CN105254615B - 苯胺嘧啶衍生物及其在制备抗恶性肿瘤药物中的用途 - Google Patents
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- CN105254615B CN105254615B CN201510405448.6A CN201510405448A CN105254615B CN 105254615 B CN105254615 B CN 105254615B CN 201510405448 A CN201510405448 A CN 201510405448A CN 105254615 B CN105254615 B CN 105254615B
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Abstract
本发明涉及一种新型的苯胺嘧啶衍生物及其在制备预防和/或治疗抗恶性肿瘤药物中的用途。本发明的苯胺嘧啶衍生物是理想的高效非可逆性EGFR激酶抑制剂，可用于治疗或预防肺癌、胃肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、头颈部鳞癌、表皮鳞癌、***癌、神经胶质瘤和鼻咽癌等多种恶性肿瘤疾病。
Description
技术领域
本发明涉及苯胺嘧啶衍生物及其在制备预防、治疗恶性肿瘤药物中的用途。
背景技术
EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)是一种跨膜受体，EGFR结合于胞外结构域即形成受体二聚体并激活胞内酪氨酸激酶结构域，引发激酶自身磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在内的多种细胞功能。近80％～85％的NSCLC患者可检测到EGFR，其表达水平在一个连续的范围中差异很大。肺腺癌EGFR突变的发生率在亚洲人群达到50％，在不吸烟者、女性以及非粘液性肿瘤中发生率更高。
最常见的EGFR突变为外显子19缺失(E19del，见于45％的患者)和外显子21L858R突变(见于40％的患者)，二者都会导致酪氨酸激酶结构域活化，且都与肿瘤对小分子TKIs(tyrosine kinase inhibitor，酪氨酸激酶抑制剂)的敏感度相关。这些药物敏感性突变见于近10％的白种人NSCLC患者及高达50％的亚洲患者。EGFR基因是亚洲肺腺癌患者突变概率最大、可使最多患者治疗获益的靶点。其他的药物敏感性突变类型包括外显子21(L861Q)和外显子18(G719X)点突变。T790M突变可导致TKI类药物耐药，有关报告显示该突变类型见于约50％的肿瘤进展患者。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的苯胺嘧啶衍生物，其是理想的非可逆性EGFR激酶抑制剂，可用于有效预防或治疗肺癌、胃肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、头颈部鳞癌、表皮鳞癌、***癌、神经胶质瘤和鼻咽癌等多种恶性肿瘤疾病。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
具有通式(Ⅰ)的化合物，其可药用盐、水合物，或以任何形式代谢形成的代谢产物，
其中：
R1为CH2F，CHF2，CF3，OCH2F，OCHF2，OCF3，C2～C3氟代烃基，C2～C3氯代烃基；或者，R1为OCkH2k+1，其中k为1～3之间的整数；
R2和R3为具有至少一个双键的直链或分支链烃链，且R2和R3的一个或两个其它亚甲基单元任选且独立地经-NHC(O)-、-C(O)NH-、-N(H)SO2-或-SO2N(H)-置换；或者，R2和R3为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基、4-乙基哌嗪-1-基，其中，R2和R3不能够为相同的基团；
R4为
其中，R5为H、CH3、CH2CH3；
X为N或CH；
所述具有通式(Ⅰ)的化合物、其可药用盐、水合物，或以任何形式代谢形成的代谢产物中，非交换性的氢未被取代，或部分或全部被氘取代。
根据本发明的一个方面，式(I)中，R1为选自CH2F，CHF2，CF3，，OCH2F，OCHF2，OCF3，以及OCH3中的一种；R2、R3、R4、R5以及X的定义同上。
根据本发明的又一方面，式(Ⅰ)中，R2为-NHC(O)CH＝CH2、-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)2、-NHSO2CH＝CH2、-NHSO2CH＝CHCH2N(CH3)2；R3为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基、4-乙基哌嗪-1-基；R1、R4、R5以及X的定义同上。
根据本发明的又一方面，式(Ⅰ)中，R3为-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)2、-NHSO2CH＝CH2、-NHSO2CH＝CHCH2N(CH3)2；R2为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基、4-乙基哌嗪-1-基；R1、R4、R5以及X的定义同上。
根据本发明的一个具体和优选方面，式(I)中，R5为H或CH3，R1、R2、R3、R4以及X的定义同上。
根据一个具体方面，X为CH。
根据本发明的一个优选方面，式(I)中，R1为选自OCH2F，OCHF2，OCF3，OCH3及OCH2CH3中的一种；R3为-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)2、-NHSO2CH＝CH2、-NHSO2CH＝CHCH2N(CH3)2；R2为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基、4-乙基哌嗪-1-基；X为CH，R4、R5的定义同上。
根据本发明，代表性的化合物如下：
根据本发明，所述的化合物，其不仅包括单一的某种化合物形式，还包括多种结构满足通式(Ⅰ)要求的化合物的混合物形式，以及同一化合物的不同异构体形式例如外消旋体、对映异构体、非对映异构体等。所述的可药用盐包括但不限于盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、苯酸盐、甲基苯磺酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、没食子酸盐、柠檬酸盐等。所述的“具有通式(Ⅰ)的化合物的前药“指一种物质，当采用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(Ⅰ)的至少一种化合物或其盐。
本发明化合物的制备可以通过化学领域众所周知的那些类似的方法的合成途径，特别是根据本文包含的描述合成本发明的化合物。试剂一般从商业来源获得或易于使用本领域技术人员众所周知的方法制备。
本发明还涉及一种制备上述具有通式(I)的化合物的中间体，该中间体如通式(II)所示：
通式(II)中，R1，R2，R4的定义同上。
进一步地，上述通式(II)中，R2为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2、4-甲基哌嗪-1-基或4-乙基哌嗪-1-基。
进一步地，上述通式(II)中，R1为OCH2F，OCHF2，OCF3或OCH3。
代表性的通式(II)中间体有例如：
利用上述中间体，经由一步酰胺化反应即可得到相应的通式(I)化合物。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供的化合物是新型的苯胺嘧啶衍生物，其是理想的高效非可逆性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，通过作用于EGFR细胞内部分与ATP竞争性结合，抑制激酶的活性和磷酸化，并封闭EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点从而达到特异性抑制EGFR的目的。因此本发明化合物可用于制备治疗或预防各种与EGFR激酶功能有关的适应症，包括但不限于肺癌、胃肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、头颈部鳞癌、表皮鳞癌、***癌、神经胶质瘤和鼻咽癌等多种恶性肿瘤疾病。更为特殊的是本发明化合物可特异性地作用于带T790M突变的EGFR激酶，而对野生型EGFR激酶只有较弱的抑制作用，这一选择性的抑制作用对带T790M突变的获得性耐药肿瘤具有治疗意义，并且毒副反应较小。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
式Ia化合物，其化学结构如下：
式Ia化合物可通过如下合成路线获得：
式Ia化合物的制备方法具体包括如下步骤：
(1)、制备中间体3：向2,4-二氯嘧啶(4.83g，32.4mmol)和二甲氧基乙烷(50mL)60℃左右搅拌溶液中加入三氯化铁(5.5g，33.9mmol)和1-甲基吲哚(5.0g，38mmol)。将所得混合物搅拌60℃左右过夜。冷却后，通过加入甲醇(50mL)和水(100mL)固体沉淀。将所得淤浆搅拌3小时。将固体通过过滤收集，用甲醇(100mL)冲洗，50℃干燥过夜，得到中间体3(6g，77％)，为紫色固体。
(2)、制备中间体5：将甲苯磺酸水合物(772.82mg，4.1mmol)加入到中间体3(1g，4.1mmol)和中间体4(763mg，4.1mmol)的2-戊醇(10mL)混合物中。将所得混合物105℃搅拌2.5小时。然后冷却至室温，所得沉淀物通过过滤收集，用2-戊醇(20mL)冲洗，真空下干燥，得到中间体5(1.2g，75％)，为黄色固体。
(3)、制备中间体7：中间体5(500mg，1.27mmol)和中间体6(155.8mg，1.53mmol)的DMA(50mL)溶液85℃搅拌5-6小时，然后冷却至室温。加入水(50mL)，然后将混合物搅拌3-4小时。固体物质通过过滤收集，用水(30mL)洗涤，50℃干燥12小时，得到中间体7(400mg，96％)，为橙色固体。
(4)、制备中间体8：将中间体7(400mg，0.84mmol)、铁(281.84mg，5.04mmol)、氯化铵(31.5毫克，0.588mmol)、乙醇(30mL)和水(10mL)混合物加热回流2小时。所需产物用7M甲醇氨洗脱柱合并，真空浓缩到硅胶上。通过柱层析提纯得到中间体8，为米色泡沫，将其直接用于下一步骤反应。
(5)、制备式Ia化合物：向中间体8(300mg，0.67mmol)DMF溶液(12mL)溶液中加入中间体9(222mg，1.34mmol)、HATU(255mg，0.67mmol)和TEA(135mg，1.34mmol)。混合物室温下搅拌2小时。该混合物通过制备型HPLC纯化，直接得到粗产物(300mg)，为暗棕色油状物。将粗产物用TLC层析法进一步纯化得到Ia化合物，为暗黄色的半固体。
对得到的目标产品Ia进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝8.88(s,1H)8.33(m,1H)8.27(m,2H)7.47(m,1H)7.24(m,3H)6.99(m,2H)6.83(d,1H)4.01(s,3H)3.92(s,3H)3.46(t,2H)3.33(m,2H)3.29(m,2H)2.89(s,6H)2.72(m,9H)。
m/z[MH]+:557.3。计算得出产品具有分子式C31H40N8O2，精确分子质量(exactmass)为556.33。
实施例2
式Ib化合物，其化学结构如下：
式Ib化合物可通过如下合成路线获得：
式Ib化合物的制备方法具体包括如下步骤：
(1)、制备中间体12：向中间体5(340mg，0.86mmol)在DMA(10mL)中的悬浮液加入DIPEA(144mg，1.12mmol)、中间体11(117mg，1.03mmol)，将混合物加热至80℃16小时。将混合物倒入水(40mL)中，搅拌5分钟并过滤，得到中间体12(290mg，69％)，为橙色固体，m/z[MH]+为488。
(2)、制备中间体13：将中间体12(290mg，0.59mmol)EtOH(12mL)/水(4mL)溶液中加入铁(200mg，3.57mmol)和氯化铵(22mg，0.41mmol)。加热回流2小时。将混合物用乙醇(100mL)和水(80mL)萃取，硅藻土过滤，干燥并通过色谱法得到中间体13(250mg，93％)，为暗半固体。
(3)、制备式Ib化合物：向中间体13(200mg，0.44mmol)DMF溶液(8mL)溶液中加入中间体9(145mg，0.88mmol)、HATU(168mg，0.44mmol)和TEA(88mg，0.88mmol)。该混合物室温下搅拌2小时。通过制备型HPLC纯化得到Ib化合物(140mg，56％)，为绿色固体。
对得到的目标产品Ib进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝8.65(s,1H)6.58(s,1H)8.29(m,1H)8.05(m,1H)7.52(d,J＝8.0Hz,1H)7.34(m,2H)7.24(m,1H)7.05(s,1H)6.85(m,2H)4.01(m,2H)3.97(s,3H)3.95(s,3H)3.72(m,2H)3.46(m,2H)3.37(m,2H)3.33(m,4H)2.94(s,6H)1.44(m,3H)。
m/s:[MH]+:569.4。计算得出产品具有分子式C32H40N8O2，精确分子质量(exactmass)为568.33。
实施例3
式Ic化合物，其化学结构如下：
式Ic化合物可通过如下合成路线获得：
式Ic化合物的制备方法具体包括如下步骤：
(1)、制备中间体15：室温下向中间体14(25g，159mmol)的DMF溶液(500毫升)溶液中加入碳酸钠(100g，943mmol)。然后，将反应物加热至90℃，将化合物A(71.5g，550mmol)加入到该溶液中。将反应物搅拌2小时。将混合物倾入冰水(300mL)中，并用MTBE萃取。将合并的有机相用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将粗物质经硅胶色谱法纯化得到中间体15(31g，94％)，为黄色油状物。
(2)、制备中间体16：室温下将Pd/C(3g，3.0mmol)加入到中间体15(31g，150mmol)的EtOH(80mL)的搅拌溶液中。将反应混合物在40psi氢气下反应过夜。将混合物在减压下过滤浓缩到中间体16(22g，82％)，为棕色油状物。
(3)、制备中间体17：℃下将中间体16(11.0g，62mmol)滴加到浓硫酸中。然后，将KNO3(6.2g，62mmol)分批加入。℃下搅拌30分钟。将溶液倾入冰水中，将pH调节至7-8，饱和NaHCO3和乙醇萃取。用盐水洗涤，并真空干燥浓缩得到中间体17(9.6g，70％)，为黄色固体。
(4)、制备中间体18：向中间体17(2.0g，9.0mmol)2-戊醇(15mL)溶液加入中间体3(2.2g，9.0mmol)和对甲苯磺酸(2.1克，10.8mmol)。将反应混合物在120℃下搅拌过夜。将溶剂减压蒸发，得到中间体18(2.9g，75％)，为棕色固体。
(5)、制备中间体19：向中间体18(2.9g，6.7mmol)DMA(20mL)溶液中加入中间体6(0.8g，8.1mmol)和DIPEA(1.1克，8.7mmol)。将混合物在85℃下搅拌2小时。将混合物倾入冰水中并搅拌半小时。然后，将混合物减压下过滤。将滤饼用乙醇洗涤得到中间体19(2.0g，65％)，为黄色固体。
(6)、制备中间体20：向中间体19(2.0g，3.9mmol)乙醇溶液(25mL)中加入氯化铵(150mg，2.7mmol)和铁(1.3g，23.4mmol)。将混合物在75℃下搅拌2小时。将混合物减压过滤。过滤液萃取液用盐水洗涤干燥真空浓缩。将粗物质经硅胶色谱法纯化得到中间体20(800mg，41％)，为灰色固体。
(7)、制备式Ic化合物：向中间体20(300mg，0.63mmol)DMF搅拌溶液(10mL)溶液中加入中间体9(165mg，1.26mmol)、HATU(237mg，0.63mmol)和TEA(126mg，1.26mmol)。将反应在室温下搅拌2小时。该混合物通过制备型HPLC纯化得到Ic化合物(20mg，5.3％)，为黄色固体。
对得到的目标产品Ic进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝8.88(s,1H),8.32(t,J＝4.0Hz,1H),8.28(s,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.21(d,J＝12.0Hz,1H),7.20-7.14(m,4H),7.10-6.96(m,2H),6.74(t,J＝12.0Hz,1H),3.94(s,3H),3.70(d,J＝4.0Hz,2H),3.44(t,J＝8.0Hz,2H),3.28(t,J＝8.0Hz,2H),2.89(s,6H),2.75(s,3H),2.70(s,6H)。
m/s:[MH]+:536.3。计算得出产品具有分子式C28H31F2N7O2，精确分子质量(exactmass)为535.25。
实施例4
式Id化合物，其化学结构如下：
该化合物可通过使实施例3中所述的中间体20与中间体9发生反应获得，具体制备过程可参见实施例3。
对得到的目标产品Id进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝8.97(s,1H),8.31(t,J＝4.0Hz,2H),8.27(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(d,J＝8.0Hz,1H),7.28-7.13(m,4H),6.94(t,J＝76.0Hz,1H),6.61-6.51(m,1H),6.47(d,J＝4.0Hz,1H),3.92(s,3H),3.05(t,J＝4.0Hz,2H),3.01-2.88(m,2H),2.74(s,3H),2.72(s,6H)。
m/s:[MH]+:593.3。计算得出产品具有分子式C31H38F2N8O2，精确分子质量(exactmass)为592.31。
实施例5
式Ie化合物，其化学结构如下：
该化合物可通过使实施例1中所述的中间体8与中间体8a【ClS(O2)CH2CH2Cl】发生反应获得，具体制备过程可参见实施例1。
对得到的目标产品Ie进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，CDCl3)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝9.0(s,1H)8.72(s,1H)8.32(m,1H)8.08(m,1H)7.70(s,1H)7.41(m,1H)7.30(m,2H)7.21(m,1H)6.77(s,1H)6.55(m,1H)6.15(m,1H)5.72(d,J＝10Hz,1H)3.96(s,3H)3.89(s,3H)2.85(m,2H)2.71(s,3H)2.33(s,6H)2.25(m,2H)。
m/s:[MH]+:536.3。计算得出产品具有分子式C27H33N7O3S，精确分子质量(exactmass)为535.24。
实施例6
式If化合物，其化学结构如下：
该化合物可通过使实施例3中所述的中间体16与中间体8a【ClS(O2)CH2CH2Cl】发生反应获得，具体制备过程可参见实施例3。
对得到的目标产品If进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，CDCl3)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝9.0(s,1H)8.63(s,1H)8.38(d,J＝5.2Hz,1H)8.08(d,J＝8.0Hz,1H)7.41(m,2H)7.28(m,3H)7.03(s,1H)6.55(m,1H)6.21(m,1H)5.76(d,J＝10Hz,1H)3.93(s,3H)2.81(m,2H)2.70(s,3H)2.35(s,6H)2.33(m,2H)。
m/s:[MH]+:572.1。计算得出产品具有分子式C27H31F2N7O3S，精确分子质量(exactmass)为571.22。
实施例7
式Ig化合物，其化学结构如下：
式Ig化合物可通过如下合成路线获得：
式Ig化合物的制备方法具体包括如下步骤：
(1)、制备中间体21：0℃下将CH3MgBr(THF中，35mL，105mol)10分钟内滴加至吲哚(11.50g，98.16mmol)的THF溶液(45mL)中。然后将溶液在0-5℃搅拌0.5小时。将2,4-二氯-5-甲基嘧啶(8g，49.08mmol)的THF溶液(25mL)溶液滴加到该溶液中。然后除去冰浴，将该溶液室温下搅拌1小时，然后60℃下18小时。加入乙酸(6mL)溶液，接着加入水(80mL)。将所得悬浮液在60℃搅拌0.5小时。所得固体通过过滤收集，用水和甲醇洗涤，真空干燥得到中间体21(2.8克，23.4％)，为白色固体。
(2)、制备中间体22：向中间体21(8.7g，35.8mmol)的THF溶液(100mL)溶液中加入NaH(945mg，39.4摩尔)。0℃下搅拌半小时。然后加入MeI(6.1g，43mmol)加入到混合物中。将反应在室温下搅拌3小时。将混合物在减压下过滤，得到中间体22(6.0g，65％)，为白色固体。
(2)、制备中间体23：向中间体22(2.9g，11mmol)2-戊醇(30mL)溶液中加入中间体4(2.5g，244mmol)和对甲苯磺酸(2.3g，13mmol)。将反应在120℃下搅拌过夜。将混合物在减压下过滤，得到中间体23(4.3克，88％)，为棕色固体。
(2)、制备中间体24：向中间体23(4.3g，9.6mmol)DMA(30mL)溶液中加入中间体6(1.2g，12mmol)和DIPEA(1.6g，13mmol)。将反应混合物在85℃下搅拌2小时。将混合物倾入冰水中并搅拌半小时。然后，将混合物在减压下过滤。将滤饼用乙醇洗涤，得到中间体24(2.3g，45％)，为黄色固体。
(2)、制备中间体25：向中间体24(2.3g，4.3mmol)乙醇溶液(25mL)加入氯化铵(115mg，2.1mmol)和铁(1.2g，21.4mmol)。将反应混合物在75℃下搅拌2小时。将混合物通过减压过滤。过滤液萃取，盐水洗涤，真空干燥浓缩。将粗物质经硅胶色谱法纯化，得到中间体25(1.2g，56％)，为灰色固体。
(3)、制备式Ig化合物：向中间体9(64mg，0.4mmol)DCM(5mL)溶液中加入氯化钴1mL)和一滴DMF。将反应物在室温下搅拌1小时。减压蒸发除去氯化钴，将残余物溶于DCM(5mL)中。向该混合物中加入化合物5(100mg，0.3mmol)。反应在0℃下搅拌30分钟。将混合物真空浓缩。将粗产物通过制备TLC纯化，得到Ig化合物(26mg，10％)，为黄色固体。
对得到的目标产品Ig进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝8.71(s,1H),8.33(d,J＝8.0Hz,1H),8.15-8.10(m,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.0Hz,1H),7.23(s,1H),7.15-6.74(m,5H),6.32-6.28(m,1H),4.04(d,J＝8.0Hz,2H),3.95(s,3H),3.44(d,J＝8.0Hz,2H),2.94(s,12H),2.77(s,3H),2.47(s,3H)。
m/s:[MH]+:607.2。计算得出产品具有分子式C32H40F2N8O2，精确分子质量(exactmass)为606.32。
实施例8
式Ih化合物，其化学结构如下：
该化合物可通过使实施例7中所述的中间体21与中间体4发生反应，以及后面3步相同反应步骤获得，具体制备过程可参见实施例7。
对得到的目标产品Ih进行了氢核磁共振1H-NMR(400MHz，MeOD)和质谱测试，结果如下：
1H-NMR谱图中吸收峰：δ＝9.02(s,1H),8.26-8.23(m,2H),7.93(s,1H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.14(s,1H),7.03(d,J＝8.0Hz,1H),6.87-6.82(m,1H),6.77(d,J＝76Hz,1H),6.43-6.39(m,1H),3.21(d,J＝8.0Hz,2H),3.05(t,J＝4.0Hz,2H),2.70(s,3H),2.52(t,J＝8.0Hz,2H),2.44(s,3H),2.34(s,6H),2.31(s,6H)。
m/s:[MH]+:593.2。计算得出产品具有分子式C31H38F2N8O2，精确分子质量(exactmass)为592.31。
药效试验
一、化合物酶活性测试：
1、试验方法
化合物的半抑制浓度IC50(把酶活性抑制至50％时所需的化合物的浓度)是以固定的酶混合特定底物及不同浓度的待测化合物来测定的。所用的测定方法是卡尺迁移变动分析(Caliper Mobility Shift Assay)，所测定的激酶为EGFRWT和EGFR790M/L858R，所应用的标准参照化合物为星形孢菌素(staurosporine)。
2、试验结果
表1总结了化合物酶活性抑制实验结果。结果显示目标化合物(Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、Ig和Ih)对两种EGFR激酶具有非常强的抑制作用，同时，结果显示目标化合物(Ia、Ib、Ic、Id、Ie和If)的选择性抑制活性较好。这一选择性的抑制作用对携带T790M突变的获得性耐药肿瘤具有重要的治疗意义。
表1 化合物酶活性抑制实验结果
二、肿瘤细胞抑制试验：
1、试验方法
(1)、化合物：体外研究中先将测试化合物溶于100％DMSO中，再稀释至所需浓度，DMSO的终浓度为0.1％。将0.1％(v/v)的DMSO加入培养基作为溶剂对照，共9个浓度梯度，重复测试二次。
(2)、肿瘤细胞系：所测肿瘤细胞系在含10％胎牛血清的RPMI10培养基中，于5％CO2，37℃孵箱中培养。所测肿瘤细胞系为：A431、Calu-3、H1975、H1650和HCC827。
(3)、MTS方法：细胞接种于96孔板中，每孔3000个细胞，并在5％CO2，37℃增湿培养箱中孵育过夜。第二天将测试化合物加入孔内后，再孵育72小时。使用MTS检测细胞的活性。计算IC50(与DMSO对照组相比使细胞生长受到50％抑制所需的药物浓度，使用GraphPadPrism软件的非线性回归分析进行计算)。
2、试验结果
目标化合物Id对A431、Calu-3、H1975、H1650以及HCC827肿瘤细胞抑制活性总结在表2中。
表2 肿瘤细胞抑制试验结果
从表2中可见，本发明化合物Id对各种测试肿瘤细胞均表现了抑制活性。
三、药物动力学实验
1、实验方法：
实验动物：裸鼠、雌性，6～7周；体重：20～25g；
供试品配制：将测试化合物配制成0.2mg/mL(为静脉给药用)和1.0mg/mL(为口服给药用)，待用。给药途径：口服/静脉。给药容量及频率：5mL/kg，单次给药。
样品采集：按照下列时间点采集血液，每个时间点3只动物，取全血约0.5-1.0mL。于给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h和24h取血。所有动物在完成试验后均实施安乐死。
2、样品分析及结果
样品分析：使用LC-MS/MS方法对采集样品进行检测。使用仪器型号为SHIMADZU20A-API4000。
药物动力学数据分析：使用WinNolin按照非房室模型法对所得血药浓度数据进行拟合和计算，部分结果总结在表3中。
表3 按照非房室模型法计算出的目标化合物药物动力学参数
在裸鼠中的试验结果表明本发明化合物具有良好的药物动力学特征。
另外，还对本发明化合物的毒副作用进行了试验测试。对裸鼠每日一次连续给药21天，对大鼠每日一次连续给药14天，结果表明本发明化合物具有较小的毒副作用，在动物中的耐受性良好，已测试的最高剂量为100mg/kg/天。
以上实施例仅是代表性的。通过上述实施例可见，本发明的化合物是理想的高效双重非可逆性酪氨酸激酶抑制剂，可期望用于治疗或预防肺癌、胃肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、头颈部鳞癌、表皮鳞癌、***癌、神经胶质瘤和鼻咽癌等多种恶性肿瘤疾病并取得非常好的效果，其还可以和不同类型的药用盐相结合制成口服制剂(片剂或胶囊等)。用本发明化合物制成的片剂或胶囊可被服用每日一次或多次。本发明化合物还可和其他它药物结合制成复方制剂。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.具有通式(Ⅰ)的化合物或其可药用盐：
其中：
R1为CH2F，CHF2，CF3，OCH2F，OCHF2，OCF3，C2～C3氟代烃基，C2～C3氯代烃基；或者，R1为OCkH2k+1，其中k为1～3之间的整数；
R2为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2；
R3为-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)2、-NHSO2CH＝CH2、-NHSO2CH＝CHCH2N(CH3)2；R4为
其中，R5为H、CH3、CH2CH3；
X为CH。
2.根据权利要求1所述的具有通式(Ⅰ)的化合物或其可药用盐，其特征在于：式(I)中，R1为选自CH2F，CHF2，CF3，OCH2F，OCHF2，OCF3，OCH3及OCH2CH3中的一种。
3.根据权利要求1所述的具有通式(Ⅰ)的化合物或其可药用盐，其特征在于：式(I)中，R5为H或CH3。
4.根据权利要求1所述的具有通式(Ⅰ)的化合物或其可药用盐，其特征在于：式(I)中，R1为选自OCH2F，OCHF2，OCF3，OCH3及OCH2CH3中的一种；R3为-NHC(O)CH＝CHCH2N(CH3)2、-NHSO2CH＝CH2、-NHSO2CH＝CHCH2N(CH3)2；R2为-NHCH2CH2N(H)CH3、-NHCH2CH2N(CH3)2、-N(CH3)CH2CH2N(H)CH3、-N(CH3)CH2CH2N(CH3)2；X为CH。
5.根据权利要求1所述的具有通式(Ⅰ)的化合物或其可药用盐，其特征在于：所述化合物为如下结构式表示的化合物中的一种：
6.如式Ic表示的化合物或其可药用盐，
7.如权利要求1至6中任一项权利要求所述的化合物或其可药用盐在制备预防和/或治疗与EGFR激酶功能有关的适应症的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述与EGFR激酶功能相关的适应症为乳腺癌、卵巢癌、胃肠癌、食管癌、肺癌、头颈部鳞癌、胰腺癌、表皮鳞癌、***癌、神经胶质瘤和鼻咽癌。
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