CN105238734B - 一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法 - Google Patents
一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，本方法采用特制的取孢器，该取孢器的一端制成扁平圆状的取孢球，另一端制成前端略尖，扁平铲子状的取孢铲。该取孢器能少量粘附病原孢子，均匀涂布于培养基上，能保证10×10倍的视野中有1个孢子出现，孢子密度低，容易找到目标孢子，且不容易粘附叶片残体，易于分离病原孢子，有效提高了分离率和分离速度。挑取的孢子为培养24小时已萌发的孢子，有效地避免了其他方法挑取单孢后不能萌发的结果，成功率高。采用粘附取孢的方式进行挑取孢子，操作快捷、成功率高，提高了挑取效率，同时该方法操作技巧性难度不大，经过几次训练便可熟练掌握，上手容易，简单易学。
Description
技术领域
本发明涉及一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，属于微生物培养技术领域。
背景技术
尾孢属真菌是植物病原菌，可寄生在植物的茎、叶、花或果实上引起病害发生。玉米灰斑病(Cercospora zeina)(Meisel B,Korsman J,Kloppers F J,et al.Cercosporazeina is the causal agent of grey leaf spot disease of maize in southernAfrica[J].European journal of plant pathology,2009,124(4):577-583.)、甜菜褐斑病(Cercospora beticola)(Holtschulte B,Asher M J C,Molard M R,et al.Cercosporabeticola-worldwide distribution and incidence[J].Cercospora beticolaSacc.biology,agronomic influence and control measures in sugar beet.,2000:5-16.)、辣椒褐斑病(Cercospora capsici)(Kawagoe H.Influence of temperature andrelative humidity on disease occurrence of sweet pepper caused by Cercosporacapsici in a plastic house[J].Annals of the Phytopathological Society ofJapan,1998,64(2):137-138.)等都是尾孢属真菌引起的，造成很大的经济损失，因此，***地研究尾孢属致病菌种类及发生规律，有效地降低病害发生几率，对减少经济损失具有重要意义。尾孢属真菌生长速度缓慢，普通的病组织分离法常无法分离到目标病原菌或易被杂菌污染。
目前，常用单孢分离法分离病原菌，单孢分离法是植物病害研究中常用的分离方法之一，该技术不仅涉及病原真菌的分离纯化、孢子形态观察方面，而且在研究群体遗传变异、生理生化特性等领域也有应用。单孢分离方法有很多，总结概括为两种类型，即使用特殊装置或手工操作分离。
其中，“单孢子分离器”是一种单孢分离装置(Constantinescu O.An instrumentand procedure for single-spore isolation[J].Transactions of the BritishMycological Society,1988,91(4):700-702.)，但该装置安装较为复杂，需要对显微镜设备改造，且国内未见此装置的广泛使用。相比之下，手工操作分离较为普遍，但不同方法也存在一些不足，例如，切取器分离法(Ho W C,Ko W H.A simple method for obtainingsingle-spore isolates of fungi[J].Botanical Bulletin of Academia Sinica,1997,38.)，需要在显微镜下对单孢子处标记，然后用切取器切割单孢琼脂块，常出现切割的范围不准确，无法切到单孢的情况；直接在显微镜下挑取涂有孢子的琼脂平板，但培养皿不能固定，也不能随意移动，造成分离率降低(方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社,1998.)；玻璃针法(Choi Y W,Hyde K D,Ho W H.Single spore isolation offungi.Fungal Diversity,1999,3:29-38.)、眉针法(刘长华,***.玉米丝黑穗病田间接种浓度与发病率关系的研究[J].玉米科学,2008,16(1):119-121.)，这些方法基本都是通过挑针挑取孢子，制作挑针的工具多为昆虫针或玻璃挑针，昆虫针较细，在显微镜下易确定孢子位置，但昆虫针较软，不易挑取粘有孢子的琼脂块，而玻璃挑针的硬度适中，但直径较粗，在显微镜视下观察常常占满整个视野，不能确定孢子的位置，同时，玻璃挑针的尖端易碎，在操作时要格外小心。这些因素降低了单孢分离的成功率和操作效率，在一定程度上限制了单孢分离法的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明在病原菌孢子分离过程中，综合已有的单孢分离方法，利用病原分离中简单的设备，组成一种简易单孢分离器，并结合一种新的单孢分离方法，其具有操作简便、设备简单、分离速度快、准确性高、不宜污染等优点。
术语解释：
WA琼脂液：是指用水和琼脂配制而成的培养液，也称为WA培养基(Water-agarmedium)-水-琼脂培养基。
PDA平板培养基：是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato DextroseAgar(Medium)。
本发明是通过以下方法实现的：
一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，包括以下步骤，
a.选取具有发病症状的叶片，0-4℃保存，备分离用；
b.将取孢器高温灭菌消毒，备用；所述取孢器的一端为取孢球、另一端为取孢铲，所述取孢球为扁平圆状，所述取孢铲为扁平铲子状、端部呈尖状；
c.配制浓度为0.030-0.035g/ml的WA琼脂液，灭菌，在WA琼脂液未凝固前，吸取WA琼脂液，均匀涂布在载玻片上，使WA琼脂液形成直径10-15mm，厚度1-1.5mm的圆形琼脂块，制得琼脂片，然后将琼脂片放置在超净无菌工作台上凝固备用；
d.取经过步骤a处理后的叶片，用无菌水冲洗、干燥；然后用步骤b制得的取孢球在叶片病斑处来回划动，使孢子粘附到取孢球上，再将粘附有孢子的取孢球在步骤c制得的琼脂片上均匀涂布，最后将涂布的琼脂片放在10×10倍显微镜下，视野中观察到1个孢子即可；
e.将经过步骤d处理后的涂有孢子的琼脂片放在25-28℃的环境下保湿培养22-24h；
f.将显微镜放在超净无菌工作台上，把经过步骤e培养后的琼脂片放在载物台上，在10×10视野下找到刚萌发，尚未分支的目标孢子，用取孢铲将孢子周围的琼脂块与琼脂片其它部分的琼脂分离，然后用取孢铲尖状端挑取带有孢子的琼脂块，移入PDA平板培养基，放在25℃恒温环境下培养，获得单孢菌株。
优选的，步骤a中，将叶片装入洁净的自封袋内，然后将自封袋放在装有冰袋的塑料泡沫盒中，0-4℃保存带到实验室，备分离用；
优选的，步骤b中，将取孢器放入三角烧瓶中，封口，在120-125℃、103-104Kpa条件下，灭菌20min后，备用。
优选的，步骤c中，将100ml纯净水装入200ml三角烧瓶中，放入3-3.5g琼脂制得浓度为0.030-0.035g/ml的WA琼脂液。
优选的，步骤d中，取经过步骤a处理后的叶片，用75％酒精表面消毒，无菌水冲洗3次，然后用灭菌滤纸擦干叶片表面。
优选的，步骤d中，取孢球在叶片病斑处来回划动之前，先在含有2％乳酸的灭菌水中蘸取。此设计的好处在于，取孢球在蘸取了含2％乳酸的灭菌水后，其具有一定的黏着性，便于粘附孢子。
优选的，步骤e中，将涂有孢子的琼脂片放置在铺有湿润吸水纸的培养皿内保湿培养，25℃下培养24h。此设计的优势在于，琼脂片较薄，含水量低，容易干燥，放置在铺有湿润吸水纸的培养皿内，利于保湿培养。
优选的，步骤f中，将显微镜放在超净无菌工作台上后，用无菌脱脂棉蘸75％酒精擦拭显微镜的镜头和载物台，紫外灯照射30min。
本发明的有益效果在于：
1.本发明单孢分离方法采用特制的取孢器挑取孢子，特制的取孢器能少量粘附病原孢子，并能均匀涂布于培养基上，保证10×10倍的视野中有1个孢子出现，孢子密度低，容易找到目标孢子，且不容易粘附叶片残体，易于分离病原孢子，有效提高了分离率和分离速度。
2.本方法采用特制的取孢器挑取的孢子为培养24小时已萌发的孢子，有效地避免了采用其他方法挑取单孢后不能萌发的结果，成功率高。
3.本方法采用特制的取孢器，使用取孢器一端的取孢球通过粘附取孢的方式进行挑取孢子，其操作更为快捷，且成功率高，大大提高了挑取效率。
4.本方法操作技巧性难度不大，且取孢器更易手持并把握轻重，经过几次训练便可熟练掌握，上手容易，简单易学，操作人员学习成本低。
5.本方法中采用的取孢器既可以通过产业方法制得，也可以通过实验设备改造制得，通过实验设备制得可选用常用实验耗材，制备取孢器及操作时无需购买特殊设备，在以后的实验中可以方便获得材料，增加操作的标准化程度。
6.本方法可实现多种用途，除可以分离尾孢属真菌孢子外，其余需要单孢分离的病原真菌也可选用此方法进行分离。
附图说明
图1为本发明分离方法中所用到的取孢器的结构示意图；
图2为在琼脂玻片培养24h的萌发孢子的显微图；
图3为在PDA培养基培养5d后单孢子生长情况的显微照片；
图4为转移到PDA培养基培养7d后单孢子生长情况的显微照片；
其中：1、取孢球；2、取孢铲；3、接种针。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例1：
一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，包括以下步骤，
a.选取具有发病症状的叶片，装入洁净的自封袋内，放在装有冰袋的塑料泡沫盒中，0-4℃保存带到实验室，备分离用；
b.制作取孢器，如图1所示，本实施例中，通过改造实验设备制得取孢器，在接种针的两端分别套设2.5μl移液枪头，将一端的2.5μl移液枪头靠近酒精灯烧成扁平圆状，迅速离开火源，在空气中冷却制成取孢球，直径约为1mm；将另一端的2.5μl移液枪头靠近酒精灯，待其融化后，用扁平头的镊子迅速在融化处拉丝，形成前端略尖，扁平铲子状的取孢铲，即得到一端为取孢球另一端为取孢铲的取孢器，然后将取孢器放入三角烧瓶中，封口，在120-125℃、103-104Kpa条件下，灭菌20min后，备用。
c.将100ml纯净水装入200ml三角烧瓶中，放入3.5g琼脂制得浓度为0.035g/ml的WA琼脂液，灭菌后备用；在WA琼脂液未凝固前，用移液枪吸取100μl的WA琼脂液，画圆均匀涂布在载玻片上，使WA琼脂液形成直径10mm，厚度1mm的圆形琼脂块，制得琼脂片，然后将琼脂片放置在超净无菌工作台上凝固备用；
d.取经过步骤a处理后的叶片，用75％酒精表面消毒，无菌水冲洗3次，然后用灭菌滤纸擦干叶片表面；将取孢球在含有2％乳酸的灭菌水中轻轻蘸取，然后用取孢球在叶片病斑处来回划动，使孢子粘附到取孢球上，再将粘附有孢子的取孢球均匀地涂布在琼脂片上，最后将涂布的琼脂片放在10×10倍显微镜下，视野中观察到1个孢子即可；
e.将涂有孢子的琼脂片放置在铺有湿润吸水纸的培养皿(选用直径为90mm的培养皿)内保湿培养，放在25℃的环境下保湿培养22h；
f.将显微镜放在超净无菌的工作台上，用无菌脱脂棉蘸75％酒精擦拭镜头和载物台，紫外灯照射30min，把经过步骤e培养后的琼脂片放在载物台上，在10×10视野下找到刚萌发，尚未分支的目标孢子，用制备好的取孢铲，将孢子周围切成一个四边形的小块，然后用取孢铲尖状端挑取带有孢子的小块，移入PDA平板培养基，放在恒温培养箱中25℃培养，获得单孢菌株。
传统方法中，挑取孢子的工具是挑针或刮刀，这两种工具，在刮除病斑时容易将病斑刮破，破坏了病斑组织的完整性。而本实施例提供的单孢分离方法，采用特制的取孢器，取孢球的圆状面增加了粘附面积，同时，圆面光滑，在涂布过程中不会将琼脂片表面刮碎，取孢铲能够快速准确地切取单孢子的琼脂块，同时方便挑取琼脂块，相比传统的单孢分离方法，其成功率高，效率更高。
实施例2：
如实施例1所述的一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，其不同之处在于：步骤c中，将100ml纯净水装入200ml三角烧瓶中，放入3g琼脂制得浓度为0.030g/ml的WA琼脂液。用移液枪吸取100μl的WA琼脂液，画圆均匀涂布在载玻片上，使WA琼脂液形成直径15mm，厚度1.5mm的圆形琼脂块。
步骤e中，将涂有孢子的琼脂片放在28℃的环境下保湿培养24h。
实施例3：
如实施例1所述的一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，其不同之处在于：用移液枪吸取100μl的WA琼脂液，画圆均匀涂布在载玻片上，使WA琼脂液形成直径10mm，厚度1.5mm的圆形琼脂块。
Claims (3)
1.一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法，包括以下步骤，
a.选取具有发病症状的叶片，将叶片装入洁净的自封袋内，然后将自封袋放在装有冰袋的塑料泡沫盒中，0-4℃保存带到实验室，备分离用；
b.将取孢器放入三角烧瓶中，封口，在120-125℃、103-104Kpa条件下，灭菌20min后，备用；所述取孢器的一端为取孢球、另一端为取孢铲，所述取孢球为扁平圆状，所述取孢铲为扁平铲子状、端部呈尖状；
c.将100ml纯净水装入200ml三角烧瓶中，放入3-3.5g琼脂制得浓度为0.030-0.035g/ml的WA琼脂液，灭菌，在WA琼脂液未凝固前，吸取WA琼脂液，均匀涂布在载玻片上，使WA琼脂液形成直径10-15mm，厚度1-1.5mm的圆形琼脂块，制得琼脂片，然后将琼脂片放置在超净无菌工作台上凝固备用；
d.取经过步骤a处理后的叶片，用75%酒精表面消毒，无菌水冲洗3次，然后用灭菌滤纸擦干叶片表面、干燥；然后用步骤b制得的取孢球先在含有2%乳酸的灭菌水中蘸取，接着用取孢球在叶片病斑处来回划动，使孢子粘附到取孢球上，再将粘附有孢子的取孢球在步骤c制得的琼脂片上均匀涂布，最后将涂布的琼脂片放在10×10倍显微镜下，视野中观察到1个孢子即可；
e.将经过步骤d处理后的涂有孢子的琼脂片放在25-28℃的环境下保湿培养22-24h；
f.将显微镜放在超净无菌工作台上，把经过步骤e培养后的琼脂片放在载物台上，在10×10视野下找到刚萌发，尚未分支的目标孢子，用取孢铲将孢子周围的琼脂块与琼脂片其它部分的琼脂分离，然后用取孢铲尖状端挑取带有孢子的琼脂块，移入PDA平板培养基，放在25℃恒温环境下培养，获得单孢菌株。
2.如权利要求1所述的简单快速分离尾孢属单孢子的方法，其特征在于，步骤e中，将涂有孢子的琼脂片放置在铺有湿润吸水纸的培养皿内保湿培养，25℃下培养24h。
3.如权利要求1所述的简单快速分离尾孢属单孢子的方法，其特征在于，步骤f中，将显微镜放在超净无菌工作台上后，用无菌脱脂棉蘸75%酒精擦拭显微镜的镜头和载物台，紫外灯照射30min。
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Families Citing this family (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN108384711A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-08-10 | 四川省农业科学院植物保护研究所 | 一种高效羊肚菌菌种分离装置及方法 |
| CN109082366A (zh) * | 2018-09-05 | 2018-12-25 | 云南省农业科学院农业环境资源研究所 | 一种分离稻瘟病菌单孢菌株的装置及方法 |
| CN111471601A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-07-31 | 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） | 一种甘蔗褐斑病菌的培养方法 |
| CN112522107A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-19 | 浙江大学 | 一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法 |
| CN112592831A (zh) * | 2021-01-06 | 2021-04-02 | 云南农业大学 | 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009035925A2 (en) * | 2007-09-13 | 2009-03-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Composition of entomopathogenic fungus and method of production and application for insect control |
| CN102140432A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-08-03 | 西北农林科技大学 | 真菌单个孢子的分离方法 |
| CN103881924A (zh) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | 青岛康地恩药业股份有限公司 | 一种高通量真菌的分离方法 |
| CN105002097A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-10-28 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种大丽轮枝菌的单孢分离纯化方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009035925A2 (en) * | 2007-09-13 | 2009-03-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Composition of entomopathogenic fungus and method of production and application for insect control |
| CN102140432A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-08-03 | 西北农林科技大学 | 真菌单个孢子的分离方法 |
| CN103881924A (zh) * | 2012-12-19 | 2014-06-25 | 青岛康地恩药业股份有限公司 | 一种高通量真菌的分离方法 |
| CN105002097A (zh) * | 2014-12-04 | 2015-10-28 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种大丽轮枝菌的单孢分离纯化方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 一种强寄生病原真菌的分离方法;董娟华等;《中国农学通报》;20091231;第25卷(第3期);210-212 * |
| 一种简便的病原真菌单孢分离方法研究;龚国淑等;《玉米科学》;20101231;第18卷(第1期);第1.2.1-1.2.5、2.2节 * |
| 稻瘟病菌孢子的分离和保存方法;赵沙沙等;《湖北农业科学》;20151231;第54卷(第24期);6252-6254 * |
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