CN103044377B

CN103044377B - 具有抑制黄嘌呤氧化酶和降尿酸作用的化合物以及组合物

Info

Publication number: CN103044377B
Application number: CN201310005709.6A
Authority: CN
Inventors: 蒋建勤; 叶楠; 陈真; 廖时余; 杨韬; 吕昊宇
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-01-08
Filing date: 2013-01-08
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-01-08
Also published as: CN103044377A

Abstract

本发明涉及中药技术领域。具体涉及来自瑞香科植物黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche)的二个化合物以及一个组合化合物：祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(Daphnobiflavon DGB1)和祖师麻双黄酮与瑞香素的组合物(DGB)或三者的可药用盐，用于制备抑制黄嘌呤氧化酶作用或治疗高尿酸血症或痛风的药物的用途。

Description

具有抑制黄嘌呤氧化酶和降尿酸作用的化合物以及组合物

技术领域

本发明涉及中药技术领域。具体涉及来自瑞香科植物黄瑞香的二个化合物祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(Daphnobiflavon DGB1)及其祖师麻双黄酮与瑞香素(结构式为3)的组合物(DGB)，或其可药用盐用于制备基于抑制黄嘌呤氧化酶作用和治疗高尿酸血症和痛风的药物的用途。

背景技术

祖师麻为瑞香科Thymelaeaceae瑞香属植物黄瑞香Daphne giraldii Nitsche的根皮和茎皮。中药祖师麻具有镇痛、抗炎、抑菌、抗血栓、抗肿瘤等多种药理作用，目前临床有祖师麻针剂、片剂等多种剂型。广泛用于治疗痛风、跌打损伤、风湿性关节炎、肩周炎、血栓闭塞性脉管炎等症，俗称“打得地上爬，离不开祖师麻”。文献有祖师麻醑剂外敷治疗急性痛风性关节炎；针刺配合祖师麻注射液治疗痛风；祖师麻片与扶他林片、别嘌呤醇联合治疗急性痛风性关节炎的疗效方面的报道。

痛风是一种嘌呤代谢紊乱引起的疾病，是仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病。临床表现为高尿酸血症、痛风性关节炎、尿酸结石、痛风结石形成等。高尿酸血症是痛风疾病发展过程中的一个阶段；痛风性关节炎是血清尿酸水平增高后，尿酸沉积于关节组织引发的一系列炎症反应。

黄嘌呤氧化还原酶(Xanthine oxidoreductase，XOR)是参与痛风发生与发展过程中的关键酶，主要通过催化嘌呤代谢的最后两步，即次黄嘌呤氧化为黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸，使体内尿酸水平升高，继而诱发痛风。研究表明，黄嘌呤氧化酶与痛风的发生密切相关，通过抑制黄嘌呤氧化酶，能够有效降低血浆尿酸水平，可用于预防和治疗痛风及高尿酸血症，因此黄嘌呤氧化酶成为开发抗高尿酸血症及痛风药物的重要靶标。

黄瑞香中的主要化学成分有香豆素、黄酮、木脂素类、二萜原酸酯等化合物。近代药理学研究表明，其化学成分的生理活性研究包括抗病毒，抗肿瘤，抗缺氧，抗血栓及动脉粥样硬化，镇痛，消炎，抑疟，引产等方面。文献报道从黄瑞香中分到两个双黄酮化合物daphnogirinA；daphnogirin B；，具有很强抗氧化活性；瑞香苷具有抗高尿酸血症作用。另有报道从芫花(Daphne genkwa)的花和芽分离黄嘌呤氧化酶抑制剂，有效成分是芹菜素、芫花素等黄酮类化合物。

发明人对祖师麻治疗痛风的物质基础进行了研究，从祖师麻中分离鉴定了2个化学成分以及一个组合化合物，祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(DaphnobiflavonDGB1)，以及祖师麻双黄酮与瑞香素(结构式为3)的组合物(DGB)，其中2个为新化合物。药效筛选证明这二个化合物及其组合化合物体外对黄嘌呤氧化酶具有较好的抑制作用，能显著降低氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平。可以预期开发成为用于制备抑制黄嘌呤氧化酶作用和治疗高尿酸血症和痛风的药物的用途。

发明内容

本发明从中药祖师麻中分离得到的二个新化合物，结构式如下：

分别命名为祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)和祖师麻双黄酮(Daphnobiflavon DGB1)

本发明从中药祖师麻中分离得到一个组合物(DGB)，该组合物由化合物3和祖师麻双黄酮组成。

3的结构式如下：

本发明的祖师麻双黄酮(Daphnobiflavon DGB1)为黄褐色粉末(水/甲醇)，浓硫酸-香草醛反应显黄色。mp207-209℃.易溶于丙酮、乙酸乙酯等，极难溶于水，不溶于石油醚。

IR(cm^-1)3245，1622，1608，1600，1510.ESIMS m/z541.68[M+H]⁺’，结合¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)和¹³CNMR(75MHz，DMSO-d6)数据推断其分子式为MFC₃₀H₂₀O₁₀。¹³CNMR(75MHz，DMSO-d6)显示在δ91-197范围内有30个碳信号，其中17个为季碳；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)显示7.69(1H，d，J＝15.5Hz)，7.22(1H，d，J＝15.5Hz)；7.35(2H，d，J＝9.0Hz)，6.93(2H，d，J＝8.7Hz)，6.61(1H，s)，5.77(1H，s)，5.76(1H，s)；7.06(2H，dt，J＝8.6Hz)，6.80(2H，dt，J＝9.0Hz)。以上数据提示该化合物为双黄酮类。

核磁共振碳谱数据

¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：196.9(C-4″)，192.1(C＝O)，166.4(C-10")，166.0(C-6″)，165.7(C-8")，159.4(C-4)，155.7(C-6′)，154.6(C-14")，154.3(C-2′)，150.1(C-4′)，149.3(C-2″)，145.3(C-β)，129.7(C-6)，129.5(C-2)，128.1(C-12″，16")，127.2(C-1)，123.3(C-11″)，116.9(C-α)，116.2(C-13"，15″)，115.8(C-3")，115.4(C-3，5)，107.9(C-3′)，105.6(C-1′)，105.1(C-5")，96.1(C-7")，95.7(C-9")，91.3(C-5′)。

结合2D-NMR(HSQC，HMBC)谱等推定化合物的结构式如上所示，命名为：祖师麻双黄酮(Daphnobiflavon DGB1)。

本发明的祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)为白色粉末(甲醇)，mp241-243℃.IR(cm^-1)3410，1690，1618，1595，1502。溶于***、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等，极难溶于水。

ESIMS m/z 369.39[M+H]⁺.结合¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)和¹³CNMR(75MHz，DMSO-d6)数据推断其分子式为MF C₁₉H₁₂O₈。¹³CNMR(75MHz，DMSO-d6)显示在δ96-162范围内有18个芳香碳信号，其中11个为季碳，和1个连氧甲基碳信号；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)显示6.36(1H，d，J＝9.5)，8.25(1H，d，J＝9.5)；6.16(1H，d，J＝8.6)，7.67(1H，d，J＝8.6)；6.09(1H，s)，6.93(1H，s)，6.88(1H，s)。以上数据提示可能为双香豆素类化合物。

核磁共振碳谱数据

¹³CNMR(DMSO-d6，75MHz)δ：161.8(C-2′)，158.9(C-2)，152.5(C-7′)，150.2(C-8′a)，149.1(C-7)，146.6(C-5)，145.1(C-4′)，143.7(C-6′)，143.0(C-8a)，138.2(C-4)，129.6(C-8)，113.7(C-5′)，113.2(C-3)，112.9(C-3′)，112.3(C-4′a)，105.3(C-4a)，104.2(C-8′)，96.7(C-6)，60.2(OCH3)。

结合2D-NMR(HSQC，HMBC)和ROESY谱等推断化合物结构式如上所示，命名为：祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)。

本发明还公开了祖师麻素(DGE1)和祖师麻双黄酮(DGB1)和组合化合物(DGB)的提取分离方法，包括方法一：将黄瑞香的干燥茎皮用65％-95％乙醇回流提取，提取液减压浓缩后的粗浸膏混悬于水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取正丁醇部分用硅胶柱层析分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份，浓缩后，分别经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份，经HPLC制备纯化，分别得到化合物DGE1、DGB1、DGB。

祖师麻素(DGE1)和祖师麻双黄酮(DGB1)和组合化合物(DGB)的制备方法，包括方法二：将黄瑞香的干燥茎皮用65％-95％乙醇回流提取，提取液减压浓缩后的粗浸膏混悬于水，通过大孔树脂柱，依次用水、不同比例的含水乙醇洗脱，收集70-90％的洗脱液，减压回收乙醇，所得部位经反复硅胶柱层析，用石油醚、乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份，浓缩后，分别经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份，经HPLC制备纯化，分别得到化合物DGE1、DGB1、DGB。

本发明还公开了化合物祖师麻素(DGE1)和祖师麻双黄酮(DGB1)和组合化合物(DGB)进行体外抑制黄嘌呤氧化酶活性和体内降低氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平作用的试验，表明具有明显的体外抑制黄嘌呤氧化酶活性和显著降低氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平的作用。

以上所提及的二个化合物及其组合物的来源可以是瑞香科植物黄瑞香(Daphne giraldii)，也可以是瑞香科瑞香属其他植物中分离，也可以是化学合成，或在某个黄酮或香豆素类化合物基础上进行半合成。

本发明的二个化合物及其组合物以及它们的盐可分别或混合与药学上可接受的载体组成药物组合物，制成各种制剂，包括：胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸、口服液、酊剂、透皮贴剂、注射液、缓释制剂等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。

具体实施方式

本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例一：将黄瑞香的干燥茎皮15Kg粉碎，用90％乙醇回流提取二次，合并提取液，减压浓缩后的粗浸膏混悬于水，依次分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，萃取液减压浓缩得到石油醚部分(172g)，氯仿部分(155g)，乙酸乙酯部分(158g)，正丁醇部分(500g)，水部分(480g)。取正丁醇部分用硅胶柱层析分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，分别收集氯仿-甲醇(10∶1；5∶1)的流份，薄层层析检测，浓缩后，分别经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份，薄层层析检测。前二种流份经HPLC制备纯化，乙腈-水洗脱，紫外检测器，检测波长为340nm，出峰时间分别为31min和40min，分别得到化合物DGE1、DGB1。

实施例二：将黄瑞香的干燥茎皮10Kg粉碎，用85％乙醇回流提取二次，提取液减压浓缩后的粗浸膏混悬于水，通过大孔树脂柱，依次用水、不同比例的含水乙醇洗脱，收集70-90％的洗脱液，减压回收乙醇，所得部位经反复硅胶柱层析，用石油醚、乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份，浓缩后，分别经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1、DGB的流份。前二种流份经HPLC制备纯化，乙腈-水洗脱，紫外检测器，检测波长为340nm，出峰时间分别为31min和40min，分别得到化合物DGE1、DGB1。

实施例三：

样品对黄嘌呤氧化酶活性的影响：

1.实验原理：

黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)是体内核酸代谢中重要的酶，能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，同时产生过氧化物自由基。体内尿酸浓度过高将导致高尿酸血症，可引起痛风发作。自由基涉及到炎症等一系列病理过程。因此，抑制XOD的活性，既可以减少体内尿酸的形成，有效地阻止或延缓痛风及其并发症，又可以减少自由基造成的组织伤害。在室温条件下，PH为7.5时，黄嘌呤可以被黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸，产物尿酸295nm处有特征吸收峰，因此以单位时间内295nm处吸光度的变化值可以表现酶活力的大小。在反应体系内，加入相应的测试样品，观察在295nm下的吸光度变化，可以反映样品对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。

2.仪器以及试剂

分析天平OHAUS CORPORATION

紫外-可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司

别嘌呤醇 sigma公司

黄嘌呤 sigma公司

黄嘌呤氧化酶 sigma公司

3.溶液的配制

1.磷酸盐缓冲液(PBS)配制

精密称取氢氧化钠0.8g，用蒸馏水200ml溶解，得氢氧化钠溶液，再精密称取磷酸二氢钾3.4g，用所得氢氧化钠溶液197.5ml使其溶解，用蒸馏水稀释至500ml，得PBS液，再用配好的氢氧化钠溶液调节PH值，使PH＝7.5，备用。

2.别嘌呤醇(A)液配制

精密称取别嘌吟醇5.4mg，用PBS液(pH＝7.5)10ml溶解，稀释到100mL，配制成浓度为400μM的别嘌呤醇液，再用磷酸盐缓冲液稀释成40，4μM的溶液，备用。

3.黄嘌呤(X)溶液的配制

精密称取氢氧化钠0.06g，用蒸馏水8ml溶解，得氢氧化钠溶液，再精密称取黄嘌呤0.057g，用所得氢氧化钠溶液溶解，得黄嘌呤氢氧化钠溶解液(a液)。精密称取磷酸二氢钾0.27g，用蒸馏水10ml溶解，得磷酸二氢钾液(b液)。将a液，b液混合，用蒸馏水稀释至40ml，再用PBS液(pH＝7.5)稀释至100ml。从中取10ml，用PBS液(pH＝7.5)稀释至50ml，得0.75mM液，备用。

4.黄嘌呤氧化酶(XO)液配制

将5U的黄嘌呤氧化酶溶解于1mL PBS中，精密量取黄嘌呤氧化酶液20μL(5U/mL)，用PBS液(pH＝7.5)稀释至1ml，得0.1U/mLXO液，备用。

5.待测样品液(T)配制

分别精密称取适量样品，以DMSO50μL溶解，加磷酸盐缓冲液(PH＝7.5)配制成400μM的溶液，再用磷酸盐缓冲液稀释成40，4μM的溶液，备用。

4.实验设计

在石英比色皿中，加入缓冲溶液、底物溶液、酶溶液(如表一所示)，测定295nm处吸光度增加值，每隔0.5min记录一次，测3-8min内的吸光度，每个样品测三次。

表一：

反应在比色皿中进行，反应后样品的终浓度为100μM，10μM，1μM，根据下面公式可以计算出不同浓度下样品的抑制率。

％Inhibition＝(1-B/A)×100

上式中，A＝ΔA_control/min B＝ΔA_test/min

用1gC对抑制率作图，求出回归曲线，根据曲线方程计算抑制率在50％的样品浓度即IC₅₀值。

结果见表1.

由实验数据可以看出，三种化合物都能明显抑制黄嘌呤氧化酶活性。

实施例四：

样品对小鼠血清尿酸水平的影响

1.样品对正常小鼠血清尿酸水平的影响

昆明种小鼠64只，雄雌各半，随机分为8组，每组8只。即正常对照组、DGE1低、高剂量组(100、200mg/kg)、DGB低、高剂量组(100、200mg/kg)、DGB1低、高剂量组(100、200mg/kg)及阳性对照药别嘌呤醇组(10mg/kg)。取血前1h ip样品和别嘌呤醇，正常对照组则ip等剂量0.5％CMC-Na，1h后小鼠眼眶后静脉丛采血，磷钼酸还原法测定血清尿酸水平。结果见表1。

表1 样品对正常小鼠血清尿酸水平的影响

*P＜0.05，**P＜0.01与正常空白对照组比较

#P＜0.05，##P＜0.01与低剂量组比较

▲▲P＜0.01与别嘌呤醇组比较

与正常空白对照组比较，DGE1高剂量组、DGB低、高剂量组、DGB1低、高剂量组均能显著降低正常小鼠的血清尿酸水平(P＜0.01)，DGB高剂量组作用强度与别嘌呤醇组无显著性差异(P＜0.01)。

实施例五：

2.样品对氧嗪酸钾所致小鼠高尿酸血症血清尿酸水平的影响

2.1高尿酸血症模型的建立

氧嗪酸钾盐是一种尿酸酶抑制剂，作为化学诱导剂可抑制尿酸分解，增加体内血清尿酸水平。在取血样前2h用氧嗪酸钾盐(Sigma公司)按300mg/kg剂量ip小鼠，正常对照组则ip等体积0.5％CMC-Na溶液。给药后2h，5h分别从小鼠眼眶后静脉丛采血，磷钼酸还原法测定血清尿酸。结果表明氧嗪酸钾能极显著地提高小鼠血清尿酸水平(P＜0.001)，造成小鼠高尿酸血症模型，模型中动物血清尿酸水平能维持5h。该法灵敏简便、重复性好，在国际上已普遍用于评价药物的抗高尿酸血症和痛风作用。

2.2DGE1对氧嗪酸钾盐致高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响

昆明种小鼠64只，雄雌各半，随机分为8组，每组8只。即正常对照组、高尿酸血症模型组、DGE1低、中、高剂量组(50、100、200mg/kg)和别嘌呤醇低、中、高剂量组(5、10、20mg/kg)。在取血样前2h分别用氧嗪酸钾盐(Sigma公司)按300mg/kg剂量ip小鼠，正常对照组则ip等体积0.5％CMC-Na溶液。给药组在取血前1h ip DGE1和别嘌呤醇，正常对照组和高尿酸血症模型组则均ip等体积0.5％CMC-Na溶液。结果见表2。

表2 DGE1对氧嗪酸钾盐致高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的影响

*P＜0.05，**P＜0.01与高尿酸血症模型组较

#P＜0.05，##P＜0.01与低剂量组比较

◆P＜0.05，◆◆P＜0.01与中剂量组比较

▲▲P＜0.01与高剂量别嘌呤醇组比较

与高尿酸血症模型组比较，DGE1高、中、低三个剂量组均能显著地降低小鼠血清尿酸水平，并呈现一定的量效关系。其中高剂量组作用强度与阳性药别嘌呤醇高剂量组无显著性差异(表2)。

实施例六：

2.3样品对小鼠因氧嗪酸钾盐致高尿酸血症的影响

昆明种小鼠80只，雄雌各半，随机分为10组，每组8只。即空白组、模型组、阳性A组(别嘌呤醇)、阳性B组(苯溴马隆)及DGB高、中、低(50，100，200mg/kg)剂量组，DGB1高、中、低(50，100，200mg/kg)剂量组。DGB剂量组及DGB1剂量组连续3天ig给药。除空白组外，其余各组在取血前2小时用氧嗪酸钾盐(Sigma公司)按300mg/kg剂量ip(腹腔注射)小鼠，阳性A组和阳性B组在取血前1小时分别ig别嘌呤醇(20mg/kg)和苯溴马隆(20mg/kg)。各组摘眼球取血，测定小鼠血UA，经Ttest，组间比较，结果见表3。

表3 样品对小鼠因氧嗪酸钾盐致高尿酸血症的影响

*P＜0.05，**P＜0.01与高尿酸血症模型组较； ▲▲P＜0.01与别嘌呤醇组比较；

#P＜0.05，##P＜0.01与低剂量组比较； ★★P＜0.01与苯溴马隆组比较；

◆P＜0.05，◆◆P＜0.01与中剂量组比较；

可见DGB低、中、高剂量组及DGB1低、中、高剂量组均能显著降低氧嗪酸钾所致高尿酸血症小鼠的血清尿酸，且呈一定的量效递增关系(P＜0.01)。DGB1高剂量组与别嘌呤醇和苯溴马隆组均没有显著性差异(P＞0.05)。

结论：实验结果表明：受试化合物具有明显的体外抑制黄嘌呤氧化酶活性和显著降低氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平的作用。提示具有治疗高尿酸血症和痛风类相关疾病的药效活性。

Claims

1.具有黄嘌呤氧化酶抑制作用和降尿酸作用的二种化合物——祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(Daphnobiflavon DGB1)，其特征在于具有下列结构式：

2.权利要求1的结构式分别为DGE1、DGB1的化合物制备方法，包括方法一：将黄瑞香的干燥茎皮用65％-95％乙醇回流提取，提取液减压浓缩后的粗浸膏混悬于水，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，取正丁醇部分用硅胶柱层析分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1的流份，浓缩后，分别经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有化合物DGE1、DGB1的流份，经HPLC制备纯化，分别得到化合物DGE1、DGB1；

权利要求1的结构式分别为DGE1、DGB1的化合物制备方法，包括方法二：将黄瑞香的干燥茎皮用65％-95％乙醇回流提取，提取液减压浓缩后的粗浸膏混悬于水，通过大孔树脂柱，依次用水、不同比例的含水乙醇洗脱，收集70-90％的洗脱液，减压回收乙醇，所得部位经反复硅胶柱层析，用石油醚、乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，分别收集含有化合物DGE1、DGB1的流份，浓缩后，分别经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，薄层层析检测，收集含有化合物DGE1、DGB1的流份，经HPLC制备纯化，分别得到化合物DGE1、DGB1。

3.一种如权利要求1所述的祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(DaphnobiflavonDGB1)在制备基于黄嘌呤氧化酶抑制作用的药物中的应用。

4.一种如权利要求1所述的祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(DaphnobiflavonDGB1)在制备基于治疗高尿酸血症的药物中的应用。

5.一种如权利要求1所述的祖师麻素(Daphnoletin，DGE1)、祖师麻双黄酮(DaphnobiflavonDGB1)在制备基于治疗痛风的药物中的应用。

6.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。