CN112592831A - 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 - Google Patents
一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112592831A CN112592831A CN202110015565.7A CN202110015565A CN112592831A CN 112592831 A CN112592831 A CN 112592831A CN 202110015565 A CN202110015565 A CN 202110015565A CN 112592831 A CN112592831 A CN 112592831A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- conidia
- needle
- microscope
- panax notoginseng
- conidium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 235000003143 Panax notoginseng Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 241000180649 Panax notoginseng Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 30
- 235000003181 Panax pseudoginseng Nutrition 0.000 claims description 17
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 claims description 17
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 7
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 238000006748 scratching Methods 0.000 claims description 3
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 4
- 238000007605 air drying Methods 0.000 abstract description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 abstract 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 abstract 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 12
- 241001330975 Magnaporthe oryzae Species 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 241001143500 Aceraceae Species 0.000 description 1
- 241000758794 Asarum Species 0.000 description 1
- 241000293679 Boraria media Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000315058 Mycocentrospora acerina Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000000497 Primula Nutrition 0.000 description 1
- 241000245063 Primula Species 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N3/00—Spore forming or isolating processes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，(1)将田间采集回来的三七圆斑病叶片在常温下风干；(2)在生物显微镜下观察病斑部位，寻找分生孢子密集处，用移液枪吸取10μL无菌水打到该部位并反复抽吸4‑5次，病斑上的分生孢子将进入到无菌水当中成为孢子悬浮液，然后把孢子悬浮液吸取到水琼脂培养基上并轻轻涂匀。(3)立即在显微镜下寻找水琼脂培养基表面的分生孢子，然后用灭菌挑针蘸取无菌水后移至孢子处吸附单个孢子；(4)将吸附有单个孢子的挑针在PDA培养基上进行多次划线，用封口膜封口后在恒温培养箱中培养。本发明直接利用挑针上无菌水的粘附作用获得单个分生孢子，分离效果更加精准，且不容易污染。
Description
技术领域
本发明涉及孢子分离技术领域，具体是指一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法。
背景技术
三七圆斑病病原菌为槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina(Hartig)Deighton)，该菌属于半知菌门菌刺孢属真菌，该病于1993年云南省文山州首次被发现，是危害三七地上部分非常严重的一种病害。槭菌刺孢喜低温高湿，且传播迅速，在三七生长地区，每年雨季来临，如果防治不及时，发病率可达80％以上，在极端条件下，三七圆斑病可造成三七绝产，对七农造成严重的经济损失。槭菌刺孢于1880年首次在德国报道侵染槭树叶片，该菌主要分布于欧洲和北美洲，寄主范围广泛，寄生于槭树科、十字花科、茄科等16科植物上，在低温高湿的条件下引起胡萝卜、莴苣、报春花等多种蔬菜和观赏植物病害(傅俊范等，1995)。目前，槭菌刺孢在我国被报道可引起两种植物病害，一种是细辛叶枯病，另外一种是三七圆斑病，均可对寄主造成毁灭性伤害。(傅俊范等，1995；陈克等，1997).
槭菌刺孢以厚垣孢子在土壤或植物病残体中越冬，是翌年三七圆斑病的主要初侵染源，常在每年雨季发病和流行，发病初期叶片病斑较小，呈圆形或近圆形水渍状，病斑中心可见棕褐色侵染小点，随后病斑逐渐扩大，褐色或灰褐色，可在病斑表面观察到轮纹状白色、灰色或粉白色的分生孢子堆。这些分生孢子可借助风力或雨水飞溅传播，造成三七圆斑病的大面积发生。槭菌刺孢分生孢子梗短小粗壮，全壁芽生合轴式产孢，孢痕明显。分生孢子长(60-)150-200(-290)μm、宽的部分约8-15μm，分生孢子具(4-)8-11(-24)个隔膜；有时在基部细胞下方的侧面具有一个向下的刺状附属丝。
槭菌刺孢由于很难在人工培养基上产生分生孢子，目前还没有一种可靠的技术手段可以使槭菌刺孢在人工培养基上稳定的产生分生孢子，因此对于槭菌刺孢单孢菌株的获得，则需从田间三七圆斑病发病叶片病斑上直接分离。CN102140432A公开了一种真菌单个孢子的分离方法，主要步骤是将玻璃毛细管从尖端***巴斯德吸管中，用解剖针挑取待分离的真菌材料，将毛细管管口中心正对并接近孢子，转移孢子至培养基上方，真孢分离完成。其关键步骤是用解剖针挑取部分待分离的真菌菌落或病斑组织，而对于病斑组织而言，上面不一定有分生孢子，且直接取病斑组织做孢子悬浮液，杂质较多，且不容易使孢子分散。另外其使用的工具包括巴斯德吸管和毛细管，将单个孢子吸到毛细管中，保持胶头不动，对操作人员的技术和经验要求很高，不适宜大批量的真菌单孢分离。CN 108587929 A公开了一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法，该方法主要是将含典型稻瘟病单病斑的水稻叶片涂布在水琼脂培养基表面，培养所述带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板，再于体视显微镜下寻找单个且已萌发的稻瘟菌分生孢子，再分离该稻瘟菌单孢，得到含有稻瘟菌单孢的琼脂块。该方法直接用病斑涂布水琼脂培养基表面，对于分生孢子的定位不精准，其他杂质较多，并且需要切割含有单孢的琼脂块，操作步骤较多，相对麻烦。
因此对三七圆斑病病原的生物学特性以及致病机理等方面的研究中，迫切需要开发一种快速，稳定，效率高且适合大批量样品分离的单孢分离方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，包括以下步骤：
(1)在田间采集具有典型三七圆斑病病斑的三七叶片，病斑处要有肉眼可以看到的明显白色霉层，然后放到纸质采样信封中，注意每个叶片要单独放置到一个信封中，不能叠加，运回实验室把病叶放入信封纸袋中，要在通风干燥处自然风干；
(2)将风干的病斑叶片病斑部位用剪刀剪下，放在载玻片上用10*10倍显微镜观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定该区域后，用10μL量程移液枪吸取无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后吸取该孢子液到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀；
(3)将涂有分生孢子的水琼脂培养皿放到显微镜下观察，当观察到单个分生孢子的时候，用预先烧红的挑针在无菌水中蘸取数秒后移到显微镜视野处，然后慢慢的移动到分生孢子附近，用挑针的一侧轻轻的触碰孢子使孢子粘附在挑针上，之后迅速用挑针针尖在PDA培养皿上轻轻的划几条线；
(4)将划完线的PDA培养皿放入恒温培养箱中培养，待单个分生孢子长成菌落即可。
进一步地，所述步骤(2)中水琼脂培养基的制备方法为：称取琼脂粉20g于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，在121℃高压灭菌20分钟，倒平板备用。
进一步地，所述步骤(3)中需要在超净工作台中进行，在显微镜放入超净工作台前，需用75％酒精擦拭镜身，用紫外灯照射30分钟后方可使用。
进一步地，所述步骤(3)中用显微镜观察水琼脂表面的单个分生孢子是在10*10倍显微镜下观察。
进一步地，所述步骤(3)中挑针是用接种棒安装一个接种丝制成，在使用时，需要预先在酒精灯上烧红，然后用针尖部分在无菌水中蘸取数秒。
进一步地，所述步骤(3)在显微镜下观察到单个的分生孢子后，把分生孢子移到视野中央，同时把挑针针尖部分也移到视野中央，然后慢慢的移动针尖部分靠近分生孢子，用针尖部分吸附分生孢子，当在目镜下观察到分生孢子被吸附到挑针上，迅速转移挑针在PDA培养基轻轻的划几条线。
进一步地，所述步骤(4)中划过线的PDA平板放入光照培养箱中培养，温度设置为20℃，全光照培养，培养5-7天即可看到明显的单孢菌落。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明采用上述技术方案，具备以下优点：
(1)本发明针对三七圆斑病病原菌提出了一种新的单孢子分离方法，填补了以往没有针对此种病原真菌单孢子分离方法的空白。另外，本发明操作过程简单，周期短，成功率高，可适用于大批量样本的处理。
(2)本发明不需要单独配置分生孢子悬浮液，也不需要稀释，而是直接在病斑部位获取分生孢子，方便快捷，节约时间，提高效率。
(3)本发明不需要制作琼脂玻片，也不需要切割琼脂块，而是直接利用挑针上无菌水的粘附作用获得单个分生孢子，分离效果更加精准，且不容易污染。
(4)本发明所使用的工具，例如显微镜，纸信封，接种棒，接种丝，移液枪等都是实验室常备材料，无需购买特殊设备，一般实验室都可以满足该操作。另外，该发明操作简单，一般实验人员经过几次训练都可以熟练掌握，简单易学。
附图说明
图1为移液枪的操作示意图；
图2为风干后的三七圆斑病病叶和病斑上的分子孢子；
图3为用移液枪在病斑分生孢子堆部位反复抽吸；
图4为在水琼脂培养基表面挑取单个分生孢子；
图5为显微镜下水琼脂培养基表面的单个分生孢子；
图6为划线后的PDA培养皿；
图7为在培养箱培养5天后的单个分生孢子菌落形态。
其中，1、移液枪，2、枪头吸取的孢子液，3、三七圆斑病病斑，4、三七叶片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法做进一步的详细说明。
结合附图，对本发明进行详细介绍。
一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，包括以下步骤：
(1)在田间采集具有典型三七圆斑病病斑3的三七叶片4，病斑处要有肉眼可以看到的明显白色霉层，然后放到纸质采样信封中，注意每个叶片要单独放置到一个信封中，不能叠加，运回实验室把病叶放入信封纸袋中，要在通风干燥处自然风干；
(2)将风干的病斑叶片病斑部位用剪刀剪下，放在载玻片上用10*10倍显微镜观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定该区域后，用10μL量程移液枪1吸取无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后吸取该孢子液2到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀；
(3)将涂有分生孢子的水琼脂培养皿放到显微镜下观察，当观察到单个分生孢子的时候，用预先烧红的挑针在无菌水中蘸取数秒后移到显微镜视野处，然后慢慢的移动到分生孢子附近，用挑针的一侧轻轻的触碰孢子使孢子粘附在挑针上，之后迅速用挑针针尖在PDA培养皿上轻轻的划几条线；
(4)将划完线的PDA培养皿放入恒温培养箱中培养，待单个分生孢子长成菌落即可。
实施例1：
a.笔者在2019年7月份在云南省文山州丘北县采集三七圆斑病病样，选择具有三七圆斑病典型特征并且在病斑上有白色或褐色霉层的三七叶片，用剪刀剪下后放入纸信封中，一个信封分装一个病叶，然后带回实验室放在通风干燥处自然风干。
b.分离孢子过程当中需要用的培养基：水琼脂培养基配置方法：称取琼脂粉20g于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，在121℃高压灭菌20分钟，倒平板备用；PDA培养基的配置方法：称取200g洗净去皮的马铃薯切成小块放入锅中，加水800mL，煮沸20分钟左右，然后用多层纱布在烧杯上过滤。再把滤液放入锅中，加入20g琼脂粉和20g葡萄糖，小火加热，待琼脂完全溶解后，倒入烧杯中加水定容到1L，121℃高压灭菌20分钟后倒平板备用
c.将风干的叶片用剪刀剪取病斑部位，放在载玻片上用显微镜在10*10倍镜下观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定孢子堆区域后(图2)，用10μL的移液枪1吸取10μL无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次(图3)，分生孢子将进入到无菌水中，最后将含有分生孢子的无菌打到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀。
d.将显微镜用75％的酒精通体擦拭表面后放入超净工作台中，紫外灯照射30分钟后在10*10倍下观察水琼脂表面的单个分生孢子，当观察到单个分生孢子后(图4)，将单个的分生孢子移到显微镜视野中央，然后右手手持挑针，用酒精灯将针尖部分烧红，再放入无菌水中蘸取数秒后(一是可以冷却挑针，二是可以起到粘附孢子的作用)将挑针针尖部分移入视野中央，慢慢的移动到分生孢子附近，轻轻的蘸取单个分生孢子(图5)。
e.当接种针成功蘸取单个分生孢子后，迅速将接种针移出，用在PDA培养基上划线的方法将分生孢子接种到培养基上(图6)，之后放到恒温光照培养箱中，20℃恒温，全光照培养，5天后即可观察到单个分生孢子形成的菌落(图7)。
实施例2：
a.笔者在2019年9月份在普洱市澜沧县林下三七基地采集三七圆斑病病叶，选择具有三七圆斑病典型特征并且在病斑上有白色或褐色霉层的三七叶片，用剪刀剪下后放入纸信封中，一个信封分装一个病叶，然后带回实验室放在通风干燥处自然风干。
b.将风干的叶片用剪刀剪取病斑部位，放在载玻片上用显微镜在10*10倍镜下观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定孢子堆区域后，用记号笔标记此位置，然后取下叶片和载玻片，在实验桌面上用10μL的移液枪1吸取10μL无菌水在标记位置反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后将孢子液打到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀。
c.将显微镜用75％的酒精通体擦拭表面后放入超净工作台中，紫外灯照射30分钟后在10*10倍下观察水琼脂表面的单个分生孢子，当观察到单个分生孢子后，将单个的分生孢子移到显微镜视野中央，然后右手手持挑针，用酒精灯将针尖部分烧红，再放入无菌水中蘸取数秒后(一是可以冷却挑针，二是可以起到粘附孢子的作用)将挑针针尖部分移入视野中央，慢慢的移动到分生孢子附近，轻轻的蘸取单个分生孢子。
d.当接种针成功蘸取单个分生孢子后，迅速将接种针移出，用在PDA培养基上划线的方法将分生孢子接种到培养基上，之后放到恒温光照培养箱中，20℃恒温，全光照培养，5天后即可观察到单个分生孢子形成的菌落。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在田间采集具有典型三七圆斑病病斑的三七叶片，病斑处要有肉眼可以看到的明显白色霉层，然后放到纸质采样信封中，注意每个叶片要单独放置到一个信封中，不能叠加，运回实验室把病叶放入信封纸袋中，要在通风干燥处自然风干；
(2)将风干的病斑叶片病斑部位用剪刀剪下，放在载玻片上用10*10倍显微镜观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定该区域后，用10μL量程移液枪吸取无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后吸取该孢子液到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀；
(3)将涂有分生孢子的水琼脂培养皿放到显微镜下观察，当观察到单个分生孢子的时候，用预先烧红的挑针在无菌水中蘸取数秒后移到显微镜视野处，然后慢慢的移动到分生孢子附近，用挑针的一侧轻轻的触碰孢子使孢子粘附在挑针上，之后迅速用挑针针尖在PDA培养皿上轻轻的划几条线；
(4)将划完线的PDA培养皿放入恒温培养箱中培养，待单个分生孢子长成菌落即可。
2.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(2)中水琼脂培养基的制备方法为：称取琼脂粉20g于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，在121℃高压灭菌20分钟，倒平板备用。
3.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)中需要在超净工作台中进行，在显微镜放入超净工作台前，需用75％酒精擦拭镜身，用紫外灯照射30分钟后方可使用。
4.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)中用显微镜观察水琼脂表面的单个分生孢子是在10*10倍显微镜下观察。
5.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)中挑针是用接种棒安装一个接种丝制成，在使用时，需要预先在酒精灯上烧红，然后用针尖部分在无菌水中蘸取数秒。
6.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)在显微镜下观察到单个的分生孢子后，把分生孢子移到视野中央，同时把挑针针尖部分也移到视野中央，然后慢慢的移动针尖部分靠近分生孢子，用针尖部分吸附分生孢子，当在目镜下观察到分生孢子被吸附到挑针上，迅速转移挑针在PDA培养基轻轻的划几条线。
7.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(4)中划过线的PDA平板放入光照培养箱中培养，温度设置为20℃，全光照培养，培养5-7天即可看到明显的单孢菌落。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110015565.7A CN112592831A (zh) | 2021-01-06 | 2021-01-06 | 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110015565.7A CN112592831A (zh) | 2021-01-06 | 2021-01-06 | 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112592831A true CN112592831A (zh) | 2021-04-02 |
Family
ID=75207432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110015565.7A Pending CN112592831A (zh) | 2021-01-06 | 2021-01-06 | 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112592831A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113234606A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-08-10 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种快速分离水稻穗颈瘟单孢的方法 |
| CN115948320A (zh) * | 2023-03-01 | 2023-04-11 | 云南农业大学 | 一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010066703A2 (en) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| CN103627659A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-12 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用 |
| CN105238734A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-01-13 | 山东省果树研究所 | 一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法 |
| CN105695389A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-06-22 | 云南农业大学 | 一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法 |
| CN106085945A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-09 | 文山苗乡三七科技有限公司 | 一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法 |
| CN108587929A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-09-28 | 中国农业大学 | 一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法 |
| CN110257316A (zh) * | 2019-07-02 | 2019-09-20 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法 |
-
2021
- 2021-01-06 CN CN202110015565.7A patent/CN112592831A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010066703A2 (en) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| US20110277043A1 (en) * | 2008-12-12 | 2011-11-10 | Basf Plant Science Company Gmbh | Desaturases and Process for the Production of Polyunsaturated Fatty Acids in Transgenic Organisms |
| CN103627659A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-12 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其在水稻稻曲病防治中的应用 |
| CN105238734A (zh) * | 2015-11-24 | 2016-01-13 | 山东省果树研究所 | 一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法 |
| CN105695389A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-06-22 | 云南农业大学 | 一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法 |
| CN106085945A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-09 | 文山苗乡三七科技有限公司 | 一种三七圆斑病菌分生孢子诱导方法 |
| CN108587929A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-09-28 | 中国农业大学 | 一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法 |
| CN110257316A (zh) * | 2019-07-02 | 2019-09-20 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 戴蕾等: "槭菌刺孢菌丝及分生孢子的生长习性研究", 《云南农业大学学报(自然科学)》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113234606A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-08-10 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种快速分离水稻穗颈瘟单孢的方法 |
| CN115948320A (zh) * | 2023-03-01 | 2023-04-11 | 云南农业大学 | 一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法 |
| CN115948320B (zh) * | 2023-03-01 | 2024-05-03 | 云南农业大学 | 一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ke et al. | Xanthomonas oryzae pv. oryzae inoculation and growth rate on rice by leaf clipping method | |
| CN103468587B (zh) | 胶膜菌属真菌菌株及其在促进硬叶兰种子萌发中的应用 | |
| CN112592831A (zh) | 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 | |
| CN105238734B (zh) | 一种简单快速分离尾孢属单孢子的方法 | |
| CN113293124B (zh) | 一种稻瘟病菌的分离方法 | |
| CN113308432B (zh) | 一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法 | |
| CN113174336A (zh) | 一种稻曲病菌的分离方法 | |
| CN111876336B (zh) | 胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用 | |
| WO2022083245A1 (zh) | 一种拮抗水稻黄单胞菌的芽孢杆菌及其应用 | |
| Cobrado et al. | Common fungi contamination affecting tissue-cultured abaca (Musa textiles Nee) during initial stage of micropropagation | |
| CN111793567B (zh) | 胶膜菌科真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用 | |
| CN105052498A (zh) | 一种建立dse与玉米共生体系的液体培养方法 | |
| CN110257316A (zh) | 一种植物炭疽病菌分生孢子快速分离纯化方法 | |
| Attri | A study on mycorhizal associations in an economically important orchid | |
| CN104357333A (zh) | 一种大豆根腐病菌尖镰孢单孢株分离的方法 | |
| CN108587929A (zh) | 一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法 | |
| CN114774287A (zh) | 一株内生球毛壳菌mg2及其在防治苹果树腐烂病的应用 | |
| Vergnaud et al. | Preinfection events in the establishment of Alnus-Frankia symbiosis: Development of a spot inoculation technique | |
| CN114395485A (zh) | 一种具有促进石斛茎粗生长的胶膜菌菌株tp-2和应用 | |
| CN110042144B (zh) | 一种室内鉴定拟轮枝镰孢菌致病力的方法 | |
| McBride | A microbiological control of Melampsora medusae | |
| CN117683644B (zh) | 一株植物内生真菌及其在植物促生中的应用 | |
| Cornejo et al. | Axenic Cultivation of mycelium of the lichenized fungus, Lobaria pulmonaria (Peltigerales, Ascomycota) | |
| CN107211893A (zh) | 一种野生蕉离体培养增殖方式 | |
| CN108165460B (zh) | 病原真菌单孢分离装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210402 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |