CN1052508A

CN1052508A - 新的多肽、能表达它们的dna序列、制备方法和应用

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Publication number: CN1052508A
Application number: CN90110047A
Authority: CN
Inventors: 多米尼科·彼得; 伊迪丝·塞伯劳德; 琼-弗兰克斯·梅尤科斯; 帕特里克·耶
Original assignee: Rhone Poulenc Sante SA
Current assignee: Rhone Poulenc Sante SA
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1991-06-26
Also published as: KR0164850B1; CA2030073C; FI905660A0; US5766918A; FI102971B; GR3024316T3; ZA909071B; HU907151D0; AU631696B2; ATE152481T1; EP0433117A1; DE69030615T2; JP3150335B2; ES2104596T3; KR910012245A; IL96309A0; JPH04218379A; FI102971B1; FI905660A; PT95909A

Abstract

本发明涉及编码具有对映选择性酰胺酶活性的多肽的DNA序列。

Description

本发明涉及具有对映选择酰胺酶活性的多肽。还涉及表达这些多肽需要的遗传物质，以及制备它们的微生物方法。最后，本发明涉及这些多肽的用途，以及从外消旋酰胺对映选择性合成酸类的转化微生物的应用。具体说来，涉及丙酸类，特别是（S）-2-芳基-丙酸和（R）-2-芳氧基-丙酸。

由于具有不对称碳原子，许多分子存在两个不同的立体异构形式、R和S，一个是另一个的镜象。2-芳基-丙酸就是这种情况。绝大多数时候，这些分子作为对映混合物存在，两个对映体具大致相同比例。在某些情况下，只需一种特定的异构体，因此就需要一种实际的手段分离这两种异构体，或者采用立体选择性合成来得到需要的异构体。

本发明属能够以对映选择的方式水解酰胺的多肽范畴。特别是关于水解外消旋2-芳基-丙酰胺类为（S）-2-芳基-丙酸类，以及水解外消旋2-芳氧基-丙酰胺类为（R）-2-芳氧基-丙酸类。

已证明微生物中有酶活性，短杆细菌属（Brevibacterium）和棒状杆菌属（Corynebacterium）菌株很显著（欧洲专利No.89400197.3），特别是短杆细菌菌株R312（CBS717.73）。此外，如红球菌（Rhodococcus）菌株也具有酶活性。

本发明包括表征和提纯这些对映选择性酰胺酶活性物，以及克隆和序列分析负责表达它们的遗传物质。下述术语“Amd”表示所有对映选择酰胺酶活性物，术语“Amd Sequence”表示能编码所说的酰胺酶活性物的核苷酸序列。

具体说来，本发明的目的是采用DNA重组技术，在不同宿主生物中，使这些对映选择性酰胺酶获得高水平表达。

因此，本发明的目的之一涉及能编码具有对映选择性酰胺酶活性的多肽的DNA序列。特别关系到外消旋的2-芳基-丙酰胺类。本发明优选的实施方案涉及能编码短杆细菌R312（示于图8）或红球菌（示于图13）的对映选择性酰胺酶的核苷酸序列。以及编码相同多肽的任何简并序列。本发明还涉及能编码具对映选择性酰胺酶活性多肽的这些DNA序列或其片断的杂交序列。本发明还涉及含这些DNA序列的基因。

研究这些酰胺酶多肽序列之间的同源性，揭示出一个对观察到的活性起作用的高守恒区。该区域相应于表示在图13（核苷酸618至788）中的肽序列的氨基酸137至193及相应于上述短杆细菌R312的酰胺酶肽序列的氨基酸159至215，由于具有这样一个守恒区，使其具严格同源性（67%）。

因此，本发明的目的之一是涉及如前所述的DNA序列，其特征是它至少含有编码图13中氨基酸137至193或图8中的氨基酸159至215的序列或者与之至少有50%同源性的肽序列。

特别是，本发明的目的之一是涉及DNA序列，其特征是它含有示于图8和13中的所有或部份Amd序列或其变种。在本发明中，“变种”意味着保存起始序列性质的所有序列，甚至包括各种因素引起的变化结果，例如：遗传密码的突变、缺失、***或简并。

更确切地说，该DNA序列含有图8或图13所示的序列。

通过多种方法可获得该DNA序列。一般方法是，借助从纯化多肽获得的核苷酸探针，克隆能编码所需多肽的染色体DNA片断。采用不同方法，包括引物延伸、限制性内切酶、连结物***、或连接子寡核苷酸配位，可构成含所需DNA序列的核苷酸***物。然后采用文献中已知方法制图和定序。

同时也可采用其它方法，包括应用DNA和/或部份或全部的化学合成。这些技术都是公知的，描述在图8和13中的结构提供了在任何微生物中，采用经典的方法对等同序列的分离。

由于已证明在不同对映选择酰胺酶之间的同源性，本发明提供了可于任何基因库中识别杂种基因（具有足够同源性的基因）的探针生产。很容易证实这些对映选择酰胺酶的基因编码。采用这种方式，可在任何微生物中获得高含量的酰胺酶，也可发现新的对映选择酰胺酶活性物。

本发明还涉及具有对映选择性酰胺酶活性的多肽，它含有至少下述之一的肽序列：

-图13中相应于氨基酸137至193的序列，

-图8中相应于氨基酸159至215的序列，

-与这些序列至少50%同源的序列。

本发明的另一个目的涉及其结构来源如上述DNA序列的新的多肽，该多肽具有对映选择性酰胺酶活性。这些多肽由自然或重组的微生物繁殖，再经提取并纯化而得。提纯采用连续步骤，包括从培养物中制备粗提取物，提取物的硫酸铵分馏，再经过色谱和凝胶过滤纯化。详细内容示于实施例中。

更确切地说来，本发明涉及短杆细菌R312和红球菌的对映选择酰胺酶。

本发明还涉及转化微生物，它含有至少一种上述提到的DNA序列表达盒。这些盒优选含有本发明的DNA序列，置于调节DNA序列控制之下，保证其在所需宿主中的表达。这些盒可在宿主的染色体中组合，或***带有选择性标记的质粒和宿主复制机能的起点上。

本发明的意义之一是多肽在人工条件下的表达，即在特别有利条件下培养的某些细胞中的异源序列的表达，和/或为促进生成和/或改善培养条件，在至少部份异源调节信号控制下的同源序列的表达。

控制DNA序列之表达的DNA序列（属本发明目的）优选带有转录子和转译起始区者。该区含启动子和核糖体结合位点，可以与肽产物的位点同源或异源。

调节区的选择取决于使用的宿主。特别是，对原核宿主来说，异源启动子可从强细菌启动子中选择，例如色氨酸操纵子Ptrp的启动子、乳糖操纵子Plac的启动子、噬菌体λP_R和P_L的左或右启动子、棒状杆菌（Corynebacteria）噬菌体的强启动子、或者甚至棒状杆菌的同源启动子。更确切地说来，在λ右启动子的情况下，优选温度敏感型的P_RCⅠts。对如酰母类的真核生物来说，可采用酵母糖酵解基因启动子，例如磷酸甘油酸激酶（PGK）基因、甘油醛-3磷酸脱氢酶（GPD）基因、乳糖酶（LAC4）基因和烯醇酶（ENO）基因的启动子。

当宿主微生物是原核微生物时，核糖体固定位点优选来自λCⅡ基因或者棒状杆菌的同源基因者。

在宿主内、转录子和转译端功能区置于编码顺序的3′位，质粒也带有供重组宿主选择的一个或几个标记。优选突出的标记，例如对氨苄青霉素或链霉素这些抗生素有抗性的，或对其它毒素有抗性的这类标记物。

所用的宿主微生物较为突出的包括肠细菌如大肠杆菌（E.Coli）和棒状细菌（Corynebacterium）属，短杆细菌（Brevibacterium）属或红球菌（Rhodococcus）属这类棒状杆菌。当然根据同样原则其它类型的细胞也可使用。

本发明的目的之一，涉及前面所述质粒，这些质粒至少包函转录子和转译起始区，编码所需多肽的DNA序列以及精选的标记。

本发明也涉及前述转化微生物，有关它们在对映选择性酰胺酶制备中的应用，以及从外消旋酰胺对映选择性合成酸类的用途。

制备对映选择性酰胺的程序包括，培养前面叙述过的微生物（在提供能编码对映选择性酰胺酶序列表达的条件下培养），然后从产生的酰胺酶中分离出微生物。

更确切地说，本发明涉及，在由相应的外消旋2-芳基-丙酸酰胺类对映选择性合成2-芳基-丙酸类中，前面描述过的重组微生物或多肽的应用。

根据本发明的一个优选实施方案，描述一个推荐的程序：从相应的外消旋酰胺制备有机酸的立体异构体，其特征在于该外消旋酰胺置于存在前述的转化微生物的条件下，或存在由前面叙述的方法获得的多肽的情况下，然后将得到的立体异构体回收。

在适于此法的酰胺中，应提及酮洛芬的外消旋酰胺，从它们可以制备医药工业上有用的S（+）酮洛芬。

下面所列出的是本发明其它的典型和优异的实施例和图表。这些只应视为例证，而不是限制。

图表的描述：

图1：A、从短杆细菌R312纯化的酰胺酶获得的肽序列（N-末端和内部）。

B、从内部肽片断得到的寡核苷酸探针。

图2：A、从短杆细菌R312酰胺酶得到的N-末端肽片断，设计探针Sq918的方法。

B、特异性探针Sq918。

图3：A、用EcoRⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和SphⅠ消化的短杆细菌R312得到的全部染色体DNA与探针Sq918杂交作用概貌。

B、用BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、SalⅠ、SmaⅠ、SphⅠ、SstⅠ和XhoⅠ消化短杆细菌R312得到的全部染色体DNA与探针Sq762杂交作用的概貌。

图4：质粒PXL1650和pXL1651的限制性图。

图5：含短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶基因的5.4Kb PstⅠ片断的限制性图。

图6：含短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶基因的BamHⅠ-PstⅠ片断的序列分析方法。

图7：已序列分析片断的开放解读结构的分析。

图8：短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶基因的核苷酸和肽的序列。

图9：质粒pXL1724的限制性图。

图10：质粒pXL1751的限制性图。

图11：质粒pXL1752的限制性图。

图12：Coomassie兰染色后的12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶、表示在大肠杆菌B和大肠杆菌K12E1035菌株中短杆细菌R312的对映选择酰胺酶的表达，每个泳道相应蛋白质量相当于60μl在2.1（E103S）或0.7（E.coliB）的O.D上的培养物。声处理（pXL1029和pXL906）的总和T包括分别在P_RCⅠts或Ptrp启动子的控制下的IL₁-β基因。

图13：红球菌对映选择酰胺酶的核苷酸和肽序列（源自质粒pXL1836的BamHⅠ片段）。

图14：往复性载体pSV73的限制性图。

图15：表达质粒pYG811B的限制性图。

图16：表达质粒pYG817B的限制性图。

图17：表达质粒pYG822的限制性图。

起始质粒：

Jung等曾经描述过质粒pXL1029（1988，Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.139.129-146）。它携带含P_RCⅠts-RBScⅡ△tRⅠ的EcoRⅠ-Ndel片断。

实施例1

鉴别和提纯短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶

1.1.鉴别：

与2-芳基-丙酰胺衍生物比较，2-芳氧基-丙酰胺的衍生物（R.S）-2-（4-羟基-苯氧基）-丙酰胺（HPP酰胺）是对映选择性酰胺酶较好的底物，显著地优于2-苯基-丙酰胺和2-（3-苯甲酰基-苯基）-丙酰胺。而且对应于HPP酰胺的R对映体的酰胺酶的选择性代表对应于2-芳基-丙酰胺衍生物S对映体的选择性。

结果是用2-（4-羟基-苯氧基）-丙酰胺作为底物来鉴定对映选择性酰胺酶活性。反应在25℃，于短杆细菌R312存在下，在50mM磷酸钠缓冲液中搅拌，pH7.0的条件下进行。以55/40/5（V/V）的比例加入0.05M磷酸、乙腈和1N HCl混合物停止反应。离心后，培养物上层清液用反相高效液相色谱（HPLC）（Hibar-Merk RP-18，5μm）分析、洗脱液是0.005M磷酸和乙腈的溶液（85/15）（V/V）。将洗脱峰与标准峰比较测量出相应的HPP酰胺和HPP酸的浓度。对于该底物，对映体的过量程度用（R-S）/（R+S）×100表示，其中R和S分别是HPP酸的R和S对映体的浓度。对映体的过量值可通过旋光测定（用589nm的钠吸收）或通过手性柱用HPLC测定推测出。

从整个细胞和可溶物提取获得的活性物质，分别是15U/mg和24U/mg的蛋白质，（1U＝每小时形成1μmol HPP酸），（R）-HPP酸对映体过量程度是95%。结果证明，短杆细菌R312具备对映选择酰胺酶，能水解外消旋2-芳基-丙酰胺为相应的S酸。从外消旋2-苯基-丙酰胺和外消旋2-（3-苯甲酰基-苯基）-丙酰胺水解为各自的S酸，都证实了这一点，一种对映体的过量值可高于93%。

1.2.纯化

纯化在4℃下进行，细胞（短杆细菌R312干重40g）被解冻并悬浮于30ml缓冲液A中（50mM磷酸钠，pH7，5mMβ-巯基乙醇）。然后用声处理打碎细胞，在20000rpm下离心处理30分钟，除去细胞膜碎片。于搅拌下，在30ml上层清液中，缓缓加入25ml10%的链霉素硫酸盐。45分钟后，如上所述澄清溶液，用硫酸铵处理所得的上层清液。在硫酸铵饱和度30.8%和56.6%之间蛋白质成份被沉淀出。离心收集沉淀、并把它溶于35ml的缓冲液A中，然后用同样缓冲液缓慢的渗析。把所得的溶液调节到20%硫酸铵饱和度，离心处理。加到苯基-琼脂糖CL-4B柱（药用）上，此柱系用缓冲液A，于20%饱和度的硫酸铵下保持平衡的。用同样缓冲液、洗脱有活性的馏份。然后用Amicon Diaflo PM10细胞超滤浓缩到体积为18ml，然后在浓缩液中加入丙三醇（10%）。把所得溶液加到用50mM Tris-HCl、pH7，100mM NaCl予先平衡的Ultrogel AcA 44柱（IBF-Bio-technics，France）上。收集含有最高比活度的馏份（约占柱中总载活性成份的32%）、浓缩、用相同的胶进行重复过滤步骤。同样用SDS-PAGE分析含有最高比活度的馏份（约占柱中所载全部蛋白质的30%）并保存之。也测定纯化蛋白质的对映选择性。

此种纯化法可使所得酶的纯度大于80%，其比活度为815U/mg。在该步骤中，从SDS-PAGE上，可见表现分子量为59+/-5KD的主要区带，它至少相应于全部蛋白质的80%。而且从HPLC TSK3000柱中洗脱的酰胺酶活性物的分子量为122KD，表明该酶是二聚体形式。

表1列出了不同馏份的特征。该表也描述了提纯短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶的不同步骤：

-以链霉素硫酸盐沉淀后，取40g湿细胞。

-在下述条件下，一单位（U）相当于每小时形成1μmol的HPP酸。

表1

提纯步聚	体积(ml)	蛋白质的量(mg)	活性(U/mg)	产率%	提纯系数
						1）粗提取物2）硫酸铵沉淀3）苯基－琼酯糖洗脱4）AcA44，第一次洗脱5）AcA44第二次洗脱	32529.57763	1918613200273.9	26.462.5198457815	100757824.46.3	12.47.517.331

实施例2

克隆短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶

2.1 蛋白质序列的衍生

使用纯化酶分别确定相应的短杆细菌R312的对映选择酰胺酶的N-末端（27个残基）和胰蛋白酶（Trypsic）内部片断（21个残基）的肽序列。

将3nmol的酰胺酶进行还原和羧甲基化制备反应，然后把主要蛋白质成分脱盐，用反相HPLC纯化至均一。然后用Applied.Biosystems Model 470A仪器进行连续自动的Edman降解，确定N-末端的序列。用这种方法得到示于图1A的序列。为了得到另外的内部序列，把相同量的蛋白质用胰蛋白酶消化。经过还原和羧甲基化的片断，采用反相HPLC分离（2.1×10mm流速0.2ml/min），使用下述的洗脱缓冲液：0至50%乙腈于0.07%三氟乙酸中的梯度。洗脱的肽具良好分离峰（在40.8%乙腈中），将之进行序列分析（图1A）。

2.2.核苷酸探针的构成

使用两种方法。

第一个方法是，建造一个29聚体探针（最小59%同源性），记住短杆细菌lactofermentum的色氨酸操纵子密码子的用法（含6个顺反子的7.7Kb序列：Matsui等Mol.Gen，Genet.209p.299，1987），且采用内部片断的IDGALGSYDV序列（显示较小平均简并度）。考虑到G：T对的相对热力学中性，通过引入几次简并合成非编码链、以使所考虑的密码子平均理论频率达极大值（相对于所用挑选的密码子的88%）。这些条件使得探针中的GC值达约69%。探针的序列（Sq762）示于图1B。

第二个方法是，用Girges等所述的PCR方法（Nucleic Acid Res.16，P.10371，1988），从相应的高简并度密码子的多肽得到准确的核苷酸探针。为达此目的，合成25聚体寡核苷酸（见图2A中划线的序列），相当于N-端基肽序列的第一或最后5个密码子的所有可能性编码，并在它们的5′末端，分别携带EORⅠ和HindⅢ位点。这些25聚体用于起始短杆细菌R312DNA染色体的酶放大。30个放大循环后，用凝胶提纯候选的片断。然后***噬菌体M13mp19的HindⅢ和EcoRⅠ位点之间。事实上，采用两个不同的引物杂交温度（45℃和48℃），得到两个候选片断。克隆片断后，每个温度下的几个克隆被序列分析，并加以比较，结果示于图2A。可见，除去由引物引入的简并外，编码酰胺酶N-末端的DNA片断（只在引物之间）被有效的放大。相当于该内部片断的合成的40聚体寡核苷酸（Sq918），因此作为准确的酰胺酶N-端基探针，用于克隆（Clonage）其余的、特异性探针Sq918的核苷酸序列示于图2B。

用³²P通过5′磷酰化来标记由此获得的Sq762和Sq918两个探针。

2.3.克隆编码短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶的基因

本方法包括首先证实探针的特异性，并通过Southern bolt法确定将被克隆的DNA染色体片断的性质。简单地说，通过几个相应于可能的克隆位点，特别是相应于PUC质粒的多位克隆区位点的几种限制性内切酶交替消化短杆细菌R312的染色体DNA。使用PstⅠ较为突出。通过琼脂糖凝胶电泳，并转移到尼龙膜后，经多种消化作用，可使探针Sq762和探针Sq918杂交。示于图3的结果证明在杂交条件下（至多每次消化杂化一个片断）两个探针有足够的特异性。而且，由于两个探针几乎有相同的杂交概貌，可认为试图获得的基因杂交信号是相当特异的，也可相信，胰蛋白酶消化所得的内部肽非常接近N-端基末端。特别是，杂交作用的印迹表示存在单独的5.4Kb PstⅠ片断，它被两个探针强烈地杂交。因此决定克隆该片断。

经克隆，从PstⅠ消化的全部短杆细菌R312染色体DNA，产生大约大小在4.6kb和5.5kb之间的片断，用琼脂糖提纯、电洗脱、并连接到用PstⅠ切断的pUC19上。大肠杆菌（E.Coli）菌株DH52转化后，在X-gal介质上得到500个白集落，它在理论上是相应的重组微生物。每一集落被单独分离，转移到尼龙膜上，然后通过以³²P标记的Sq918探针杂交来分析。将二个克隆强烈杂交、分离并用于下面步骤。

使用各种方法分析从这两个克隆中分离出的两个重组质粒pXL1650和pXL1651，包括限制性制图，用探针作序列引物部份序列分析，并可使用Southern blot法。图4表示两个质粒含有相同5.4kb PstⅠ***物，有两个取向。图5表示这些片断的限制性图。这两个质粒确实含有能编码特定肽的序列，邻近N-末端的胰蛋白酶片断（图8）。而且这些结果表示编码短杆细菌R312的对映选择酰胺酶的基因位于2.3kb的BamHⅠ-PstⅠ片断，在此种情况下，定向是BamHⅠ对着PstⅠ。给出了编码序列5′末端的位置，且已知酶在至多2kb被编码（据我们估计是57-63KD单体），便可肯定整个基因包含在BamHⅠ-PstⅠ片断上，因此我们对该片断进行序列分析。

实施例3

含有编码短杆细菌R312对映选择酰胺酶基因的BamHⅠ-PstⅠ片断序列

图6表示BamHⅠ-PstⅠ片断的序列分析方法。通过链中止法（在7-deaza-dGTP，（³⁵S）-dATP存在下的Sequenase Kit），可获得各种序列，在带有亚片断的单股M13基质上获得，或者直接在质粒pXL1650上获得。为此也合成了几个特定的引物。获得的序列平均GC含量是61.5%，图7表示开放阅读框架的分析，可以看到相应于521个氨基酸（计算过分子量为54671的蛋白质）的酰胺酶密码的开放阅读框架。开放阅读框架的GC含量分别是第一密码子位为65.8%，第二密码子位52.5%，第三密码子位为70%。上述是富GC微生物编码序列的典型分布。图8表示BamHⅠ-PstⅠ片断的完全序列。

实施例4

编码短杆细菌R312对映选择性酰胺酶的基因在大肠杆菌（E Coli）中的表达

4.1.质粒的构成

建造几个质粒，其中，酰胺酶结构基因（含均一核蛋白体结合位点（RBS）或来自λCⅡ基因的RBS）置于它自己的启动子，色氨酸操纵启动子或λ右温度敏感启动子控制下。由将5.4kb片断（由全部短杆细菌R312染色体DNA的PstⅠ消化而来）***质粒PUC19的独特PstⅠ位而获得质粒pXL1650（图4）。因此该质粒携带乳糖操纵子Plac的启动子，再加上核蛋白体结合位点，编码短杆细菌R312对映选择性酰胺酶的结构基因，以及编码抗氨苄青霉素的标记。

质粒pXL1724（图9）含有从5.4kb PstⅠ片断切下（在大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子控制下）的2.3kb BamHⅠ-PstⅠ片断。因此在此结构中，短杆细菌的酰胺酶基因由含其自身核蛋白体结合位点的ATG密码子的58对碱基上段领先（图8）。

制得其它两种结构，其中，编码短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶的结构基因置于异源启动子控制下（带异源核蛋白体结合位点）。这些质粒（pXL1751和pXL1752）通过如下方法获得：

为了由NdeⅠ位点（CATATG）取代位于酰胺酶结构基因上段的ATG密码子，用PCR诱变质粒pXL1724。使用相应于以起始ATG密码子杂交的NdeⅠ位的引物，和以位于ATG密码子下段的XhoⅠ位的相应引物进行放大处理。然后通过以NdeⅠ和XhoⅠ消化切断该放大片断。

-启动子Ptrp的应用：

由EcoRⅠ和XhoⅠ消化的质粒pXL1724中***带有Ptrp启动子和λCII基团的核蛋白体结合位（λCII基因除去了端基序列tR₁），并携带有酰胺酶结构基因（片断NdeⅠ-XhoⅠ）的5′区的EcoRⅠ-NdeⅠ片断。这样产生出质粒pXL1751（图10）

-启动子P_RCⅠts的应用：

采用相同的方法，只不过这次采用来自质粒pXL1029的EcoRⅠ-NdeⅠ片断，该片段含λCII基因，P_RCⅠts启动子和核蛋白体结合位（消除了端基序列tR₁）。由此生成质粒pXL1752（图11）。

4.2.短杆细菌R312的酰胺酶基因在E.ColiB和E.ColiK12B1035中的表达

采用氯化钙法，质粒pXL1751和pXL1752分别被用于转化coli B和E.coli K12 E103S菌株，在氨苄青霉素介质中进行重组微生物的选择。

声处理细胞后，采用粗分馏SDS-PAGE测量短杆细菌R312的对映选择性酰胺酶的表达，或者离心处理之后，声处理碎片和上层清液再测量。从图12的结果可见酰胺酶高水平表达，达全部蛋白质的20%。

实施例5

用短杆细菌R312对映选择酰胺酶对映选择性合成2-芳基-丙酸

下述的菌株用于此例：

大肠杆菌（E.Coli）（pXL1751）-酰胺酶编码序列放置在色氨酸操纵子的启动子的控制下。大肠杆菌（E.Coli）（pXL1752）-在指数生长期末，λP_R启动子在温度敏感阻遏物CIts控制下，将温度从30℃提高到40℃，产生酰胺酶。

也采用两个对照菌株：

大肠杆菌（E.Coli）（pXL906）-等同于带有由基因IL1β置换了酰胺酶基因的大肠杆菌（E.Coli）（pXL1751）

大肠杆菌（E.Coli）（pXL1029）-等同于带有被IL1β基因置换了酰胺酶基因的大肠杆菌（E.Coli）（pXL1752）。

下述的方法用于检验这些微生物的活性。

将适当诱导条件下培养的细胞悬浮液，加入含有下述成份的溶液中：

-羟基-4-苯氧基-2-丙酰胺（HPPAm）或

-苯基-2-丙酰胺（PPAm）或例如

-酮洛芬的酰胺（KAm）

用含有乙腈：N盐酸（90∶10）（V/V）的缓冲液稀释反应混合物、离心除去细胞。反应混合物用HPLC分析，并测定酰胺酶活性，其结果表示在表2中，证明该***的效率。

表2列出短杆细菌R312酰胺酶（在诱导条件下，于E.Coli产生的）的特定的对外消旋的底物HPPAm、PPAm和KAm的特异活性，以及产生的手性酸对映异构体的过量程度。在本实验中，含有质粒pXL1751（酰胺酶）或pXL906（对照）的大肠杆菌（E.Coli）的菌株，在37℃条件下生长。

表2

还原条件下的大肠杆菌的菌株

比活度μmol/h/g蛋白质

对映选择过量值%

HPPAm

PPAm

KAm

HPPAP+

HPPAS+

Ketos+

pXL1751pXL1752

13001300

5050

45

9394

9697

9595

续表2

还原条件下的大肠杆菌的菌株

比活度μmol/h/g蛋白质

对映选择过量值%

HPPAm

PPAm

KAm

HPPAP+

HPPAS+

Ketos+

pXL906pXL1029

014

nd0

ndnd

表3表示短杆细菌R312（表达质粒pXL1751）酰胺酶（在28℃诱导或抑制条件下于E.Coli产生的）对外消旋底物KAm的特异性活性，以及产生的手性酸的对映异构体过量值。

表3

细菌	质粒	阻遏物(1)	比活度μmol/h/g蛋白质	ee(%)
					大肠杆菌大肠杆菌	pXL1751pXL1751	-Trp	5313	96nd

nd＝未测定 ee：对映体过量值（%）

注（1）＝Trp：L-tryptophane（色氨酸）

因此，含有短杆细菌R312（genotype Amd⁺）的酰胺酶基因的大肠杆菌（E.Coli）菌株，可有效地水解下述三种酰胺（phenotype AMD⁺）

-2-（4-羟基-苯氧）-丙酰胺（HPPAm）

-2-苯基-丙酰胺（PPAm）

-酮洛芬的酰胺（KAm）

所得对映体过量值总是大于93%

实施例6

提纯红球菌（Rhodococcus）的对映选择酰胺酶

Ⅰ.测定酶的活性

把活性成份在500μl的缓冲液（0.1M Tris HCl pH7.5，5mM DTT，18mM 2-苯基-丙酰胺）保温后，在反应混合物中加入2ml乙腈/HCl 1N（90/10）混合物和2ml 50mM H₃PO₄/CH₃CN（75/25）的混合物。于5000rpm下离心处理约10分钟后，等分的上层清液用高效液相色谱测定反应产物。

柱：Nucleosil 5-C18 25cm

洗脱液：50mM H₃PO₄/CH₃CN（75/25）

载荷：10μl。

流速：1ml/min

一个单位活力定义为：每小时水解1μmol 2-苯基-丙酰胺需要的酶量

Ⅱ.纯化方案

6.1.酶提取物的制备

将7g细胞悬浮于15ml 0.1M Tris-HCl pH7.5 5μM DTT的溶液中，在4℃下声处理约15分钟，在50000rpm下离心约1小时，收集粗酶提取物。

6.2.第一级离子交换色谱

在20ml的粗提取物中，加入20ml缓冲液A（25mM Tris HCl pH7.5，5mM DTT）。样品被注入到Mono QHR 10/10柱（药用）中，用缓冲液A平衡，流速为3ml/min。洗完柱后，蛋白质以0.1至1M KCl的线性1小时梯度，在流速3ml/min下洗脱出，馏份体积是6ml，以18ml大约0.3M KCl将酰胺酶洗脱。

6.3.第二级离子交换色谱

合并活性馏份，并用Centriprep超滤***（Amicon）浓缩至2ml，用6ml缓冲液稀释后，以1ml/min的速度，把4ml样品注射到用缓冲液A平衡的Mono Q HR 5/5柱中，以缓冲液A中0至0.5M KCl的线性梯度洗脱蛋白质。合并活性馏份，调节至15%丙三醇溶液（V/V），按上述方法浓缩至1ml。

6.4.疏水色谱

在样品中加入1ml缓冲液B（0.1M Tris HCl pH7.5，0.5mM DTT，1.7M（NH₄）₂SO₄），然后在流速为0.25ml/min下，把样品注射入（分二针）苯基-琼脂糖HR5/5柱中（药用）。蛋白质在0.5ml/min，用25ml（NH₄）₂SO₄（1.7M至0M）递减线性梯度洗脱。馏份的体积是0.5ml。将活性馏份调节至15%丙三醇，然后用缓冲液A稀释至1ml。

6.5.羟磷灰石色谱

把样品以0.5ml/min的速度，注射入Bio-Gel HPHT，用缓冲液C（85mM Tris HCl pH7.5，0.5mM DTT，10μM CaCl₂、15%的丙三醇）平衡的柱（Bio-Rad）中。在流速0.5ml/min下，用缓冲的（0.35M磷酸钾，pH7.5，0.5mM DTT，10μM CaCl₂、15%丙三醇）0至100%线性梯度洗脱酰胺酶，洗脱在20分钟内进行。

通过上述步骤酶纯化达到均一程度，其蛋白质的比活度为988U/mg。

所得的酶以相同亚单元的二聚体形式存在，其表观分子量为53+/-2KD。

实施例7

克隆编码该酰胺酶的基因

经过在TSK-G3000SW上进行的附加提纯步骤后，对该酶进行序列分析。用埃德曼型化学变化难于得到N-末端，因此，进行完全胰旦白酶消化，水解产物的HPLC三馏份-123，124和162提供了能得到确定序列的多肽，从得到的123分馏物的序列，合成32-聚体核苷酸探针，它相应于8个寡聚核苷酸的混合物，且在至少简并三次的位点处含有7个次黄苷。

探针A（来自肽123）

ATVDVPVPDYA

5′ 3′

GCIACIGTIGATGTCCIGTICCIGATTATGC

C C C

利用Southern方法，通过转移到来自红球菌（Rhodococcus）的基因组DNA上，而测定5′末端用³²P标纪的探针的效能，该基因组DNA先用下面任一种限制性内切酶消化：SstⅠ，SphⅠ，SmaⅠ，PstⅠ，KpnⅠ，EcoRⅠ，SalⅠ和BamHⅠ。实验条件如下：杂交缓冲液：5×SSC，5×Denhardt，0.1% SDS，50mM NaPO₄，pH6.5，250μg/ml鲑***DNA;杂交的温度是50℃或55℃（两个实验）;洗涤条件是在室温下用6×SSC洗涤1小时，以及在50℃用2×SSC，0.1%SDS洗涤5分钟。

在上述条件下，探针A显示出强的，确定的信号;尤其是，用BamHⅠ，KpnⅠ，SphⅠ，SstⅠ，SmaⅠ，SalⅠ和PstⅠ消化时，得到一条单一的基因组谱带，它能与探针A强烈地杂交。通过PstⅠ的消化，与探针A杂交的信号大小相当于约3.2kb的染色体片段。

染色体DNA的3至4kb PstⅠ消化片段的纯化是经过琼脂糖制备电泳后，电洗脱，然后连接到质粒pUC19，该质粒已用PstⅠ切割。转化大肠杆菌（E.Coli）菌株DH5α后，在LB Amp-X-gal上显示白色的600个克隆各自再挑取出，并在与Southern影印法相同的严谨条件下，采用菌落杂交的方法，用探针A检测。9个克隆显示有强烈的杂交信号，然后通过限制性分析质粒DNA，分析这9个克隆，结果清楚地显示，在这些克隆中的6个，以两种定向***了相同的3.2kb的片段，对其中显示每一种定向的两个克隆（pXL1835和pXL1836）进行更详细分析（详细制图，Southern分析），从而确定获得了预期的片断。

实施例8

3.2kb的PstⅠ片段的序列

已测定3.2kb PstⅠ片段的两条链的全部核苷酸序列。该片段的GC含量是62.4%。与R312的GC含量（约62%）相近，序列分析表明，存在一个为含有462氨基酸的多肽（计算得分子量为48554）编码的1386个核苷酸（位点210至1595）的开放式阅读框架，该多肽也含有先前通过序列分析胰蛋白酶片段获得的三肽。该开放式阅读框架包含于BamHⅠ亚克隆的片段中，该片段的核苷酸序列示于图13。

3个划线的肽序列对应于根据纯化酶的胰旦白酶片段直接测得的肽片段（肽123，124和162），划线的核苷酸序列相应于用于克隆基因的（已简并）探针，斜体字表示的肽序列相应于残基137至193，它们于短杆菌（Brevibacterium）菌株R312和红球菌（Rhodococcus）菌株的对映选择性酰胺酶之间高度守恒（见下文）。

该开放式阅读框架表示对映选择酰胺酶的结构基因。

实施例9

不同酰胺酶之间的同源性：鉴定具酰胺酶活性特征的序列

比较R312的对映选择酰胺酶（图8）和示于图13的酰胺酶的肽序列，结果表明，序列的三分之二处即位于R312的残基150-300之间的序列有高度同源性（50%完全相同）。在残基159到215之间同源性达67%）。

通过导找GENPRO基因库的同源性序列，发现在150至200区域，和构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的乙酰胺酶，Pseudomonas Syringae和Bradyrhizobium japonicum的吲哚乙酰胺水解酶（IAH），根癌农杆菌（Agro bacterium tumefaciens）的tms2蛋白质，和黄胞菌属（Flavobacterium）菌株K172和假单孢菌属（Pseudomonas）菌株NK87的6-氨基己酸-环-二聚水解酶（ACDH）的序列都有强烈的同源性。

表4表示上面描述的酰胺酶的肽137-193残基之间与其它酶相应位点之间的同源性（用氨基酸的严格等同百分数表示）：

表4

酰胺酶	％同源性
		R312tm2A,tumefaciensIAHP.syringaeACDH(F.K172 or P.NK87)IAH B. japonicum乙酰胺酶（构巢曲霉）	65.564.361.861.454.447.4

该高度守恒区域很可能负责提供这些酶的活性（催化位点）。

实施例10

对映选择性酰胺酶在大肠杆菌（E.Coli）中的表达

为了确切鉴定编码对映选择性酰胺酶的状态，通过PCR方法，在210位的假定的ATG密码子处制造出NdeⅠ位点（CATATG）（图13），将在该位点和在1683位的SalⅠ位点之间的片段（该片段含有唯一的编码酰胺酶的区域）置于大肠杆菌（E.Coli）的转录起始（启动子Ptrp或PR）和转译（核旦白体结合位点CⅡ）的功能信号的控制下。由此获得的载体（pXL1893，Ptrp;和pXL1894和P_R-CIts）与表达R312酰胺酶的载体pXL1752和pXL1751相似，如上所述。分别在大肠杆菌（E.Coli）B和大肠杆菌（E.Coli）K12E103S中研究了质粒pXL1893和pXL1894的表达。在42℃，质粒pXL1894存在时，特异性地产生一种与纯化的酰胺酶共迁移的旦白质。

实施例11

对映选择性酶胺酶在棒状杆菌中的表达

1.构建表达载体

这些载体来自于棒状杆菌的复制性载体。他们包括：

-一个大肠杆菌（E.Coli）的复制子

-一个棒状杆菌（corynebacteria）的复制子

-一个选择性标记

-一个Amd序列

载体pSV73（图14）：该质粒是通过在C.glutamicum（Yoshihama et.al.，J.Bacteriol.162，591，1985）的pSR1质粒中***含有大肠杆菌（E.Coli）复制子的质粒pUC8和携带于转座子Tn903的卡那霉素抗性基因而获得。

这些质粒用于构建示于图13的Amd序列的不同表达载体，较好的：

-载体pYG811A和B（图15）。通过将图13描绘的SalⅠ片段中含有的Amd序列，以两种取向克隆到pSV73的SalⅠ位点而获得这些表达载体。

-载体pYG817A和B（图16）。这些表达载体是通过将图13描绘的BamHⅠ片段中含有的Amd序列，以两种取向克隆到pSV73的BglⅡ位点而获得。

-载体pYG882（图17）。该表达载体来自于pSV73，通过在SalⅠ和BglⅡ位点之间***一个表达盒而获得，该表达盒含有显示于图13的Amd序列，该Amd序列在E.Coli的色氨酸操纵子的Ptrp启动子控制下。

-其他同形的棒状杆菌质粒可用于构建在棒状杆菌中具功能的表达Amd序列的载体。例如，从B.lactofermentum（Yeh et.al.，Gene，47，301-306，1986）中分离的质粒pX18，可用于构建穿梭载体pYG820A和pYG820B，它们可以在短杆菌属（Brevibacterium）R312中复制，因而可在几种棒状细菌的克隆和表达实验中作为受体。

2.转化棒状杆菌

可采用所有已知的转化技术，较好的是如前记载的Yoshima et.al.所述的质生质体-再生技术。但是本申请的申请人已证明，电击穿技术是非常有效的，可将转化频率扩大至1000倍。

经超声波处理的细胞的SDS-PAGE分析技术，可用于研究重组宿主内酶的胞内表达。

实施例12

酶的催化作用

本实施例例证了Amd-型蛋白质，或表达这些旦白质的重组微生物，在通过水解相应的外消旋的酰胺，对映选择性地合成有旋光活性的有机酸中的应用。

1.细胞的制备

在28℃，以每分钟150转的速度搅拌的合适培养条件下，将不同的菌株培养于含有600ml培养基的锥形瓶中，终止培养后，收集细胞，用NaCl（9g/l）溶液洗涤，并贮藏在-18℃。

2.以2-苯基-丙酰胺作为底物

方法如下：

2-苯基-丙酰胺和细胞悬浮液被加到带有搅拌器的烧瓶中，用50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）将体积调至5ml。将烧瓶放在恒温的结晶盘上，在25℃搅拌约1小时，然后用乙腈/HCl（9/1）（V/V）溶液稀释反应混和物。通过离心除去细菌和细胞碎片，用HPLC测定酸和酰胺的组合。

从短杆菌（Brevibacterium）R312和Brevibacterium lactofermentum（ATCC 21086）获得的结果如下：

表5

菌株	质粒	比活度μmol/h/mg蛋白质
			短杆菌R312短杆菌R312短杆菌R312B.lactofermentumB.lactofermentum	pSV73pYG811ApYG811BpSV73pYG822	0.14.35.402.8

3.外消旋苯酮苯丙酸（酮洛芬）酰胺作为底物

如表6所示，用重组体棒状杆菌表达来自红球菌（Rhodo coceus）的酰胺酶的活性明显高于用pSV73转化的对照细胞表达的酶活性。

表6

细菌菌株	质粒	诱导物比活性(1) μmol/h/mg蛋白质		ee(%)
					短杆菌R312短杆菌R312短杆菌R312B.LactofermentumB.Lactofermentum	pSV73pYG811ApYG811BpSV73pYG822	IBNIBNIBNIBN+IBNAmIBN+IBNSm	0.010.040.0400.02	nd9694ndnd

nd＝未测定 ee：对映异构体的过量值

注释（1）＝IBN：异丁腈;IBNAm：异丁酰胺

Claims

1、编码具对映选择酰胺酶活性的多肽的DNA序列。

2、根据权利要求1的DNA序列，其特征在于它们选自：

-示于图8的编码短杆细菌（Brevibacterium）R312对映选择酰胺酶的序列和示于图13的编码红球菌（Rhodo-coccus）的对映选择酰胺酶的序列，

-编码相同蛋白质的一些类似序列，但其来源于基因密码的简并，

-用一个该序列或其片断杂交并编码具有对映选择酰胺酶活性多肽的DNA。

3、根据权利要求1的DNA序列，其特征在于它至少包括示于图13的编码氨基酸137至193的序列，或示于图8的编码氨基酸159至215的氨基酸，或与这些序列有至少50%同源性的肽序列。

4、至少含有示于图8的序列编码位区的DNA。

5、至少含有示于图13的序列编码位区的DNA。

6、含有根据权利要求1～5任何一项的DNA序列的基因。

7、根据权利要求1～6任何一项中的DNA序列的表达所得的新的多肽，该多肽具有对映选择酰胺酶的活性。

8、根据权利要求7的多肽，其特征在于示于图8和图13的序列。

9、具有对映选择酰胺酶活性的多肽，且具有至少选自下述的序列。

-图13中相应的氨基酸137至193序列，

-图8中相应的氨基酸159至215序列，

-与前述序列至少具有50%同源性的序列。

10、根据权利要求7～9的任何一项的多肽，其特征在于它们不是自然起源的。

11、转化微生物它含有至少载有根据权利要求1～6任何一项序列的表达盒，在DNA序列的控制下，保证这些序列在宿主生物中的表达。

12、根据权利要求11的微生物，其特征在于保证根据权利要求1～6中之一项的序列表达的DNA序列含转录和转译起始区。

13、根据权利要求11的微生物，其特征在于转录和转译起始位区含有启动子序列和核蛋白体结合位点。

14、根据权利要求13的微生物，其中启动子序列和核蛋白体结合位点，根据产生的肽可以是同源的或异源的。

15、根据权利要求14的微生物，其特征在于启动子序列可以选自下述的棒状细菌噬菌体的强启动子，色氨酸操纵子的启动子Ptrp紫胶操纵子的启动子Plac，λ噬菌体的左启动子PL₁或λ噬菌体的右启动子PR。

16、根据权利要求15的微生物，其中，启动子选自色氨酸操纵子的启动子Ptrp和λ噬菌体的右启动子P_RCIts。

17、根据权利要求11的微生物，其中，核蛋白体结合位点，源自λ噬菌体的CⅡ基因，或棒状细菌的同源基因。

18、根据权利要求11至17之一项的微生物，其特征在于表达盒携带于带有选择性手段的质粒上。

19、根据权利要求11的微生物，其中选择手段是具有对抗生素有抗性的精心挑选的标记。

20、根据权利要求11的微生物，其特征在于质粒含有色氨酸操纵子的启动子Ptrp，删除了转录末端序列tR₁的λ噬菌体基因CⅡ的核蛋白体结合位点，编码短杆细菌（Brevibacterium）R312的对映选择酰胺酶基因的DNA和具有氨苄青霉素抗性的基因。

21、根据权利要求11的微生物，其特征在于质粒含有温度敏感的λ噬菌体P_RCIts右启动子，删除了转录末端序列tR₁的λ噬菌体CⅡ基因的核蛋白体结合的位点，编码短杆细菌（Brevibacterium）R312的对映选择酰胺酶基因的DNA和具有氨苄青霉素抗性的基因。

22、根据权利要求11至21之一项的微生物，其特征在于它选自下述的大肠杆菌（E.coli），短杆细菌（Brevibacterium），棒状杆菌（Corynehacterium），红球菌（Rhodococcus）菌株。

23、根据权利要求22的微生物，其特征在于它是大肠杆菌（E.coli）B或大肠杆菌（E.coli）K12E103s。

24、对映选择酰胺酶的制备方法，其特征在于根据权利要求11至23任何一项的微生物，使之在能表达编码酰胺酶序列的条件下培养，培养后分离微生物并提取酰胺酶。

25、根据权利要求24的方法，其特征在于声处理培养物，用硫酸铵分馏。在苯基-琼脂糖凝胶色谱上分析并进行双凝胶过滤。

26、从相应的外消旋酰胺制备有机酸的立体异构体的方法，其特征在于外消旋酰胺放置于上述权利要求11至23任何一项叙述的微生物存在下，或上述权利要求7-10任何一项所述的多肽的存在下，反应完成后回收立体异构体。

27、根据权利要求26的制备方法，其特征在于酰胺是外消旋的2-芳基-丙酰胺，而酸是（S）酸。

28、根据权利要求27的方法。其特征在于外消旋的2-芳基-丙酰胺是酮洛芬的酰胺而酸是（s⁺）酮洛芬。

29、根据权利要求26的方法，其特征是酰胺是外消旋的2-芳氧基-丙酰胺，而酸是相应的R立体异构体。