CN105218377B - 一种羟基酪醇no供体衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羟基酪醇NO供体衍生物及其制备方法和应用，其用于制备在降血糖和血管内皮保护方面的药物。经过体内外药理实验证实，上述化合物具有以下药理活性：(1)清除活性氧自由基；(2)释放NO，舒张血管；(3)抑制葡萄糖苷酶活性，有一定的降血糖作用。体内药动学实验结果表明其能在体内迅速释放NO，使其达到较高的水平。本发明提供羟基酪醇NO供体衍生物的制备方法，通过4步有机合成即可得到改衍生物，具有原料易得，反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜的优点。该衍生物具有明显的降糖及血管舒张作用，可用于防治糖尿病及其血管并发症，具有较大的临床应用价值。
Description
技术领域：
本发明属于新药研发领域，具体涉及一种羟基酪醇NO供体衍生物及其制备方法和在降血糖和血管内皮保护方面的应用。
背景技术：
羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)化学名3,4-二羟基苯乙醇，是橄榄油中具有强抗氧化性的一种天然多酚类化合物，广泛存在于木犀科植物橄榄的果实和枝叶中，对多种活性氧具有消除作用，具有较强的抗氧化活性。除此之外，大量研究证实羟基酪醇还在预防心脑血管疾病、抗炎抗癌等方面有良好的作用。羟基酪醇因其特殊的生物和药理活性，已广泛应用于食品工业、营养保健和化妆品中。目前国外已经相继有羟基酪醇的胶囊和片剂问世。
一氧化氮(NO)供体型药物是在体内经酶或非酶作用释放NO。经典药物是***、硝普钠等单一结构直接释放NO，目前通过各种连接基团与已知药物或活性药效团与NO供体形成药物日趋受到关注。已证明：给予NO底物或外源性NO供体药物能明显改善血管病变中舒血管效应并延缓病变过程。美国Merck公司研究的已经进入Ⅱ期临床NO-供体型COX-2抑制剂，就是通过释放NO保护血管内皮细胞，而且还可以降低胃肠道粘膜刺激。目前作用于NO环节的NO供体药物是改善内皮功能有效方法之一。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种羟基酪醇NO供体衍生物及其制备方法，以及其在降低血糖、抗氧化应激和修复内皮功能障碍方面的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案来实现的：
一种羟基酪醇NO供体衍生物，其化学结构式为：
R为其中n＝1～6。
上述一种羟基酪醇NO供体衍生物的制备方法，包括：
当n＝1时，合成步骤如下：
1)3,4-二羟基苯甲醇经取代反应制得4-氯甲基-1,2-苯二酚；
2)4-氯甲基-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-氯甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-氯甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-硝酰氧基甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-硝酰氧基甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-硝酰氧基甲基)-1,2-苯二酚；
当n＝2时，合成步骤如下：
1)3,4-二羟基苯乙醇经取代反应制得4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚；
2)4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-(2-硝酰氧基乙基)-1,2-苯二酚；
当n＝3时，合成步骤如下：
1)3,4-二羟基苯丙醇经取代反应制得4-(3-氯丙基)-1,2-苯二酚；
2)4-(3-氯丙基)-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-(3-氯丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-(3-氯丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-(3-硝酰氧基丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-(3-硝酰氧基丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-(3-硝酰氧基丙基)-1,2-苯二酚；
当n＝4时，合成步骤如下：
1)3,4-二羟基苯丁醇经取代反应制得4-(4-氯丁基)-1,2-苯二酚；
2)4-(4-氯丁基)-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-(4-氯丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-(4-氯丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-(4-硝酰氧基丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-(4-硝酰氧基丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-(4-硝酰氧基丁基)-1,2-苯二酚；
当n＝5时，合成步骤如下：
1)3,4-二羟基苯戊醇经取代反应制得4-(5-氯戊基)-1,2-苯二酚；
2)4-(5-氯戊基)-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-(5-氯戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-(5-氯戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-(5-硝酰氧基戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-(5-硝酰氧基戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-(5-硝酰氧基戊基)-1,2-苯二酚；
当n＝6时，合成步骤如下：
1)经取代反应制得4-(6-氯己基)-1,2-苯二酚；
2)4-(6-氯己基)-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-(6-氯己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-(6-氯己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-(6-硝酰氧基己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-(6-硝酰氧基己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-(6-硝酰氧基己基)-1,2-苯二酚。
上述一种羟基酪醇NO供体衍生物的应用，在制备预防和治疗糖尿病血管并发症的药物中的应用。
本发明进一步的改进在于：作为抗氧化剂的应用。
本发明进一步的改进在于：在制备血管扩张药物中的应用。
本发明进一步的改进在于：在制备用于血管内皮保护药物中的应用。
本发明进一步的改进在于：在制备降血糖药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点：
本发明是以天然多酚类化合物羟基酪醇为母核，在其4位侧链上引入不同长度的碳链，合成一系列羟基酪醇NO供体衍生物。通过4步有机合成即可得，具有原料易得，反应条件温和，反应过程操作简单，所用试剂便宜的优点。本发明经过体内外药理实验证实，上述化合物具有以下药理活性：(1)清除活性氧自由基；(2)释放NO，舒张血管；(3)抑制葡萄糖苷酶活性，有一定的降血糖作用。体内药动学实验结果表明其能在体内迅速释放NO，使其达到较高的水平。
本发明提供的羟基酪醇NO供体衍生物有良好的降血糖及血管舒张作用，可用于防治糖尿病及其血管并发症，具有较大的临床应用价值。
附图说明：
图1为4-(2-硝酰氧基甲基)-1,2-苯二酚的合成路线图；
图中标注的具体为：
(a)CCl4，PPh3，MeCN；(b)Ph2CCl2，PhMe；(c)AgNO3，MeCN；(d)AcOH：H2O(4:1)。
图2为4-(2-硝酰氧基乙基)-1,2-苯二酚的合成路线图；
图中标注的具体为：
(a)CCl4，PPh3，MeCN；(b)Ph2CCl2，PhMe；(c)AgNO3，MeCN；(d)AcOH：H2O(4:1)。
图3为4-(2-硝酰氧基丙基)-1,2-苯二酚的合成路线图；
图中标注的具体为：
(a)CCl4，PPh3，MeCN；(b)Ph2CCl2，PhMe；(c)AgNO3，MeCN；(d)AcOH：H2O(4:1)。
图4为4-(2-硝酰氧基丁基)-1,2-苯二酚的合成路线图；
图中标注的具体为：
(a)CCl4，PPh3，MeCN；(b)Ph2CCl2，PhMe；(c)AgNO3，MeCN；(d)AcOH：H2O(4:1)。
图5为4-(2-硝酰氧基戊基)-1,2-苯二酚的合成路线图；
图中标注的具体为：
(a)CCl4，PPh3，MeCN；(b)Ph2CCl2，PhMe；(c)AgNO3，MeCN；(d)AcOH：H2O(4:1)。
图6为4-(2-硝酰氧基己基)-1,2-苯二酚的合成路线图；
图中标注的具体为：
(a)CCl4，PPh3，MeCN；(b)Ph2CCl2，PhMe；(c)AgNO3，MeCN；(d)AcOH：H2O(4:1)。
图7为HT-NO体外NO释放曲线。
图8为HT-NO对大鼠胸主动脉环舒张活性的影响。
图9为HT-NO对人脐静脉内皮细胞活性的影响。
图10为HT-NO对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞活性的影响。
图11为HT-NO对人脐静脉内皮细胞NO水平的影响。
图12为HT-NO对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞NO水平的影响。
图13-1为HT在-20℃条件下加入1％抗坏血酸冻存一周的浓度变化曲线。
图13-2为HT-NO在-20℃条件下加入1％抗坏血酸冻存一周的浓度变化曲线。
图14为大鼠灌胃HT的血药浓度-时间曲线。
图15为大鼠灌胃HT-NO的血药浓度-时间曲线。
图16为大鼠灌胃HT-NO后HT的血药浓度-时间曲线。
图17为大鼠灌胃HT-NO、HT和生理盐水24h内血浆中NO水平变化曲线。
具体实施方式：
下面用过实施例来对本发明作进一步说明，应当指出的是这些实施例仅用于对本发明进行举例说明，不应理解为对本发明的限制。
HT-NO的合成步骤：
实施例1
4-氯甲基-1,2-苯二酚的合成
将3,4-二羟基苯甲醇溶解于25mL无水乙腈中，依次加入三苯基磷、四氯化碳，氮气保护，室温搅拌10h，待反应完全后，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-氯甲基-1,2-苯二酚；
5-氯甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将4-氯甲基-1,2-苯二酚溶解于甲苯中，加入二氯二苯甲烷，氮气保护，回流搅拌24h，待反应完全后，冷却至室温，反应体系用H2O(50mL)洗涤，水相用甲苯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-氯甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
5-硝酰氧基甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将5-氯甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯溶解于25mL无水乙腈中，加入硝酸银(2.50g)，氮气保护下，避光，57℃下搅拌至反应完全，加入NaCl溶液室温搅拌1h，过滤出去固体，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-硝酰氧基甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4-硝酰氧基甲基-1,2-苯二酚的合成
将5-硝酰氧基甲基-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯加入到AcOH/H2O(20mL/5mL)的混合溶液中，氮气保护下，回流搅拌4-5h，待反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)和H2O(50mL)，有机相用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-硝酰氧基甲基-1,2-苯二酚。
实施例2
4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚的合成
将3,4-二羟基苯乙醇溶解于25mL无水乙腈中，依次加入三苯基磷、四氯化碳，氮气保护，室温搅拌10h，待反应完全后，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚；
5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚溶解于甲苯中，加入二氯二苯甲烷，氮气保护，回流搅拌24h，待反应完全后，冷却至室温，反应体系用H2O(50mL)洗涤，水相用甲苯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯溶解于25mL无水乙腈中，加入硝酸银(2.50g)，氮气保护下，避光，57℃下搅拌至反应完全，加入NaCl溶液室温搅拌1h，过滤出去固体，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4-(2-硝酰氧基乙基)-1,2-苯二酚的合成：
将5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯加入到AcOH/H2O(20mL/5mL)的混合溶液中，氮气保护下，回流搅拌4-5h，但反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)和H2O(50mL)，有机相用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(2-硝酰氧基乙基)-1,2-苯二酚。
实施例3
4-(3-氯丙基)-1,2-苯二酚的合成
将3,4-二羟基苯丙醇溶解于25mL无水乙腈中，依次加入三苯基磷、四氯化碳，氮气保护，室温搅拌10h，待反应完全后，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(3-氯丙基)-1,2-苯二酚；
5-(3-氯丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将4-(3-氯丙基)-1,2-苯二酚溶解于甲苯中，加入二氯二苯甲烷，氮气保护，回流搅拌24h，待反应完全后，冷却至室温，反应体系用H2O(50mL)洗涤，水相用甲苯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(3-氯丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
5-(3-硝酰氧基丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将5-(3-氯丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯溶解于25mL无水乙腈中，加入硝酸银(2.50g)，氮气保护下，避光，57℃下搅拌至反应完全，加入NaCl溶液室温搅拌1h，过滤出去固体，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(3-硝酰氧基丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4-(3-硝酰氧基丙基)-1,2-苯二酚的合成：
将5-(3-硝酰氧基丙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯加入到AcOH/H2O(20mL/5mL)的混合溶液中，氮气保护下，回流搅拌4-5h，但反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)和H2O(50mL)，有机相用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(3-硝酰氧基丙基)-1,2-苯二酚。
实施例4
4-(4-氯丁基)-1,2-苯二酚的合成
将3,4-二羟基苯丁醇溶解于25mL无水乙腈中，依次加入三苯基磷、四氯化碳，氮气保护，室温搅拌10h，待反应完全后，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(4-氯丁基)-1,2-苯二酚；
5-(4-氯丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将4-(4-氯丁基)-1,2-苯二酚溶解于甲苯中，加入二氯二苯甲烷，氮气保护，回流搅拌24h，待反应完全后，冷却至室温，反应体系用H2O(50mL)洗涤，水相用甲苯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(4-氯丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
5-(4-硝酰氧基丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将5-(4-氯丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯溶解于25mL无水乙腈中，加入硝酸银(2.50g)，氮气保护下，避光，57℃下搅拌至反应完全，加入NaCl溶液室温搅拌1h，过滤出去固体，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(4-硝酰氧基丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4-(4-硝酰氧基丁基)-1,2-苯二酚的合成：
将5-(4-硝酰氧基丁基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯加入到AcOH/H2O(20mL/5mL)的混合溶液中，氮气保护下，回流搅拌4-5h，但反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)和H2O(50mL)，有机相用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(4-硝酰氧基丁基)-1,2-苯二酚。
实施例5
4-(5-氯戊基)-1,2-苯二酚的合成
将3,4-二羟基苯戊醇溶解于25mL无水乙腈中，依次加入三苯基磷、四氯化碳，氮气保护，室温搅拌10h，待反应完全后，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(5-氯戊基)-1,2-苯二酚；
5-(5-氯戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将4-(5-氯戊基)-1,2-苯二酚溶解于甲苯中，加入二氯二苯甲烷，氮气保护，回流搅拌24h，待反应完全后，冷却至室温，反应体系用H2O(50mL)洗涤，水相用甲苯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(5-氯戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
5-(5-硝酰氧基戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将5-(5-氯戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯溶解于25mL无水乙腈中，加入硝酸银(2.50g)，氮气保护下，避光，57℃下搅拌至反应完全，加入NaCl溶液室温搅拌1h，过滤出去固体，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(5-硝酰氧基戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4-(5-硝酰氧基戊基)-1,2-苯二酚的合成：
将5-(5-硝酰氧基戊基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯加入到AcOH/H2O(20mL/5mL)的混合溶液中，氮气保护下，回流搅拌4-5h，但反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)和H2O(50mL)，有机相用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(5-硝酰氧基戊基)-1,2-苯二酚。
实施例6
4-(6-氯己基)-1,2-苯二酚的合成
将3,4-二羟基苯己醇溶解于25mL无水乙腈中，依次加入三苯基磷、四氯化碳，氮气保护，室温搅拌10h，待反应完全后，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(6-氯己基)-1,2-苯二酚；
5-(6-氯己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将4-(6-氯己基)-1,2-苯二酚溶解于甲苯中，加入二氯二苯甲烷，氮气保护，回流搅拌24h，待反应完全后，冷却至室温，反应体系用H2O(50mL)洗涤，水相用甲苯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(6-氯己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
5-(6-硝酰氧基己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯的合成
将5-(6-氯己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯溶解于25mL无水乙腈中，加入硝酸银(2.50g)，氮气保护下，避光，57℃下搅拌至反应完全，加入NaCl溶液室温搅拌1h，过滤出去固体，减压除去乙腈溶剂，加入H2O(20mL)，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得5-(6-硝酰氧基己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4-(6-硝酰氧基己基)-1,2-苯二酚的合成：
将5-(6-硝酰氧基己基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯加入到AcOH/H2O(20mL/5mL)的混合溶液中，氮气保护下，回流搅拌4-5h，但反应完全后，冷却至室温，加入乙酸乙酯(50mL)和H2O(50mL)，有机相用碳酸氢钠饱和溶液(20mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得黄色油状物。柱层析分离得4-(6-硝酰氧基己基)-1,2-苯二酚。
实施例7
HT-NO抗氧化活性实验
采用清除自由基法([DPPH·]法)，对4-(2-硝酰氧基乙基)-1,2-苯二酚(以下简写为HT-NO)的抗氧化活性经行测试。
1材料与方法
1.1实验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料：
试剂：
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl[DPPH·](上海宝曼生物科技有限公司)；无水乙醇(天津天力化学试剂有限公司)；
主要仪器：752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；WH-2微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；
1.2实验方法
待检测样品的制备：
1)[DPPH·]与样品组(Ai)：在10mL的具缘试管中加入2mL浓度为0.08mg/mL[DPPH·]乙醇溶液，分别加入2mL不同浓度的待测样品(HT-NO)和阳性对照(0.1mg/mL抗坏血酸)；
2)[DPPH·]与溶剂组(Ao)：在10mL的具缘试管中加入2mL浓度为0.08mg/mL[DPPH·]乙醇溶液和2mL无水乙醇；
3)样品与溶剂组(Aj)：在10mL的具缘试管中加入2mL无水乙醇，分别加入2mL不同浓度的待测样品(HT-NO)和阳性对照(0.1mg/mL抗坏血酸)；
待检测样品加样完毕后，摇匀，室温静置30min，在517nm波长时检测吸光值。按照下式计算自由基清除率。
[DPPH·]自由基清除率S％＝[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％。
1.3实验结果
使用SPSS拟合曲线并计算IC50，得HT-NO对[DPPH·]半数清除率IC50为3.28×10- 5mol·L-1，抗坏血酸对[DPPH·]半数清除率IC50为6.95×10-5mol·L-1。结果显示，HT-NO具有良好的自由基清除能力。结果如表1，表2
表1[DPPH·]法测定HT-NO的抗氧化活性结果(％)
表2[DPPH·]法测定抗坏血酸的抗氧化活性结果(％)
实施例8
HT-NO体外NO释放活性实验
采用Griess法对HT-NO的体外NO释放活性经行测试。
1材料与方法
1.1实验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料：
试剂：无水对氨基苯磺酸纳(天津市福晨化学试剂厂)；N-1-萘乙二胺盐酸盐(天津傲然精细化工研究所)；亚硝酸钠(天津市福晨化学试剂厂)；L-半胱氨酸(天津市福晨化学试剂厂)；磷酸二氢钾(广东光华科技股份有限公司)；氢氧化钠(天津市河东区红岩试剂厂)；磷酸(西安化学试剂厂)。
主要仪器：752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司制造)；WH-2微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司制造)；
1.2实验方法
(1)NO释放标准曲线的绘制：磷酸盐缓冲溶液2.5mL，甲醇2.5mL，等体积混合，再加入不同浓度的NaNO2 -和50μL的0.1mol/L的L-半胱氨酸溶液，混匀后加入Griess试剂，混匀静置10min，于540nm下测定其吸光度。使用SPSS拟合标准曲线，并通过曲线拟合获得标准曲线方程。
(2)HT-NO的体外NO释放测定：磷酸盐缓冲溶液2.5mL，甲醇2.5mL，等体积混合，在加入不同浓度的HT-NO和50μL的0.1mol/L的L-半胱氨酸溶液，混匀后加入Griess试剂，混匀静置10min，于540nm下测定其吸光度。使用SPSS拟合曲线，并由标准曲线方程求出相应的NO2 -的浓度，硝普钠及羟基酪醇衍生物释放NO效率＝NO释放浓度与初始反应液中0.1mM衍生物含有NO的摩尔数的比值。
1.3实验结果
结果显示HT-NO能在体外释放出一定浓度的NO。结果如图7
实施例9
HT-NO对血管内皮舒张功能的影响实验
1材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
硝普钠，SD大鼠，计算机生物信号记录分析***，张力换能器，离体组织器官恒温灌流***。
1.2实验方法
颈椎脱臼处死大鼠，迅速取出主动脉，置于通有混合气体的4℃台氏液中，剔除血管外壁的脂肪和***。将血管条截成小段，每段2～3mm左右；取一段血管条，穿过固定的小棒，再用小钩将血管挂起，小钩用细棉线连至传感器。最后将血管浸泡于装有台氏液、通有混合气体并保持37℃恒温的反应池中。通过软件，监控血管条的拉力状态，将平衡状态的拉力调整至0.8g左右；平衡1h，每15min换台氏液1次。用60mmol的KCl刺激3次，待血管收缩到最强并稳定时，加入不同浓度的HT-NO，以生理盐水作为对照，以加入药物15min后的血管张力幅度与KCl诱发的血管环的最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。
1.3实验结果
结果显示HT-NO可以抑制KCl对血管环引起的收缩作用。结果如图8
实施例10
HT-NO对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞活性的影响实验
材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
DMEM培养基干粉(Gibco，USA)，胎牛血清(FBS)(Gibco，USA)，胰酶(Trypsin)(Beyotime)，MTT(Sigma)，葡萄糖(Sigma)，人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)，酶标仪(ThermoScientific)
1.2实验方法
1.2.1细胞培养：以含10％FBS的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养液培养HUVECs细胞，每1-2天传代1次。
1.2.2将HUVECs细胞以5000-6000个/孔为单位接种于96孔板，分为空白对照组，高糖组和给药组。模型组给予55mM的葡萄糖溶液，给药组给予不同浓度的HT-NO(12.5、25、50、100、200μM)和55mM的高糖共同孵育48h。孵育结束后，每孔加入20μL MTT，孵育4h，用DMSO溶解后在酶标仪492nm波长下测定吸光度(A)。按下列方法计算细胞活性(％)：细胞活性(％)＝(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％，计算相应的细胞活性。
1.3实验结果
结果显示单独给予HT-NO作用内皮细胞，可以在一定浓度范围内促进细胞增殖，如图9；而给予内皮细胞高糖刺激后，细胞活性明显降低，给予HT-NO可以对高糖诱导的细胞损伤起到一定的保护作用，如图10。
实施例11
HT-NO对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞NO水平的影响实验
材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
DMEM培养基干粉(Gibco，USA)，胎牛血清(FBS)(Gibco，USA)，胰酶(Trypsin)(Beyotime)，MTT(Sigma)，葡萄糖(Sigma)，人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)，酶标仪(ThermoScientific)
1.2实验方法
1.2.1细胞培养：以含10％FBS的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培养液培养HUVECs细胞，每1-2天传代1次。
1.2.2将HUVECs细胞以5000-6000个/孔为单位接种于96孔板，分为空白对照组，高糖组和给药组。模型组给予55mM的葡萄糖溶液，给药组给予不同浓度的HT-NO(12.5、25、50、100、200μM)和55mM的高糖共同孵育48h。孵育结束后，收集细胞上清液，用NO检测试剂盒在酶标仪550nm波长下测定吸光度(A)。按检测试剂盒说明书计算相应的NO浓度。
1.3实验结果
结果显示单独给予HT-NO作用内皮细胞，可以在一定浓度范围内促进细胞上清液中NO的释放，如图11；而给予内皮细胞高糖刺激后，细胞上清液中NO含量降低，给予HT-NO可以升高高糖诱导的细胞上清液中NO的水平，如图12。
实施例12
HT-NO的体外糖苷酶抑制活性实验
1材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
阿卡波糖(德国拜耳公司，50mg/片，市售)，葡萄糖检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，α-葡萄糖苷酶(Sigma)，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-PNPG)(Sigma)，752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司制造)
1.2实验方法
1.2.1对酵母α-葡萄糖苷酶抑制
(1)配制α-PNPG溶液配制；α-葡萄糖苷酶溶液10U/mL；NaCO3溶液1mol/L；不同浓度的目标化合物待测液(用体积比为1:9的DMSO-磷酸盐缓冲液溶解)。
(2)取α-葡萄糖苷酶溶液10μL，在37℃水浴中孵育10min，分别加入不同浓度的待测溶液50μL，混匀后继续保温10min，再加入α-PNPG溶液20μL，混匀后保温15min，加入NaCO3溶液50μL终止反应。设立空白对照(不含酶和样品)和阴性对照组(不含样品)，阿卡波糖为阳性对照。在405nm处检测溶液吸光度，按下列方法计算抑制率(％)：抑制率(％)＝(A阴性对照-A样品)/(A阴性对照-A空白对照)×100％，计算相应的半数抑制浓度(IC50)。
1.2.2对大鼠小肠粘膜α-糖苷酶抑制
(1)大鼠小肠粘膜酶液的制备：大鼠禁食不禁水12h后脱颈椎处死，取出小肠，用冷生理盐水冲洗肠腔，将洗净的小肠置于冰台上，刮取小肠粘膜，称重。加入5倍量的4℃的磷酸盐缓冲液，于冰浴中匀浆，然后5000r/min离心20min，取上清。
(2)取酶液10μL，于37℃水浴中孵育15min后，加入不同浓度的抑制剂50μL，继续保温30min，再加入50mmol/L的麦芽糖20μL，在37℃水浴中反应60min后，取出置于沸水浴中终止反应；同时做空白对照(不加抑制剂)，阿卡波糖为阳性对照。取反应液10μ于EP管中，再加入葡萄糖试剂盒中A试液500μL、B试液500μL混匀，37℃保温15min后，于505nm下测定其吸光度。按下列方法计算抑制率(％)：抑制率(％)＝(A空白对照-A样品)/A空白对照×100％，计算相应的半数抑制浓度(IC50)。
1.3实验结果
结果显示制备的化合物可抑制酵母α-葡萄糖苷酶以及大鼠小肠粘膜α-糖苷酶。结果如表3
表3 HT-NO对α-糖苷酶的抑制作用IC50(μM)
实施例13
HT-NO对STZ诱导的糖尿病小鼠血糖的影响实验
材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
试剂：STZ(Sigma)，二甲双胍原料药(东京化成工业株式会社)，羟基酪醇(陕西应化生物技术有限公司)，三诺安稳血糖仪及血糖试纸条(三诺生物传感股份有限公司)
实验动物：昆明小鼠，体质量25-30g，由西安交通大学动物实验中心提供。
1.2实验方法
1.2.1糖尿病小鼠模型建立
将购买的50只小鼠适应性喂养3天之后，从中随机抽取8只做为正常对照组，给予正常饲料喂养，其余42禁食过夜，然后给实验小鼠腹腔部位注射一定量的STZ柠檬酸-柠檬酸钠(160mg·kg-1)。相同剂量体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液亦给予正常对照组的小鼠注射。注射后的第5天所有小鼠均禁食，造模的小鼠尾静脉取血测量其空腹血糖，以小鼠空腹血糖值≥16.7mmol·L-1为糖尿病实验小鼠模型成功的标准。
1.2.2实验动物分组以及给药
将造模成功的小鼠随机分为：模型组、二甲双胍组(250mg·kg-1)、羟基酪醇组(77mg·kg-1)和HT-NO组(100mg·kg-1)，每组小鼠8只。连续灌胃4周，正常组及模型组给予同等体积的生理盐水灌胃。每日观察小鼠的外观情况，同时记录各组饮水量和饮食量。
1.3实验结果
灌胃给药4周后，与模型组相比，二甲双胍组，羟基酪醇组以及HT-NO组的糖尿病小鼠的空腹血糖均有显著性降低(P＜0.05)，与羟基酪醇组相比，HT-NO组降血糖效果更好，结果如表4。
表4 HT-NO对糖尿病小鼠血糖的影响
注：与模型对照组比较：*P＜0.05
实施例14
羟基酪醇及HT-NO在大鼠体内的药动学研究
材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
药品与试剂：HT(HPLC级纯度≥98％)，西安应化生物科技有限公司；HT-NO(HPLC级纯度≥95％)，本课题小组合成；槲皮素(HPLC级纯度≥99.3％)，上海永野生物科技公司；甲醇(色谱级)，天津科密欧化学试剂公司；乙酸乙酯(分析级)，天津天力化学试剂公司；甲酸，广东光华化学试剂公司；超纯水，TTL-30超纯水***获得。
主要仪器：Agilent 1200系列高效液相色谱仪，上海WoWorkers ScientificInstrumen；API3200质谱仪，美国AB SCIEX,Foster City,CA公司；N-EVAP112型恒温水浴氮气吹干仪，美国Organomation公司；WH-2微型涡旋混匀器，上海沪西分析仪器公司；TTL-30超纯水***，北京同泰科技仪器有限公司；GENIUS 16K-R低温高速离心机，长沙鑫奥仪器仪表有限公司。
实验动物：雄性SD大鼠，体质量250-300g，由西安交通大学动物实验中心提供。
1.2实验方法：
(1)建立大鼠血浆中羟基酪醇及HT-NO的LC-MS/MS测定法，并进行方法学验证；
(2)将此方法应用于灌胃羟基酪醇及HT-NO在大鼠体内的药动学研究。
1.3实验结果：
(1)方法学验证
①线性和灵敏度：羟基酪醇血浆浓度线性范围0.00799-1.642μg·mL-1，线性关系良好(r＝0.9984)，最低检测限(LLOQ)为0.002μg·mL-1；HT-NO血浆浓度线性范围0.00768-1.536μg·mL-1，线性关系良好(r＝0.9990)，最低检测限(LLOQ)为0.002μg·mL-1；
②准确性和精密度：羟基酪醇日内和日间精密度RSD分别为2.30-3.88％、2.34-5.32％，日内和日间准确性分别为93.85-98.28％、87.35-98.41％；羟基酪醇NO衍生物日内和日间精密度RSD分别为2.84-4.69％、3.14-6.15％，日内和日间准确性分别为90.12-98.44％、85.77-98.86％；
③提取回收率：羟基酪醇提取回收率87.17-97.94％，羟基酪醇NO衍生物提取回收率为86.40-101.14％。
④稳定性：研究表明，羟基酪醇及HT-NO稳定性较差，但是加入10μL1％抗坏血酸能够显著提高羟基酪醇及其NO衍生物的稳定性。0.799μg·mL-1羟基酪醇血浆标准品和0.752μg·mL-1HT-NO血浆标准品在-20℃冻存一周的稳定性如图13-1、13-2所示。
(2)药动学参数
①灌胃给药羟基酪醇
采用3P97药动软件对血药浓度结果采用一室模型计算药动学参数。灌胃羟基酪醇的药动学参数结果见表5。羟基酪醇平均血药浓度-时间曲线见图14。
表5灌胃给药HT后血浆中的药动学参数(n＝5)
②灌胃给药羟基酪醇NO衍生物
采用3P97药动软件对HT-NO血药浓度结果采用二室模型计算药动学参数，对给药HT-NO后的羟基酪醇血药浓度结果采用一室模型计算药动学参数。灌胃HT-NO后其药动学参数结果见表6，平均血药浓度-时间曲线见图15；灌胃HT-NO后羟基酪醇药动学参数结果见表7，平均血药浓度-时间曲线见图16；
表6灌胃给药HT-NO后HT-NO在血浆中的药动学参数(n＝5)
表7灌胃给药HT-NO后HT在血浆中的药动学参数(n＝5)
1.4实验结论
(1)该法简便，灵敏，重复性好，可应用于测定血浆中羟基酪醇和HT-NO的含量并应用于灌胃羟基酪醇及HT-NO在大鼠体内的药物动力学研究。
(2)HT-NO能够在体内快速代谢释放出羟基酪醇发挥其药理和生理作用。
实施例15
羟基酪醇及HT-NO在大鼠体内的NO释放评价
材料与方法
1.1试验药物
实施例2制备所得化合物
实验材料
试剂：NO试剂盒，南京建成生物工程研究所，货号：A012。
主要仪器：酶标仪；WH-2微型涡旋混匀器，上海沪西分析仪器公司；GENIUS 16K-R低温高速离心机，长沙鑫奥仪器仪表有限公司；DK98-1恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司。
实验动物：雄性SD大鼠，体质量250-300g，由西安交通大学动物实验中心提供。
1.2实验方法
大鼠分别灌胃羟基酪醇及HT-NO后，按照药动学研究的时间点取大鼠动脉血离心得血浆，评价大鼠血浆中24h内活性NO的动态水平。采用硝酸酶还原法测定大鼠血浆中的NO2-、NO3-，按试剂盒说明书进行操作(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)，利用酶标仪进行测定，测定波长为550nm。
1.3实验结果
分别灌胃给药50mg·kg-1的羟基酪醇和65mg·kg-1的HT-NO后，大鼠血中24h内NO的动态水平见图17。
1.4实验结论
(1)HT-NO在大鼠体内能够迅速释放NO，使其达到较高的水平。
(2)给药羟基酪醇后大鼠体内NO水平较给药生理盐水高，这是由于羟基酪醇可以增加NO的合成。
Claims (6)
1.一种羟基酪醇NO供体衍生物，其特征在于，其化学结构式为：
R为其中n＝2。
2.权利要求1所述的一种羟基酪醇NO供体衍生物的制备方法，其特征在于：
合成步骤如下：
1)3,4-二羟基苯乙醇经取代反应制得4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚；
2)4-(2-氯乙基)-1,2-苯二酚与二氯二苯甲烷反应制得5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
3)5-(2-氯乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯与硝酸银发生亲核取代反应制得5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯；
4)5-(2-硝酰氧基乙基)-2,2-二苯基苯并[1,3]二氧杂环戊烯经过酸性水解制得4-(2-硝酰氧基乙基)-1,2-苯二酚。
3.权利要求1所述的一种羟基酪醇NO供体衍生物的应用，其特征在于：在制备预防和治疗糖尿病血管并发症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种羟基酪醇NO供体衍生物的应用，其特征在于：在制备血管扩张药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的一种羟基酪醇NO供体衍生物的应用，其特征在于：在制备用于血管内皮保护药物中的应用。
6.根据权利要求3所述的一种羟基酪醇NO供体衍生物的应用，其特征在于：在制备降血糖药物中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |