CN105229467A - 快速且灵敏的分析物测量测定法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了，除其他事项外，用于加速测定中的时间的方法，所述方法包括：获得板，所述板包括基片表面上的局部电场及电场梯度增强层；将捕捉剂附接于所述增强层的表面；在所述增强层与至少一个对电极之间施加电压以在溶液中产生局部电场及电场梯度；以及检测所述目标分析物与板上的捕捉剂的结合；其中所述分析物的移动速度、分析物的朝向、捕捉剂的朝向、分析物与捕捉剂的结合速度和/或结合强度被所述电场梯度和/或所述电场所改善，并且检测所述分析物的时间得以减少。还公开了用于实施所述方法的***。

Description

快速且灵敏的分析物测量测定法
关于得到联邦政府资助的研究的声明
本发明是在美国政府的支持下由(美国)国防部高级研究计划局(DARPA)授予的基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。
交叉引用
本申请是2013年3月15日提交的美国申请系列号13/838,600(NSNR-003)的部分继续申请，所述申请要求2012年4月10日提交的美国临时申请系列号61/622,226的权益，并且是2013年6月13日提交的美国专利申请系列号13/699,270的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的US2011/037455的§371申请案，并且要求2010年5月21日提交的美国临时申请系列号61/347,178的权益；
本申请也是2013年6月13日提交的美国申请系列号13/699,270(NSNR-001)的部分继续申请，所述申请是2011年5月20日提交的国际申请系列号US2011/037455的§371申请案，所述申请要求2010年5月21日提交的美国临时专利申请系列号61/347,178的权益；并且
本申请还要求以下申请的权益：2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,424(NSNR-004PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,096(NSNR-005PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/800,915(NSNR-006PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/793,092(NSNR-008PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/801,933(NSNR-009PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/794,317(NSNR-010PRV)、2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,020(NSNR-011PRV)和2013年3月15日提交的临时申请系列号61/802,223(NSNR-012PRV)，所有这些申请通过提述并入本文用于所有目的。
背景
本发明涉及减少测定温育时间并改善分析物和相关的捕捉剂和标记物的移动、结合、和朝向，并由此改善测定感应质量的方法、装置、和***。
在固相测定中，固定在固体表面上的捕捉剂捕获并结合溶液中的分析物。在常规的测定方法中，溶液中的分析物的移动是通过扩散过程进行的，因此固定的捕捉剂捕获溶液中的分析物所需的时间取决于所述分析物的扩散时间。扩散时间取决于分析物移行距离的平方。此外，分析物与捕捉剂的结合也需要时间。温育时间，即捕捉剂在溶液中捕获足够用于感测的分析物所需要的时间，取决于分析物扩散时间和分析物结合时间，这些时间可以很长，达几个小时或更长。
缩短扩散时间的一种办法是施加额外的力以将分析物推向捕捉剂。帮助分析物与捕捉剂之间的结合的一种办法是使这些分子的适当结合位点以正确的朝向对齐。这两者都可以通过电力实现。力越大，则分析物移动越快，并且这些分子对齐越多。
在分子上的电力可以两种方式产生：(a)使用电场和(b)使用电场梯度。电场产生作用在具有净电荷的分子上的力。该力与分子净电荷和电场成比例。电场梯度产生作用在具有净偶极矩的分子上的力。该力与分子分子电偶极矩和电场梯度成比例。
如果所述分子或颗粒在均匀(即，均一的)电场中由于它们的电荷所产生的力而被转运和分离，则称为“电泳”(EP)。如果所述分子或颗粒由于它们的电偶极矩和电场梯度(即，在不均匀的电场中)所产生的力而被转运和分离，则称为“介电电泳”(DEP)。
许多分析物具有围绕它们自身分布的许多电荷，但净电荷接近于零或很弱。因此，均匀电场将不会产生足以推动分析物的力。然而，具有接近于零或很弱的净电荷的分子常常具有大的电偶极矩(固有的或诱导的)，因此可通过电场梯度产生强大的力。
具有适当方向的电力可有助于分析物与捕捉剂之间的结合，并且还可有助于感测信号。例如，如果抗体捕捉剂竖立，同时让用于捕获分析物的结合部位突出，则结合变得更容易。类似地，如果定向分析物使得其结合部位成为该分析物的“头部”，则当蛋白质分析物朝向捕捉剂移动时，能更容易地结合捕捉剂。
分子的等电点(pI)和缓冲溶液pH值的pH水平是共同决定分子上的净电荷的两个因素。等电点(pI)，有时被缩写为IEP，是特定分子或表面没有携带净电荷时的pH。在具有低于其pI的pH的溶液中，该分子携带净正电荷；而在具有高于其pI的pH的溶液中，该分子携带净负电荷。不同类型的分子可具有不同的pI。因此，通过控制溶液在结合过程(即，温育过程)中的pH值，结合的质量可得以改善，并且结合过程的总时间可缩短。
急需新的方法用于(a)改善测定中的分子结合，(b)加速分子运动并缩短温育时间，(c)产生更高的电场梯度，(d)在分子结合部位处或其附近产生更高的电场梯度，以及(e)根据分子的等电点调节溶液的pH值。
现有技术
某些现有技术使用一对平面电极，而不(a)使用电极上的纳米结构和/或(b)根据分子的等电点(pI)控制溶液的pH值。
某些现有技术确实使用结构化的介电材料和/或结构化的电极来产生电场梯度，但是这些结构的结构尺寸为几十到几百微米大小，从而导致电场梯度小。此外，所产生的电场梯度位于远离分析物结合部位的位置，并且电场梯度的方向常常不同于分析物移动和/或结合的优选方向。
当需要大的DEP力时，现有技术必须施加非常高的电场和梯度，这可能引起分子断裂。
概述
以下简述并不意在包括本发明的所有特征和方面，也不意味着本发明必须包括在此简述中论述的所有特征和方面。
本发明涉及减少测定温育时间和改善分析物和相关的捕捉剂及标记物的移动、结合、和朝向、以及由此改善测定感测质量的方法、装置、和***。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。
本发明的一个实施方案使用在测定板202上的纳米结构化电场及梯度增强层201。
本发明的另一个实施方案是，EFGE层201具有纳米级的金属-介电/半导体-金属结构100、400，其增强局部表面电场及梯度。EFGE层201上具有最大增强的局部电场及梯度的区域是金属结构的尖锐(即，曲率大的)边缘，和两个金属结构130与150、430与450之间的小间隙。本发明包括几种不同的EFGE层结构。
本发明的另一个实施方案是将捕捉剂160固定在电场及梯度增强(EFGE)层201的表面上。
本发明的另一个实施方案是在许多情况下将捕捉剂160仅固定在EFGE层201表面上的电场梯度和/或电场最高的区域中。
本发明的另一个实施方案是，EFGE层表面201自身充当用于电偏置的电极之一，因此更少被溶液干扰。
本发明的另一个实施方案使用光而不是电偏置来在EFGE层表面201上产生电场及梯度。
本发明的另一个实施方案是一起使用或替换使用电偏置和光来在EFGE表面201的表面上产生电场及梯度。
本发明的另一个实施方案是，同一EFGE层201还可直接放大感测信号。
本发明的另一个实施方案在于，将根据分析物的等电点对溶液pH值的控制与电偏置和/或光一起使用。
本发明的另一个实施方案在于，EFEG层201可用于微升级多孔板或微流体通道207。
附图简述
技术人员将理解的是，下文描述的附图仅用于说明的目的。附图并不旨在以任何方式限制本发明教导的范围。某些附图不是按比例绘制的。
图1.用于通过电偏置、增强局部电场及梯度的纳米结构、和pH值控制来增强测定感测并缩短测定温育时间的方法的装置和***的示意图。感测放大层(SAL)201充当一个电极，而另一个导电板203充当对电极，用于施加电场。在这些电极之间的偏压可以是直流或交流的，并且由电源204供应。
图2.EFGE增强层、柱上盘(DoP)结构400的一个实施方案，(a)大体结构的概观。(b)一个实施方案的横截面，其中背面金属膜围绕立柱并与之相邻，所述立柱是电介质或半导体。(c,d,e)另一个实施方案的横截面，其中金属膜是在所述盘的下面展开的膜片，但是所述立柱与所述盘具有不同的横向尺寸。
图3.EFGE增强层、盘耦合柱上点天线阵列(D2PA)板100的另一个实施方案。(a)不具备免疫测定的D2PA板的示意图(概观)。D2PA具有三维(3D)共振空穴纳米天线(由在周期性排列的非金属立柱120、顶部的金盘130和所述立柱底部的金底板150形成)的密集阵列，其内部有密集的等离子纳米点140，并通过纳米间隙耦合金属部件。(b)该D2PA(横截面)的示意图，包括(consistingof)作为粘附层的自组装单分子层(SAM)。(c)在D2PA(横截面)上涂覆SAM的过程的图解。通过特异性的化学结合效应将SAM选择性地涂覆在D2PA部件上。
图4.在接近D2PA板100的区域中的电场和电场梯度的示意图。(A)无免疫测定的D2PA板的示意图(概观)。(B)当施加外电场时D2PA的纳米结构附近的电场线。金属材料的边缘处以及间隙之间的高电场梯度。(C)由于高电场梯度而使D2PA附近的生物分子感受到的对应介电泳(DEP)力方向。(D)在由顶盘和底板形成的空穴之间没有纳米点的D2PA纳米结构的纳米结构附近的电场线。(E)当施加外电场时柱上盘(DoP)的纳米结构附近的电场线。
图5.通过薄电介质与金属平面电极分开的随机金属岛的示意图。
图6.将电极定位的不同方式的示意图。(A)对电极可相对EFGE层垂直地放置，亦可以水平方向跨基片放置。和(b)对电极与EFGE层同平面。
图7电场辅助免疫测定平台的实施方案的图解。在“传感放大层”(SAL)与对电极(顶部导电板和等离子纳米结构)之间供应的电压在0.1V到1000V之间。所述SAL增强了局部电场和电场梯度，进而在阅读过程中可施加所述局部电场和电场梯度以进一步增强测定特性，包括改善传感敏感性和减少温育时间。
图8示意性地展示了示例性抗体检测测定。
图9示意性地展示了示例性核酸检测测定。
图10显示在160秒内在DC场中温育的10pM免疫测定的荧光强度的曲线图。虚线为在没有DC场条件下使用1小时温育时间进行的相同免疫测定的荧光信号强度。
图11在一定电压下，电场和电场梯度可帮助分析物的附接和对齐，进而可改善传感敏感性。(a)带负电的IgG。尽管总电荷为负，但是在抗体上的电荷分布是不均匀的。(b)定向抗体的电化学沉积的示意图。Au电极与DSU单分子层一起起作用。
相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是，附图用于示出本公开中给出的构思，并且不是依比例给出的。
在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是，本发明的应用不限于下文描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。
定义
在更详细地描述例示性实施方案之前，列出下述定义，以说明并界定说明书中使用的术语的含义和范围。
术语“电偏置”是指在两个点之间施加的电压。
术语“分子粘附层”指具有确定厚度的一层或多层分子，其包括附接于纳米器件的内表面和能结合至捕捉剂的外表面。
术语“捕捉剂反应性基团”指分子中具有化学功能的部分，其对捕捉剂具有反应性，即，能与捕捉剂中的部分(例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团)反应生成稳定的强(例如共价)键。
如本文中使用的，术语“捕捉剂”指经由相互作用结合靶分析物的作用剂，该相互作用足以允许该作用剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作用通常由捕捉剂的亲和力区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。某些捕捉剂以小于约10-6M(例如小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M、小于约10-12M、至低达10-16M)的解离常数(KD)特异性结合靶分子，而与其它分子没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质(例如抗体)和核酸(例如寡核苷酸、DNA、RNA，包括适体)。
术语“特异性结合”和“选择性结合”指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的(例如有活性的)和不想要的(例如无活性的)靶分子，通常大于约10至100倍或更多(例如大于约1000或10,000倍)。
术语“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合物形式，即大于2个氨基酸、大于约5个氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基酸，通常不大于约10,000个氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨酸残基的融合物；带免疫学标签的蛋白质；具有可检测的融合配偶的融合蛋白，例如包含荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白；等等。这些术语还包括在细胞中经过翻译后修饰(例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等)的多肽，具有二级或三级结构的多肽，和与其它部分(例如其它多肽、原子、辅因子等)强结合(例如共价或非共价)的多肽。
术语“抗体”意图指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够结合抗原的单链抗体和噬菌体展示抗体。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的任何长度的聚合物，或合成生成的、能够与天然存在的核酸以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交(例如能参与Watson-Crick碱基配对相互作用)的化合物(例如美国专利no.5,948,902及其引用的参考文献中记载的PNA)。
如本文中使用的，术语“互补”指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配对。在规范的Watson-Crick碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(U)替换。如此，A与T互补，而G与C互补。通常，“互补”指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补，使得序列中的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列不是完全互补(100％互补性)，但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然可以与非靶序列进行碱基配对时，可以计算百分比互补性以评估非特异性(脱靶)结合的可能性。一般而言，50％或更低的互补性不引起非特异性结合。另外，70％或更低的互补性在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。
如本文中使用的，术语“核糖核酸”和“RNA”表示由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”表示长约10个至200个核苷酸，直至300个核苷酸或更长，例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的，而且在某些实施方案中，长度小于300个核苷酸。
如本文中使用的，术语“附接”指一个分子与另一个分子的强(例如共价或非共价)键连接。
如本文中使用的，术语“表面附接”指分子强附接于表面。
如本文中使用的，术语“样品”涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料混合物。在特定实施方案中，样品可以是自生物学样品获得的，生物学样品例如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜(chime)、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕(nasaldrainage)和体内痰(phlegm))、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液(rheum)、唾液、皮脂(皮肤油)、***、咳出痰(sputum)、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中，样品可以是自受试者(例如人)获得的，而且可以在用于主题测定法之前进行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自组织样品提取蛋白质/核酸，提取方法是已知的。在特定实施方案中，样品可以是临床样品，例如自患者收集的样品。
术语“分析物”指能被捕捉剂结合和检测的分子(例如蛋白质、核酸、聚合物或其它分子、它们的复合物或颗粒)。
术语“测定”指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。
如本文中使用的，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，包括定量和定性测定二者。
如本文中使用的，术语“发光标记物”指当处于外部激发下时能发出光的标记物。这可以是发光(luminescence)。荧光标记物(其包括染料分子或量子点)和发光标记物(例如电致发光或化学发光标记物)是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光(光子)、对于电致发光而言是电流，对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述的组合。
短语“带标记的分析物”指这样的分析物，该分析物被发光标记物可检测地标记，使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标记的(即，可以将分析物自身直接缀合于标记物，例如通过强的键，如共价或非共价键直接缀合于标记物)，或者，带标记的分析物可以是被间接标记的(即，分析物被次级捕捉剂所结合，而次级捕捉剂是被直接标记的)。
术语“杂交”指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而，术语“原位杂交”指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。
就核酸而言，术语“杂交”和“结合”可互换使用。
术语“捕捉剂/分析物复合物”是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在“特异性结合条件”或“适合于特异性结合的条件”下彼此特异性结合，其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发生结合的条件(在盐浓度、pH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面)。此类条件(特别是就抗体及其抗原和核酸杂交而言)是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane(Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和Ausubel等,ShortProtocolsinMolecularBiology,5thed.,Wiley&Sons,2002)。
如本文中使用的，术语“特异性结合条件”指生成包含彼此特异性结合的成对分子的核酸双链体或蛋白质/蛋白质(例如抗体/抗原)复合物，同时不利于并非彼此特异性结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合(全体)，而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。
对于核酸杂交，特异性结合条件可以如下实现：于42℃在50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖酐、和20μg/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育，接着于约65℃在0.1xSSC中清洗滤膜。
对于抗体结合抗原，特异性结合条件可以如下实现：在封闭溶液(例如含3％BSA或脱脂奶的PBS)中封闭含有抗体的基片，接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样品一起温育。在该温育之后，在清洗溶液(例如PBS+TWEEN20)中清洗基片并与捕捉第二抗体(检测抗体，它识别抗原中的另一位点)一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可检测标记物，例如荧光团，诸如IRDye800CW、Alexa790、Dylight800。再次清洗之后，可以检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号及降低背景噪声的参数。
术语“次级捕捉剂”(也可称作“检测剂”)指对抗原具有高度特异性亲和力的一组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物，例如酶、荧光标记物等强连接，或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所检测((Hermanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress,2ndEd.,2008)。
术语“生物素部分”指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、2’-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至少10-8M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头，例如─LC-生物素、─LC-LC-生物素、─SLC-生物素或─PEGn-生物素，其中n为3-12。
术语“链霉亲合素”指链霉亲合素和亲合素二者，以及它们的任何以高亲和力结合生物素的变体。
术语“标志物”指这样的分析物，它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状况相关。
术语“键”包括共价和非共价键，包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。
术语“放大”指信号的量级(magnitude)的增大，例如信号增大至少10倍、增大至少100倍、增大至少1,000倍、增大至少10,000倍、或增大至少100,000倍。
如本文中使用的术语“盘耦合柱上点天线阵列”(“disk-coupleddots-on-pillarantennaarray”)和“D2PA”是指在图3中展示的装置，其中阵列100包括：(a)基片110；和(b)位于基片的表面上的D2PA结构，其包括从基片表面伸出的一个或多个立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括柱体120、在所述立柱顶部的金属盘130、在所述立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的所述基片表面的相当大部分；布置在所述立柱侧壁上的金属点结构130。所述D2PA将邻近D2PA表面的光信号放大。所述D2PA增强邻近D2PA表面的区域中的局部电场和局部电场梯度。所述光信号包括光散射、光衍射、光吸收、非线性光产生和吸收、拉曼散射、色度、发光，其中发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。
D2PA阵列还可包括覆盖所述金属点结构、所述金属盘和/或所述金属底板的至少一部分的分子粘附层、和任选地特异性地与分析物结合的捕捉剂，其中所述捕捉剂连接到所述D2PA阵列的分子粘附层上。当所述分析物结合于捕捉剂时，纳米传感器可放大来自分析物的光信号。一个优选的SAL实施方案是，SAL的一个、几个或所有关键金属和介电部件的尺度小于感测中的光的波长。盘耦合柱上点天线阵列的物理结构的详情、用于制造它们的方法、用于将捕捉剂连接到盘耦合柱上点天线阵列上的方法和使用盘耦合柱上点天线阵列来检测分析物的方法描述于许多出版物中，包括WO2012024006、WO2013154770、Li等(OpticsExpress201119,3925-3936)、Zhang等(Nanotechnology201223:225-301)；和Zhou等(Anal.Chem.201284:4489)，通过提述将这些出版物的公开内容并入本文。
其他特异性结合条件是本领域已知的并且也可在本文中采用。
必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一”和“该”包括复数指称，除非上下文另外明确指明，例如在使用词语“单个/单种”时。例如，提到“一种分析物”包括单种分析物和多种分析物，提到“一种捕捉剂”包括单种捕捉剂和多种捕捉剂，而提到“一种检测剂”包括单种检测剂和多种检测剂。
示例实施方案的详述
下面详细的描述以举例的方式而不是以限制的方式示出了本发明的一些实施方案。
本发明涉及减少测定温育时间和改善分析物和相关的捕捉剂及标记物的移动、结合、和朝向、以及由此改善测定感测质量的方法、装置、和***。所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。所述感测包括电磁信号的感测，包括与捕获的分析物相关的具有不同频率的电信号和光信号、光强度、荧光、色度、发光(电致发光和化学发光)、拉曼散射、时间分辨信号(包括闪烁)。
本发明的一个关键实施方案是使用在测定板202上的纳米结构化电场及梯度增强层201。
本发明的另一个关键实施方案是，EFGE层201具有纳米级金属-介电/半导体-金属结构100、400，其增强局部表面电场及梯度。EFGE层201上具有最大增强的局部电场及梯度的区域是金属结构的尖锐(即，曲率大的)边缘，和两个金属结构130与150、430与450之间的小间隙。本发明包括几种不同的EFGE层结构。
本发明的另一个关键实施方案是将捕捉剂160固定在电场及梯度增强(EFGE)层201的表面上。
本发明的另一个关键实施方案是在许多情况下将捕捉剂仅固定在EFGE层表面上的电场梯度和/或电场最高的区域中。
本发明的另一个关键实施方案是，EFGE层表面自身充当用于电偏置的电极之一，因此更少被溶液干扰。
本发明的另一个关键实施方案使用光而不是电偏置来在EFGE层表面上产生电场及梯度。
本发明的另一个实施方案是一起使用或替换使用电偏置和光来在EFGE表面的表面上产生电场及梯度。
本发明的另一个实施方案是，同一EFGE层还可直接放大感测信号。
本发明的另一个实施方案是，将根据分析物的等电点对溶液pH值的控制与电偏置和/或光一起使用。
本发明的另一个实施方案是，EFEG层可用于微升级多孔板或微流体通道。
在减少测定温育时间并在分析物感测中改善分析物的移动、朝向或结合的方法的一个实施方案中，其包括(a)获得板200，其包括位于基片表面202上的局部电场及电场梯度增强层201；(b)将捕捉剂附接于增强层201的表面上；(c)在该增强层与至少一个对电极203之间施加电压以产生局部电场及电场梯度(图1)；和(d)使溶液中的分析物结合捕捉剂160(图3)；其中分析物的移动速度、分析物的朝向、捕捉剂的朝向、或分析物与捕捉剂的结合速度和/或强度被所述电场梯度和/或所述电场所改善。同一EFGE层201也可以直接放大感测信号。
所述分析物包括蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、具有不同形状的纳米颗粒。所述感测包括电磁信号的感测，所述电磁信号包括与捕获的分析物相关的具有不同频率的电信号和光信号、光散射、光衍射、光吸收、非线性光产生和吸收、光强度、荧光、色度、发光(电致发光和化学发光)、拉曼散射、时间分辨信号(包括闪烁)。
局部电场及电场梯度增强(EFGE)层
本发明包括局部电场及电场梯度增强(EFGE)层201的几个实施方案，所述层具有纳米级的金属-介电/半导体-金属结构，所述结构可增强局部表面电场及梯度。EFGE层201上具有最大增强的局部电场及梯度的区域是金属结构的尖锐(即，曲率大)边缘以及两个金属结构之间的小间隙。最高的增强区域是即有所述尖锐边缘又有所述小间隙的区域。小间隙意指两个金属结构之间的0.5到100nm，优选0.5nm到25nm的距离。优选的EFGE层201应当具有尽可能多的金属尖锐边缘和小间隙。这要求有密集的金属纳米结构，金属纳米结构之间由小间隙分开。本发明包括几种不同的EFGE层结构。此外，可以通过能够进一步覆盖不具有尖锐边缘和小间隙的金属材料部分的过程来进一步改进EFGE层自身，正如在2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/801,424、和2014年3月15日提交的名称为“Methodsforenhancingassaysensingpropertiesbyselectivelymaskinglocalsurfaces”的共同未决PCT申请中所述，通过提述将这些申请并入本文。
EFGE层的一个实施方案包括一个或多个金属盘和显著连续的金属膜，其中所述金属盘的相当大部分与所述金属膜具有一定的间隔。为了增强由电偏置(DC或AC)产生的电场及电场梯度，所述间隔(即，在两个金属结构之间的距离)应为0.5到100nm，优选0.5nm到25nm，并且所述盘的尺寸是亚微米级的，优选小于500nm或小于100nm。为了增强与光有关的感测信号，所述盘的间隔和尺寸小于在感测中使用的光的波长。因此，这样的结构在金属材料中具有许多尖锐边缘，并且在金属结构之间具有许多小间隙(即，距离)。
用于EFGE结构1的实施例：柱上盘(DoP)
柱上盘(DoP)400的实施方案几个例子包括基片410、基本上连续的金属膜420、从所述基片的表面伸出的一个或多个立柱，其中至少一个立柱包括柱体420、立柱顶部的金属盘430、和金属底板450。所述金属底板可以为A451型：在立柱的底部覆盖立柱底部附近的基片表面的相当大部分；或B452型：在立柱下面展开的一片膜。所述盘可具有比所述立柱大(优选)、或比所述立柱小、或与所述立柱相同的横向尺寸。
为了增强波长为400nm到1,000nm的光(可见光到近红外光)，所述间隔为0.5到30nm，盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，并且盘厚度为10nm到60nm，这取决于在感测中使用的光波长。
用于EFGE结构2的实施例：D2PA
参考图13，D2PA板是具有被称为“盘耦合柱上点天线阵列”(D2PA)100的表面结构的板，其包括：(a)基片110；和(b)在基片的表面上的D2PA结构，其包括：从基片表面伸出的一个或多个立柱115，其中所述立柱中的至少一个包括柱体120、所述立柱顶部的金属盘130、所述立柱底部的金属底板150，所述金属底板覆盖所述立柱底部附近的基片表面的相当大部分；布置在所述立柱侧壁上的金属点结构140。所述D2PA放大邻近D2PA表面的光信号。所述D2PA增强邻近D2PA表面的区域中的局部电场和局部电场梯度。
所述光信号包括光散射、光衍射、光吸收、非线性光产生和吸收、拉曼散射、色度、和发光，所述发光包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光。
一般形状和尺寸。在一些实施方案中，所述立柱的一个或多个部分的尺寸、或两个部件之间的距离可以小于被放大的光的波长。例如，柱体120的横向尺寸、柱体120的高度、金属盘130的尺寸、金属点结构140之间的任何间隙之间的距离、在金属点结构140与金属盘130之间的距离可以小于被放大的光的波长。在一些实施方案中，不使用金属点，只是金属盘和金属底板被间隙分隔开。
如图2中所示，可以阵列的形式将立柱安排在基片上。在特定情况下，阵列的最相近的立柱之间的相隔的距离可以小于光的波长。立柱阵列可以是周期性和非周期性的。
用于所有EFGE层的金属盘的尺寸。所述盘阵列可以是周期性430，也可以是非周期性501。所有实施方案中的金属盘具有选自以下形状组的形状：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合。每个盘可具有与其他盘相同、相似、或不同的形状。在每个立柱顶部的金属盘可具有圆形、尖端(如处于金字塔形或锥体的形式)、多边形、椭圆形、长条形、多边形的形状、其他类似形状或其组合。金属盘横向尺寸和厚度应当小于被放大的光波长。取决于被放大的光波长，每个盘的横向尺寸可选自4nm到1500nm，并且盘的厚度为1nm到500nm。每个盘的形状与它所布置在其上的相关立柱的顶面的形状可以相同，或者比所述顶面的形状小，或者比所述顶面的形状大，或者与所述顶面的形状不同。形状差可依赖于工作波长在0到200nm之间变化。
用于所有具有立柱的EFGE层的立柱材料和尺寸。所述立柱阵列可以是周期性的，也可以是非周期性的。基片顶层上的柱体可以由绝缘材料形成，但可以是半导体。用于形成立柱的示例性材料是电介质：二氧化硅、氮化硅、氧化铪(HfO)、氧化铝(AIO)或半导体：硅、GaAs、和GaN。一旦形成，所述立柱可具有为柱形的(直的)、倾斜的、弯曲的侧壁，或其任何组合。立柱的顶面的形状可以是圆形、尖端(金字塔形的)、多边形、椭圆形、长条形、多边形、其他类似形状或其组合。每个立柱的高度可选自5nm到300nm。
每个立柱的横向尺寸应当小于被放大的光波长，并且应当根据被放大的光波长从5nm到8,000nm选择。阵列中立柱之间的间距可以是周期性或非周期性的。优选的间距应当小于被放大的光波长。对于某些应用，周期性周期是优选的，并且选择周期使得光吸收和辐射最大化，所述光吸收和辐射是光波长依赖性的。在阵列中的邻近立柱之间的间距(间隔)可为4nm到4000nm。
用于所有EFGE层的金属底板的材料和尺寸。金属底板150、450、503与金属盘协作形成光空穴。在该实施方案中，金属底板在基片上定义一金属层，对每个立柱有一个孔。孔的大小应当小于被放大的光波长。金属底板的厚度选择为1nm到2000nm，其优选厚度在50nm-200nm的范围内。金属底板的材料可选自与用来形成上述金属盘的相同的材料组，但是对于给定的D2PA结构，用于形成金属底板的材料与用来形成盘的材料可以相同或不同。任一前述权利要求的D2PA纳米器件，其中所述立柱具有柱形的、倾斜的、或弯曲的侧壁表面。
用于所有具有点的EFGE层的金属点材料和尺寸。布置在所述金属盘与所述金属底板之间的每个立柱的侧壁上的金属点140具有大致为球形、盘状、多边形、长条形的形状、其他形状或其组合。立柱上的金属点140可以全部具有大致相同的形状，或可以个别地变化。所述金属点的尺寸应当小于被放大的光波长，并且依赖于放大的光波长，优选在3nm到600nm之间，并且可以在三个维度上不同。在一些实施方案中，相邻金属点之间的间隙、以及盘与邻近金属点之间的间隙在0.5nm到200nm之间。对于许多应用，小的间隙是优选的，以实现更强的信号增强。立柱上的每个金属点之间的间隙可以变化。
用于所有EFGE的金属材料：用于金属盘、底板、和点的金属材料选自(a)单元素金属，如金、银、铜、铝、镍；(b)单种金属的单分子层和/或多层的组合；(c)金属合金；(d)半导体，(e)任何其他在被放大的光波长下产生等离子体的材料，或(f)(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的任何组合。每个金属盘、底板和点使用彼此相同的金属材料，或使用不同的金属材料。
用于所有EFGE的基片。基片110、410、504为D2PA物理支持，并且可以为任何材料，只要它不产生对D2PA放大的化学和电磁干扰即可。所述基片还可以处于许多种不同的形式：薄膜(膜)和厚板，柔性和刚性。所述基片可由电介质(例如SiO2)制成，虽然可以使用其他材料，例如硅、GaAs、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。
优选的D2PA实施方案。D2PA的关键元件的所有尺寸均小于所述光的波长。所述金属材料选自金、银、铜、和铝及其合金。在配置为用于增强波长约800nm的光的一个实施方案中，所述D2PA纳米结构可以包括：周期性的非金属(例如，电介质或半导体)立柱阵列(200nm跨距和约100nm直径)、每个立柱顶部的金属盘、立柱底部的金属底板、随机定位于立柱壁上的金属纳米点、以及这些金属部件之间的纳米间隙。所述金属盘具有约120nm直径，且略大于立柱的直径，因此具有突出部分。所述盘阵列和底板(两者均为40nm厚)形成一3D空穴天线，其可高效地竖向和横向捕获激发光。所述立柱的高度为约50nm，因此所述金属盘与所述金属底板之间的最近距离为约10nm。该最近距离，常称为“纳米间隙”，优选尽可能地小，以实现更高的增强。每个立柱具有约3到30个纳米点，取决于立柱的几何形状和制造加工条件；并且立柱的密度为2.5×109个立柱/cm2。对于这个光波长范围优选的金属材料厚度为5nm到80nm。为了使用不同的金属材料厚度，需要调整立柱高度以实现所述盘与所述底板之间的预期间隙。同样，在一些实施方案中，不使用金属点，所述金属盘和所述金属底板仅被间隙所分隔开。
其他EFGE层。
所述感测放大表面的另一个实施方案包括一个或多个位于基片上的金属盘，并且盘的平均横向尺寸为20nm到250nm，两个邻近的盘之间的间隙为至少0.5到30nm。
捕捉剂附接。
将针对目标分析物的捕捉剂直接地固定、或通过薄的分子粘附/间隔层(MSL)710固定在电场及电场梯度增强层(EFGE)上(图7、8、9)。
在一个实施方案中，捕捉剂主要附接在高电场和/或高电场梯度的区域，即，具有金属材料的尖锐边缘和小间隙的区域。实现这一点的一种方法是(a)利用捕捉剂中(用于直接附接)或MSL中的末端官能团，该末端官能团仅附接金属，和(b)选择性地掩蔽具有低局部电场或低局部电场梯度的金属表面(如在2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/801,424、和2014年3月15日提交的名称为“Methodsforenhancingassaysensingpropertiesbyselectivelymaskinglocalsurfaces”的共同未决PCT申请中所述，通过提述将这些申请并入本文)。
涂覆在EFGE外表面(EFGE的内表面是与基片表面接触的表面)上的分子粘附/间隔层(MSL)710发挥以下两种作用或其中之一：(1)提供良好的粘附以便与捕捉剂结合，以及(2)作为间隔物，控制EFGE中的金属与信号产生分子之间的距离以优化信号放大。一个优选的EFGE实施方案是，EFGE的一个、几个或所有关键金属和介电部件的尺寸均小于感测中的光的波长。
分子间隔物厚度的实例：将金属与产生光信号的分子分开的间隔物(即，MSL)的厚度对于荧光而言为3nm到50nm(对于约800nm光波长优选为5nm)；对于表面增强拉曼散射(SERS)而言为1到15nm。所述厚度依赖于光的波长。
EFGE结构的实施例-1.分子粘附层和捕捉剂的附接。在一个实施方案中，EFGE与捕捉剂之间存在着分子粘附层(也称为“分子连接层”)(MAL)710(参见同7、8、9)。所述分子粘附层用作两个目的。首先，所述分子粘附层充当间隔物。为了最佳的荧光，不能使发光标记物(例如，荧光团)太靠近金属表面，因为非辐射过程可使荧光淬灭。发光标记物也不能离开金属表面太远，因为这可能减弱放大。理想的是，所述发光标记物应当距金属表面一段最佳的距离。其次，分子粘附层为捕捉剂附接到EFGE层上提供了良好的粘附。粘附是通过在分子粘附层的分子提供反应性基团实现的，所述反应性基团在一侧与捕捉剂具有高亲和力，在另一侧与EFGE层具有高亲和力。
所述分子粘附层可具有许多不同的构造，包括(a)交联分子的自组装单分子层(SAM)，(b)多分子层薄膜，(c)(a)和(b)的结合，以及(d)捕捉剂本身。
用于将捕捉剂连接到具有或没有分子连接层的金属表面上的不同方法描述于WO2013154770中，就这样的方法通过提述将该文献并入本文。例如，在一些情况下，可首先将所述金属表面接合到具有规定长度(例如，0.5nm到50nm长)的分子的一端(例如，介由硫醇或硅烷头部基团)，并且可介由捕捉剂反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、或碘代乙酰基)将所述捕捉剂连接到所述分子的另一端。在某些情况下可使用具有通过硫-金键结合到金表面上的–SH头部基团、以及与伯胺反应的NHS-酯末端基团的二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)。。
电偏置(即，电压)
可使用电源360施加偏压(即电压差)。该偏压产生电场和电场梯度。电压可以是直流或交流，或两者的结合或交替。在直流电压中，电压幅度在0.1V到1,000V之间，其取决于间隙，取决于电极之间的间距。两个电极之间的优选平均电场电场应当大于100V/cm。
在交流偏压下，幅度为0.1V到1000V(取决于两个电极之间的间距)，且频率为100Hz到20MHz。将使用的确切偏压取决于所要求的电场和/或电场梯度。
偏压可通过使用不同的对电极安排来施加。在图1中所示，对电极在EFGE层(它是另一个电极)顶部。在图6A中，对电极对EFGE层垂直，还在水平方向跨基片放置。而在图6B中，对电极与EFGE层同平面。
使用光增强电场及电场梯度
本发明的另一个实施方案使用光而不是电偏置来在EFGE层表面上产生电场及梯度。被EFGE吸收的光将被聚焦于金属材料的尖锐边缘和两个金属材料之间的间隙，由此产生电场及电场梯度，该电场及电场梯度将作用于分子。光波长将由EFGE层的共振波长决定并且可以为300nm到5000nm。优选波长为400nm到1500nm—可见光和近红外光。
本发明的另一个实施方案是一起使用或替换使用电偏置和光来在EFGE表面的表面上产生电场及梯度。
本发明的另一个实施方案是，同一EFGE层还可直接放大感测信号。
溶液pH的控制
本发明的另一个实施方案是，将根据分析物的等电点对溶液的pH值的控制与电偏置和/或光一起使用。该发明的一个关键实施方案是，为了捕捉剂206和目标分析物204的转运、操作和定向，根据分子的等电点(pI)和电荷分布来设计和控制电场方向和样品基质的pH值，从而确保实验同时满足两个条件：(1)运行缓冲溶液的pH值引起分子携带相反符号的电荷到EFEG层201，和(2)在EFEG层201与对电极203之间提供的电场与生物分子的电偶极矩的方向平行并对齐。
结合分析物
图8展示了其中捕捉剂为蛋白质(例如抗体)的生物传感器。图9展示了其中捕捉剂为核酸(例如寡核苷酸)的生物传感器。在一些实施方案中，选择分子粘附层的厚度以优化光信号的放大。取决于分析物如何被标记，被放大的光信号可以是发光(例如，化学发光或电致发光、或荧光)。
示例性抗体结合测定的一些步骤显示在图8中。在这个测定中，根据上述方法将生物传感器连接至抗体，以产生包含连接至生物传感器的分子粘附层710的抗体702的生物传感器。在已经产生生物传感器之后，使该生物传感器与含有目标分析物704(例如，目标蛋白)的样品在适合于特异性结合的条件下接触。所述抗体与样品中的目标分析物特异性地结合。在从所述生物传感器洗掉未结合的分析物之后，使所述生物传感器与以发光标记物708标记的第二抗体206在适合于特异性结合的条件下接触。在从所述生物传感器去除未结合的第二抗体之后，可阅读所述生物传感器，以鉴定和/或定量初始样品中分析物204的量。
示例性的核酸结合测定的一些步骤显示在图9中。在这个测定中，根据上述方法将生物传感器连接至核酸，例如，寡核苷酸，以产生包含连接至分子粘附层710的核酸分子302的生物传感器。在产生所述生物传感器之后，使所述生物传感器与含有目标核酸304的样品在适合于目标核酸特异性地杂交到核酸捕捉剂的条件下接触。所述核酸捕捉剂与样品中的目标核酸304特异性地结合。在从所述生物传感器洗掉未结合的核酸之后，使所述生物传感器与用发光标记物308标记的第二核酸306在适于特异性杂交的条件下接触。在从所述生物传感器去除未结合的第二核酸之后，可阅读所述生物传感器，以鉴定和/或定量初始样品中核酸的量。
在图8和9中显示的这些实施方案中，可使用第二捕捉剂(即，“检测剂”)检测结合的分析物，所述第二捕捉剂可与荧光团或与催化显色化合物的合成的酶缀合，所述显色化合物可视觉检测或使用成像***进行检测。在一个实施方案中，可使用辣根过氧化物酶(HRP)，其可将显色底物(例如，TMB、DAB、或ABTS)转化成有色产物，或作为替代，当使用化学发光底物时产生发光产物。在特定的实施方案中，由标记物产生的光信号具有从300nm到900nm范围的波长。在某些实施方案中，所述标记物可以是电化学发光的，因此，可通过向传感器供应电流来产生光信号。
在一些实施方案中，第二捕捉剂(即，检测剂)，例如，第二抗体或第二核酸，可与荧光团连接。
用荧光团标记蛋白质例如第二抗体、和核酸的方法是本领域公知的。化学发光标记物包括吖啶酯类和磺酰胺类、鲁米诺和异鲁米诺；电化学发光标记包括钌(II)螯合物、和其他已知的标记物。
实施例
根据以下实施例，可进一步理解本发明教导的多个方面，这些实施例决不应当被视为限制本发明教导的范围。
实施例1：在使用电场的D2PA上的测定时间显著更快
作为示范，使用作为模型***的1步直接免疫测定，当使用交流电场时显示10分钟的短温育时间，当使用直流电场时温育时间为3分钟。
D2PA纳米器件上的免疫测定的制备。D2PA免疫测定由两个部件组成：(1)上述的D2PA等离子纳米结构，和其上涂覆的(2)蛋白A层在二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)之上的混合自组装层。DSU分子通过在一端提供牢固结合金的硫化物，且在另一端提供良好结合蛋白A的胺基的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基，而提供蛋白A与金表面的牢固交联。在这个测定中使用荧光标记的IgG(预标记的)作为模型抗原。荧光标记物为IRDye800CW，其吸收和发射波长在所述等离子纳米结构的局部等离子共振之内。
为了在D2PA上涂覆DSUSAM和蛋白A，首先将新制造的D2PA基片切成5mmx5mm的小片，浸入到含0.5mMDSU(Dojindo，Japan)的1,4-二噁烷(Sigma-Aldrich)溶液中，并且在密封容器中室温温育过夜。在温育之后，在1,4-二噁烷中充分冲洗D2PA基片并且用氩气干燥。立即将这些DSU涂覆的D2PA基片置于标准96孔板(Pierce,USA)的分开的孔中。然后将它们浸入到溶有10μg/mL蛋白A(RocklandImmunochemicals)的100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH＝7.2，Sigma-Aldrich)中，并且在4℃冰箱中在密封条件下温育过夜。然后吸出溶液，并且在洗涤溶液(R&DSystem)中将各个单独的D2PA板洗涤3次，每次15分钟，以去除未结合的蛋白A。然后在去离子水流中轻轻冲洗所述板，以去除任何内含的盐。在用氩气干燥之后，D2PA免疫测定板已准备好用于立即进行免疫测定测试，或者被储存在-20℃下备用。
将浓度为10pM的用IRdye800CW标记的IgG加入到免疫测定室中，同时打开外电场。然后，将样品温育10秒到1小时的不同时间，而后关闭电场，随后将样品在洗涤溶液中洗涤3次。另外通过简单地在没有电场的条件下室温温育1小时来制备参考样品–与常规的免疫测定温育条件相同。
电极之间的距离总是控制在3mm。样品体积总是控制在150μL，而表面样品面积为5mmx5mm。
洗涤之后，再测量经历了不同温育时间的测定的荧光强度并与参考样品比较。
结果.图10A显示经历了Vpp＝100V的250kHz交流电场的10pM免疫测定的荧光强度。可以清楚地看到在10分钟处荧光强度开始接近饱和，这意味着大多数标记的IgG已经被驱赶到等离子表面。
图10B显示经历了V＝135V的直流电场的10pM免疫测定的荧光强度。可清楚地看到，在160秒(约3分钟)内，荧光强度开始接近与没有任何电场时温育1小时相同的值。
实施例2：电场通过提高捕捉抗体包被质量而减少D2PA测定的测定间变差(CV％)
作为示范，利用直接1步免疫测定来证明：使用外电场，通过操纵朝向而增加捕捉效率，可显著提高捕捉抗体的包被质量。
D2PA纳米器件上的免疫测定的制备。D2PA免疫测定由两个部件组成：(1)上述的D2PA等离子纳米结构，和其上涂覆的(2)蛋白A层在二硫代双(十一烷酸琥珀酰亚胺酯)(DSU)之上的混合自组装层。DSU分子通过在一端提供牢固结合金的硫化物，且在另一端提供良好结合蛋白A的胺基的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基，而提供蛋白A与金表面的牢固交联。在这个测定中使用荧光标记的IgG(预标记的)作为模型抗原。荧光标记物为IRDye800CW，其吸收和发射波长在所述等离子纳米结构的局部等离子共振之内。
为了在D2PA上涂覆DSUSAM和IgG，首先将新制造的D2PA基片切成5mmx5mm的小片，浸入到含0.5mMDSU(Dojindo，Japan)的1,4-二噁烷(Sigma-Aldrich)溶液中，并且在密封容器中室温温育过夜。在温育之后，在1,4-二噁烷中充分冲洗D2PA基片并且用氩气干燥。立即将这些DSU涂覆的D2PA基片置于标准96孔板(Pierce,USA)的分开的孔中。然后将它们浸入到在溶有1μg/mL人IgG(invitrogen)的100μL磷酸盐缓冲(PB)溶液(pH＝8.0，Sigma-Aldrich)中，并以改变的实验条件温育。
图9显示了本实施例的实验原理的示意图。定向的抗体可被固定在金属部件上：
1.抗体在PB缓冲液(pH＝8.0)中带有负电荷。因此，当施加外电场时，抗体将被拉向电极(图9A)。施加电场的幅度为27V/mm。优选的是使用更大的电场，使得缓冲溶液内的生物分子可受到更强的电泳力。建议要避免电场大于两个电极之间的击穿条件，以防止损坏电极上的纳米结构化感测放大层(SAL)。
2.抗体的重链(Fc区)由于COO-基团而比轻链带有更多负电荷。因此，抗体将偏好通过重链结合在电极上(图9B)。这种姿态导致抗体竖直朝向，这对于抗体而言是具有最大捕捉效率的优选朝向。
为了比较电场对此IgG包被质量的影响，实施了4种情形(条件)：
1.在不施加任何外电场的条件下在蛋白A(浓度：1μg/mL)包被的D2PA上包被人IgG(浓度：1μg/mL)
2.在具有27V/mm幅度的外电场的条件下在D2PA上直接包被IgG(浓度：1μg/mL)
3.在不施加任何外电场的条件下在D2PA上包被人IgG(浓度：1μg/mL)
4.在具有27V/mm幅度的外电场的条件下在蛋白A(浓度：1μg/mL)包被的D2PA上包被人IgG(浓度：1μg/mL)
电极之间的距离总是控制在3mm。样品体积总是控制在150μL，而表面样品面积为5mmx5mm。对于所有四种情形，温育时间都保持在5分钟。
在温育之后，吸出溶液并在洗涤溶液(R&DSystem)中将各个单独的D2PA板洗涤3次，每次15分钟，以去除未结合的IgG。
将以200ng/mL浓度的IRdye800CW标记的人抗IgG添加到免疫测定室中。然后将样品温育30分钟，然后在洗涤溶液中洗涤3次。用去离子水冲洗并用氩气干燥之后，使用荧光显微镜测量具有以上列出的4种条件的样品，以读取其信号。为了测量荧光强度，使用具有1.5mW功率的785nm激光来激发免疫测定的荧光。使用配备具有0.01光谱分辨率的分光计的致冷电荷耦合器件(CCD)来测量荧光光谱。用于CCD测量的曝光时间为1秒，荧光强度计算为在795nm到805nm范围内的荧光光谱的平均计数，所述范围对应于抗IgG上的近红外(NIR)荧光染料标记物的发射峰±5nm。
结果以下是总结免疫测定结果的表格。
情形I 情形II 情形III 情形IV
电场(V/mm) 0 27 0 27
蛋白A包被(μg/mL) 1 0 0 1
荧光强度(a.u.) 6972 7049 2667 8502
均一性(CV％) 17％ 5％ 26％ 9％
通过比较情形I和情形II的荧光强度清楚可见，电场(E＝27V/mm)辅助的抗体包被(1μg/mL的人IgG)可实现与使用蛋白A层(浓度：1μg/mL)的相同测定相等的包被质量。通过比较情形I与情形II(从17％到5％)进一步可见，电场(E＝27V/mm)辅助的捕捉抗体包被(1μg/mL的人IgG)还可以改善测定的均一性达340％。这里，均一性是在相同的免疫测定和测量条件下，5个重复样品的测定间结果的标准偏差。还观察到，通过同时使用电场(E＝27V/mm)和蛋白A(浓度：1μg/mL)包被，可以实现荧光信号增强20％(比较情形IV与情形II)。不过，这可能是由于具有厚度＝4.5nm的额外蛋白A间隔物，其降低了来自D2PA的金属部件的淬灭效应。
结果以下是总结免疫测定结果的表格。
情形I 情形II 情形III 情形IV
电场 否 是 否 是
蛋白A包被 是 否 否 是
荧光强度(a.u.) 6972 7049 2667 8502
均一性(CV％) 17％ 5％ 26％ 9％
通过比较情形I和情形II的荧光强度清楚可见，电场辅助的抗体包被可实现与使用蛋白A层的相同测定相等的包被质量。通过比较情形I与情形II(从17％到5％)进一步可见，电场辅助的捕捉抗体包被还可以改善测定的均一性达340％。比较情形IV与情形II可知，通过既使用电场又使用蛋白A，可以实现略微更佳的荧光信号。不过，这可能是由于具有厚度＝4.5nm的额外蛋白A间隔物，其降低了来自D2PA的金属部件的淬灭效应。
其他应用
主题传感器的应用包括但不限于：(a)检测、纯化和定量与某些疾病(例如感染性和寄生虫疾病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神病症和器官疾病，例如肺病、肾病)的阶段相关的化合物或生物分子；(b)检测、纯化和定量来自环境(例如水、土壤、或生物学样品，例如组织、体液)的微生物，例如病毒、真菌和细菌；(c)检测、定量对食品安全或国家安全造成威胁的化合物或生物学样品，例如有毒废物、炭疽；(d)定量医学或生理学监控器中的生命参数，例如葡萄糖、血氧水平、总血细胞计数；(e)检测和定量来自生物样品(例如细胞、病毒、体液)的特定DNA或RNA；(f)测定和比较染色体和线粒体中的DNA中的遗传序列用于基因组分析；或(g)检测反应产物，例如在药品合成或纯化过程中。
可以在各种样品基质中进行检测，诸如细胞、组织、体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血(例如全血、成分血、血浆、血清、等)、母乳、脑脊液(CSF)、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和体内痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、***、咳出痰、汗、滑液、泪、呕吐物、尿和呼气冷凝液。
本发明具有若干关键的新颖之处，包括：
(1)新的装置平台，其可提供跨等离子纳米结构的均匀电场，用于加速免疫测定的速度。该装置平台包括多功能电场供应器、使用金属或导电材料的等离子纳米结构器件、位于所述等离子纳米结构上的用于免疫测定的空穴小室、和位于顶部的使用金属或导电材料的导电板。
(2)新的测定结构，其提供在增强荧光和生物/化学标志物检测灵敏度方面的高性能。该新结构包括金属、介电材料或半导体中的新纳米结构、以及具有期望的化学和生物特性的不同分子层。
(3)新的等离子纳米结构，其在近场中提供大的电场梯度，加速分子向纳米间隙区域移动，以进一步增强荧光。

Claims (34)

1.用于减少测定温育时间和改善溶液中目标分析物的移动、朝向、或与传感器的结合的方法，所述方法包括
(a)获得板，所述板包括位于基片表面上的局部电场及电场梯度增强层；
(b)将捕捉剂附接于所述增强层的表面；
(c)在所述增强层与至少一个对电极之间施加电压以在溶液中产生局部电场及电场梯度；其中所述溶液在所述板上；以及
(d)检测所述目标分析物与所述板上的捕捉剂的结合；
其中所述分析物的移动速度、分析物的定向、捕捉剂的朝向、分析物与捕捉剂的结合速度和/或结合强度被所述电场梯度和/或所述电场所改善，并且检测所述分析物的时间得以减少。
2.权利要求1的方法，其中所述分析物选自蛋白质、肽、DNA、RNA、核酸、小分子、细胞、和具有不同形状的纳米颗粒。
3.任一前述权利要求的方法，其中所述方法进一步包括在目标分析物与所述捕捉剂结合之前或之后用标记物标记所述目标分析物的步骤。
4.任一前述权利要求的方法，其中所述增强层进一步增强来自所述标记物的光和/或激发标记物的光。
5.任一前述权利要求的方法，其中增强层包括(a)电气上连续的金属膜和(b)在所述金属膜上的一个或多个金属纳米结构，其中有多个金属纳米结构以0.5nm到100nm范围内的距离与所述金属膜分开。
6.权利要求5的方法，其中所述金属纳米结构是具有选自以下形状组的形状的盘：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合，并且所述盘具有20nm到250nm范围内的平均横向尺寸。
7.权利要求5的方法，其中所述距离在0.5到30nm的范围。
8.权利要求5的方法，其中所述增强层包括电气上连续的金属膜，所述金属膜具有位于表面上和/或该金属膜内部的金属纳米结构和/或纳米级空洞。
9.权利要求1的方法，其中所述增强层包括D2PA阵列，其中该D2PA阵列的纳米结构与纳米间隙的区域中的电场及电场梯度被增强。
10.任一前述权利要求的方法，其中所述增强层直接增强来自所述目标分析物的信号。
11.任一前述权利要求的方法，其中在施加电压的步骤(c)中，进一步包括在所述增强层上照射光的步骤，其中光的波长与所述增强层共振，以增强纳米结构与纳米间隙的区域中的电场及电场梯度。
12.任一前述权利要求的方法，其中在所述增强层上照射光的同时将电压设置为零，其中光的波长与所述增强层共振，以增强纳米结构与纳米间隙的区域中的电场及电场梯度。
13.任一前述权利要求的方法，其中在结合目标分析物的步骤(d)中，进一步包括控制溶液的pH值以减少温育时间并改善结合质量的步骤。
14.任一前述权利要求的方法，其中在附接捕捉剂的步骤(b)中，进一步包括在所述增强层与另一个电极之间施加电压或者/并且在所述增强层上照射光，以减少温育时间并改善分子结合质量。
15.任一前述权利要求的方法，其中所述捕捉剂与分析物特异性地结合。
16.任一前述权利要求的方法，其中在步骤(b)之前，所述方法进一步包括在目标分析物与所述捕捉剂结合之前或之后用标记物标记所述目标分析物的步骤。
17.权利要求15的方法，其中在目标分析物与所述捕捉剂结合后用标记物标记所述目标分析物的过程中，所述方法进一步包括在所述增强层与另一个电极之间施加电压或者/并且在所述增强层上照射光，以减少标记温育时间并改善分子结合质量的步骤。
18.任一前述权利要求的方法，其中来自目标分析物的信号为包括荧光、电致发光、化学发光、和电致化学发光在内的发光，或拉曼散射。
19.任一前述权利要求的方法，其中所述板在微流体通道中。
20.任一前述权利要求的方法，其中所述场是由1V到1000V范围内的电压差所产生的直流电场，或者是由1V到1000V的峰间电压差所产生的频率为1000kHz到2MHz的交流电场。
21.任一前述权利要求的方法，其中所述方法包括使分析物与捕捉剂结合，并且使用标记的检测剂检测所述分析物。
22.任一前述权利要求的方法，其中所述增强层具有将所述捕捉剂与所述增强层连接的分子连接层。
23.一种***，其包括：
(a)板，其包括
(i)增强层，其包括增强该增强层表面上或附近的区域中的局部电场及电场梯度的纳米结构，和
(ii)捕捉剂，其附接于所述放大层；
(b)至少一个对电极；和
(b)电源，其连接于所述增强层和所述至少一个对电极。
24.权利要求23的方法，其中增强层包括(a)电气上连续的金属膜，和(b)所述金属膜上的一个或多个金属纳米结构，其中有多个金属纳米结构以0.5nm到100nm范围内的距离与所述金属膜分开。
25.权利要求23的***，其中所述金属纳米结构是具有选自以下形状组的形状的盘：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合，并且所述盘具有在20nm到250nm范围内的平均横向尺寸。
26.权利要求23的***，其中所述距离在0.5到30nm范围内。
27.权利要求23的***，其中所述增强层包括电气上连续的金属膜，所述金属膜具有位于表面上和/或该金属膜内部的金属纳米结构和/或纳米级空洞。
28.权利要求23的***，其中所述增强层包括D2PA阵列，其中该D2PA阵列的纳米结构与纳米间隙的区域中的电场及电场梯度被增强。
29.一种***，其包括：
(a)板，其包括
(i)增强层，其包括增强该增强层表面上或附近的区域中的局部电场及电场梯度的纳米结构，和
(ii)捕捉剂，其附接于所述放大层；
(b)光源，所述光源照亮所述增强层。
30.权利要求29的方法，其中增强层包括(a)电气上连续的金属膜，和(b)所述金属膜上的一个或多个金属纳米结构，其中有多个金属纳米结构以0.5nm到100nm范围内的距离与所述金属膜分开。
31.权利要求29的***，其中所述金属纳米结构是具有选自以下形状组的形状的盘：圆形、多边形、金字塔形、椭圆形、长条形、或其任何组合，并且所述盘具有在20nm到250nm范围内的平均横向尺寸。
32.权利要求29的***，其中所述距离在0.5到30nm范围内。
33.权利要求29的***，其中所述增强层包括电气上连续的金属膜，所述金属膜具有位于表面上和/或该金属膜内部的金属纳米结构和/或纳米级空洞。
34.权利要求29的***，其中所述增强层包括D2PA阵列，其中该D2PA阵列的纳米结构与纳米间隙的区域中的电场及电场梯度被增强。
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