상구균 세균파쇄물을 복강 내 1회 주사시킨 뒤 7일 뒤 1회 더 주사시키고 다시 7일 지난 후 채취한 생쥐의 혈청 샘플로 측정한 ELISA 역가의 평균 로그값(± SD);

(D): 리신효소 작용에 의해 얻어진 황색포도상구균 세균파쇄물을 복강 내 1회 주사시킨 뒤 7일 간격으로 2회 더 주사시키고 다시 7일 지난 후 채취한 생쥐의 혈청 샘플로 측정한 ELISA 역가의 평균 로그값(± SD)

실시예 5: 황색포도상구균 세균파쇄물의 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 하는 면역혈청의 황색포도상구균 시험감염에 대한 방어능 조사

통상적으로 백신조성물을 동물에 투여하게 되면 항체가 생기며, 이 항체를 포함한 혈청이나 또는 이 혈청으로부터 분리한 정제된 항체를 다시 백신조성물로 사용하기도 하며, 이는 천연두 백신 등 전통적인 백신제제 개발에 활용되어 왔다.

이에 본 발명자들은 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 얻어진 세균파쇄물을 동물에 투여한 후, 이로부터 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 세균감염에 대한 방어 유도능을 확인하였다. 세균파쇄물을 동물에 투여하여 얻은 초면역 혈청을 주사하여 피동면역(passive protection)시킨 생쥐군에 황색포도상구균을 시험감염시켜 방어 효과를 조사하였다. 이를 요약하여 설명하면 다음과 같다. 우선 초면역 혈청을 얻기 위해 실시예 3에서 제조한 세균파쇄물, 세균파쇄물 제조에 사용한 황색포도상구균과 동량인 황색포도상구균을 포함한 부유액을 60℃에서 1시간동안 불활성화 시켜 제조한 세균액, 및 또 동량의 황색포도상구균을 포함한 부유액을 일반적인 초음파 분쇄법으로 파쇄한 세균파쇄액을 군당 10마리씩의 BALB/c 생쥐(5주령, 체중16.5g, 암컷)에 5주 동안 일주일에 한번의 빈도로 200 ㎕씩 각각 복강 투여하였다. 대조실험군은 인산생리식염수를 같은 방법으로 투여한 것으로 하였다. 최종 투여 다음날, 쥐의 심장에 구멍을 내어 방혈한 후 혈액을 얻고 이로부터 혈청을 얻었다. 그리고 얻어진 면역혈청(immune serum)에 의한 피동면역 효과를 조사하기 위해, 각 얻어진 혈청을 인산생리식염수로 4배 희석하여 이를 각 실험군당 10마리의 BALB/c 생쥐에 100 ㎕씩 복강 투여하였다. 투여 한 시간 후, 황색포도상구균 1*10⁷cfu로 시험감염시킨 다음 매 12시간 마다 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 각 데이터 포인트는 생쥐 한 마리를 나타낸다. 시험감염 전에 아무 처리를 하지 않은 생쥐군과 인산생리식염수만을 투여한 생쥐에서 채취한 혈액으로부터 준비한 혈청을 투여한 생쥐군에서의 중간 생존 기간은 약 3일 이었다. 황색포도상구균을 포함한 부유액을 60℃에서 1시간동안 불활성화시켜 제조한 세균액, 및 황색포도상구균을 포함한 부유액을 일반적인 초음파 분쇄법으로 파쇄한 세균파쇄액을 투여한 생쥐에서 채취한 혈액으로부터 준비한 혈청을 이용하여 피동 면역시킨 생쥐군의 중간 생존 기간은 약 7~10일이었다. 이 생존 기간은 아무것도 투여받지 않거나 인산생리식염수만을 투여한 생쥐에서 채취한 혈액으로부터 준비한 혈청을 투여 받은 생쥐군에 비해 유의성 있게 길었다. 반면, 불활성화 시킨 세균의 투여로 얻어진 면역혈청을 투여 받은 생쥐군의 경우나 황색포도상구균을 포함한 부유액을 일반적인 초음파 분쇄법으로 파쇄한 세균파쇄액의 투여로 얻어진 면역혈청을 투여 받은 생쥐군의 경우 중간 생존 기간은 약 7~8일이었으며, 실시예 3에서 제조한 세균파쇄물의 투여로 얻어진 면역혈청을 투여 받은 생쥐군의 경우 중간 생존 기간은 약 9~10일이었다.

본 결과는, 리신효소 작용에 의해 제조된 세균파쇄물의 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물이 피동면역 효과가 있다는 것을 보여주며, 이는 본 발명에서 개시한 세균파쇄물의 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 포함한 조성물이 세균에 의한 동물의 감염성질환 예방용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있다.

또한 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 제조된 세균파쇄물의 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물이 불활성화 시킨 세균의 투여로 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물 또는 황색포도상구균을 포함한 부유액을 일반적인 초음파 분쇄법으로 파쇄한 세균파쇄액의 투여로 생성된 항체를 유효성분으로 포함하는 조성물에 비해 세균감염에 대한 방어 효과가 뛰어남을 보여준다 할 수 있다. 이로부터 박테리오파지 유래의 용균단백질인 리신효소 작용에 의해 제조된 세균파쇄물의 투여가 불활성화 시킨 세균의 투여나 일반적인 초음파 분쇄법으로 파쇄한 세균파쇄액의 투여에 비해 항체 생성능이 우수하다고 할 수 있다. 즉, 항원성(면역원성)이 더 높다고 할 수 있다.

이러한 면역혈청에 의한 피동면역효과로부터 본 발명에서 개시한 세균파쇄물의 투여로 생성된 항체가 예방용 목적뿐만 아니라 치료용 목적으로도 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 용균단백질의 세균 사멸효과 조사에 대상이 된 세균 목록이다.

도 2는 용균단백질의 세균 사멸효과 조사의 결과로서, 용균단백질 처리로 생성된 용균반의 크기가 지름으로 제시되어 있다. A는 용균반의 지름을 나타낸다.

도 3은 복강 내 시험감염 후 생쥐 생존 시간을 보여주는 결과로서, “SA3”는 황색포도상구균 SA3를 투여한 경우이고 “PBS”는 인산생리식염수를 투여한 경우를 나타낸다.

도 4는 용균단백질 처리로 제조된 세균파쇄물을 보여 주는 사진으로서, 왼쪽은 황색포도상구균의 부유액에 용균단백질을 첨가하여 1시간동안 처리시켜 생성된 세균파쇄물이고, 오른쪽은 아무 처리도 하지 않은 황색포도상구균의 부유액이다.

도 5는 리신효소 작용으로 제조된 세균파쇄물을 이용한 세균감염 방어능 조사 결과로서, 대조군은 백신조성물 대신 인산생리식염수를 투여한 경우이고, 실험군 1은 백신조성물을 최초 1회만 투여한 경우이고, 실험군 2는 백신조성물을 최초 투여한 다음 최초 투여 7일 후에 또한번 투여한 경우이고, 실험군 3은 백신조성물을 최초 투여한 다음 최초 투여 7일 간격으로 추가 2회 투여한 경우이다.

도 6은 황색포도상구균 세균파쇄물의 투여에 의해 생성된 항체를 유효성분으로 하는 혈청의 황색포도상구균 시험감염에 대한 방어능 조사 결과로서, “무처리”는 아무처리도 하지 않고 시험감염 시킨 경우이고, “PBS”는 인산생리식염수를 투여한 생쥐로부터 혈청을 얻어 조사한 경우이고, “불활성화”는 불활성화 시킨 세균을 투여한 생쥐로부터 혈청을 얻어 조사한 경우이고, “세균파쇄물1”은 초음 파 분쇄법으로 파쇄한 세균파쇄액을 투여한 생쥐로부터 혈청을 얻어 조사한 경우이며, “세균파쇄물2”는 본 발명에 따라 제조한 세균파쇄물을 투여한 생쥐로부터 혈청을 얻어 조사한 경우이다.

<110> INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD <120> Bacteria lysates prepared by bacteriolytic lysin enzyme, and vaccine composition for preventing animal disease comprising the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 495 <212> PRT <213> Antimicrobial Protein <400> 1 Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp 50 55 60 Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile 65 70 75 80 Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser 85 90 95 Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr 100 105 110 Gln Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser 115 120 125 Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys 130 135 140 Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu 145 150 155 160 Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys 165 170 175 Ser Ala Ser Lys Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val 180 185 190 Ser Lys Asn His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro 195 200 205 Glu Gly Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln 210 215 220 Tyr Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly 225 230 235 240 Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile Asp 245 250 255 Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly Ala Asn 260 265 270 Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln Ser Met Ser 275 280 285 Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala Val Phe Gln Phe 290 295 300 Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr Pro Asn Arg Lys Thr 305 310 315 320 Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr Ala Cys Pro His Arg Ser 325 330 335 Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser 340 345 350 Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys 355 360 365 Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly 370 375 380 Lys Thr Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser 385 390 395 400 Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr 405 410 415 Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe 420 425 430 Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val 435 440 445 Tyr Asp Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn 450 455 460 Ala Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly 465 470 475 480 Val Pro Pro Asn His Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys 485 490 495

Claims (6)

1. 황색포도상구균 세포막의 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시키는 박테리오파지 유래 용균단백질인 리신효소의 작용에 의하여 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시켜 제조한 황색포도상구균 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 감염성 질병에 대한 예방용 백신조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리오파지 유래 용균단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 세균파쇄물을 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 감염성 질병에 대한 예방용 백신조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 황색포도상구균 세포막의 펩티도글리칸 구조물을 특이적으로 파괴시키는 박테리오파지 유래 용균단백질인 리신효소의 작용에 의하여 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시켜 제조한 황색포도상구균 세균파쇄물을 동물에 투여하여 형성된 항체를 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 감염성 질병에 대한 예방 및 치료용 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 박테리오파지 유래 용균단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 황색포도상구균 세균파쇄물을 동물에 투여하여 형성된 항체를 유효성분으로 포함하는 황색포도상구균 감염성 질병에 대한 예방 및 치료용 조성물.

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