CN109077067A - 一种生防菌及其在农作物灰霉病防治方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的生防菌及其在农作物灰霉病防治方面的应用；本发明的生防菌CGMCC No.15763，可以有效防治农作物灰霉病，并对于农作物有促生作用；特别在辣椒种植应用方面，不仅对于辣椒灰霉病的防治效果显著，还可以提高辣椒的抗旱性以及促进生长、提高产量；再者，本发明的生防菌与现有技术的化学药剂相比，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展。

Description

一种生防菌及其在农作物灰霉病防治方面的应用

技术领域

本发明涉及一种生防菌及其在农作物灰霉病防治方面的应用，属于农作物生物防治技术领域。

背景技术

灰霉病是我国农业生产中比较严重的病害，特别是对于辣椒的种植生成带来严重危害。辣椒作为人们喜爱的蔬菜之一，随着种植的专业化，由于品种单一，倒茬困难，多年的连茬栽培使田间灰霉病菌基数逐年增多，进而导致辣椒灰霉病发生日趋严重，一般损失率达15％～20％；严重时达30％～50％；最高可达100％，造成叶片大量腐烂，失去食用价值；同时也能引起田间损失，甚至在果实的储存和运输中造成严重危害。

目前抗灰霉病的育种工作还未取得突破性进展，辣椒抗灰霉病育种基本处于停滞状态。现阶段在辣椒栽培生产和釆后过程中对灰霉病的主要防治措施仍然是喷洒化学药剂等手段，但是由于长期的使用化学药使得灰霉病菌对多种杀菌剂产生了抗药性。我国北京、上海等地的田间和保护地栽培设施中的多种蔬菜上的灰霉病菌都产生了较为严重的抗药性，甚至有些地区的灰霉病对多菌灵等内吸性杀菌剂的抗性频率达到100％。

因此，寻求新的防治措施成为灰霉病防治的重中之重。生物防治措施作为一种新兴的防治措施，与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展因此。

生物防治灰霉病逐渐成为研究的热点，本领域希望筛选出能够对灰霉病进行防治的微生物。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种生防菌，其中，所述生防菌为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15763。

本发明另一方面还提供了一种采用如上述生防菌的菌药组合物，其中，所述菌药组合物包含杀菌剂和上述的生防菌的菌粉；所述杀菌剂为吡咯类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂、烟酰胺类杀菌剂或甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中任意一种或几种的混合物。

本发明再一方面提供了一种菌药制剂，其中，所述菌药制剂包含上述的生防菌和农药学上可接受的助剂，或者所述菌药制剂包含上述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂。

本发明还一方面提供了上述生防菌在防治农作物灰霉病方面的应用、在农作物促生方面的应用或者在辣椒种植方面的应用。

本发明还一方面提供了上述的菌药组合物在防治农作物灰霉病方面的应用。

本发明还一方面提供了上述菌药制剂在防治农作物灰霉病方面的应用。

本发明提供的生防菌CGMCC No.15763，可以有效防治农作物灰霉病，并对于农作物有促生作用；特别在辣椒种植应用方面，不仅对于辣椒灰霉病的防治效果显著，还可以提高辣椒的抗旱性以及促进生长、提高产量；再者，本发明的生防菌与现有技术的化学药剂相比，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展。

附图说明

图1为针对灰霉菌的平板拮抗试验结果的照片。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的生防菌(贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis)CGMCC No.15763的操作过程。

(1)分离潜在的生防菌

分离存在于植物体外的潜在生防菌：

剪取辣椒(采自上海阿林果蔬园)的根、茎、叶各3g，根围土称取3g，作为样本，分别加入到27mL灭菌水中(含灭菌玻璃珠)；

将上述获取的样本置于180rmp摇床振荡0.5h，静置5min，再各自吸取上清液进行梯度稀释，取稀释10⁴、10⁵和10⁶倍的稀释液；分别从三个梯度的稀释液中取0.1mL涂LB平板，28℃培养24～48h，选取菌落数在50～300之间的平板，计数并且挑取所有菌落，纯化后接种于盛有5mL LB液体培养基的试管中，28℃200rpm摇菌培养24～48h，取菌悬液与等体积80％甘油溶液混匀，存于-70℃保存备用(Berg et al.,2000)。

分离存在于植物体内的潜在生防菌：

剪取辣椒(采自上海阿林果蔬园)的根、茎、叶各3g，作为样本。首先对样本的表面进行消毒灭菌，具体的消毒灭菌过程如下：分别用1％的次氯酸钠1mL浸5min，70％酒精浸2min，无菌水清洗样本表面3次(取最后一次清洗下来的水0.1mL涂于R2A平板后28℃200rpm摇菌培养48h，或取最后一次清洗下来的水0.1mL加入R2A培养液，28℃振荡培养，若48h后无菌生长则认为样本表面消毒干净)。

将表面已消毒灭菌的样本，分别用灭菌的研砵研碎，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0.1mL涂LB平板，每个点重复3次，28℃培养48h后计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化后接种于盛有5mL LB液体培养基的试管中，28℃200rpm摇菌培养24～48h，取菌悬液与等体积80％甘油溶液混匀，存于-70℃保存备用(Krechel et al.,2002)。

(2)产酶及代谢产物活性测定初步筛选生防菌株

蛋白、几丁质、葡聚糖、纤维素等物质为植物病原真菌细胞壁的组成成分，能够产生具有以上几种物质降解酶活性的菌株，初步推测能够降解植物病原真菌的细胞壁，具有对植物病原真菌的拮抗活性，因此可以作为初筛生防菌的标准。牙签挑取处于生长旺盛期的菌株点于蛋白酶酶活测定培养基、以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基(Chi-Ayers)、β-1,3-葡聚糖酶酶活测定培养基、纤维素酶酶活测定培养基上，接菌后28～30℃培养3天观察透明圈有无，分别记录透明圈的内径和外径。具有一种或多种以上产酶及次生代谢物活性的菌株保留，待进一步筛选。

(3)与灰霉菌的平板拮抗试验进一步筛选抗灰霉生防菌株

取在25℃培养箱中已培养5天的灰霉菌真菌(取菌落中靠近边缘部分，用已灭菌的打孔器打取直径为0.6cm的菌碟)接种于PDA平板的中央，然后在距离接种位置等距离的相对两处用无菌牙签点接种本发明的生防菌5YN8的菌液(菌液活菌浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml)，另外两个相对的角不接种(作为对照)，再将平板倒置，放置于25℃培养箱中培养4天；上述处理同时做3组平行实验。观察抑菌圈的有无及大小，以此判断潜在生防菌株对灰霉菌的拮抗左右有无及强弱。

由辣椒健株根部土壤中分离得到一菌株，经产酶活性检测及平板拮抗试验确认其为潜在生防菌株，命名为生防菌5YN8。

二、关于本发明的生防菌5YN8的鉴定过程如下：

分子生物学鉴定

根据细菌16S rRNA序列，采用***发育分析对筛选获得的生防菌5YN8进行分子生物学的鉴定。

将筛选获得的生防菌5YN8在LB培养基中，28℃环境下培养至对数期，以12000转/分钟离心5分钟收集菌体。

采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组DNA。

再采用天根生化科技有限公司的PCR扩增试剂盒扩增该生防菌5YN8的16S rRNA序列及gyrB基因片段，以上述提取的基因组DNA产物为模板，具体操作按照试剂盒说明书进行。

扩增16S rRNA序列所采用的正向引物序列为：5’-AGAGTTTGATCACTGGCTCAG-3’，扩增采用的反向引物序列为：5’-CTACGGAGTACCTTGTTACGAC-3’。

扩增gyrB基因片段采用的正向引物序列为：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’，扩增采用的反向引物序列为：5’-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’。

扩增条带使用天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收。回收的样品送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

将测序结果通过NCBI BLAST软件进行同源性比较(与已知细菌的16S rRNA序列以及gyrB基因片段进行相似性比对)，鉴定本发明的生防菌5YN8为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)。

三、关于菌株的保藏

本发明的防治农作物灰霉病的生防菌5YN8，属于贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年05月15日，其保藏编号为CGMCC No.15763。

四、本发明生防菌的培养方法以及应用

将本发明的生防菌5YN8在LB平板上划线，28℃培养24h，待长出单菌落后，挑单菌落接入含有5ml LB培养液的试管中，28℃、200rpm培养12h，作种子液。按照1:100的比例将种子液接于500mL的LB培养液中，28℃、200rpm培养24h，至其活菌总浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml。

关于本发明生防菌5YN8的应用，一般来说，在农作物移栽入土后，立刻将上述培养获得的菌液稀释100～200倍后对移栽的农作物进行灌根，同时稀释500～1000倍进行叶面喷施。

五、本发明生防菌5YN8对灰霉菌的平板拮抗试验结果

具体的试验方法为：取在25℃培养箱中已培养5天的灰霉菌真菌(取菌落中靠近边缘部分，用已灭菌的打孔器打取直径为0.6cm的菌碟)接种于PDA平板的中央，然后在距离接种位置等距离的相对两处用无菌牙签点接种本发明的生防菌5YN8的菌液(菌液活菌浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/ml)，另外两个相对的角不接种(作为对照)，再将平板倒置，放置于25℃培养箱中培养4天；上述处理同时做3组平行实验。

参见图1，为对灰霉菌的平板拮抗试验的照片，其中标注“5YN8”的位置为接种了生防菌5YN8的菌斑，标注“CK”的位置为对照。

经测量，左右两侧的生防菌5YN8的菌斑的半径为0.72cm(以生防菌接种点为圆心的半径)，生防菌5YN8的菌斑的边缘到灰霉菌的边缘的距离为0.53cm，上下两侧(对照处)的灰霉菌的菌斑半径为3.93cm(以上述圆形菌碟的中心点为圆心的半径)，生防菌5YN8与灰霉菌交界处形成明显透明圈，而对照处滤纸片周围并无透明圈形成。

因此，从上述平板拮抗试验结果可知：5YN8对灰霉菌具有明显的拮抗活性。

六、本发明生防菌5YN8对辣椒灰霉病的温室防病试验结果

待辣椒幼苗3-4叶期后，对其进行移栽，一次移栽12个小杯(例如移栽到一次性塑料杯中)，每杯2株。待幼苗缓和后，用生防菌5YN8的菌液(活菌浓度为5×10⁷CFU/ml)进行灌根处理，每株苗灌20ml；此为实验组(辣椒灰霉病试验的实验组)。

同时，同样的移栽方式，每株苗灌溉20ml清水作为对照组(辣椒灰霉病试验的对照组)。

当天，对上述实验组和对照组进行喷雾接种(灰霉病菌孢子悬浮液)，喷雾用量为叶片表面完全湿透并滴落为宜。

20-25℃保湿，待对照组出现发病情况后(大约20天左右)，开始统计发病情况。

关于发病情况的统计，下面介绍灰霉病病害分级标准：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积6％～10％；

5级：病斑面积占整个叶面积11％～20％；

7级：病斑面积占整个叶面积21％～40％；

9级：病斑面积占整个叶面积40％以上。

关于“病害严重程度”和“防治效果”的计算公式：

病害严重度＝{∑(各级病叶数×相对级数值)}/(调查总数×9)；

防治效果＝(对照组病害严重度-处理组病害严重度)/对照组病害严重度；

试验结果参见下表1。

表1

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	9.04±0.028	90.67
对照组	96.94±0.019	-

其中，病害严重度的结果为平均值±标准误差。

从上述表1的针对辣椒灰霉病的温室防病试验结果显示，本发明的生防菌5YN8对辣椒灰霉病具有显著的防治效果(接种20天左右，对辣椒灰霉病的防治效果达90.67％)。

七、本发明生防菌5YN8对辣椒抗旱性的影响的温室试验结果

待辣椒幼苗3-4叶期后，对其进行移栽，隔天浇25ml自来水。移苗15天后开始处理，设以下两个处理组。每个处理24株苗。

生防菌5YN8处理组：每棵苗浇灌20ml，正常浇水诱导5天后，断水进行模拟干旱处理，模拟干旱处理20天后重新浇水。

对照处理组：每棵苗浇灌20ml清水，正常浇水诱导5天后，断水进行模拟干旱处理，模拟干旱处理20天后重新浇水。

对照处理组的试验结果显示：模拟干旱处理8天后，对照组辣椒显示严重干旱症状，全部叶片都出现中度萎蔫症状(叶片卷曲或下垂，早晨和晚上不能恢复)，茎秆萎蔫下垂；

生防菌5YN8处理组的试验结果显示：模拟干旱处理8天后，辣椒仅有子叶下垂，少数叶片边缘卷曲，显示轻微萎蔫症状。

于模拟干旱处理8天的时间点，检测了干旱胁迫下叶片相对含水量、根系还原能力、叶片MDA含量、叶片相对电导率和叶绿素含量(每种检测重复三次)。

干旱胁迫条件下的检测结果表明：

1)相对含水量：生防菌5YN8处理组的辣椒叶片的平均相对含水量为93.3％，与对照处理组的平均值相比高出44％；

2)根系还原能力：生防菌5YN8处理组的辣椒的根系还原强度为是对照处理组的两倍左右；

3)叶片MDA含量：生防菌5YN8处理组的辣椒的叶片MDA含量，与对照处理组相比，低21.4％；

4)叶片相对电导率：生防菌5YN8处理组的辣椒的叶片相对电导率为56.0％，与对照处理组相比，低28.2％；

5)叶绿素含量：生防菌5YN8处理组的辣椒的叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别为1.16mg g^-1Fw，0.85mg g^-1Fw和2.02mg g^-1Fw，与对照处理组相比，分别高出16％，20％和20.2％。

综合上述结果表明，生防菌5YN8能通过保护细胞膜的完整性、保持根系活力和维持较高水平的叶绿素含量来提高辣椒的耐旱能力。

八、本发明生防菌5YN8对辣椒促生的温室试验结果

待辣椒幼苗3-4叶期后，对其进行移栽，一次移栽12个小杯(例如移栽到一次性塑料杯中)，每杯2株。

待幼苗缓和后，用生防菌5YN8的菌液(活菌浓度为5×10⁷CFU/ml)进行灌根处理，每株苗灌20ml；此为实验组(辣椒促生试验的实验组)。

同时，同样的移栽方式，每株苗灌溉20ml清水作为对照组(辣椒促生试验的对照组)。

处理45天后，观察辣椒苗长势，统计每一株植物的生物量：茎粗、叶片数、株高、叶绿素，结果参见下表2。

表2

表格中的数值为平均值±标准误差，以下表格皆同。

从表2的结果可以看出，与对照组相比，生防菌5YN8处理的实验组的各项生物量(茎粗、叶片数、株高、叶绿素)均有显著增加，且总生物量高出87.8％。因此，结果表明，本发明的生防菌5YN8对于辣椒种植有促生作用。

九、本发明的生防菌5YN8对多种农作物(辣椒、番茄、黄瓜和草莓)灰霉病的防治的大田试验结果

本次大田试验在江苏省淮安市淮阴区王营镇大娘村进行，分为2个处理区域，中间设立2m宽的保护行，按常规栽培管理技术进行田间管理，每个处理区域面积20m²，长10m、宽2m，每个处理区域的四周均开好排灌沟，做到能排能灌，排灌方便。

在幼苗移栽当天，用生防菌5YN8的菌液(活菌浓度为5×10⁷CFU/ml)进行灌根处理，每株苗灌20ml；此为实验组(大田灰霉病防治的实验组)。

同时，同样的移栽方式，每株苗灌溉20ml清水作为对照组(大田灰霉病防治的对照组)。

待苗缓和后喷雾接种灰霉病菌孢子悬浮液，喷雾用量为叶片表面完全湿透并滴落为止。等对照发病后，观察发病情况。

参见下表3，为辣椒灰霉病防治的大田试验结果。

表3

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	11.04±0.011	88.48
对照组	95.83±0.024	-

参见下表4，为番茄灰霉病防治的大田试验结果。

表4

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	13.05±0.034	86.44
对照组	96.27±0.025	-

参见下表5，为黄瓜灰霉病防治的大田试验结果。

表5

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	12.11±0.014	87.11
对照组	93.94±0.030	-

参见下表6，为番茄灰霉病防治的大田试验结果。

表6

	病害严重度(％)	防治效果(％)
			实验组	11.37±0.041	87.97
对照组	94.48±0.026	-

从上述表3、4、5和6的结果可以看出，本发明的生防菌5YN8对于多种农作物(辣椒、番茄、黄瓜和草莓)的灰霉病的防治效果均达到85％以上，防治效果显著，特别是对于辣椒灰霉病的防治效果最好。

十、本发明的生防菌5YN8对多种农作物(辣椒、番茄、黄瓜和草莓)促生作用的大田试验结果

本次大田试验在江苏省淮安市淮阴区王营镇大娘村进行，分为2个处理区域，中间设立2m宽的保护行，按常规栽培管理技术进行田间管理，每个处理区域面积20m²，长10m、宽2m，每个处理区域的四周均开好排灌沟，做到能排能灌，排灌方便。

按常规栽培管理技术进行田间管理，用生防菌5YN8的菌液(活菌浓度为5×10⁷CFU/ml)进行灌根处理，每株苗灌20ml；此为实验组(大田促生试验的实验组)。

同时，同样的方式，每株苗灌溉20ml清水作为对照组(大田促生试验的对照组)。

处理5周后，观察农作物幼苗的变化，统计每一株植物的生物量：茎粗、叶片数、株高、叶绿素。

参见下表7，对辣椒促生作用的大田试验结果。

表7

参见下表8，对番茄促生作用的大田试验结果。

表8

参见下表9，对黄瓜促生作用的大田试验结果。

表9

参见下表10，对草莓促生作用的大田试验结果。

表10

从上述表7、8、9和10的结果可以看出，本发明的生防菌5YN8对于多种农作物(辣椒、番茄、黄瓜和草莓)都具有显著的促生作用，各项生物量(茎粗、叶片数、株高、叶绿素)均有显著增加，且总生物量均高出各自对照组的82％以上。

综上所述，本发明的生防菌5YN8，可以有效防治农作物灰霉病，并对于农作物有促生作用；特别在辣椒种植应用方面，不仅对于辣椒灰霉病的防治效果显著，还可以提高辣椒的抗旱性以及促进生长、提高产量。

在获知本发明的生防菌5YN8具有农作物灰霉病的防治效果后，可以将常规的防治灰霉病的杀菌剂(化学药剂)与本发明的生防菌5YN8的菌粉进行复配获得菌药组合物。

常规的防治灰霉病的杀菌剂有吡咯类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂、烟酰胺类杀菌剂及甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。

因此，可以将上述常规的杀菌剂中的任意一种或几种的组合物与本发明的生防菌5YN8的菌粉进行复配获得菌药组合物，本领域技术人员可以根据具体的需求和药效来进行比例的调配，经过有限次试验就可以验证。

此外，在获知本发明的生防菌5YN8具有农作物灰霉病的防治效果后，可以将本发明的生防菌5YN8与农药上可接受的助剂组合获得防治农作物灰霉病的菌药制剂。

同样的，可以将上述的菌药组合物(杀菌剂与本发明生防菌5YN8的菌粉的组合物)与与农药上可接受的助剂组合获得防治农作物灰霉病的菌药制剂。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种生防菌，其特征在于：所述生防菌为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.15763。

2.一种采用如上述权利要求1的生防菌的菌药组合物，其特征在于：所述菌药组合物包含杀菌剂和权利要求1所述的生防菌的菌粉；所述杀菌剂为吡咯类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂、烟酰胺类杀菌剂或甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂中任意一种或几种的混合物。

3.一种菌药制剂，其特征在于：所述菌药制剂包含如权利要求1所述的生防菌和农药学上可接受的助剂，或者所述菌药制剂包含如权利要求2所述的菌药组合物和农药学上可接受的助剂。

4.如权利要求1所述的生防菌在防治农作物灰霉病方面的应用、在农作物促生方面的应用或者在辣椒种植方面的应用。

5.如权利要求2所述的菌药组合物在防治农作物灰霉病方面的应用。

6.如权利要求3所述的菌药制剂在防治农作物灰霉病方面的应用。