CN105287511B - 土甘草a的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土甘草A作为治疗糖尿病药物制剂的应用。通过体外清除自由基实验，证明本发明的土甘草A对1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼自由基和ABTS自由基均有明显的清除作用IC50分别为1mg/ml和0.5mg/ml，具有与2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚相似的抗氧化能力。同时对α‑葡萄糖苷酶活性具有较好的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种土甘草A的应用。
背景技术
糖尿病是一种糖、蛋白以及脂肪的代谢障碍性疾病，它的病因及发病机制尚未完全阐明，主要是因为胰岛素的分泌或者生产异常，临床上表现为多饮、多尿、多食、消瘦等。研究表明，α-葡萄糖苷酶的抑制剂能抑制小肠上段α-葡萄糖苷酶的活性，可阻断碳水化合物分解成单个葡萄糖，从而达到控制餐后血糖过高的目的。此外，糖尿病患者体内的氧化应激性比正常人高，氧化应激的产生由于糖的氧化及糖与蛋白反应而来，这一过程使得氧自由基增加及清除自由基能力的降低。以中药为主的传统天然药物以毒副作用低，多靶点作用为特征，可以有效的治疗糖尿病。
本课题组分离提纯的土甘草A，来源于两粤黄檀(Dalbergia benthami Prain)中，在植物中的含量高达3.5％，属香豆素类化合物。香豆素类化合物一般都具有很好的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等。本发明通过体外药理实验发现该化合物不仅对DPPH、ABTS自由基具有较强的清除能力，还对α-葡萄糖苷酶具有很好的抑制活性，具有发展成为治疗糖尿病等疾病药物的良好应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种土甘草A用于制备α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，取代了西药作为α-葡萄糖苷酶活性抑制剂，毒副作用小。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种土甘草A在制备α-葡萄糖苷酶活性抑制剂中的应用。
优选的是，所述α-葡萄糖苷酶活性抑制剂在治疗糖尿病的药物制剂的应用。
优选的是，所述药物制剂包括有效量的土甘草A和药学上可接受的辅料组成。
优选的是，所述药物制剂为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
本发明还提供了一种土甘草A在制备治疗糖尿病的抗氧化剂中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
1.通过体外清除自由基实验，证明本发明的土甘草A对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和ABTS自由基均有明显的清除作用IC50分别为1mg/ml和0.5mg/ml，具有与2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)相似的抗氧化能力。
2.通过体外α-葡萄糖苷酶的抑制实验，证明了本发明的土甘草A对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性，对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值为17mg/ml。
以上实验结果表明，本发明的土甘草A有望用于治疗糖尿病等以α-葡萄糖苷酶和氧化应激为靶点的相关疾病，该药物可以制成药学上的常见剂型，包括制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为土甘草A(PRA)及人工合成抗氧化剂BHT对DPPH自由基清除活性；
图2为土甘草A(PRA)及人工合成抗氧化剂BHT对ABTS自由基清除活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
土甘草A的结构式为：其化学名称为：3-(对甲氧苯基)-4-羟基-5-甲氧基-2’-2’-二甲基-6,7-二氢吡喃香豆素；所述土甘草A的分子式为：C20H20O6；所述土甘草A的相对分子量为：380。
土甘草A的提取方法包括：
1)取两粤黄檀粗粉10.0kg，用10倍量80％乙醇渗漉提取，合并提取液，蒸发溶剂后得到提取物浸膏；
2)将提取物浸膏加水悬浮，然后向悬浮液加入石油醚萃取并分离石油醚部位浸膏，再向悬浮液中加入乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯部位浸膏；
3)取乙酸乙酯部位浸膏30g，反复用硅胶柱色谱分离，得到无色透明颗粒状结晶化合物，即为目标产物土甘草A。该硅胶柱色谱分离的做法可以根据以下操作：先以氯仿-丙酮梯度洗脱(氯仿→80∶1→50∶1→30∶1→15∶1→7∶1→3∶1→丙酮)，共收集358流份，用TLC检识合并，合并相同流分，共得到14个组分(A、B、C、D、E、F、G、H、I、G、K、L、M、N)；其中，I组分为白色粉末状，然后取300mg组分I，以石油醚-丙酮梯度洗脱(15∶1→7∶1→3:1)，共收集103流份，用TLC检识合并，合并相同流分，得到的组分在石油醚-丙酮(7∶1)洗脱部位，得到无色透明颗粒状结晶化合物80.55mg，该无色透明颗粒状结晶化合物为土甘草A。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
将土甘草A与淀粉浆按质量比为1：1混合，通过80目筛，混匀，加入10％淀粉浆，过14目筛制粒，在52℃下干燥至水分含量低于1％，干粒通过16目筛整粒。将制备的干粒加入3％硬脂酸镁混匀，压片，控制每片重量为0.2g，即得土甘草A的片剂。
实施例2
将土甘草A干燥成粉状，将土甘草A与淀粉按质量比2：1混匀，加入总重量0.5％的硬脂酸镁，用硬质胶囊填充，控制填充量在0.2-0.3g，即得土甘草A的胶囊剂。
实施例3
将土甘草A与氯化钠按质量比为60:40混合，溶解于注射用水中，过滤得溶液，在无菌条件下灌装入安瓶，即得注射剂。
实验研究
1.土甘草A(PRA)体外抗氧化能力的测定
1.1 DPPH体系抗氧化实验
方法：取0.10mL土甘草A(0.5-2.0mg.mL-1)加入4mL DPPH(质量分数0.002％)溶液中，室温25℃放置20min，以不加提取液的DPPH为空白对照(A0)，以相同浓度BHT为阳性对照，在最大波长处(517nm)测吸光度，实验平行进行三次。
根据下列公式计算各种提取液对DPPH自由基的清除率：
清除率SC(％)＝(1－A1/A0)×100％
式中，A1为加药液后DPPH溶液的吸光度；A0为未加提取液时DPPH溶液的吸光度。
如图1所示，各浓度土甘草A对DPPH自由基均有清除作用，并且自由基清除能力与提取物浓度成正比，其清除IC50为1mg/mL，由此可知土甘草A对DPPH自由基的清除效果显著，且为中药成分，毒副作用小。
1.2清除ABTS自由基的能力测定
方法：用蒸馏水将ABTS自由基配制成7mmol/L准备液，取5mL和88uL 140mmol/L过硫酸钾固体混合，室温避光放置2天，形成ABTS·+储备液。将该储备液用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，使其在732nm下吸光度为(0.70±0.05)。将15uL土甘草A药液(0.5-2.0mg.mL-1)与3.2mL ABTS·+溶液混合，以PBS溶液作为参比，并以相同浓度BHT为阳性对照，在室温下放置3min后测其吸光度，实验平行进行三次。
清除率计算公式如下：SC％＝[(Acontrol－Atest)/Acontrol)]×100％。其中，Acontrol＝不加药液的ABTS·+的吸光度。
如图2所示，土甘草A各浓度对ABTS·+均有较好清除能力，自由基清除能力(SC％)与提取物浓度成正比，其清除IC50为0.5mg/mL，由此可知土甘草A对ABTS自由基的清除效果显著，且为中药成分，毒副作用小。
2.土甘草A体外α-葡萄糖苷酶活性的测定
2.1实验材料
所有测试都是用Microplate reader ELX808TM型酶标仪(美国BioTek公司)，在37℃条件下测定。数据分析软件使用Origin软件进行数据处理，使用阿卡波糖作为对照品。
2.2实验方法
(1)抑制剂储备液的配制：所测试的抑制剂配成含10mmol/L的土甘草A的DMSO溶液。
(2)酶储备液的配制：α-葡萄糖苷酶购自美国Sigma公司；用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液分别配成1mg/mL。
(3)底物储备液的配制：对硝基苯葡萄糖苷(PNPG)为底物，购自Sigma公司；用pH＝6.8 的磷酸盐缓冲液分别配成10mg/mL。
(4)终止液的配制：碳酸钠(Na2CO3)购自上海国药；用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液分别配成0.1mol/L Na2CO3溶液。
(5)测试：每次测试的体积都为200μL的pH＝6.8的磷酸盐缓冲液。
往96孔酶标板中分别加入10μL不同浓度抑制剂溶液(用pH＝6.8磷酸盐缓冲溶液稀释抑制剂储备液)，用pH＝6.8磷酸盐缓冲溶液补齐至170μL，然后加入10μL酶储备液，在37℃的酶标仪中保温10min，立即加入20μL底物储备液，混匀后立即测其在λ＝405nm处一分钟吸光度变化(斜率)。参比液为pH＝6.8磷酸盐缓冲溶液。
2.3实验结果
以未加样品所测得的吸光度变化(斜率)作为100个活力单位；相对酶活力＝(加入抑制剂的吸光度变化(斜率)/没有加入抑制剂的吸光度变化(斜率)×100，当酶的相对活力为50时的抑制剂的浓度即为抑制剂的IC50值，结果见表1：
表1.土甘草A对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值
从表1的结果可知，土甘草A对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与对照品阿卡波糖相近，对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制效果，同时土甘草A为中药制剂，毒副作用小。
综上可看出，土甘草A对DPPH自由基和ABTS自由基均有明显的清除效果，且对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好。本发明为研究开发新的抗糖尿病药物提供了新的思路，本发明的土甘草A有望用于治疗糖尿病等以α-葡萄糖苷酶和氧化应激为靶点的相关疾病。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (3)
1.一种土甘草A在制备治疗糖尿病的药物制剂的应用。
2.如权利要求1所述的土甘草A的应用，其特征在于，所述药物制剂包括有效量的土甘草A和药学上可接受的辅料组成。
3.如权利要求2所述的土甘草A的应用，其特征在于，所述药物制剂为注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂。
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