CN105052743B - 一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞工程组织培养技术领域，旨在提供一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法。该种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法包括步骤：材料采取、愈伤诱导培养、胚性愈伤组织的筛选与保存。本发明以黄菖蒲幼嫩胚为外植体，污染率极低、愈伤诱导率高、愈伤胚性好，繁殖系数高，同时解决了黄菖蒲愈伤组织保存中易褐化和分化等严重问题，实用性强，操作简便，推广性好。
Description
技术领域
本发明是关于细胞工程组织培养技术领域，特别涉及一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法。
背景技术
黄菖蒲是鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)多年生湿生或挺水宿根植物，为水生花卉中的骄子，花姿秀美，叶色青翠，观赏价值极高。此外黄菖蒲抗性强，可耐盐碱，对水体中的重金属离子和有机污染有一定的吸收能力，随着城乡水景建设的加快，其在城市水景中的使用量不断增加。
尽管黄菖蒲具有很高的观赏价值和生态适应性，但仍存在花色单一、单花花期过短等缺点。通过转基因技术对植物性状进行定向改造是一种较快的育种方式，尤其适用于观赏植物新品种的培育。目前对鸢尾属植物的遗传转化，大多是对其愈伤组织进行转化，然后筛选、分化，从而获得转基因植株。因此，筛选出胚性良好的愈伤组织并使其具有较高的再生能力是最终获得转基因植株的关键环节。同时胚性愈伤组织还可用于植物种质资源保存与快繁生产中。
目前针对鸢尾属植物愈伤组织的研究多集中于诱导阶段，有关胚性愈伤组织的鉴定及胚性保持方法的报道和专利几乎没有。以幼叶和花器官作为外植体，诱导效率较低，且获得的愈伤组织胚性较差，不易后期保存增殖，以茎尖为外植体时，由于根状茎长期处于土壤环境中，携带病菌多，组培过程中消毒困难、污染率高，并且需要以损耗植物母体为代价。
植物组织诱导愈伤组织的能力，以及愈伤组织的分化再生能力，存在品种间、个体间的差异。随着愈伤组织继代时间增加，分化能力随之下降。继代一年的愈伤组织，几乎不能再生出苗。这亦是转基因研究的瓶颈之一。因此，探索一种污染率低，诱导率高、且能使胚性愈伤组织长期保持较高分化再生能力的方法，非常必要。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能有效保持黄菖蒲愈伤组织胚性，并使其能长期具有分化再生能力的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，包括培养基的配置，所述有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法具体包括下述步骤：
(1)材料采取：
在黄菖蒲花期后50天，取(发育良好的)蒴果置于封口袋中，于4℃冰箱中冷藏4天；
将冷藏过的蒴果，在添加(少量)洗洁精和TWEEN-20的自来水中浸泡20min，再在流水下冲洗40min，然后在超净工作台上进行消毒处理；
(2)愈伤诱导培养：
将步骤(1)处理后的蒴果，放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，剥取白色的嫩胚后接种至愈伤诱导培养基上；然后在培养室温度为25摄氏度，黑暗条件下培养30天；
所述愈伤诱导培养基为含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT(Kinetin，6-呋喃甲基腺嘌呤)和2.0mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)的MS培养基，且培养基溶液的pH值为5.85；
(3)胚性愈伤组织的筛选与保存：
外植体在愈伤诱导培养基上培养30天后，会出现胚性良好的愈伤组织，颜色金黄，颗粒致密，不发生褐化、水渍化、无根毛，从石蜡切片中可以看到，其细胞体积小，排列十分紧密，细胞核明显，细胞含糖量丰富；同时，也会出现一些不能再生的非胚性愈伤组织或胚性较差的愈伤组织，颜色为淡黄色，外层有黏液，表现出水渍化，无明显的颗粒状结构，从切片中可以看出，其细胞较大，部分周缘细胞破碎，细胞与细胞之间空隙较大，多数无细胞核，细胞质少，细胞壁附近出现薄片状糖类物质；
挑选质地紧密、颜色金黄的胚性愈伤组织团块，接种于愈伤保存培养基上；待愈伤组织团块平均直径达到1cm以上后，将其切分为平均直径为0.5cm的愈伤组织团块后，再接种到新鲜的愈伤保存培养基上，继代保存在25摄氏度、黑暗条件下进行，并每隔60天转接一次(黄菖蒲愈伤组织保存)；
所述愈伤保存培养基为含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0～2.0mg/L 6-BA(6-Benzyladenine，6-苄氨基腺嘌呤)、0～2.0mg/L KT、0～2.0mg/L TDZ(Thidiazuron，噻重氮苯基脲)、0～2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，且培养基溶液的pH值为5.8～5.9。
作为进一步的改进，所述步骤(1)中，所取的蒴果为长7～10cm的蒴果。
作为进一步的改进，所述步骤(1)中，消毒处理具体为：先将蒴果浸入体积浓度为70％的酒精溶液中，然后取出蒴果并置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
作为进一步的改进，所述步骤(2)中，嫩胚剥取的方法具体为：取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，(操作人员带上一次性PE手套后)用手沿种子纵轴撕开，即可看到白色的嫩胚，为提高操作速度，可先将撕开的种子放置于空的无菌培养皿中，撕开多个种子后统一用镊子夹出嫩胚接种至愈伤诱导培养基上。
作为进一步的改进，所述步骤(3)中的愈伤保存培养基，采用添加有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.1mg/L KT、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基。
作为进一步的改进，所述步骤(3)筛选的胚性愈伤组织，还能用于遗传转化体系中，作为遗传转化体系的受体，在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得黄菖蒲的转基因植株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明以黄菖蒲幼嫩胚为外植体，具有污染率低、材料易得、愈伤诱导率高的特点。
2、本发明根据愈伤形态即可直观判断其胚性状态，简便快捷，使用筛选得到的胚性良好的愈伤组织有利于后期保存或用于遗传转化体系。
3、使用本发明的黄菖蒲愈伤组织保存培养基，繁殖系数最大可达3.47倍，愈伤组织生长好，繁殖速度快，不发生褐化和分化现象，可作为黄菖蒲胚性愈伤组织保存培养基；本发明保存的愈伤组织转到分化培养基上容易分化，是黄菖蒲遗传转化受体的良好材料。
4、本发明污染率极低、愈伤诱导率高、愈伤胚性好，繁殖系数高，同时解决了黄菖蒲愈伤组织保存中易褐化和分化等严重问题，实用性强，操作简便，推广性好。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明中，MS培养基购自Phyto Technology Laboratories公司，规格为50L；MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖均可用它作为培养基的基本培养基。Phytagel(植物凝胶)购自Sigma公司，规格为100g，在植物组织培养过程中用来凝固培养基，使用方便，对培养植物不产生不利影响，具有较好的透明度。Kinetin(KT,6-呋喃甲基腺嘌呤)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，由Sigma公司产品分装，规格为1g；6-Benzyladenine(6-BA,6-苄氨基腺嘌呤)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，规格为10g；Thidiazuron(TDZ，噻苯隆)购自Sigma公司，规格为100mg；三者均为细胞***素类植物生长调节剂，主要功能是促进细胞***，抑制衰老。2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D,2,4-二氯苯氧乙酸)购自PhytoTechnology Laboratories公司，规格为10mg/mL，100mL，是一种生长素类植物生长调节剂，主要功能是促进细胞伸长生长和细胞***，诱导愈伤组织形成。
实施例1
步骤一：材料采取：
在黄菖蒲花期后50天，取发育良好的蒴果(长7-10cm)，置于封口袋中于4℃冰箱中冷藏4天后，在添加洗洁精和少量TWEEN-20的自来水中浸泡约20min，再在流水下冲洗40min，然后在超净工作台上进行消毒；将蒴果浸入体积浓度为70％的酒精溶液后，置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
步骤二：愈伤诱导培养：
将步骤一中消毒过的蒴果放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，剥取白色的嫩胚后接种至愈伤诱导培养基上；所述诱导培养基为含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，培养基溶液的pH值为5.85；所述培养室温度为25摄氏度，黑暗条件下培养30天。
步骤三：胚性愈伤组织的筛选与保存：
挑选质地紧密、颜色金黄的胚性愈伤组织团块接种于愈伤保存培养基上；待愈伤组织团块平均直径达到1cm以上后，可将其切分为平均直径为0.5cm的愈伤组织团块后接种于新鲜的愈伤保存培养基上，继代保存在25摄氏度、黑暗条件下进行，每隔60天转接一次。
所述愈伤保存培养基为含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.1mg/L KT、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，培养基溶液的pH值为5.8。
培养60天后愈伤组织生长达到最佳效果，平均繁殖系数达到3.47倍，愈伤组织颗粒紧密，颜色金黄，繁殖速度快，胚性保持好，不发生褐化、分化现象，无根毛产生。因此，采用该愈伤保存培养基培养，每隔60天转接一次，可以保持黄菖蒲的脱分化状态。
在本实施例中，步骤三中的愈伤保存培养基替换采用含30g/L蔗糖、7g/L琼脂和其余添加物的MS培养基也可实现；具体的其余添加物配方见表2。
实施例2
步骤一：材料采取：
在黄菖蒲花期后50天，取发育良好的蒴果(长7-10cm)，置于封口袋中于4℃冰箱中冷藏4天后，在添加洗洁精和少量TWEEN-20的自来水中浸泡约20min，再在流水下冲洗40min，然后在超净工作台上进行消毒；将蒴果浸入体积浓度为70％的酒精溶液后，置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
步骤二：愈伤诱导培养：
将步骤一中消毒过的蒴果放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，剥取白色的嫩胚后接种至愈伤诱导培养基上；所述诱导培养基为含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，培养基溶液的pH值为5.85；所述培养室温度为25摄氏度，黑暗条件下培养30天；
步骤三：胚性愈伤组织的筛选与保存：
挑选质地紧密、颜色金黄的胚性愈伤组织团块接种于愈伤保存培养基上；待愈伤组织团块平均直径达到1cm以上后，可将其切分为平均直径为0.5cm的愈伤组织团块后接种于新鲜的愈伤保存培养基上，继代保存在25摄氏度、黑暗条件下进行，每隔60天转接一次；
所述愈伤保存培养基为含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.1mg/LTDZ、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，培养基溶液的pH值为5.85。
培养60天后愈伤组织平均繁殖系数达到3.20倍，愈伤组织较少发生褐化、水渍化(不超过总数10％)、无根毛、颗粒致密、颜色鲜黄。因此，采用该愈伤保存培养基培养，每隔60天转接一次，可以较好地保持黄菖蒲的脱分化状态，可用于胚性愈伤组织的长期保存。
实施例3
步骤一：材料采取：
在黄菖蒲花期后50天，取发育良好的蒴果(长7-10cm)，置于封口袋中于4℃冰箱中冷藏4天后，在添加洗洁精和少量TWEEN-20的自来水中浸泡约20min，再在流水下冲洗40min，然后在超净工作台上进行消毒；将蒴果浸入体积浓度为70％的酒精溶液后，置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
步骤二：愈伤诱导培养：
将步骤一中消毒过的蒴果放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，剥取白色的嫩胚后接种至愈伤诱导培养基上；所述诱导培养基为含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，培养基溶液的pH值为5.85；所述培养室温度为25摄氏度，黑暗条件下培养30天；
步骤三：胚性愈伤组织的筛选与保存：
挑选质地紧密、颜色金黄的胚性愈伤组织团块接种于愈伤保存培养基上；待愈伤组织团块平均直径达到1cm以上后，可将其切分为平均直径为0.5cm的愈伤组织团块后接种于新鲜的愈伤保存培养基上，继代保存在25摄氏度、黑暗条件下进行，每隔60天转接一次；
所述愈伤保存培养基为含30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.1mg/LTDZ、0.2mg/L 2,4-D的MS培养基，培养基溶液的pH值为5.9。
培养60天后愈伤组织平均繁殖系数达到2.25倍，愈伤组织颗粒紧密，颜色金黄，胚性保持好，不发生褐化、分化现象，无根毛产生。因此，采用该愈伤保存培养基培养，每隔60天转接一次，可以保持黄菖蒲的脱分化状态，但愈伤组织生长缓慢，可用于胚性愈伤组织的长期保存。
在本发明有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法中：
步骤(1)中所采用的外植体消毒方法，可避免氯化汞、次氯酸钠等对环境和操作人员带来的伤害，省去消毒剂及无菌水冲洗时间，操作简便，节约人力物力。体积浓度为70％的酒精与细菌的渗透压相近，可以在细菌表面蛋白未变性前逐渐不断地向菌体内部渗入，使细菌所有蛋白脱水、变性凝固，最终杀死细菌，火焰灼烧也可有效杀死微生物。
步骤(2)外植体接种工程中，所取种子未完全成熟，胚乳和种皮易撕开，可大大节省取胚的劳力和时间，也避免解剖刀取胚时较易损伤嫩胚的弊端，同时种胚处于幼嫩阶段，生长旺盛，无病菌，可显著提高愈伤组织诱导效率。
在愈伤组织诱导过程中，会出现一些不能再生的非胚性愈伤组织或胚性较差的愈伤组织，而胚性良好的愈伤组织在后期继代后仍可保持良好的胚性和较高的再生能力。为了将愈伤组织形态与其胚性状态之间建立一种较为直观的联系，经过多次试验，结果表明：胚性良好的愈伤组织，颜色金黄，颗粒致密，不发生褐化、水渍化、无根毛，从切片中可以看到，其细胞体积小，排列十分紧密，细胞核明显，细胞含糖量丰富；非胚性愈伤组织为淡黄色，外层有黏液，表现出水渍化，无明显的颗粒状结构，从切片中可以看出，其细胞较大，部分周缘细胞破碎，细胞与细胞之间空隙较大，多数无细胞核，细胞质少，细胞壁附近出现薄片状糖类物质。具体可参考表1。进而实现了步骤(3)中胚性愈伤组织的筛选。
表1愈伤组织胚性状态评分标准
在黄菖蒲愈伤组织培养过程中，经常出现易褐化、生根、分化且愈伤组织胚性难以保持等问题。为探讨黄菖蒲胚性愈伤组织保存的方法，我们在MS基本培养基基础上，试验不同浓度细胞***素(BA、KT、TDZ)和2,4-D组合对愈伤组织保存的影响。为了更加准确地区分愈伤组织胚性状态，胚性状态按表1标准评分，其中再生率＝发生分化的愈伤组织团块数/接种的愈伤组织团块数。不同浓度细胞***素和2,4-D组合对愈伤保存影响的结果如表2所示。
表2不同植物生长调节剂浓度对黄菖蒲愈伤组织愈伤保存的影响
试验结果表明：愈伤组织保存培养基有利于愈伤组织的繁殖和生长；其中使用0.1mg/L KT+2.0mg/L 2,4-D的激素组合对愈伤组织生长的效果最好，愈伤组织的平均繁殖系数达到3.47倍，生长旺盛，不发生褐变，保存效果显著，继代一年的愈伤组织再生率可达到95～100％。进而本发明获得了优选的愈伤保存培养基。
注：差异显著性分析方法为Duncan新复极差，检测水平为P≤0.05。
表2采用字母标记法来表示多重比较结果，按照统计分析平均数多重比较标记字母法规定，用小写拉丁字母a、b、c、d......表示差异显著水平。先将各处理平均数由大到小排列，最大平均数后标记a，并将该平均数与以下各平均数相比，差异显著的依次标记b。依此类推，不显著的标同一字母。两平均数之间凡有相同字母的即为差异不显著，否则为差异显著。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，包括材料采取、愈伤诱导培养、胚性愈伤组织的筛选与保存，其特征在于，所述有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法具体包括下述步骤：
(1)材料采取：
在黄菖蒲花期后50天，取蒴果置于封口袋中，于4℃冰箱中冷藏4天；
将冷藏过的蒴果，在添加洗洁精和TWEEN-20的自来水中浸泡20min，再在流水下冲洗40min，然后在超净工作台上进行消毒处理；
(2)愈伤诱导培养：
将步骤(1)处理后的蒴果，放置在经高温灭菌的滤纸上，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，剥取白色的嫩胚后接种至愈伤诱导培养基上；然后在培养室温度为25摄氏度，黑暗条件下培养30天；
所述愈伤诱导培养基采用添加有30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L2,4-D的MS培养基，且培养基溶液的pH值为5.85；
(3)胚性愈伤组织的筛选与保存：
外植体在愈伤诱导培养基上培养30天后，会出现胚性良好的愈伤组织，颜色金黄，颗粒致密，不发生褐化、水渍化、无根毛，从石蜡切片中可以看到，其细胞体积小，排列十分紧密，细胞核明显，细胞含糖量丰富；同时，也会出现一些不能再生的非胚性愈伤组织或胚性较差的愈伤组织，颜色为淡黄色，外层有黏液，表现出水渍化，无明显的颗粒状结构，从切片中可以看出，其细胞较大，部分周缘细胞破碎，细胞与细胞之间空隙较大，多数无细胞核，细胞质少，细胞壁附近出现薄片状糖类物质；
挑选质地紧密、颜色金黄的胚性愈伤组织团块，接种于愈伤保存培养基上；待愈伤组织团块平均直径达到1cm以上后，将其切分为平均直径为0.5cm的愈伤组织团块后，再接种到新鲜的愈伤保存培养基上，继代保存在25摄氏度、黑暗条件下进行，并每隔60天转接一次；
所述愈伤保存培养基采用添加有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0～2.0mg/L 6-BA、0～2.0mg/LKT、0～2.0mg/L TDZ、0～2.0mg/L 2,4-D的MS培养基，且培养基溶液的pH值为5.8～5.9。
2.根据权利要求1所述的一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所取的蒴果为长7～10cm的蒴果。
3.根据权利要求1所述的一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，消毒处理具体为：先将蒴果浸入体积浓度为70％的酒精溶液中，然后取出蒴果并置于酒精灯火焰上灼烧，直至蒴果表面酒精完全挥发。
4.根据权利要求1所述的一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，嫩胚剥取的方法具体为：取出颗粒饱满的种子放于无菌滤纸上，用手沿种子纵轴撕开，即能看到白色的嫩胚，为提高操作速度，先将撕开的种子放置于空的无菌培养皿中，撕开多个种子后统一用镊子夹出嫩胚接种至愈伤诱导培养基上。
5.根据权利要求1所述的一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的愈伤保存培养基，采用添加有30g/L蔗糖、7g/L琼脂、0.1mg/L KT、2.0mg/L 2,4-D的MS培养基。
6.根据权利要求1所述的一种有效保存黄菖蒲胚性愈伤组织的方法，其特征在于，所述步骤(3)筛选的胚性愈伤组织，还能用于遗传转化体系中，作为遗传转化体系的受体，在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即能获得黄菖蒲的转基因植株。
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