CN114660283A - 一种基于电学加速的免疫检测板式芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子快速检测技术领域，尤其是涉及一种基于电学加速的免疫检测板式芯片及其制备方法，包括：生物探针加速包被：将激励信号施加于含有探针溶液的板式芯片上，获得表面结合有探针的板式芯片；样本或标准品电学加速：将激励信号施加于结合有探针的板式芯片上，获得结合有样品或标准品的板式芯片；抗体或蛋白电学加速：将激励信号施加于结合有样品或标准品的板式芯片上，获得结合有抗体或蛋白的板式芯片。本发明采用板式芯片作为固相载体，取代传统的聚苯乙烯材料，采用电学加速主动微粒操控原理在1‑5分钟内完成酶标板包被生物高分子的制备和生物医学检测，准确度、灵敏度及特异性都不低于传统ELISA酶标板的质量要求和标准。

Description

一种基于电学加速的免疫检测板式芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子快速检测技术领域，尤其是涉及一种基于电学加速的免疫检测板式芯片及其制备方法。

背景技术

免疫检测技术（如酶联免疫检测，化学发光检测等）是指将抗体或抗原等高分子结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用专一特异性反应进行的定性和定量检测方法，是免疫测定技术中应用最广的技术，在免疫、药物筛选鉴定，以及医学临床诊断治疗上等领域都具有重大意义。

现有酶标板作为固相聚苯乙烯载体，采用了高分子材料表面处理技术，对抗原、抗体或高分子及其反应复合物的吸附起着重要作用，是酶联免疫吸附测定中重要器材。酶标板一般分96孔板、48孔板和384孔板，其中96孔板最为常见。

目前基于聚苯乙烯等固相载体的ELISA酶标板所应用的检测领域，如发光检测，化学发光检测和荧光检测，虽然灵敏度特异性准确度都较高，但固相聚苯乙烯载体对抗原、抗体或高分子及其反应复合物的被动吸附都要经过温育或孵育反应，抗体或高分子与其结合都耗时比较长，达几十分钟甚至数小时以上，在生产制备和检测过程中效率都非常低。

发明内容

为了克服传统酶标板检测耗时长的缺点，本发明的目的采用一种新型可用电学加速的板式芯片作为固相载体，取代传统的聚苯乙烯材料，采用电学加速主动微粒操控原理在短短数分钟内就完成酶标板包被生物高分子如抗原抗体的生产制备和相应的生物医学检测，准确度、灵敏度及特异性都不低于传统ELISA酶标板的质量要求和标准，极大提高了制备和检测效率。

本发明提供了一种基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1、生物探针加速包被：将激励信号施加于含有生物探针溶液的板式芯片上，获得表面结合有生物探针的板式芯片，所述板式芯片包括电极片，所述电极片经过活化处理，用于固定所述生物探针；

S2、样本或标准品电学加速：在结合有生物探针的板式芯片上加入用于结合生物探针的样品或标准品，然后将激励信号施加于板式芯片上，获得结合有样品或标准品的板式芯片；

S3、抗体或蛋白电学加速：在结合有样品或标准品的板式芯片加入用于结合样品或标准品的抗体或蛋白，然后将激励信号施加于板式芯片上，获得结合有抗体或蛋白的板式芯片；

S4、对结合有抗体或蛋白的板式芯片进行荧光检测或化学发光检测。

本发明能将生物探针分子良好的固定在板式芯片上特别是良好的固定在板式芯片的电极片上，以便制备的芯片能够用于基于电学检测的生物芯片检测方法中，促进基于电学检测的生物芯片检测方法的发展。

本发明在化学发光检测的基础上，创造性地添加探针加速包被步骤，利用板式芯片上的电极产生特定的电场，在电场的作用下，促进液体局部温度改变，还可以促进生物探针分子的运动，实现生物探针分子固定于电极片上，从而更为加快了免疫检测的过程，同时再辅助样本或标准品电学加速步骤及抗体或蛋白电学步骤，实现生物探针分子和样品或标准品、样品或标准品和抗体或蛋白（酶标记抗体、蛋白和吖啶酯标记抗体、蛋白）的快速结合，在短时间内可以完成检测。

在探针加速包被步骤中，施加激励信号，产生电泳效应加快了探针分子向电极片方向移动的速度，并且产生电热效应使得芯片内部形成显著的温度梯度而引起的局部流体流动，温度效应和介电泳效应一同加快探针分子固定电极片上的结合速度。激励信号是指能够促进芯片中分子运动的交流电信号，其特征参数包括频率以及电压等。

本发明采用可电学加速的板式芯片作为新型固相载体取代聚苯乙烯，通过设定特定的制备方法，方法中采用电学加速主动微粒操控技术（如介电泳，交流电热和交流电渗等技术）替代被动吸附的温育或孵育反应，使反应时间大大缩短，从数十分钟、几小时到短短几分钟，制备效率和检测效率都大提高，同时还具备易于操作，灵敏度特异性准确度高等优势。

作为本发明所述基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法的优选实施方式，所述步骤S1-S3中，激励信号为电压1V -20V及频率100Hz-10MHz。

本发明的步骤S1-S3中，采用上述电压及频率的激励信号，可以达到生物探针分子和样品或标准品、样品或标准品和抗体或蛋白快速反应结合的效应。并且，采用本发明激励信号的参数可以提升检测灵敏度，灵敏度保持在0.10-0.15 ng/ml。

作为本发明所述基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法的优选实施方式，所述激励信号的施加时长为0.1-5min。

激励信号的施加时长可以保证生物探针分子和样品或标准品、样品或标准品和抗体或蛋白充分结合，较好地提升检测效果。

作为本发明所述基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法的优选实施方式，所述生物探针的浓度为2-20μg/mL。

当生物探针的浓度在2-20μg/mL范围内，采用本发明的电学加速主动微粒操控技术可以提高检测的信噪比。

作为本发明所述基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法的优选实施方式，所述生物探针的种类包括高分子，蛋白质，DNA，RNA，抗原，抗体中的一种。

作为本发明所述基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法的优选实施方式，所述生物探针加速包被步骤包括使用0.01-10×磷酸盐缓冲液作为溶剂配制生物探针溶液。

作为本发明所述基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法的优选实施方式，在生物探针加速包被步骤之前依次包括芯片活化成膜步骤；在芯片活化成膜步骤中，等离子清洗所述芯片电极片，且用氩气载气将APTES沉积在芯片表面以提高探针结合效率和有效期。

本发明还提供了一种上述制备方法制得的芯片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用可电学加速的板式芯片作为新型固相载体取代聚苯乙烯，采用电学加速主动微粒操控技术（如介电泳，交流电热和交流电渗等技术）替代被动吸附的温育或孵育反应，在短短数分钟内（1-5分钟之内）就完成酶标板包被生物高分子如抗原抗体的生产制备和相应的生物医学检测，准确度灵敏度特异性都不低于传统ELISA酶标板的质量要求和标准，极大提高了制备和检测效率。

附图说明

图1为板式芯片的零件图；

图2为板式芯片的结构示意图；

图3为本发明电学加速检测标准曲线图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

传统ELISA酶标板聚苯乙烯作为固相载体，在酶联免疫试验中，抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、氢键/离子键等作用键的被动吸附，也可以通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键提高结合强度。无论何种方式，参与免疫学反应的抗原、抗体、标记抗体或抗原的纯度、浓度和比例以及缓冲液种类、浓度和离子强度、pH值和反应温度、时间等条件对最后完成结合的效率都起着关键作用，尤其是反应温度和温育时间，若完全达到反应平衡，需要几十分钟甚至数小时以上才能完成。

本发明采用可电学加速的芯片材料作为新型固相载体取代聚苯乙烯，通过设计的高通量板式芯片，芯片加速器以及相关夹具和配套器件，采用电学加速主动微粒操控技术（如介电泳，交流电热和交流电渗等技术）替代被动吸附的温育或孵育反应，使反应时间大大缩短，从数十分钟、几小时到短短几分钟，制备效率和检测效率都大提高，同时还具备易于操作，灵敏度特异性准确度高等优势。

在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例是在未固定包被分子（抗体或者抗原或者其他的亲和分子）的芯片的基础上进行加工形成包被了抗体的成品芯片。

本实施例使用的芯片参见发明人在先专利CN104965081B（基于移动设备的抗体抗原检测方法），在该专利中记载有：一种抗体抗原检测测试***，包括至少一个反应单元，反应单元包括一个顶部开口的反应腔，反应腔底部设置有一块检测板，检测板上铺设有至少一对电极片，电极片的接线端穿过并固定在反应腔的盒体上；检测板上还固定有目标抗体或抗原的对应抗原或抗体。在本实施例中，芯片具体是指CN104965081B中的反应单元，铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an ACelectrokinetics-based immunoassay system for on-site serodiagnosis ofinfectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensors and Actuators A， 171 (2011) 406–413，Fig. 3.（b））。通常反应腔和检测板为绝缘材料（表面为SiO₂，玻璃，本实施例为SiO₂），电极片均为金属材质（铝、金或铜，本实施为铝材质），电极片非常容易在加工过程中或者在加工完成后的存放过程中，逐渐地被腐蚀，使得整个芯片失效。

本方案在从芯片制作成为成品芯片的方法工艺上进行了改进。

1.预处理：

取未包被芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，确认芯片的电极片是否有无断条和连条（电极片之间相互平行），有无其他粘附的杂质，选取无断连条及粘附杂质的芯片继续后续实验（称为第一次镜检）。粘附的杂质的判断依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有粒径或者长度大于0.5μm的斑点、颗粒、脏物或尘埃粒子，如有就判定为不合格。

2.芯片清洗

将芯片置于装有无水乙醇的烧杯中，用超声波清洗机清洗10分钟，再用超纯水冲洗10秒，最后用氮气吹干。

3.芯片活化成膜

Dinner等离子体设备用于APTES 沉积成膜。首先样品经过活化预处理（氩气流：300sccm, 10-30 %额定功率，压力0.10-0.3 mbar , 持续时间5-20mins )。然后，气体混合物包含氩气Ar 和载体气体 Ar 携带 APTES 注入到反应室。使用 10%-30%额定功率和气体压力进行APTES成膜沉积。压力为0.10-0.3mbar，持续时间5-20mins。每片成膜后的芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染，则舍弃该芯片（称为第二次镜检），判断方法同第一次镜检。

板式芯片的结构包括芯片、硅胶垫、垫圈孔和芯片上盖，所述硅胶垫贴于芯片的叉指部位，所述垫圈孔在叉指部位的正上方，盖上芯片上盖（参考图1-2）。

4.探针加速包被

在板式芯片每孔中加入10-20μL（优选10μL）、20μg/mL（2-20μg/mL）的布病抗原（生物探针包括高分子，蛋白质，DNA，RNA，抗原，抗体中的一种），溶剂为1×PBS（0.01× PBS-10×PBS）、将板式芯片放入加速器加速槽中，在3V（1V-20V），100 kHz（100Hz-10MHz）的条件下加速1min（0.1-5min），获得结合有探针的板式芯片；其中使用1×PBS（磷酸盐缓冲液）作为溶剂分散和溶解上述探针。

5.包被后清洗、封闭及封闭后清洗：从加速槽中取出板式芯片，每孔用PBS冲洗10秒，清洗2次，最后一次用氮气吹干；每孔加入10-20μL PBS溶解的 SuperBlock，室温封闭0.5-1小时；每次每片芯片用PBS冲洗10秒，清洗2次，最后一次用氮气吹干。

6.样本或标准品电学加速：在步骤8获得板式芯片每孔分别加入0.1-1000ng/ml鼠抗体(1%BSA-PBS)，用加速器在3V（1V-20V），100 kHz（100Hz-10MHz）的条件下加速1min（0.1-5min）。

7.清洗：每孔用PBS冲洗10秒，清洗2次，最后一次用氮气吹干。

8.抗体或蛋白电学加速：在步骤11获得板式芯片每孔分别加入10-20μL的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:1000稀释，溶于1%BSA-PBS)，用加速器在3V（1V-20V），100 kHz（100Hz-10MHz）的条件下加速1min（0.1-5min）。

9.清洗：每孔用0.1%PBST（Tween-20溶于1×PBS）冲洗两次，每次10秒，最后一次用氮气吹干。

10.检测：每孔加入10-20μL的发光底物或化学发光底物，用酶标仪读取每孔数值。

实施例2-4基本同实施例1一致，不同点如表1所示。

表1

组别	探针	检测目标物	灵敏度（ng/ml）
				实施例1	布病抗原	布病抗体	0.10-0.15
实施例2	心梗抗体	心梗抗原	0.06-0.07
				实施例3	载体蛋白	黄曲霉毒素	0.01-0.02
实施例4	适配体DNA	病毒DNA	0.004-0.005

实施例5-6及对比例1-4基本同实施例1一致，不同点在于探针加速包被步骤的电加速参数不同，具体如表2所示。

表2

组别	电加速参数	灵敏度（ng/ml）	CV(%)
				实施例1	3V，100KHz	0.10-0.15	3.7
实施例5	1V，5KHz	0.10-0.15	4.9
				实施例6	20V，500KHz	0.10-0.15	4.5
对比例1	3V，50Hz	0.27	5.8
				对比例2	3V，12MHz	0.58	6.7
对比例3	0.5V，100KHz	0.49	8.5
				对比例4	30V，100KHz	0.36	7.8

对比例5-6基本同实施例1一致，不同点在于加速时间；对比例7为传统温育包被，具体如表3所示。

表3

组别	包被方式、时间	包被温度（℃）	包被效果%	灵敏度（ng/ml）
					实施例1	电加速（1min）	常温	大于90	0.10-0.15
对比例5	电加速（5s）	常温	80	0.50
					对比例6	150s温育	常温	50	1.20
对比例7	120min（或720min）温育	37℃（或4℃）	大于90	0.10-0.15

当布病抗原的浓度为2-20μg/mL时，采用上述方法（实施例1）检测的标准曲线如图3所示，当布病抗原的浓度为20μg/mL时，检测的信噪比最高，在检测时间的显著缩短的条件下，本发明采用电学加速的方法与传统温育检测相比，效果相似，如表4所示。

表4

组别	检测时间（分钟）	信噪比（S/N）	灵敏度（ng/ml）
				实施例1	5	210-220	0.10-0.15
传统温育检测	150	210-220	0.10-0.15

试验例

对来源于重庆理工大学和重庆市动物疫病预防控制中心消毒灭绝后的布鲁氏菌病阴性和阳性样本做了测试，测出结果为阴性或阳性的统计值如表5所示。采用本发明的电学加速的方法，可以在显著缩短检测时间的前提下，达到与传统温育检测一致效果。

表5

组别	阴性样本检测	阳性样本检测	总体符合率（%）
				实施例1	70/70	100/100	100
传统温育检测	70/70	100/100	100

本发明采用可电学加速的板式芯片作为新型固相载体取代聚苯乙烯，采用电学加速主动微粒操控技术（如介电泳，交流电热和交流电渗等技术）替代被动吸附的温育或孵育反应，在短短数分钟内（1-5分钟之内）就完成酶标板包被生物高分子如抗原抗体的生产制备和相应的生物医学检测，准确度灵敏度特异性都不低于传统ELISA酶标板的质量要求和标准，极大提高了制备和检测效率。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (8)

1.一种基于电学加速的免疫检测板式芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、生物探针加速包被：将激励信号施加于含有生物探针溶液的板式芯片上，获得表面结合有生物探针的板式芯片，所述板式芯片包括电极片，所述电极片经过活化处理，用于固定所述生物探针；

S2、样本或标准品电学加速：在结合有生物探针的板式芯片上加入用于结合生物探针的样品或标准品，然后将激励信号施加于板式芯片上，获得结合有样品或标准品的板式芯片；

S3、抗体或蛋白电学加速：在结合有样品或标准品的板式芯片加入用于结合样品或标准品的抗体或蛋白，然后将激励信号施加于板式芯片上，获得结合有抗体或蛋白的板式芯片；

S4、对结合有抗体或蛋白的板式芯片进行荧光检测或化学发光检测。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1-S3中，激励信号为电压1V -20V及频率100Hz-10MHz。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述激励信号的施加时长为0.1-5min。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物探针的浓度为1-20μg/mL。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物探针的种类包括高分子，蛋白质，DNA，RNA，抗原，抗体中的一种。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物探针加速包被步骤包括使用0.01-10×磷酸盐缓冲液作为溶剂配制生物探针溶液。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在生物探针加速包被步骤之前依次包括芯片活化成膜步骤；在芯片活化成膜步骤中，等离子清洗所述电极片；用氩气载气将APTES沉积在芯片表面。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的芯片。

Images