CN104483492A

CN104483492A - 抗链球菌溶血素o抗体的检测试剂盒

Info

Publication number: CN104483492A
Application number: CN201410804871.9A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 方亮
Original assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Ningbo Medical System Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2015-04-01

Abstract

本发明公开了一种抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗体抗原特异性结合的反应液；所述试剂2由缓冲液和蛋白胶乳颗粒复合物组成；所述蛋白胶乳颗粒复合物为组合蛋白标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上形成的复合物；所述组合蛋白由链球菌溶血素O和惰性蛋白通过化学交联而成；本发明抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确性高、稳定性好及生产成本低的优点。

Description

抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种医学检测试剂盒，具体讲是一种抗链球菌溶血素O抗体（ASO）的检测试剂盒。

背景技术

链球菌溶血素O（SLO）是链球菌产生的一种外毒素，它能够溶解人体血液中的红细胞，并且对多种细胞有毒性作用，当链球菌感染人体后，人体免疫***会产生抗链球菌溶血素O的抗体，并且释放到血液中，使血液中抗链球菌溶血素O的抗体浓度升高。因此，临床上通过对人体血液中抗链球菌溶血素O抗体的浓度检测，辅助诊断由链球菌感染后引起的***性疾病（如风湿热和肾小球肾炎）。

目前市场上，通过胶乳增强免疫比浊试剂来检测人体血清中的抗链球菌溶血素O抗体。在销售的胶乳增强免疫比浊试剂中，胶乳与抗原或抗体的交联，通常有物理吸附法和化学交联法。物理吸附法通常是靠蛋白质分子结构上的疏水基团与胶乳表面的疏水基团间的相互作用，将抗原或抗体吸附到胶乳表面。化学交联法是通过抗原或抗体与胶乳表面的化学基团反应，将抗原或抗体交联在胶乳上。此两种方法各有优缺点，物理吸附法有易于结合，不会影响抗原或抗体的活性，但特异性比较差，结合不够牢固。化学交联法有特异好，易保存，分散性良好等优点，但对抗体或抗原活性影响大。

化学交联法现已广泛应用于体外诊断试剂制备中，但是化学交联法会由于化学反应造成抗原或抗体在交联过程中活性丧失，影响试剂的灵敏度和准确度，而且经多步交联，试剂的稳定性受到大的影响，而且制备的时间时间很长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种检测灵敏度，准确度高；精密度好，检测线性宽，稳定性好；生产成本低的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒。

本发明的技术解决方案如下：一种抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗体抗原特异性结合的反应液；所述试剂2由缓冲液和蛋白胶乳颗粒复合物组成；所述蛋白胶乳颗粒复合物为组合蛋白标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上形成的复合物；所述组合蛋白由链球菌溶血素O和惰性蛋白通过化学交联而成。

所述试剂1由以下组分组成：100-400 mM Tris-HCl；5-10 mM聚乙二醇6000；1 mg/mL Proclin-300；1-20mM乙二胺四乙酸钠(EDTA)；1-10 mg/mL BSA和150mM氯化钠。

作为优选，所述惰性蛋白为小牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白中的一种。

作为进一步优选，所述惰性蛋白为BSA。

作为优选，所述试剂2中的链球菌溶血素O为天然抗原或重组抗原。

作用优选，所述聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为60-500 nm。

作为进一步优选，所述聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为100-200 nm。

作为优选，所述试剂2中蛋白胶乳颗粒复合物含量为1-10 mg/mL。

作为进一步优选，所述试剂2中蛋白胶乳颗粒复合物含量为1-5 mg/mL。

作为优选，通过化学交联制备所述组合蛋白的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或戊二醛中的一种。

蛋白胶乳颗粒复合物是先由组合蛋白上的氨基通过EDC和聚苯乙烯胶乳颗粒表面羧基反应形成化学交联，然后加入还原性物质进行反应制得。

所述还原性物质为亚硫酸钠、硫辛酸、硼氢化钾或硼氢化钠中的一种。

所述试剂1中Tris-HCl缓冲液的pH值为5.5-8.5，进一步优选为6.5-7.5。

本发明试剂盒中试剂1与试剂2的容积比为4︰1。

由于BSA稳定性好，SLO通过化学交联与BSA先结合，制得稳定性好的组合蛋白，再通过第二次化学交联把BSA标记到胶乳颗粒表面上。由于BSA蛋白分子量比SLO大，稳定性好。通过多个SLO蛋白分子和一个BSA通过化学交联组合，导致交联在BSA上的SLO的稳定性大大提高，再通过组合蛋白和胶乳颗粒的化学交联，形成SLO-BSA-胶乳颗粒复合物。

本发明以上所述SLO序列中含有多个半胱氨酸，半胱氨酸中的巯基易被氧化，导致SLO结构变化，降低试剂2稳定性。因此，在试剂2中加入还原剂可提高试剂2的稳定性。

本发明上述试剂盒除包括试剂1和试剂2外，还包括抗链球菌溶血素O检测试剂盒的校准品。所述校准品为添加抗链球菌溶血素O抗体的人血清或者类似血清基质的液体，并且过滤除菌。类似血清基质的液体即类似人血清基质的溶液，如50mg/mL BSA，150 mM NaCl和15 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。所述抗链球菌溶血素O检测试剂盒的校准品有5个浓度，分别为25 IU/mL，50 IU/mL，100 IU/mL，200 IU/mL和400 IU/mL。

本发明中的抗链球菌溶血素O抗体检测试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法（PETIA）测定血清中抗链球菌溶血素O抗体含量，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒，与样本中相应的抗原或抗体发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。进一步的，所述本发明中，样本中的抗链球菌溶血素O抗体与结合在胶乳颗粒表面的链球菌溶血素O抗原结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集，在570nm波长处测定反应吸光度，对照标准曲线可求出血清样本中抗链球菌溶血素O抗体的含量。

本发明的有益效果是：本发明抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确性高、稳定性好及生产成本低的优点。

本发明试剂盒中的试剂2制备过程中先通过化学交联把SLO固定在惰性蛋白BSA上，再通过化学交联把BSA-SLO组合蛋白标记在胶乳颗粒表面，这一技术提高了SLO的稳定性，从而提高了试剂2的稳定性，试剂2制备过程中加入了适量的还原剂，使SLO在试剂中保持还原状态，保护了SLO的结构和抗原性，进一步提高了试剂的稳定性。

本发明可以缩短试剂盒制备的时间，提高灵敏度的同时，还能提高试剂盒的开口稳定性。

附图说明

图1为本发明抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒实施例中校准曲线图。

图2为本发明抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒实施例中相关性实验数据图。

图3为本发明抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒实施例中开口稳定性实验数据图。

图4为本发明抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒实施例中热稳定性实验数据图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

实施例1

1、试剂2的配制：

用15mM PB，pH=7.4缓冲液，将SLO溶液稀释至2 mg/mL，加入到烧杯中，再等体积加入浓度为2 mg/mL 的BSA溶液，再加入100 mg/mL戊二醛水溶液，在闭口的烧杯中开始反应，戊二醛的终浓度为0.05 mg/mL，反应温度为15℃，时间为3小时，反应结束后，敞开盖子，4℃放置1小时，制得组合蛋白溶液，通过超滤，滤掉反应中多余的戊二醛。可以直接用于下一步反应或4℃储存备用。

用10 mM MES， pH 6.0 缓冲液稀释粒径为100-200 nm聚苯乙烯胶乳颗粒至4 mg/mL，再加入2 mg/mL的EDC溶液，使EDC在体系中的达200 μg/mL， 25℃反应1 h，反应结束后离心，去上清后，再入15 mM PB缓冲液，然后加入0.5 mL上述制备组合蛋白溶液，25℃反应3 h，反应结束后，再加入1M硼氢化钠溶液，使硼氢化钠终浓度为10 mM，25℃反应0.5 h，离心去上清，再加入20 mM Hepes，pH7.4溶液，再次离心去上清，使聚苯乙烯胶乳颗粒分散于含3 mg/mL BSA的Hepes（20 mM，pH 7.4）溶液中，4℃保存。

2、试剂1的配制：

试剂1为200 mM Tris-HCl，向该缓冲液中分别加入NaCl，EDTA, BSA，PEG6000和Proclin-300。各组分的终浓度分别为150 mM NaCl，15 mM EDTA，3 mg/mL BSA，8 mM PEG6000和1 mg/mL PC-300。向缓冲液里添加完各组分后，用HCl调节pH值到7.5。

3、抗链球菌溶血素O试剂盒校准品制备：

含高浓度抗链球菌溶血素O抗体（ASO）血清，用相应的类似人血清基质的溶液（1 mg/mL BSA，9 mg/mL NaCl，15 mM磷酸盐缓冲液 pH 7.5）进行稀释和过滤除菌，所述的ASO校准品中抗体含量分别控制在25 IU/mL，50 IU/mL，100 IU/mL，200 IU/mL和400 IU/mL，这些校准品均为微黄色液体。以进口的电化生研公司的ASO试剂盒对照，分别对制备的校准品进行测定和调整，调整合适后分别检测20次，求出平均值达到校准品所要求的五个梯度的浓度，分别为25 IU/mL，50 IU/mL， 100 IU/mL，200 IU/mL和400 IU/mL。

4、抗链球菌溶血素O抗体的检测方法：

ASO试剂测定方法是两点终点法，检测波长分别为主波长570 nm，副波长700 nm。试剂1和试剂2的用量分别为240 μl和60 μl。样本用量为3 μl；反应方向向上，测定温度为37℃。样本与试剂1混匀后，置37^oC孵育5分钟，之后加入试剂2，即开始读点，反应5 min后读取另一点。使用日立7060自动生化分析仪测得5种不同含量的ASO校准品的标准曲线（如图1所示），其中X轴为ASO校准品浓度IU/mL，Y轴为反应吸光度。

实施例2：

1、相关性实验

从市场上购买ASO检测试剂盒和本发明试剂盒在日立7060全自动生化分析仪上按照各自设定的上机参数，对50份新鲜人血清（血清取自医院）进行检测，对测定值进行相关性分析，结果如图2所示，回归方程为：y=0.9576x+4.0652，相关系数R²=0.996，结果表明本试剂与目前市场销售的试剂相关性好。

2、开口稳定性实验

从市场上购买ASO质控品（干粉），依说明书的要求，复溶分管后储存于-20^oC条件下，长期保存。对本发明试剂上机开口保存。进行30天开口稳定性检测实验。在第1天进行定标之后，不再进行重复定标。分别在第1、3、5、7、14、21、30天对质控品进行检测。检测结果如图3所示，本发明试剂测定随着天数的增加，测值偏差维持在5%之内。结果表明本试剂的开口至少能够稳定1个月，稳定性好。

3、热稳定性实验

从市场上购买ASO质控品（干粉），依说明书的要求，复溶分管后储存于-20^oC条件下，长期保存。第一天定标后，将本发明试剂闭口放置在37^oC烘箱中保存。进行10天加速破坏性实验。分别在第1、3、5、7、9、10天测定质控品。检测结果如图4所示，本发明试剂在前9天测定值偏差在5%之内，第10天测值超过5%。结果表明本发明试剂至少在37^oC环境中能保存9天。按照试剂保存在4^oC条件下估算，试剂至少能够稳定15个月。稳定性好。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims

1. 一种抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗体抗原特异性结合的反应液；所述试剂2由缓冲液和蛋白胶乳颗粒复合物组成；所述蛋白胶乳颗粒复合物为组合蛋白标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上形成的复合物；所述组合蛋白由链球菌溶血素O和惰性蛋白通过化学交联而成。

2. 根据权利要求1所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：试剂1由以下组分组成：100-400 mM Tris-HCl；5-10 mM聚乙二醇6000；1 mg/mL Proclin-300；1-20 mM乙二胺四乙酸钠；1-10 mg/mL BSA和150 mM氯化钠。

3. 根据权利要求1所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述惰性蛋白为牛血清白蛋白或酪蛋白中的一种。

4. 根据权利要求1所述的所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂2中的链球菌溶血素O为天然抗原或重组抗原。

5. 根据权利要求1所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：通过化学交联制备所述组合蛋白的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或戊二醛中的一种。

6. 根据权利要求1所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：蛋白胶乳颗粒复合物是先由组合蛋白上的氨基通过EDC和聚苯乙烯胶乳颗粒表面羧基反应形成化学交联，然后加入还原性物质进行反应制得。

7. 根据权利要求6所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述还原性物质为亚硫酸钠、硫辛酸、硼氢化钾或硼氢化钠中的一种。

8. 根据权利要求1所述的抗链球菌溶血素O抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂2中蛋白胶乳颗粒复合物含量为1-10 mg/mL。