CN105223355A - 临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒 - Google Patents

临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，涉及一种过氧化物酶的测定试剂盒，特别是涉及一种用于定量检测髓过氧化物酶的试剂盒。其目的是为了提供一种高灵敏、高特异、重复性好、易操作的临床用髓过氧化物酶检测试剂盒。本发明的试剂盒包括：抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板、生物素化抗髓过氧化物酶抗体、亲和素化碱性磷酸酶、碱性磷酸酶底物液、髓过氧化物酶标准品、髓过氧化物酶质控品、样本稀释液和酶反应终止液。本发明采用碱性磷酸酶作为标记物，提高了检测的特异性；采用生物素-亲和素增敏***整合，提高了检测灵敏度；采用重组髓过氧化物酶肽作为标准品，提高了检测的重复性和稳定性。本发明用于体外免疫检测领域。

Description

临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒
技术领域
本发明涉及一种过氧化物酶的测定试剂盒，特别是涉及一种用于定量检测髓过氧化物酶的试剂盒。
背景技术
当前临床上对急性冠脉综合征的诊断与评估主要应用心肌酶谱等指标。此类指标的水平通常会在心肌发生实质损伤后发生明显升高，因此，该类指标不能对心血管疾病的发生提供早期预警。髓过氧化物酶是由人中性粒细胞、单核细胞产生的一种有酶活性的血色素蛋白，其分子量约为118kDa，由一对重链和轻链组成。通常合成后存于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，但在炎症条件下可释放入血，可将氯化物和过氧化氢催化成次氯酸盐，参与杀菌效应。但髓过氧化物酶能氧化低密度脂蛋白胆固醇，促进巨噬细胞向泡沫细胞转化；该蛋白也可激活金属蛋白酶(MMPs)，并促进粥样硬化斑表面失稳定、甚至破裂；可降低NO的含量及生物利用度，影响其对血管扩张和抗炎功能的效应。近年来的研究表明，髓过氧化物酶参与了心脏冠脉疾病的发生、发展过程，是急性冠脉综合征发生的重要原因，其活性的水平在一定程度反应了冠脉疾病的活化程度。目前，国内各临床实验室已认识到髓过氧化物酶检测在急性冠脉综合征诊断中的重要价值，并开始尝试对其开展检测，并用于急性冠脉综合征等炎症疾病的诊断。
当前对于髓过氧化物酶的检测主要有二种方法，一种是酶活性检测方法，即利用髓过氧化物酶的过氧化物酶活性进行检测；另一种是利用髓过氧化物酶的抗原性建立的酶联免疫检测法。第一种方法的主要特点是可检测髓过氧化物酶的活性，但方法灵敏度差、且多为定性检测。而酶联免疫检测法快速且可定量分析，但常规方法中用辣根过氧化物酶标记的抗体直接检测，并采用髓过氧化物酶作为标准品，因此，其检测灵敏度低；易受髓过氧化物酶本身过氧化物酶的干扰，特异性差；同时，标准品稳定性差。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏、高特异、重复性好、易操作的临床用髓过氧化物酶检测试剂盒。
本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，包括抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板、生物素化抗髓过氧化物酶抗体、亲和素化碱性磷酸酶、碱性磷酸酶底物液、髓过氧化物酶标准品、髓过氧化物酶质控品、样本稀释液和酶反应终止液；
其中，所述髓过氧化物酶标准品和髓过氧化物酶质控品均为重组的髓过氧化物酶肽抗原；所述髓过氧化物酶质控品用于校准、拟合标准曲线。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板按以下步骤制备：
将稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗加入96孔聚苯乙烯酶标板中，孵育8-12小时；将抗体吸出后，用洗涤缓冲液洗加样孔三遍；加入封闭液静置4小时；弃去孔中液体，冷风机吹干后，真空包装，置4℃保存；
所述稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗，浓度为10μg/mL；
所述洗涤缓冲液为加0.08％吐温-20的0.1mM磷酸缓冲液，pH为7.4；
所述封闭液为含5％牛白蛋白和5％人白蛋白的pH7.4的0.1mM磷酸缓冲液，以上所述百分数均为质量百分数。
更进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述羊抗人髓过氧化物酶多抗为髓过氧化物酶全蛋白免疫羊后，纯化、制备的多抗。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述生物素化抗髓过氧化物酶抗体按以下步骤制备：
将兔抗人髓过氧化物酶多抗采用N-羟基丁二酰亚胺(生物素)进行偶联标记；用磷酸缓冲液透析去除游离生物素后，即制得生物素化抗髓过氧化物酶抗体；
将制得的生物素化抗髓过氧化物酶抗体用含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1M磷酸缓冲液按1：20-200稀释，-20℃保存；
所述磷酸缓冲液pH为7.4，以上百分数均为质量百分数。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述亲和素化碱性磷酸酶按以下步骤制备：
将碱性磷酸酶用链霉亲和素采用戊二醛法进行标记；透析去除游离链霉亲和素后，即制得亲和素化碱性磷酸酶；
将制得的亲和素化碱性磷酸酶用含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1mM磷酸缓冲液按1:20-200稀释，-20℃保存；
所述磷酸缓冲液pH为7.4，以上所述百分数均为质量百分数。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述碱性磷酸酶底物液按以下步骤制备：将pNPP以10mM的浓度溶于含1mMMgCl2的0.1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中，即制得碱性磷酸酶底物液。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述样本稀释液为含0.5％牛白蛋白的0.1mM磷酸缓冲液，pH为7.4。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述酶反应终止液为3N的NaOH。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述髓过氧化物酶标准品的浓度分别为30ng/mL、15ng/mL、7.5ng/mL、3.75ng/mL、1.87ng/mL。
进一步，本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，所述生物素化抗髓过氧化物酶抗体和亲和素化碱性磷酸酶应用的稀释比均为1:2000，稀释液均为含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1mM磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液pH为7.4，以上所述百分数均为质量百分数。
本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒与现有技术不同之处在于：
1、本发明的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒中采用碱性磷酸酶作为标记物，替代常规方法中的辣根过氧化物酶，避免了髓过氧化物酶本身的干扰，提高了检测的特异性；本发明在检测体系中采用生物素-亲和素增敏***整合，提高了检测灵敏度；同时，标准品采用重组髓过氧化物酶肽，由于重组髓过氧化物酶肽表位比较单一，结合特异性更好，因此提高了标准品检测的重复性和定量检测的稳定性，降低了成本。
2、经实验验证本发明试剂盒的检测区间为0.233-30ng/ml；无论是高浓度样本，还是低浓度样本，其批内CV值均小于7％，方法学精密度良好；试剂盒的回收效率平均为101.39％，说明准确度良好。
下面结合附图和实施例对本发明的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒作进一步说明。
附图说明
图1为本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒的技术原理图；
图2为本发明实施例2中采用不同包被抗体浓度的检测结果曲线图；
图3为本发明实施例3中采用不同检测抗体浓度的检测结果曲线图；
图4为本发明实施例4中采用不同碱性磷酸酶浓度的检测结果曲线图；
图5为本发明实施例5中采用不同抗原和标准品的孵育时间的检测结果曲线图；
图6为本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒对髓过氧化物酶的检测区间图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒包括：抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板、生物素化抗髓过氧化物酶抗体、亲和素化碱性磷酸酶、碱性磷酸酶底物液、髓过氧化物酶标准品、髓过氧化物酶质控品、样本稀释液和酶反应终止液。
1)抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板按以下步骤制备：
将稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗加入96孔聚苯乙烯酶标板中，孵育10h；将抗体吸出后，用洗涤缓冲液洗加样孔三遍；加入封闭液静置4小时；弃去孔中液体，冷风机吹干后，真空包装，置4℃保存；
其中，羊抗人髓过氧化物酶多抗为髓过氧化物酶全蛋白免疫羊后，纯化、制备的多抗；
稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗，浓度为10μg/mL；
洗涤缓冲液为加入0.08％吐温-20的0.1mM磷酸缓冲液，pH为7.4；
封闭液为含5％牛白蛋白和5％人白蛋白的pH7.4的0.1mM磷酸缓冲液，以上百分数均为质量百分数。
2)生物素化抗髓过氧化物酶抗体按以下步骤制备：
将兔抗人髓过氧化物酶多抗采用N-羟基丁二酰亚胺进行偶联标记；用磷酸缓冲液透析去除游离生物素后，即制得生物素化抗髓过氧化物酶抗体；
将制得的生物素化抗髓过氧化物酶抗体用含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1M磷酸缓冲液按1：200稀释，-20℃保存；
磷酸缓冲液pH为7.4，以上百分数均为质量百分数。
3)亲和素化碱性磷酸酶按以下步骤制备：
将碱性磷酸酶用链霉亲和素采用戊二醛法进行标记；透析去除游离链霉亲和素后，即制得亲和素化碱性磷酸酶；
将制得的亲和素化碱性磷酸酶用含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1mM磷酸缓冲液按1:200稀释，-20℃保存；
磷酸缓冲液pH为7.4，以上百分数均为质量百分数。
4)碱性磷酸酶底物液按以下步骤制备：将pNPP以10mM的浓度溶于含1mMMgCl2的0.1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中，加入终体积1％的溶剂稳定剂，即制得碱性磷酸酶底物液。
5)髓过氧化物酶标准品和髓过氧化物酶质控品均为重组的髓过氧化物酶肽抗原(ProspectBiosystems公司型号为621-745Aa的产品)；髓过氧化物酶标准品的浓度分别为30ng/mL、15ng/mL、7.5ng/mL、3.75ng/mL、1.87ng/mL；髓过氧化物酶质控品用于校准、拟合标准曲线。
6)样本稀释液为含0.5％牛白蛋白的0.1mM磷酸缓冲液，pH为7.4。
7)酶反应终止液为3N的NaOH。
采用以上步骤和配比即制得本实施例的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒。
实施例2
本实施例采用不同浓度的羊抗人髓过氧化物酶多抗进行包被，对包被不同浓度多抗对检测效果的影响进行研究，操作步骤如下：
将羊抗人髓过氧化物酶多抗用pH9.6碳酸缓冲液稀释成30、20、10、5、1μg/mL的浓度，分别加入到96孔酶标板的小孔中，进行4℃包被。将包被好的酶标板用洗涤液清洗三次后，分别加入不同浓度的重组髓过氧化物酶肽抗原(30，15，7.5，3.75，1.87ng/mL)。37℃孵育1小时后，洗涤三次。加入生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体(1：1000稀释)，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加入亲和素碱性磷酸酶(1：1000)，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加pNPP底物显色液，37℃孵育20分钟后，加反应终止液。在酶标仪上405nm检测其OD值。以OD值为Y轴，包被抗体浓度为X轴，做曲线，分析其最佳包被浓度，结果如图2所示。由图2可知，最佳包被抗体浓度为10μg/mL。
实验过程的原理如图1所示，首先将抗髓过氧化物酶抗体5(捕获抗体)预包被于酶标板1上，利用此捕获抗体5对待测样本中髓过氧化物酶4或标准品中的重组髓过氧化物酶肽4进行特异性捕获，通过生物素化抗髓过氧化物酶抗体3(反应抗体)与被捕获抗原4的特异性结合，将生物素偶联至酶标板上。利用生物素-亲和素间放大效应的特异性结合，终将亲和素化碱性磷酸酶2结合至酶标板，从而实现碱性磷酸酶对底物pNPP的有效催化呈色反应。在此检测中，以重组的髓过氧化物酶肽作为髓过氧化物酶标准品进行同步检测，以制备标准曲线用于样本中髓过氧化物酶的定量分析。
实施例3
本实施例采用不同的生物素化抗髓过氧化物酶浓度，对不同检测抗体浓度对检测效果的影响进行研究，操作步骤如下：
将包被用的抗髓过氧化物酶捕获抗体用pH9.6碳酸缓冲液稀释成10μg/ml的浓度，分别加入到96孔酶标板的小孔中，进行4℃包被。加入浓度为15ng/ml的重组髓过氧化物酶肽抗原。37℃孵育1小时后，洗涤三次。加入不同稀释倍数的生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体(1：3000，1：2000，1：1000，1：500，1：200)，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加入亲和素碱性磷酸酶(1：1000)，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加pNPP底物显色液，37℃孵育20分钟后，加反应终止液。酶标仪上405nm检测其OD值。以OD值为Y轴，不同稀释倍数的生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体为X轴，做曲线，分析其最佳稀释倍数，结果如图3所示。
由图3可知生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体应用时，其最佳稀释倍数为1：2000。
实施例4
本实施例采用不同亲和素化碱性磷酸酶浓度，对不同碱性磷酸酶浓度对检测效果的影响进行研究，操作步骤如下：
将包被用的抗髓过氧化物酶捕获抗体用pH9.6碳酸缓冲液稀释成10μg/ml的浓度，分别加入到96孔酶标板的小孔中，进行4℃包被。加入浓度为15ng/ml的重组髓过氧化物酶肽抗原。37℃孵育1小时后，洗涤三次。加入1：1000稀释的生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加入不同稀释倍数的亲和素化碱性磷酸酶(1:5000,1：3000，1：2000，1：1000，1：500)，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加pNPP底物显色液，37℃孵育20分钟后，加反应终止液。酶标仪上405nm检测其OD值。以OD值为Y轴，不同稀释倍数的亲和素化碱性磷酸酶为X轴，做曲线，分析其最佳稀释倍数，结果如图4所示。
由图4可知，亲和素化碱性磷酸酶最佳稀释倍数为1：2000。
实施例5
本实施例采用不同抗原和标准品的孵育时间，对不同孵育时间对检测效果的影响进行研究，操作步骤如下：
将包被用的抗髓过氧化物酶捕获抗体用pH9.6碳酸缓冲液稀释成10μg/ml的浓度，分别加入到96孔酶标板的小孔中，进行4℃包被。加入浓度为15ng/ml的重组髓过氧化物酶肽抗原。37℃孵育不同时间(120分钟，90分钟小时，60分钟，30分钟，15分钟)后，洗涤三次。加入1：1000稀释的生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加入1：2000稀释的亲和素化碱性磷酸酶，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加pNPP底物显色液，37℃孵育20分钟后，加反应终止液。酶标仪上405nm检测其OD值。以OD值为Y轴，不同孵育时间为X轴，做曲线，分析其最佳孵育不同时间，结果如图5所示。
由图5可知，最佳孵育时间为60分钟。
验证试验
采用以下方法对本发明临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒的检测范围、精密度、回收率进行方法学评估。
1)试剂盒检测区间的评估
按实施例1中制备抗髓过氧化物酶捕获抗体包被的酶标板。加入不同浓度的髓过氧化物酶标准品(购自Sigma,为人白细胞的酶提取物)，浓度分别为30，15，7.5，3.75，1.87，0.935，0.468，0.233，0ng/ml。37℃孵育不同时间(120分钟，90分钟小时，60分钟，30分钟，15分钟)后，洗涤三次。加入1：1000稀释的生物素化抗髓过氧化物酶检测抗体，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加入1：2000稀释的亲和素化碱性磷酸酶，37℃孵育30分钟，洗涤三次。加pNPP底物显色液，37℃孵育20分钟后，加反应终止液。酶标仪上405nm检测其OD值。以OD值为Y轴，不同孵育时间为X轴，做曲线，分析其检测区间，结果如图6所示。由图6可知，其检测区间为0.233-30ng/ml。
2)方法学检测精密度的评估
将髓过氧化物酶标准品分别配成高、中、低三个浓度梯度(12、5、0.5ng/ml)后，方案1)中的方案对其在同一酶标板上进行检测。每个浓度样本各做20孔，同时设阳、阴性对照和空白对照，以计算其结果的标准差和批内CV值。其结果如表1所示。
表1不同浓度梯度标准品的标准差和批内CV值
由表1可知，无论是高浓度样本，还是低浓度样本，其批内CV值均小于7％，方法学精密度良好。
3)试剂盒回收率的评估
采用标准品内掺法进行试剂盒回收率的检测。将测定的髓过氧化物酶浓度为3.75ng/ml和15ng/ml的二样本(n＝5)各取9等份，分别加入浓度为5、10、20ng/ml的髓过氧化物酶标准品1等份。混合后，作为样本用本检测试剂盒检测其浓度值，并计算其回收率。结果显示：本发明试剂盒的回收效率为101.39％，说明准确度良好。如表2所示。
表2髓过氧化物酶的回收效率(％)
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于：包括抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板、生物素化抗髓过氧化物酶抗体、亲和素化碱性磷酸酶、碱性磷酸酶底物液、髓过氧化物酶标准品、髓过氧化物酶质控品、样本稀释液和酶反应终止液；
其中，所述髓过氧化物酶标准品和髓过氧化物酶质控品均为重组的髓过氧化物酶肽抗原；所述髓过氧化物酶质控品用于校准、拟合标准曲线。
2.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述抗髓过氧化物酶抗体预包的酶标板按以下步骤制备：
将稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗加入96孔聚苯乙烯酶标板中，孵育8-12小时；将抗体吸出后，用洗涤缓冲液洗加样孔三遍；加入封闭液静置4小时；弃去孔中液体，冷风机吹干后，真空包装，置4℃保存；
所述稀释的羊抗人髓过氧化物酶多抗，浓度为10μg/mL；
所述洗涤缓冲液为加入0.08％吐温-20的0.1mM磷酸缓冲液，pH为7.4；
所述封闭液为含5％牛白蛋白和5％人白蛋白的pH7.4的0.1mM磷酸缓冲液，以上所述百分数均为质量百分数。
3.根据权利要求2所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述羊抗人髓过氧化物酶多抗为髓过氧化物酶全蛋白免疫羊后，纯化、制备的多抗。
4.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗髓过氧化物酶抗体按以下步骤制备：
将兔抗人髓过氧化物酶多抗采用N-羟基丁二酰亚胺进行偶联标记；用磷酸缓冲液透析去除游离生物素后，即制得生物素化抗髓过氧化物酶抗体；
将制得的生物素化抗髓过氧化物酶抗体用含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1M磷酸缓冲液按1：20-200稀释，-20℃保存；
所述磷酸缓冲液pH为7.4，以上百分数均为质量百分数。
5.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述亲和素化碱性磷酸酶按以下步骤制备：
将碱性磷酸酶用链霉亲和素采用戊二醛法进行标记；透析去除游离链霉亲和素后，即制得亲和素化碱性磷酸酶；
将制得的亲和素化碱性磷酸酶用含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1mM磷酸缓冲液按1:20-200稀释，-20℃保存；
所述磷酸缓冲液pH为7.4，以上所述百分数均为质量百分数。
6.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶底物液按以下步骤制备：将pNPP以10mM的浓度溶于含1mMMgCl2的0.1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)中，加入终体积1％的溶剂稳定剂，即制得碱性磷酸酶底物液。
7.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为含0.5％牛白蛋白的0.1mM磷酸缓冲液，pH为7.4。
8.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于：所述酶反应终止液为3N的NaOH。
9.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述髓过氧化物酶标准品的浓度分别为30ng/mL、15ng/mL、7.5ng/mL、3.75ng/mL、1.87ng/mL。
10.根据权利要求1所述的临床用定量检测髓过氧化物酶试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗髓过氧化物酶抗体和亲和素化碱性磷酸酶应用的稀释比均为1:2000，稀释液均为含20％甘油、10％牛白蛋白、0.5％海藻酸钠和0.05％叠氮钠的0.1mM磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液pH为7.4，以上所述百分数均为质量百分数。
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