CN104155282A - 纳米等离子体激元共振器 - Google Patents

纳米等离子体激元共振器 Download PDF

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CN104155282A CN201410331906.1A CN201410331906A CN104155282A CN 104155282 A CN104155282 A CN 104155282A CN 201410331906 A CN201410331906 A CN 201410331906A CN 104155282 A CN104155282 A CN 104155282A
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陈帆青
乔纳森.A.埃尔曼
张祥
孙诚
苏凯宏
韦齐和
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Abstract

本发明提供纳米等离子体激元共振器(NPR)，其包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘,具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子。NPR以高度重现性的方式将拉曼信号增强至6.1×1010倍，使得能够在6pM(0.2ng/ml)的灵敏度下以3个数量级的动态范围实时地进行蛋白酶和酶活性如***特异性抗原(paPSA)的快速检测。对来自paPSA-阳性细胞的细胞外液(ECF)的实验证明了在复杂的生物流体背景中的特异性检测。这种方法提供了以非常小的样品量检测蛋白酶活性的快速、灵敏、精确且单步的手段。

Description

纳米等离子体激元共振器
本申请是国际申请日为2008年11月3日、申请号为200880123805.8、发明名称为“具有超高灵敏度的使用纳米等离子体激元共振器的实时单步生物测定”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年11月2日提交的美国临时专利申请No.60/984,859的优先权，其全部内容引入本文作为参考。
政府支持的声明
本工作得到以下支持：NSF Nano-scale Science and Engineering Center(DMI-0327077)、NSFSST/Collaborative Research Program(DMI-0427679)、和NASA Institute for Cell Mimetic Space Exploration(CMISE)，以Award No.NCC2-1364；NHLBI/NIH HL078534和NCI/NIH R1CA95393-01；DARPA和UCSF Prostate Cancer SPORE award(NIH Grant P50CA89520和P01CA072006)，以Contract no.DE-AC02-05CH11231，由美国能源部授予，在University of California/Lawrence Berkeley National Laboratory。
参考序列表
纸张形式序列表的全部内容引入本文作为参考，如附在说明书后一样。
技术领域
本发明涉及使用单独的纳米等离子体激元共振器(nanoplasmonicresonator)和纳米等离子体激元共振器阵列检测酶活性的表面增强拉曼散射(SERS)的领域。本发明具体涉及蛋白酶活性，例如用于***癌诊断应用的***特异性抗原(PSA)和蛋白水解活性PSA的检测。
背景技术
最早在1928年开发的拉曼光谱已经广泛地用于表征分子性质(KazuoNakamoto John R.Ferraro,Chris W.Brown,Introductory Raman Spectroscopy,第二版(Elsevier Science,2003)。表面增强拉曼光谱学(SERS)通过靠近表面的增强电磁场显著提高拉曼信号(C.R.Yonzon,C.L.Haynes,X.Zhang等,AnalChem76(1),78(2004)；A.E.Grow,L.L.Wood,J.L.Claycomb等,J MicrobiolMethods53(2),221(2003)；K.Nithipatikom,M.J.McCoy,S.R.Hawi等,AnalBiochem322(2),198(2003)；J.B.Jackson和N.J.Halas,P Natl Acad Sci USA101(52),17930(2004))。在粗糙金属表面或分散的金属纳米颗粒聚集体上进行的SERS测量显示对于下至单个分子水平的检测的高达1014的最高拉曼增强因子(Katrin Kneipp,Harald Kneipp,Irving Itzkan等,Current Science(Bangalore)77(7),915(1999)；S.Nie和S.R.Emory,Science275(5303),1102(1997))，但是这些测量经常遭受差的重现性(M.Moskovits,Reviews ofModern Physics57(3),783(1985))。为了改善重现性，已经开发了其它方法以高达108的重现性增强因子在大面积上制造由同质特征组成的SERS基底，所述方法包括金属胶体纳米颗粒的自组装(R.G.Freeman,K.C.Grabar,K.J.Allison等,Science267(5204),1629(1995))、纳米球平版印刷术(lithography)(NSL)和纳米球上的金属膜(MFON)(C.L.Haynes和R.P.VanDuyne,Journal of Physical Chemistry B107(30),7426(2003))、抛光的金基底的电化学糙化(J.M.Sylvia,J.A.Janni,J.D.Klein等,Analytical Chemistry72(23),5834(2000))和使用电子束平版印刷术的周期结构化的金属基底(M.Kahl,E.Voges,S.Kostrewa等,Sensors and Actuators B-Chemical51(1-3),285(1998))。虽然这些努力导致SERS分析成功用于许多有前途的应用中，但是缺少在特定位置制造SERS热点的能力限制了对于非常小的样品量的应用，所述有前途的应用包括基因和蛋白质鉴别(Y.C.Cao,R.C.Jin,J.M.Nam等,J Am Chem Soc125(48),14676(2003)；Y.W.C.Cao,R.C.Jin和C.A.Mirkin,Science297(5586),1536(2002)；T.Vo-Dinh,F.Yan和M.B.Wabuyele,Journalof Raman Spectroscopy36(6-7),640(2005))、生物战剂检测(D.A.Stuart,K.B.Biggs和R.P.Van Duyne,Analyst131(4),568(2006))和实时葡萄糖监测(O.Lyandres,N.C.Shah,C.R.Yonzon等,Analytical Chemistry77(19),6134(2005))。
为了克服这种限制，我们最近开发了可调的纳米等离子体激元共振器(NPR)，其由夹在引入本文作为参考的Durant S.Su K,Steel M.J.,Xiong Y.Sun C,Zhang X,Journal of Physical Chemistry B110(9),3964(2006)中所述的金属纳米盘之间的薄SiO2层组成。可通过改变介电层厚度和NRP的纵横比精确地调控共振频率。在对于单独的SERS基底或纳米颗粒所得的最大值之中，个别NPR可增加拉曼强度至6.1×1010倍。使用已经确立的(wellestablished)纳米平版印刷术方法制造，基于NPR的方法使得能够在所需位置以小得多的尺度可重现地制造SERS热点，容许多重的(多路的，multiplexed)高通过量检测和芯片上的实验室应用。
***癌生物标记物***特异性抗原(PSA)，一种激肽释放酶(hK)家族丝氨酸蛋白酶(S.R.Denmeade和J.T.Isaacs,BJU Int93Suppl1,10(2004)；J.A.Clements,N.M.Willemsen,S.A.Myers等,Crit Rev Clin Lab Sci41(3),265(2004))用作本申请中的模型蛋白酶。通常使用的***特异性抗原(PSA)血液测试已经被广泛地用于***癌(最主要的男性癌症)的早期诊断和处理(H.Gronberg,Lancet361(9360),859(2003)；S.R.Denmeade和J.T.Isaacs,NatRev Cancer2(5),389(2002))。然而，血清PSA浓度更经常地反映良性***增生(BPH)的存在，而不是癌症(A.Caplan和A.Kratz,Am J Clin Pathol117Suppl,S104(2002)；E.I.Canto,S.F.Shariat和K.M.Slawin,Curr Urol Rep5(3),203(2004))。特异性的缺乏导致高的假阳性率并且经常导致昂贵的用于诊断的***针吸活组织检查和活组织检查后的并发症(complication))以及相当大的焦虑(M.B.Gretzer和A.W.Partin,Urol Clin North Am30(4),677(2003)；A.Haese,M.Graefen,H.Huland等,Curr Urol Rep5(3),231(2004))。最近的研究已经鉴定了一类高度特异性的肽，其可在异种移植模型(S.R.Denmeade,C.M.Jakobsen,S.Janssen等,J Natl Cancer Inst95(13),990(2003))和人类样品(P.Wu,U.H.Stenman,M.Pakkala等,Prostate58(4),345(2004)；P.Wu,L.Zhu,U.H.Stenman等,Clin Chem50(1),125(2004))中被paPSA同种型(isoform)切割，因此，来自体内样品的paPSA蛋白酶活性的测量是可能的，并且作为***癌的更特异性的筛选剂(掩蔽剂，screening agent)和在复发性疾病的检测中是潜在有价值的。然而，基于免疫肽分析(IMPA)的报道结果显示出低的荧光信噪比，妨碍在临床上重要的60～300pM范围内较低的浓度下的可靠测量(P.Wu,U.H.Stenman,M.Pakkala等,Prostate58(4),345(2004)；P.Wu,L.Zhu,U.H.Stenman等,Clin Chem50(1),125(2004))。此外，通常从细针吸活组织检查或循环细胞捕获中分离有限数量的***癌细胞(<1000)。不存在对于临床分期可以在少量细胞上进行paPSA蛋白酶活性测定的商业化方法。因此，本发明的一个目的是提供容许以非常少的样品量进行用于***癌检测的paPSA的特异性和灵敏的测量的方法。
发明内容
本发明提供使用由纳米等离子体激元共振器(NPR)组成的纳米传感器以至少皮摩尔灵敏度在体外和原位检测和测量酶活性。在一个实施方式中，生物结合的(bioconjugated)NPR增强在表面增强拉曼光谱学(SERS)中的拉曼光谱强度并且使得能够以非常小的量灵敏地单步检测酶活性。
在一些优选的实施方式中，本发明提供包括纳米等离子体激元共振SERS平台的纳米传感器。所述平台包括特征在于单独的或阵列形式的表面增强拉曼散射(SERS)纳米等离子体激元共振器的基底，其中所述纳米等离子体激元共振器(NPR)具有与其结合的生物分子(biomolecule)。在一个实施方式中，所述NPR包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘，具有结合或束缚(tether)到所述NPR表面的被标记的生物分子。在优选的实施方式中，所述标记物是拉曼活性标记物。
在一个实施方式中，所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述肽包括可被特异性修饰或者通过酶切割的特异性序列。因此，这种肽结合的纳米等离子体激元共振器意图用作特异性筛选工具以提供关于酶例如蛋白酶、激酶和肽酶的存在、浓度和活性的信息。在一个实施方式中，筛选将测量在生物样品中癌生物标记例如***特异性抗原(PSA)的活性。在一个实施方式中，所述肽应为被待检测的相应酶特异性识别、修饰和/或发挥作用的底物。
在另一实施方式中，实时反应监测还提供关于酶活性的关键(临界，critical)信息，而不是仅测量蛋白质的存在。可使用不同的拉曼标记物分子，使得可通过多重肽结合的NPR进行两种或更多种类型酶的检测。而且，在基底上的肽结合的NPR的阵列描述用于进一步放大或扩展检测。
在另一实施方式中，彼此正交或者具有特异性的较小重叠的不同生物分子底物可用于检测相应的酶。在一个实施方式中，生物分子库可与NPR结合并且以无规阵列或有序的微阵列形式空间分离。生物分子-纳米等离子体激元共振器的多重阵列可用于同时检测多种酶。
NPR也可通过激光或磁场操作以在空间上以高精确度寻址(address)，使得其可多重化为高密度阵列(具有亚微升容量)。以微阵列或纳米阵列形式的用于多种蛋白酶的另外的空间多重化是预期的。另外，磁场或激光操纵性容许在所需的位置处生物传感，这对于在细胞内得到原位测量是有用的。
在另一实施方式中，本文中所述的纳米传感器可集成到微流体***或其他芯片***中。在一个实施方式中，基于纳米传感器的测定可以液相进行，其中样品与NPR纳米传感器或NPR阵列接触，和可进行SERS测量。
更具体地说，本发明涉及如下方面。
1.纳米等离子体激元共振器(NPR)，包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘,具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子。
2.根据1的共振器，其中所述标记物是用于表面增强拉曼散射(SERS)检测的拉曼活性标记物。
3.根据1的共振器，其中所述标记物是荧光或其它能检测的标记物。
4.根据1的共振器，其中所述纳米盘包括金属薄层、半导体材料、金属多层、金属氧化物、合金、聚合物、或碳纳米材料。
5.根据4的共振器，其中所述纳米盘由金属组成。
6.根据1的共振器，其中所述屏蔽层包括具有恒定拉曼光谱的材料。
7.根据6的共振器，其中所述屏蔽层选自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋糖酐。
8.根据1的共振器，其中所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述肽包括可被酶特异性修饰或者切割的特异性序列。
9.根据1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID NO:1)。
10.纳米等离子体激元共振SERS检测平台，包括特征在于单独的或阵列形式的表面增强拉曼散射(SERS)纳米等离子体激元共振器(NPR)的图案化基底，其中所述纳米等离子体激元共振器具有与其结合的生物分子。
11.根据10的平台，其中其上图案化所述纳米等离子体激元共振器的基底可由石英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光谱的任意其它材料组成。
12.根据10的平台，其中所述纳米等离子体激元共振器包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘，具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子，其中所述标记物是用于SERS检测的拉曼活性标记物。
13.根据12的平台，其中所述纳米盘包括金或银的薄层。
14.根据12的平台，其中所述屏蔽层包括二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、或右旋糖酐。
15.根据10的平台，其中所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述肽包括可被酶特异性修饰或者切割的特异性序列。
16.根据10的平台，其中所述阵列形式的纳米等离子体激元共振器是相同或不同的。
17.根据15的方法，其中生物分子库与所述纳米等离子体激元共振器结合并且以无规阵列或有序的微阵列形式空间分离。
20.用于使用纳米传感器以至少皮摩尔灵敏度体外检测和测量酶活性的方法，所述纳米传感器包括纳米等离子体激元共振器(NPR)，其中所述NPR增强在表面增强拉曼光谱学(SERS)中的拉曼光谱强度并且使得能够以非常小的量灵敏地单步检测酶活性。
21.用于酶活性的实时反应监测的方法，包括：
(a)提供在基底上图案化的肽结合的纳米等离子体激元共振器阵列，其中各纳米等离子体激元共振器(NPR)包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘并且具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子，其中所述标记物是拉曼标记物分子，各自相同或不同，和其中各个肽包括通过特异性酶使用特异性反应识别和修饰的序列；
(b)提供怀疑含有酶的生物样品；
(c)使所述样品与所述纳米等离子体激元共振器阵列接触；
(d)使所述反应进行；
(e)通过SERS检测测量所述酶的检测。
22.根据21的方法，其中生物分子库可与所述纳米等离子体激元共振器结合并且以无规阵列或有序的微阵列形式空间分离。
23.根据22的方法，其中所述生物分子-纳米等离子体激元共振器的阵列可用于同时检测多种酶的活性。
附图说明
图1：使用肽结合的NPR SERS纳米传感器检测PSA蛋白酶活性的工作原理的示意性图解。(a)NPR通过耦合的等离子体激元共振呈现出可调的等离子体激元共振和高度增强的局部电磁场。短轴150nm和长轴200nm的NPR由厚度分别为25nm和5nm的银和SiO2层的多重叠层制成。(b)由拉曼染料R19、PSA特异性肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO:1)和半胱氨酸组成的生物标记的分子结构。所述肽可通过PSA酶在HSSKLQ和LAAAC之间切割。(c)用肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO:1)和拉曼染料R19(星)官能化的NPR的检测图。PSA酶的存在将切割所述肽序列。切割之后，通过R19部分的SERS标志(signature)的消失监测R19(星)离开表面的扩散。填充分子辛烷硫醇(HS-(CH2)2-CH3)用于减小NPR表面上的报告肽的填充密度，由此容许PSA酶达到所述报告肽。(d)使用标准电子束平版印刷术和薄膜沉积方法制造的NPR阵列的光学显微图像。制造的NPR阵列由间隔500nm的30×30NPR组成。可在相同的基底上便利地制造多个NPR阵列和对准标记。(e)通过扫描电子显微镜测量的NPR阵列的放大图像。使用精确平版印刷术方法，可以受控的方式制备NPR。(f)使用原子力显微镜(AFM)在较高的放大率下测量的NPR图像。(g)在425～650nm的波长范围内所测量的NPR阵列的消光光谱。已调节NPR的共振峰以紧密匹配激光激发和拉曼发射频率，并由此使拉曼信号的总体增强最大化。(h)在不同的NPR阵列上测量的结合在NPR表面上的对巯基苯胺(pMA)分子的高度重现性拉曼光谱。积分时间为30秒。
图2：PSA蛋白酶活性的实时动态测量。(a)对于在30分钟内所取的6nMPSA培养的SERS光谱，积分时间为30秒。(b)对于在30分钟内所取的阴性对照6nM粒酶B的SERS光谱。(c)添加PSA蛋白酶之前和之后在1316cm-1、1456cm-1、1526cm-1和1597cm-1处的拉曼峰强度的相对变化的时间分辨的测量。负时间表示添加蛋白酶之前的时间。
图3：通过改变活性PSA浓度的PSA活性的时间分辨的测量。(a)对于1316cm-1峰在6pM～6nM的活性PSA浓度下的归一化的SERS强度变化。可清楚地测量SERS强度的降低，而在不含活性PSA蛋白酶的对照实验中不能观察到显著的改变。(b)30分钟时获得的归一化SERS强度变化与浓度的关系。(c)从未处理的细胞外流体(ECF)中获得的蛋白酶活性测量结果：在将LNCaP细胞(阳性对照)ECF暴露于NPR纳米传感器开始时(t＝0分钟)和30分钟之后所得的拉曼光谱。(d)在1316cm-1峰处的归一化的SERS强度变化，表示从LNCaP和K562细胞系中提取的流体中PSA蛋白水解活性。
图4：使用拉曼检测和光谱学的PSA检测图。
图5A：SERS显微光谱学***以及纳米等离子体激元共振器目测和实时酶反应检测。图5B：光谱测量设备的示意图。
图6(a)具有各个金属层的单独纳米盘的模拟散射光谱。所述纳米盘是圆形的，直径为90nm，而金属层和SiO2层的总厚度均保持为30nm。入射光的偏振在Y-轴方向偏振。(b)共振频率下单独Au层纳米盘(SiO2/Au/SiO2)的局部电场分布的Y-Z面横截面。(c)共振频率下6Au层纳米盘(SiO2/Au)6/SiO2的局部电场分布的Y-Z面横截面。
具体实施方式
本发明证明使用由纳米等离子体激元共振器(NPR)组成的纳米传感器以至少皮摩尔灵敏度在体外检测和测量酶活性。在一个实施方式中，生物结合的NPR增强表面增强拉曼光谱学(SERS)中的拉曼光谱强度并且使得能够以非常小的量灵敏地单步检测酶活性。
小量性质的主要优点和应用之一是其在单细胞水平上检测癌细胞的蛋白酶例如***特异性抗原(PSA)的活性中是有用的。小量的要求和灵敏度水平使得可能在捕获的循环***癌细胞中检测PSA活性用于指示各种疾病状态例如转移，这是使用常规技术不可行的。在***中，PSA浓度为10～150μM，大约三分之二的PSA是酶活性的。使用NPR PSA探针实现的灵敏度水平(纳摩尔范围)足以进行基于***的测定，因此本文所述的纳米等离子体激元共振SERS平台意图具有临床应用。
在优选的实施方式中，本发明提供包括纳米等离子体激元共振SERS平台的纳米传感器。所述平台包括特征在于单独的或阵列形式的表面增强拉曼散射(SERS)纳米等离子体激元共振器的基底，其中所述纳米等离子体激元共振器(NPR)具有与其结合的生物分子。在一个实施方式中，所述NPR包括至少两个具有交替薄屏蔽层的纳米盘，和结合或束缚到所述NPR的表面的被标记的生物分子。在优选的实施方式中，所述标记物是拉曼活性标记物。
现有技术中已知潜在用于拉曼光谱学的各种检测装置并且可使用任意已知的拉曼检测装置。拉曼检测装置的非限制性实例公开在美国专利No.6,002,471中。在该实例中，通过532nm(纳米)波长的Nd:YAG激光或者365nm波长的Ti:蓝宝石激光产生激发束。可使用脉冲激光束或连续激光束。激发束通过共焦光学器件和显微镜物镜，并且可聚焦在含有连接的生物分子目标物的基底上。可通过显微镜物镜和共焦光学器件收集拉曼发射光目标，其耦合至用于光谱分离的单色器。所述共焦光学器件可包括用于减少背景信号的反射镜、二向色性滤光器、屏障滤光片、共焦针孔、和透镜的组合。标准全场光学器件也可用作共焦光学器件。
可通过拉曼检测器检测拉曼发射信号。所述检测器可包括与用于计算和数字化信号的计算机接口的雪崩光电二极管。在待分析目标阵列时，可设计光学检测***以检测拉曼信号和将拉曼信号定位到芯片或格子上的特定位置。例如，发射光可引导到CCD(电荷耦合器件)照相机或在检测区域内能够同时测量来自20个多重像素或像素组的光发射的其它检测器。
各种激发源包括，但不限于，337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利No.6,174,677)。激发束可使用带通滤光器30(Corion)光谱纯化并且可使用6×物镜(Newport,Model L6X)聚焦在基底140上。物镜可用于激发指示器和收集拉曼信号两者，通过使用全息分束器(Kaiser Optical Systems,Inc.,Model HB647-26NI8)产生用于激发束和发射的拉曼信号的直角几何形状。全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems,Inc.)可用于减小瑞利散射辐射。供选择的拉曼检测器包括，但不限于，配置有红色增强强化电荷耦合器件(RE-ICCD)检测***的ISA HR-320摄谱仪(Princeton Instruments)。可使用其它类型的检测器，例如电荷注射器件、光电二极管阵列或光电晶体管阵列。
现在参考图1A，NPR的纳米级尺寸和高的局部电磁场增强使得能够在其表面上高灵敏度地光学检测生物分子反应。在优选的实施方式中，所述纳米等离子体激元共振器是包括通过屏蔽层分离的至少两个垂直堆叠的纳米盘的平版印刷限定的金属电介质纳米颗粒。在各种实施方式中，NPR优选通过电子束平版印刷术在基底上图案化。
其上NPR图案化的基底可由石英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光谱的任意其它材料组成。在一个实施方式中，为了防止电子束平版印刷术期间的带电效应，所述基底进一步涂布有层例如氧化铟锡。所述层可溅射、沉积、涂布或使用任意其它方法添加到所述基底上以形成薄膜。在另一实施方式中，然后用聚合物旋涂所述基底以在曝光以产生图案之前产生正性光刻胶。在一个实施方式中，在曝光之后，使用溶剂混合物显影图案，随后进行多层电子束蒸发和标准的剥离过程。
在一个实施方式中，如实施例1所述制备NPR。在另一实施方式中，如以下所述制备NPR：K.H.Su,Q.H.Wei和X.Zhang,"Tunable and augmentedplasmon resonances of Au/SiO2/Au nanodisks",Appl.Phys.Lett.88,063118,2006；以及Kai-Hung Su,Stéphane Durant,Jennifer M.Steele,Yi Xiong,ChengSun和Xiang Zhang,Raman Enhancement Factor of a Single TunableNanoplasmonic Resonator,Journal of Physical Chemistry B,110(9),3964(2006)，这两者的全部内容引入本文作为参考。
在优选的实施方式中，所述纳米等离子体激元共振器由层叠或堆叠有交替屏蔽层的纳米盘组成。例如，可在两个金纳米盘之间夹入SiO2屏蔽层制备NPR。在另一实施方式中，其间夹有SiO2屏蔽层的两个金纳米盘在一端用另一SiO2屏蔽层覆盖，从而产生SiO2/Au/SiO2/Au纳米等离子体激元共振器。
在一个实施方式中，在图案化基底上蒸发纳米级层以形成NPR的纳米盘层。在优选的实施方式中，各纳米盘在其最宽点处为50～500nm。所述纳米盘可由金属薄层、半导体材料、金属多层、金属氧化物、合金、聚合物、或碳纳米材料组成。在一些实施方式中，纳米月牙状物(nanocrescent)包括选自Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo的金属、及其氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或烧结基质。
屏蔽层材料可为具有恒定拉曼光谱的任意材料。所述屏蔽层起到NPR的等离子体激元共振频率的调节参数的作用。与单层金属纳米盘相比，多层纳米盘呈现出若干独特的性质，包括显著增强的等离子体激元共振和可调的共振波长，所述共振波长可通过简单地改变电介质层厚度而修整到所需值同时保持颗粒直径恒定。数值计算表明将一个金属层分为金属多层导致较高的散射强度和更多的“热点”或者强场增强区域。图6显示具有各个金属层的纳米盘的颜色模拟散射光谱。
因此，在另一实施方式中，NPR中各纳米盘层可具有相同或不同的厚度。通过选择不同的层厚度，可以调节等离子体激元共振波长和表面增强因子以匹配各种应用。例如，在实施例1中，短轴150nm和长轴200nm的NPR由厚度分别为25nm和5nm的银和SiO2层的多重叠层制成。而且，通过选择性地屏蔽金属结构的外表面，可通过将分子集合体(assembly)导向呈现出强电磁场的位置来进一步增强效率。因此，在另一实施方式中，所述外层为包括具有恒定拉曼光谱的材料的屏蔽层。图1A显示优选纳米等离子体激元共振器(NPR)的示意图和透射电子显微照片。
在一个实施方式中，所述生物分子是包括可通过蛋白酶特异性切割的特异性序列的肽，其与拉曼活性标记物连接。
现有技术中已知各种拉曼标记(例如，美国专利No.5,306,403；6,002,471；6,174,677，其引入本文作为参考)并且可使用任意这种已知的拉曼标记。所述标记典型地具有特有的(例如，独特的)和高度可见/可检测的光学标志。合适的拉曼标记包括，但不限于，荧光团、生色团、量子点、荧光微球、生物素等。在一些实施方式中，所述拉曼标记包括若丹明、荧光素、或外源化学分子。在一些实施方式中，所述拉曼标记包括作为拉曼标记物的部分。标记物分子的非限制性实例包括TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧杂-l,3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、灿烂甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、异羟洋地黄毒苷、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、5-羧基-2',4',5',7'四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-10羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-若丹明、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(el)、溴(Br)、甲基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有这些部分的化合物。在一些实施方式中，碳纳米管、量子点(参见，例如Evident Technologies,Troy N.Y.；Invitrogen/Molecular Probes,15等)或者微球(例如荧光微球(参见，例如来自InvitrogenIMolecular Probes的)可用作拉曼标记物。
在各种实施方式中，一种或多种拉曼标记(拉曼标记物)可以与附着到NPR的生物分子(例如,多肽)连接。这种拉曼标记物的存在可以增强通过切割肽产生的拉曼信号的变化。
因此，在一个实施方式中，这种拉曼标记的生物分子结合的纳米等离子体激元共振器意图用作特异性筛选工具以提供关于生物样品中酶和其它癌生物标记例如***-特异性抗原(PSA)的存在、浓度和酶活性的信息。在一些实施方式中，所述生物分子是肽。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在一些实施方式中,多个肽与纳米月牙的表面结合，各自相同或不同。在各种实施方式中，约5～500，更优选约10～约400，还更优选约20、30或40～约200、250或300，和最优选约50～约150个底物分子(例如肽)与纳米月牙状物连接。在一个实施方式中，约100个肽以Au与肽上的硫醇基团之间的直接反应15结合至纳米月牙状物。
其活性受到监测的酶可以包括，但不限于，酶、蛋白酶、激酶、肽酶或其它生物分子。在各种实施方式中，所述生物分子是被待检测的相应酶特异性识别和修饰或切割的肽。在另一实施方式中，所述生物分子是被待检测的激酶特异性识别和磷酸化的肽。各种类型的蛋白酶和通过这些蛋白酶特异性识别的肽也描述于名为“Detection of Protease and Protease Activity Using aSingle Nanoscrescent SERS Probe”的共审未决国际申请No.PCT/US2007/010722中。使用纳米月牙探针用于蛋白酶或其它生物分子的SERS检测的相关方法也描述于PCT/US2007/010722中，其全部内容引入本文作为参考。
在优选的实施方式中，所述生物分子是肽，其中所述肽是长度约10～12个氨基酸残基的寡肽。然而，所述肽可短至4个氨基酸残基，和长至100个氨基酸。在一个实施方式中，所述肽应为被相应酶特异性识别和修饰的序列。所述肽可合成和商业上得到，或者所述肽可以根据实施例1中所述方法制备。拉曼活性分子例如生物素或若丹明6G(R19)(图1B)优选通过短的聚乙二醇或氨基戊酸连接物接枝在所述肽的氨基末端。
所述生物分子可直接地或者经由一个或多个连接剂“结合”(即连接)到所述纳米等离子体激元共振器。本文中使用的“连接剂”是指在NPR和生物分子之间形成键且包括例如官能团、亲和剂、或稳定化基团的任意化合物。合适的键包括离子相互作用，共价化学键，物理力例如范德华或疏水相互作用，包封作用，包埋，结合亲和力，吸引或认可，和各种类型的一级、二级、三级连接，所述连接包括，但不限于，肽、醚、酯、丙烯酰基(acryl)、醛、酮、丙烯酰基(acryloyl)、硫醇、羧基、羟基、巯基和胺连接等。
在一个实施方式中，数百种肽通过NPR的金属纳米盘与所述肽上的硫醇基之间的直接反应与所述NPR结合。在另一实施方式中，NPR金属表面还可使用胺或羧基改性，从而所述肽可以通过肽键经由与异双官能交联剂的反应束缚到NPR表面上，其中所述异双官能交联剂可与胺基和硫醇基两者反应，或者与羧基和硫醇基两者反应。在具体实施方式中，Au/SiO2/Au/SiO2NPR可以使用胺或羧基官能团官能化，和所述肽可经由交联剂与胺和羧基官能团交联。各种交联剂可用于硫醇活化的肽和NPR上表面官能团例如胺、羧基和羟基的结合。
在一个优选的实施方式中，依靠Au-硫醇反应以形成共价键，使用在肽羧基末端的半胱氨酸基团以将所述肽连接到Au表面将底物肽束缚到Au/SiO2/Au NPR的表面上。在优选的实施方式中，类似地将多个肽结合到NPR的表面，各自相同或不同。
本文中所述的NPR指示物可利用包括用于需要检测的任意蛋白酶的一个或多个识别位点的多肽序列。蛋白酶(蛋白水解活性)不仅对于维持正常的细胞功能是需要的，而且对于各种人类疾病的发病也是重要的。寄生虫感染(例如血吸虫病和疟疾)、真菌感染(例如白念珠菌(C.albicans))和病毒感染(例如HIV、疱疹和肝炎)以及癌症、炎症疾病、呼吸***疾病、心血管疾病和包括阿尔茨海默病的神经变性疾病需要蛋白水解活性用于进展。因此蛋白酶存在、量或活性的检测作为用于疾病的存在或可能性的诊断/预示标志是有用的。另外，蛋白酶活性(或者其抑制)的检测在筛选用于治疗许多病状的蛋白酶抑制剂疗法中是有用的。
可根据本发明检测和/或定量的“蛋白酶”是典型地使位于多肽链中一对氨基20酸之间的肽键水解的酶，也称作内切蛋白酶。典型地参考酶催化中心的亲核物质来限定蛋白酶。最通常的亲核物质来自丝氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸的侧链，产生蛋白酶家族例如丝氨酸蛋白酶(Paetzel等(1997)TrendsBiochem.Sci.22:28-31)、天冬氨酰蛋白酶(Spinelli等(1991)Biochemie73:1391-251396)、和半胱氨酸蛋白酶(Altschuh等(1994)Prot.Eng.7:769-75,1994)。金属蛋白酶通常在催化位点含有锌催化金属离子(Klimpel等(1994)Mol.Microbiol.13:1093-1100)。
“蛋白酶识别位点”是通过肽键连接的邻接氨基酸序列，其含有一对通过由特定蛋白酶水解的肽键连接的氨基酸。任选地，蛋白酶识别位点可包括在待水解肽键任一侧的一个或多个氨基酸，其也结合有所述蛋白酶的催化位点(Schecter and Berger,(1967)Biochem.Biophys.Res.Commun.27:157-62)，或者蛋白质底物上的识别位点和切割位点可为通过一个或多个(例如2～4个)氨基酸分离的两个不同位点。
蛋白酶识别位点中的氨基酸的特异性序列典型地取决于蛋白酶的催化机理，其通过蛋白酶活性位点处的官能团性质所限定。例如，胰蛋白酶水解其羰基官能由赖氨酸或精氨酸残基贡献的肽键，而不管多肽链的长度或氨基酸序列。然而，因子Xa识别特异性序列Ile-Glu-Gly-Arg并且水解在Arg的C末端侧上的肽键。各种优选的蛋白酶识别位点包括，但不限于，对于来自丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶识别位点，或者对于金属蛋白酶的蛋白酶识别位点，或者对于来自半胱氨酸蛋白酶家族、和/或天冬氨酸蛋白酶家族、和/或谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶识别位点。在一些实施方式中，优选的丝氨酸蛋白酶识别位点包括，但不限于，对于类似糜蛋白酶的蛋白酶、和/或类似枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶、和/或α/β水解酶、和/或信号肽酶的识别位点。在一些实施方式中，优选的金属蛋白酶识别位点包括，但不限于，对于金属羧基肽酶或金属内肽酶的识别位点。说明性的蛋白酶和蛋白酶识别位点如下表1所示。
表1.说明性的蛋白酶和蛋白酶识别位点(*表示水解的肽键)
在检测PSA的具体实施方式中，肽设计将按照具有丝氨酸残基的PSA-特异性肽的活性位点和可通过PSA识别的侧翼序列的氨基酸序列。在优选的实施方式中，所述肽含有已经对蛋白水解活性PSA具有非常高的特异性的HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO:1)序列(参见Denmeade,S.R.等Specificand efficient peptide substrates for assaying the proteolytic activity ofprostate-specific antigen.Cancer Res57,4924-4930(1997))。已经显示，在小鼠模型中，HSSKLQ-L被PSA而不是被任意其它蛋白酶在体内切割。因此，在另一实施方式中，可产生多个肽，各自具有随机或已知序列部分，只要各自结合有高度特异性序列HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO:1)。
PSA消化位点在肽HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO:1)中谷氨酰胺(Q)和亮氨酸(L)残基之间，并且所述肽被消化成两个片段HSSKLQ和LAAAC。在本发明优选的实施方式中，所述肽优选如图1B所示束缚到NPR表面，使得没有使PSA肽和PSA酶空间阻碍且从而PSA肽是最佳可达到的，并且拉曼标记物R19在组氨酸处与所述肽连接。预计在Cys(C)残基之后在肽序列HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO:1)和NPR之间合成的额外的间隔物，将改善表面上PSA底物肽HSSKLQ的呈现并从而提高检测灵敏度。虽然这样做，拉曼标记物分子与NPR表面的距离可更远和导致较低的拉曼强度水平，因为线圈状短肽结构意味着远端拉曼标记物分子与NPR金属表面接触的机会大。在优选的实施方式中，所述间隔物是填充分子例如辛烷硫醇(HS-(CH2)2-CH3)并且用于减少NPR表面上报告肽的填充密度，因此容许所述酶达到所述报告肽。
本方法可用于检测其它水解生物分子的存在。因此，例如肽蛋白酶底物可用单链或双链核酸(RNA或DNA)取代，并且指示剂可检测和/或定量活性核酸酶的存在。在这种情况下，核酸底物典型地包括对于核酸酶(例如限制性内切核酸酶)的1个或30更多个识别位点。核酸酶识别位点的长度典型地为约3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp至约15bp、20bp、25bp或30bp。在各种实施方式中，核酸的长度范围可为约3bp至约200bp，优选约4bp至约100bp，更优选约6、8、10、16或20bp至约80、60、40或30bp。
在另一实施方式中，基本上可通过激酶磷酸化的任意分子可用作本文所述方法和组合物中的激酶底物。虽然蛋白质/肽包括最大的激酶底物类型，但是也已知许多其它的激酶底物。这种底物包括，但不限于，各种糖(例如己糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等)、核苷酸/核酸、醋酸盐、丁酸盐、脂肪酸、二氢鞘氨醇、甘油二酯、神经酰胺等。说明性的蛋白质激酶底物和序列如序列表和表3所述。
表3.说明性的蛋白质激酶底物
因此，例如，当底物被同源结合配偶识别和结合时可提供蛋白质、和/或糖、和/或复合糖、和/或脂质、和/或核酸“底物”与一个或多个NPR耦合，将改变拉曼光谱并且检测到相互作用。
典型的实验***配置如图6所示，包括具有用于从单独的被标记的纳米等离子体激元共振器获取拉曼散射光谱的拉曼光谱仪的显微镜检查***。在优选的实施方式中，所述***由装配有数字照相机和具有摄谱仪CCD照相机的单色器的倒置显微镜、激光源和光学透镜组成。在一个实施方式中，可使用在背散射配置中具有50×物镜的改进的倒置显微镜例如Carl ZeissAxiovert200(Carl Zeiss,Germany)测量拉曼光谱。激光波长可在可见光和近红外区域中。在优选的实施方式中，将785nm半导体激光用作拉曼散射的激发源，并且在NPR上通过40×物镜聚焦激光束。785nm或其它近红外光源可以确保生物组织较少的吸收和较低的荧光背景。然而，对于一些应用，较低波长的激发光可为更有利的，甚至可以使用UV光激发用于应用。还可通过光度计测量激发功率以确保～0.5至1.0mW的输出。然后通过长通滤光器经由相同光路收集拉曼散射光并且通过光谱仪分析。拉曼光谱仪优选与计算机连接，由此可以控制光谱仪，可得到光谱和可以观察摄谱仪。可使用普通的光谱多色仪和冷却的CCD照相机进行光谱检测。监测的拉曼峰的波长范围为400cm-1～2000cm-1。
在一个实施方式中，肽结合的NPR与怀疑含有待检测生物分子的样品一起培养，优选在封闭透明的微室中。所述微室装在具有用于纳米颗粒目测的暗视野照明的倒置拉曼显微镜上的37℃热板上。使用暗视野照明从斜角目测NPR，如图1D中嵌入图像中所示的亮点。激发激光通过显微镜检查物镜聚焦在NPR上。通过相同的物镜收集SERS信号并且通过光谱仪分析。图1D中的图像显示聚焦在NPR视野上～0.8mW的激发激光点。
酶反应的实时检测可在30分钟内发生。然而，培养和检测可以短至1～5分钟和长至24小时或者更长，如果应用需要较长的生物培养时间。在初始离心分级分离之后，生物样品中的可溶内容物可以直接与NPR或NPR阵列一起培养。在一个实施方式中，为了特异性抑制结合肽的蛋白酶介导的(mediated)蛋白质水解，在加入蛋白酶之前引入蛋白酶抑制剂。例如，给定相同的实验条件，在添加抑制剂之后通过PSA的肽消化被抑制超过90％。
在各种实施方式中，确定生物样品中酶的存在、和/或浓度、和/或活性。生物样品基本上可包括需要测定的任何生物材料。这种生物材料包括，但不限于，生物流体例如血液或血液级分(blood fraction)、淋巴、脑脊液、***、尿、口腔液等、组织样品、细胞样品、组织或器官活组织检查或抽吸物、组织学标本等。
一种典型的用于酶的存在、浓度和活性的实验检测示意图如图5所示。在该方法中，向肽结合的SERS NPR或NPR阵列提供溶液或样品。在酶反应之前，肽结合的NPR的SERS光谱含有来自拉曼标记物分子、肽和纳米等离子体激元共振器的特征峰。通过酶的酶反应应在预定的修饰位点处修饰所述肽。例如，在通过PSA的消化反应期间，在Q和L残基之间切割肽HSSKLQ-L，这里通过虚线表示。人工肽的SERS光谱在被蛋白酶切割之后改变，因为含有拉曼标记物分子的切割片段扩散离开NPR表面，而其它片段留在NPR表面上。由于肽消化之后标记物分子从NPR表面扩散位移进入到溶液中，具有拉曼活性标记物的分子部分的特征SERS峰消失；因此可以通过监测肽结合的NPR的SERS光谱探查溶液中蛋白水解活性PSA的存在和浓度。然后连接肽的拉曼散射信号通过NPR放大并且通过显微镜检查***检测，所述显微镜检查***包括拉曼光谱仪以从单独的或阵列的NPR获得拉曼散射光谱。例如，如图1g所示，所测量的NPR-肽-R19结合物的共振峰紧密匹配532nm的激光激发波长，因此使拉曼散射的增强最大化。如图1h所示，基于NPR的SERS底物呈现出具有在相同数量级的一致增强因子的重现性拉曼光谱。从6个不同NPR阵列获得的实验性测量的SERS强度的变化低于25％并且其可在实验中容易地归一化。
可通过时间分辨的SERS光谱获取监测反应动力学。在一个实施方式中，所述测定可通过将生物分子结合的NPR阵列暴露于生物流体样品来进行，在约1分钟的时间间隔和约30秒的积分时间下记录随后的与时间相关的R19拉曼光谱变化。SERS标记分子(R19)在1316cm-1的拉曼峰可作为主要标志峰监测，而其它标志峰例如1456cm-1、1526cm-1和1597cm-1峰也可作为额外参考监测(参见图2)。在酶存在下的时间分辨的光谱测量可绘制在如图2c中。SERS强度与NPR表面上没有被酶作用的任意残留生物分子成比例，因此使归一化的SERS强度变化成为酶活性的直接指示。虽然不同拉曼标志峰的初始强度有变化，但是归一化的数据都会聚到相同的曲线，表明归一化的SERS强度变化是定量确定待描述或检测的肽的可靠度量。
例如，如图2c所示，在添加酶之前，肽结合的NPR显示所有峰在10分钟期间的稳定强度。然而，在添加酶时，在初始的10～12分钟中观察到各拉曼峰的显著下降，表明所述酶是活性的并且能够切割NPR上的肽。在30分钟的终点时，拉曼信号的下降在6nM的PSA浓度处达到平台，而在较低的浓度水平(～pM)下，所述信号继续以低得多的速率下降。选择另一丝氨酸蛋白酶，粒酶B作为阴性对照(图2b-c)。在50分钟的记录内没有观察到SERS强度的显著变化，即使在最高达1μM的浓度下。该结果证明PSA测定中拉曼信号的下降是基于真实的酶过程，而不是非特异性水解反应或者由于表面的肽被缓冲液中其它组分置换。
在优选的实施方式中，在消化反应中NPR SERS探针中拉曼活性标记物的拉曼峰随时间推移的强度分别使用蛋白酶、带有抑制剂的蛋白酶、和阴性对照获得。所有峰强度值归一化为内部对照峰(例如，图1g中对于R19-肽和NPR测量的峰强度为532cm-1)和在阳性或阴性对照的波数下的初始峰的强度。在一个实施方式中，阴性对照为NPR-肽杂合物，其中所述肽不是所关注的蛋白酶的底物并且不被所研究的蛋白酶所切割。通过拉曼活性标记物的峰强度逐渐消失，结果应该表明所述肽被PSA有效和特异性地切割。
NPR颗粒起到拉曼信号放大物的作用并且检测的拉曼信号来自束缚在NPR颗粒表面上的所有肽。在一个实施方式中，每个NPR连接至少100个肽分子。即使连接这样数量的肽，如果少部分的肽连接到提供电磁场的最大增强的区域(图1C)，预计也没有完全利用具有最高SERS信号的NPR表面。数值模拟(图1c)表明局部电场的幅度可增强接近20dB(100倍)，特别是在纳米盘边缘的周围。由于电场幅度与拉曼增强因子之间四次方的关系，通过NPR可将肽拉曼信号放大若干倍(例如108)。
而且，由于在结合反应中对于每个NPR平均使用几十到几百个肽，来自标记物分子的特征拉曼峰的消失不是突然的。由于大部分增强场集中在占NPR总面积的～1/6的尖端区域周围，即使假设结合效率为100％，在该高增强区域中对拉曼散射信号作出贡献的实际分子数也小于20(图1d)。
在优选的实施方式中，使用阳性对照。例如，在一个实施方式中，在检测样品中PSA的存在或活性之前得到对于各种PSA浓度的随PSA消化时间变化的阳性对照的拉曼峰强度。阳性对照生物素和R19拉曼标记物分子的肽结合的NPR的典型SERS光谱分别如图3a和3b所示。通过对比肽消化实验之前和2小时之后的SERS光谱，来自NPR核心(例如，聚苯乙烯核心，例如1003cm-1)的拉曼峰保持恒定，因此也可作为内部对照。消化率与PSA浓度有关并且典型地对于浓度1nM在30分钟内观察PSA活性(生物素信号强度的～50％降低，未显示数据)。在消化后残留在NPR表面上的部分氨基酸链的一些拉曼峰仍可出现在光谱中，虽然峰位置稍有变化并且峰强度由于肽切割时可能的构象变化而降低。
在另一实施方式中，进行阴性对照以显示肽被样品中存在的蛋白酶特异性切割。实施例1显示使用可作为阴性对照的其它丝氨酸蛋白酶例如粒酶B时的结合肽对PSA的特异性。图2B和2C显示分别在具有PSA抑制剂和丝氨酸蛋白酶粒酶B的两个对照实验中带有R19标记物分子的NPR随时间推移的SERS光谱，该丝氨酸蛋白酶粒酶B对于PSA具有正交底物特异性。在通过420nM粒酶B的肽消化的对照实验中，反应速率没有显示出与抑制剂处理的反应的统计学显著差异。还预计粒酶B不能切割所述肽，因为已经显示PSA是体内用于HSSKLQ-LAAAC序列的唯一蛋白酶。
在优选的实施方式中，这种肽结合的NPR可以用作特异性筛选工具以提供关于从在临床环境中的患者获得的生物样品中癌症生物标记PSA的浓度和蛋白水解活性的信息。
在另一实施方式中，所述肽结合的NPR可以用作特异性筛选工具以提供关于从临床环境中的患者获得的生物样品中生物标记、酶、激酶或其它蛋白酶的浓度和酶活性的信息。
预期本探针的一种应用是将NPR颗粒结合到可使样品传输和冲洗过程自动化和便利的微流体设备中。所述NPR颗粒也可实时传输或固定在所述设备中。
在另一实施方式中，NPR可以微阵列形式空间布置以实现具有宽应用的多重测量，通过测量未处理生物样品中所有已知的蛋白酶而无需复杂的样品处理和纯化步骤。当与以微阵列形式布置的NPR纳米阵列簇组合时，底物肽空间多重性可以使用工业标准协议以微阵列器(microarrayer)实现。即使500+蛋白酶各自被10种不同的底物肽交叉询问，所述阵列仍然具有小于1万的容易管理的特征数。
实施例1
单独的可调的纳米等离子体激元共振器(TNPR)的拉曼增强因子
通过电子束平版印刷术(EBL)(Leica Microsystems Nanowriter Series EBL100)在石英基底(HOYA Co.)上图案化TNPR。首先将30nm厚的氧化铟锡(ITO)层溅射在所述基底上以防止EBL过程期间的带电效应。旋涂在ITO-石英玻璃上的聚(甲基丙烯酸甲酯)(100nm厚,MicroChem Corp.PMMA)膜用作正性光刻胶。在曝光后，使用1:3比的甲基异丁基酮和异丙醇混合物显影所述图案，随后进行银和氧化物的多层电子束蒸发和标准的剥离过程。我们在相同的基底上制造三层Ag/SiO2/Ag和四层Ag/SiO2/Ag/SiO2TNPR(在该实施例中我们将四层TNPR称作被盖的TNPR)，各个银和SiO2层厚度分别固定为20nm和5nm。在沉积额外的5nm SiO2覆盖层期间在三层TNPR上***障板(shadow mask)以防止在三层TNPR上的沉积。通过扫描电子显微术和原子力显微术测量样品以确定它们的尺寸、形状和厚度。夹在金属层之间的SiO2层可通过调节其厚度用于调节表面等离子体激元共振频率。可通过将表面等离子体激元共振与泵激光频率匹配来使EF最大化。在光学显微镜下，如图1d所示，这些颗粒由于在共振波长下强的光散射而是区分可见的。扫描电子显微术(SEM)图像(图1e)显示TNPR稍微伸长，分别具有长轴117nm和短轴81nm。原子力显微术(AFM)测量(图1f)确认了被盖的TNPR和未被盖的TNPR之间的高度差为5nm，这与SiO2覆盖层的厚度匹配。进行AFM用于保证金属盘之间良好的SiO2层覆盖。
通过用来自150W Xe白色光源通过多模光纤传输的准直光照射TNPR获得散射光谱。所述光通过直角棱镜以产生全内反射(TIR)的角度传输，并且使用JY(550光栅)光谱仪***(Jobin Yvon)收集散射光。参见图5B。对于SERS实验，使用在背散射几何条件中具有20×物镜的改进Zeiss倒置共焦显微镜测量SERS光谱。将514nm下操作的氩激光器(减弱为～10mW)耦合到所述显微镜中，并且将合适的干涉滤光器和全息陷波滤波器(Kaiser)置于束路径中以除去不想要的激光线。将输出光路耦合到与散射光谱测量相同的分光镜中。参见图5A。
在测量中，入射电场的极化与TNPR长轴平行。图2a描述了分别的具有516nm和536nm的共振峰的单独的TNPR和被盖的TNPR的散射光谱。SiO2夹层用作等离子体激元共振频率的可调耦合因子，和SiO2顶层用作覆盖层以防止分子在金属表面顶部上自组装。由于局部提高折射率的SiO2层的存在，观察到被盖的TNPR的共振光谱的红移。17在本研究中选择对巯基苯胺(pMA)，一种常用的拉曼染料。低的荧光发射背景使其成为用于拉曼信号定量分析的良好候选物。
为了确保pMA单层在TNPR表面上的最大覆盖，将基底在100iM pMA溶液中培养超过24小时。在使用去离子水反复清洗以除去所述基底和SiO2覆盖层上吸附的不需要的pMA之后，所述基底使用N2气彻底干燥。光谱测量表明，pMA涂布的被盖和未被盖TNPR的散射峰位置分别移动到534nm和550nm(图2b)。该结果表明在TNPR附近存在pMA导致共振光谱红移，对于未被盖的TNPR等于移动18nm和对于被盖的TNPR等于移动14nm。这种观察显示，未被盖TNPR顶部上的pMA不导致显著的位移(低于5nm)并且TNPR中的表面等离子体激元模式对于在侧壁上(在激发电场的方向上)的局部折射率的变化比对于在顶部表面上的敏感。数值模拟是更合乎需要的以获得对于不同样品配置的峰移的定性解释。应该注意，这些峰移意味着TNPR也可起到分子/生物传感器的作用监测局部折射率变化。
使用表达EF)(RSTNPR/RS参照)([参照]/[TNPR])通过直接比较由TNPR得到的SERS强度和未增强的分子来评价TNPR的SERS EF。RSTNPR和RS参照分别是TNPR和正常拉曼标准样品的测量SERS强度。[TNPR]和[参照]是实验中估计的分子数。每分子0.39nm2的饱和pMA单层覆盖用于估计TNPR表面上的分子数。18假设单个TNPR是圆柱状椭圆颗粒，可自组装的最大pMA分子数是～5.1×104。在具有由20倍显微镜物镜已知的检测量的石英基底上的0.1mL纯液体pMA(1.06g/cm3)液滴用于估计参照样品的分子数，得到～4.5×1013个pMA分子。我们在单独的TNPR上在10个不同位置以精确相同的曝光时间和单独的拉曼光谱取得SERS光谱，其如图3所示。引入注目地，所测量的拉曼光谱强度是非常恒定的，表明颗粒形状的制造重复性是非常可靠的。特别地，监测pMA的1590和1077cm-1环模式的信号强度。通过仔细地观察原始数据，我们发现这两种模式的强度在测量中是非常恒定的。单个TNPR的最大SERS EF分别在1077和1590cm-1处达到～(3.4±0.3)×1010和(2.9±0.3)×1010，并且由样品与样品的拉曼散射强度变化得到误差棒。应该注意，在估计pMA的表面覆盖和由显微镜物镜照亮的量中的可能误差明显影响计算SERS EF的精确度。为了提供用于TNPR的SERS EF的可靠估计，我们以最保守的方式进行计算。通过假设在整个TNPR金属表面上的最大pMA覆盖和用由显微镜物镜照亮的最小量来确定SERS EF。报道值实际上表示SERS EF的下限，且实际的EF可甚至更高。
我们还测量了SiO2覆盖的TNPR上的拉曼光谱以将SERS贡献与被盖的TNPR的侧壁分离。我们假设在大量的去离子水清洗之后在SiO2层上没有自组装的pMA分子。假设在TNPR的暴露金属表面上的自组装pMA分子与被盖TNPR的那些之比与面积比相同，其为约1.6。在被盖TNPR上测量的最大SERS EF强度对于1077和1590cm-1环模式分别达到(6.1±0.3)×1010和(4.6±0.3)×1010。TNPR与被盖TNPR的相对SERS强度比为约1.3。这是令人感兴趣的观察，因为被盖TNPR与TNPR之间的SERS EF比不与暴露金属表面上组装的分子数成比例。
为了理解这些实验结果，我们进行若干数值计算。我们应用离散偶极近似(DDA)法来计算TNPR周围电场的近场分布。图4显示在TNPR侧壁和顶部表面的计算电场幅度分布，其中几何参数对应于SEM和AFM测量。从对于大块Ag材料的文献得到Ag的介电常数，并且将SiO2的介电常数设定为2.13。通过将颗粒埋入折射率为1.4的均质介质中来考虑对等离子体激元共振具有显著作用的基底，所述折射率是空气和ITO的平均折射率。26图6c清楚地显示角形偶极状电场分布，其中较强的场沿着入射极化方向θ＝0(沿着TNPR长轴)局部化。所述场的z依赖性显示，强的局部场主要接近于Ag/SiO2、Ag/空气和Ag/ITO界面分布。图6b显示较强的场或“较热点”主要位于接近入射极化方向周围椭圆的边缘。
总之，我们研究了TNPR的SERS EF。当等离子体激元共振调节为泵激光频率时单独TNPR的观察的SERS EF可高达6.1×1010，这是迄今为止报道的最高值。我们开发了新技术，其迫使分子在其中场最强的共振器的侧壁上组装，得到拉曼增强因子的准确测量。实验结果很好地符合TNPR的数值计算。纳米制造使得能够进行TNPR的精确尺寸控制和准确布置，消除经常与胶体纳米颗粒的化学合成或自组装相关的由聚集和尺寸变化作用产生的问题。因此，其提供用于开发集成的生物传感设备的独特优点。
实施例2
用于实时蛋白酶检测和测量的蛋白酶-特异性底物肽结合的NPR
在本研究中，将NPR(图1a)与具有序列R19-HSSKLQLAAAC(SEQ IDNO:1)(S.R.Denmeade,C.M.Jakobsen,S.Janssen等,J Natl Cancer Inst95(13),990(2003)；S.R.Denmeade,W.Lou,J.Lovgren等,Cancer Res57(21),4924(1997))的PSA蛋白酶-特异性底物肽结合，其中SERS分子若丹明(R19)在N末端和半胱氨酸在C末端(图1b)。已经鉴定所述肽是高度特异性肽，其可在异种移植物模型(S.R.Denmeade,C.M.Jakobsen,S.Janssen等,J Natl CancerInst95(13),990(2003))和人类样品(P.Wu,U.H.Stenman,M.Pakkala等,Prostate58(4),345(2004)；P.Wu,L.Zhu,U.H.Stenman等,Clin Chem50(1),125(2004))中在体内被paPSA切割。paPSA切割所述肽，导致R19部分的释放(图1c)和随后拉曼散射强度以剂量相关和时间相关的方式下降，并且可以准确量化PSA蛋白酶活性。已经理论上估计SERS增强强烈地局部化在纳米颗粒共振器表面的附近(5-10nm)，这有效地消除来自周围流体中拉曼散射物质或者在蛋白酶切割后扩散到溶液中的R19部分的测定背景噪声。由于这种独特的性质，所述测定可以简化的单步形式进行而无需额外的清洗步骤。
在光学显微镜下，NPR阵列由于在它们的共振波长下强的光散射而是区分可见的(图1d)。通过扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)测量的NPR阵列放大视图如图1e和1f所示。NPR的光学性质通过如下表征：使用来自150W氙灯(Thermo Oriel)通过多模光纤传输的准直光照射所述NPR并且使用具有匹配的液氮冷却CCD检测器(CCD-3500,Jobin Yvon)的光栅分光计(Triax550,Jobin Yvon)收集消光光谱(Durant S.Su K,Steel M.J.,Xiong Y.Sun C.,Zhang X,Journal of Physical Chemistry B110(9),3964(2006))。夹在Ag层之间的SiO2层使得能够精确地调节NPR共振。如图1g所示，NPR-肽-R19结合物的测量共振峰紧密地与532nm的激光激发波长匹配，因此使拉曼散射的增强最大化。对于SERS实验，使用在背散射配置中具有50×物镜的改进的倒置显微镜(Axiovert200,Zeiss)测量拉曼光谱。如图1h所示，基于NPR的SERS基底呈现出具有相同的数量级的一致增强因子的重现性拉曼光谱。由6个不同SERS NPR阵列获得的实验测量SERS强度的变化低于25％并且其可以在实验中归一化。
通过使NPR-肽纳米传感器暴露于流体样品进行测定，并且在1分钟的时间间隔和30秒的积分时间下记录随后与时间相关的R19拉曼光谱变化。监测来自PSA肽的拉曼1316cm-1环呼吸模式作为本研究中的主要标志峰，同时还监测1456cm-1、1526cm-1和1597cm-1峰作为额外的参考(图2)。在PSA的存在下(图2a)的时间分辨的光谱测量结果绘制在图2c中。考虑到SERS强度与NPR表面上残留的R19成比例，归一化的SERS强度变化是PSA活性的直接指示。虽然不同的拉曼标志峰的初始强度有变化，但是归一化的数据都会聚到相同的曲线，表明归一化的SERS强度变化是定量地确定被切割的底物肽的可靠度量。如图2c所示，在加入PSA之前，NPR纳米传感器显示所有峰在10分钟期间的稳定强度。然而，在加入PSA时，在开始的10～12分钟内观察到各拉曼峰的显著下降，表明PSA蛋白酶能够切割NPR上的肽。然后在30分钟拉曼信号的下降到达平台。另一丝氨酸蛋白酶，粒酶B选作阴性对照(图2b-c)。在记录的50分钟内，没有观察到SERS强度的实质变化，即使在高达1μM的浓度下。该结果证明PSA测定中拉曼信号的下降是基于真实的酶过程，而不是非特异性的水解反应或者由于表面的肽被缓冲液中其它组分置换。
通过测量PSA酶浓度范围为6nM～6pM的样品组的SERS强度的变化评价NPR纳米传感器的灵敏度。归一化SERS强度变化的绝对值如图3a所示。和预期的一样，拉曼信号的减小率与PSA的浓度成比例，这通过当PSA浓度下降时肽切割率降低来解释。如各拉曼信号达到平台所表示的那样，蛋白水解活性最终在30分钟达到平衡阶段。在图3b中绘制在加入酶30分钟之后SERS强度的归一化减少的绝对值相对于各种浓度。在当前测定装置中检测的动态范围为6pM～6nM。在给定的检测时间内高于6nM的PSA浓度没有呈现出明显的差别。如图3c所示，在取样的初始4分钟期间在不同PSA浓度下监测的拉曼峰强度呈现出可区别的衰变特性。因此，通过使衰变率合适，可能在4分钟内完成可靠的测定。
除了测量纯化PSA的蛋白酶活性之外，还进行来自活细胞培养的细胞外流体(ECF)中PSA蛋白酶活性的测量(图3d)。公知LNCaP细胞分泌PSA并且最近已用于异种移植物评价体内PSA浓度(S.R.Denmeade,C.M.Jakobsen,S.Janssen等,J Natl Cancer Inst95(13),990(2003))。为了对比，把在ECF中不分泌PSA的K562细胞系用作阴性对照。LNCaP ECF显示出SERS信号的显著变化，而K562显示出非常低的PSA酶活性(图3d)。通过将拉曼信号的归一化减少与图3b关联，确定LNCaP介质具有提高量的paPSA浓度(图3d)。
与基于荧光的测定相比，基于NPR的方法提供若干优点。强烈局部化的拉曼增强可以实质上放大信号并且还有效地减少背景噪音。因此，其容许以在6pM的灵敏度和3个数量级的动态范围单步地和无标记地检测蛋白酶活性。应该注意，认为PSA是弱的蛋白酶并且其它蛋白酶将得到甚至更好的灵敏度。第二，其容许以非常少的样品量进行准确测量。实际上，我们估计可准确地测量来自单独细胞的PSA蛋白酶活性(见下文)。第三，使用已经确立的纳米平版印刷术过程制造，基于NPR的方法是高度重现性的，因此容许定量地评价蛋白酶活性。
方法
NPR制造
通过电子束平版印刷术(EBL)(Nanowriter Series EBL100,LeicaMicrosystems)在石英基底(HOYA Corp.)上图案化NPR。将30nm厚的氧化铟锡(ITO)底层溅射在所述基底上以防止EBL过程期间的带电效应。将旋涂在ITO-石英玻璃上的100nm厚的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA,MicroChem Corp.)膜用作正性光刻胶。在曝光之后，使用1:3比的MIBK和IPA混合物显影图案，随后进行使用电子束蒸发(Mark40,CHA)的金属和电介质材料的多层沉积和标准的剥离过程。我们制造了三层Ag/SiO2/Ag NPR阵列，各银和SiO2层厚度分别等于25nm和5nm。通过原子力显微术检查所制造的NPR的几何形状，并且确认NPR的总厚度为55nm。
设备设计和表征
在具有匹配的高分辨率光栅分光计(Triax550,Jobin Yvon)的倒置光学显微镜(Axiovert200,Zeiss)上进行微区域的SERS测量。仪器设置如图5A和5B所示。为了激发颗粒等离子体激元，用准直激光束(Frequency doublingYAG laser,532nm)以产生全内反射(TIR)配置的角度通过直角棱镜照射纳米等离子体激元共振器(NPR)。产生渐消失的电磁波并且将其用于激发颗粒等离子体激元。通过在样品基底和棱镜之间应用指数匹配油(index matching oil)将样品附着到棱镜的底部。由于表面缺陷和尘粒，这种样品配置有效地消除所有的杂散散射光，导致背景信号显著下降。然后在所述颗粒内激发的集体电子振荡将相同频率的电磁波辐射到远场中，由此进行收集和光谱测量。然后通过50×长工作距离物镜收集来自NPR的散射光。将全息陷波滤波器(532nm,Kaiser Optical System)放置在束路径中以除去照明光束。然后将射出的光成像在具有液氮冷却的电荷耦合器件(CCD)照相机(CCD-3500,Jobin Yvon)的光栅分光计***的入口狭缝上用于光谱分析。
以类似的配置进行消光光谱测量。在这种测量中，将150W氙白色光源用作照明源并且通过光纤束传输准直光。
对于SERS实验，使用在背散射配置中具有50×物镜的改进的倒置显微镜(Axiovert200,Zeiss)测量拉曼光谱。应用基线扣除来除去测量光谱的荧光背景。然后在Matlab中使用具有平方多项式和9的窗口尺寸的Savitsky-Golay方法使所述光谱平滑。为了校正由于照度波动、拉曼散射的频率相关性和报道分子的初始填充密度的变化引起的可能影响，在加入蛋白酶之前将SERS强度的变化归一化为平均的强度。归一化的SERS强度变化定义为：
ΔI＝[It-I0]/I0
其中I0是加入蛋白酶之前的平均SERS强度和It是在给定时间t时测量的SERS强度。
为了估计NPR阵列的检测量，首先将扩散长度计算为其中D估计为1×10-6cm2/s且t为1800s。然后确定未归一化的检测量为V＝(LA+LD)2LD～1×10-7L，其中LA是NPR阵列的长度(15μm)。由于分子在任意方向具有相同的扩散可能性的事实，这种量必须归一化。可以基于阵列的表面积和可用于扩散的总表面积来估计这些分子与NPR阵列接触的可能性。然后通过如下给出分子可扩散到NPR阵列中的概率：假设所述阵列的NPR阵列表面积远小于可用的扩散表面积。然后总采样量计算为VDet＝WDetV～15pL。
肽合成
将R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID NO:1).(2).401mg(0.277mmol)的Rink Amide AM聚苯乙烯树脂(负载0.69mmol/g)加入12mL烧结注射器中并且使用NMP(4mL)溶胀。通过用1:2:2哌啶/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)处理30分钟除去Fmoc保护基团，并且将所述树脂过滤和使用NMP(3×3mL)和CH2Cl2(3×3mL)清洗。为了负载α-氨基酸残基，使所述树脂经历结合(耦合，coupling)条件的重复循环(方法A或方法B)，随后进行清洗(5×3mLNMP，5×3mL CH2Cl2)，Fmoc去保护[使用1:2:2哌啶/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)处理30分钟]，并且再次使用NMP(5×3mL)和CH2Cl2(5×3mL)清洗。通过如下负载第一个α-氨基酸残基：将Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.17g,2.00mmol)、PyBOP(1.04g,2.00mmol)和HOBt(270mg,2.00mmol)在1:1NMP/CH2C12(2mL)中的预先形成溶液加入到所述树脂上，并且将所得浆料在手腕作用的振荡器上搅拌5分钟，随后加入i-Pr2EtN(0.55mL,4.0mmol)。使所述反应进行5小时。然后将所述树脂过滤，清洗(5×3mL NMP、5×3mL CH2Cl2)并在高真空下干燥。确定Cys的负载为0.60mmol/g(78％产率)。通过方法A或方法B实现连续的结合。方法A由如下组成：加入Fmoc-保护的氨基酸[Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.17g,2.00mmol)、Fmoc-Ala-OH(622mg,2.00mmol)、Fmoc-Leu-OH(707mg,2.00mmol)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.22g,2.00mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(767mg,2.00mmol)、和Fmoc-His(Trt)-OH(1.24g,2.00mmol)]、PyBOP(1.04g,2.00mmol)、和HOBt(270mg,2.00mmol)在NMP/CH2Cl2(1:1,2mL)中的预先形成溶液，随后加入i-Pr2EtN(0.55mL,4.0mmol)。使反应进行至少4小时。方法B由如下组成：使所述树脂经历0.4M的合适保护酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH(375mg)]溶液，其已经通过用在DMF(2mL)中的DIC(130μL,0.84mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)培养10分钟而预活化。使结合进行4小时。在每次结合之后，将所述树脂过滤和清洗(NMP：5×3mL NMP，CH2Cl2：5×3mL)，随后除去Fmoc保护基团。在最终α-氨基酸残基的结合和去保护之后，通过使所述树脂经历0.4M的Fmoc-S-Ava-OH(272mg,0.800mmol)溶液加入Ava连接剂，其已经通过用在N-甲基吡咯啶酮(N-methylpyrrolydinone)(1mL)中的DIC(120μL,0.80mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)培养10分钟而预活化。使结合进行整夜。将所述树脂过滤和清洗(5×3mL NMP、5×3mL CH2Cl2)，除去Fmoc保护基团并且再次清洗所述树脂。通过加入0.4M若丹明19(412mg,0.8mmol)溶液引入若丹明基团，其已经通过用在NMP(2mL)中的DIC(130μL,0.84mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)培养10分钟而预活化。使所述反应进行6小时，再一次重复结合过程并且使反应进行整夜。通过用94:2:2:2TFA/三异丙基硅烷/H2O/乙烷二硫醇的溶液(3mL)培养2小时将基底与所述树脂切割开，使用预备的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1％TFA,5-95％50分钟,20mL/分钟,220/254/280nm检测100分钟,tR＝24.3分钟)进行纯化，并且冻干。MS(MALDI)，对于C78H116N19O17S计算的m/z：1622.85，测得：m/z1623.90。
肽与NPR的结合
所述肽通过半胱氨酸上的硫醇基与NPR连接。将与辛烷硫醇以1:3比混合的PSA底物肽培养24小时以确保在NPR金属表面上良好有序的自组装单层(SAM)。SAM链长度为1～2nm的辛烷硫醇用作填充材料以管理PSA底物肽之间的距离并且有助于竖立PSA底物肽用于最佳的空间呈现。因此，辛烷硫醇SAM改善蛋白酶与所述肽的接触机会。
细胞培养和临床***样品
LNCaP细胞活性地将PSA分泌到ECF中，并且人类CML细胞K562对于PSA是阴性的。将两种细胞系在37℃和5％CO2下保持在具有10％FBS和1×Pen/Strep的RPMI-1640中。在10ml新鲜介质中培养10×106细胞整夜。收集来自两种培养物的介质并且通过之前所述的荧光方法测量PSA活性，并且相对于商业化PSA(Calbiochem,San Diego,CA)进行校准。简单地说，具有间隔物的PSA-结合肽和衍生物被化学合成并且用于制备将在***浆中的PSA分级分离的亲和柱。
纯化的PSA制备和蛋白水解反应
通过柱色谱法将蛋白水解活性PSA从人类***浆中纯化到均质，除去所有已知的PSA络合物并且保留其蛋白酶级分。固定在NPR纳米传感器上的底物肽的切割在50mM Tris-HCl、pH8.0、100mM NaCl和0.1mM EDTA的缓冲液中进行，并且在37℃下实时监测该反应。从CalBiochem获得蛋白酶抑制剂(防止PSA和粒酶B降解)并且按照制造商的指示将其加入所述反应，使得最终的反应溶液含有5μM AEBSF、4.2nM抑酞酶、200nM弹性酶抑制剂和10nM GGACK。以6pM至6nM的宽浓度范围已经制备在PSA试剂中蛋白水解活性PSA的浓度。
本发明的实施例、方法、步骤、具体化合物和分子旨在示例和说明本发明，而决不应该看作限制本发明的范围。本说明书中和以下提及的任意专利、出版物、公开可获得的序列表现出本发明所属领域的技术人员的程度并且引入本文作为参考至似乎各自具体和单独地引入作为参考的相同程度。

Claims (9)

1.纳米等离子体激元共振器，包括具有交替屏蔽层的金属纳米盘,具有结合或束缚到所述纳米等离子体激元共振器的表面的被标记的生物分子。
2.权利要求1的共振器，其中所述标记物是用于表面增强拉曼散射(SERS)检测的拉曼活性标记物。
3.权利要求1的共振器，其中所述标记物是荧光或其它能检测的标记物。
4.权利要求1的共振器，其中所述纳米盘包括金属薄层、半导体材料、金属多层、金属氧化物、合金、聚合物、或碳纳米材料。
5.权利要求4的共振器，其中所述纳米盘由金属组成。
6.权利要求1的共振器，其中所述屏蔽层包括具有恒定拉曼光谱的材料。
7.权利要求6的共振器，其中所述屏蔽层选自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋糖酐。
8.权利要求1的共振器，其中所述生物分子是与拉曼活性标记物连接的肽，其中所述肽包括可被酶特异性修饰或者切割的特异性序列。
9.权利要求1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID NO:1)。
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