CN105189742A - 化学交联剂 - Google Patents

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Abstract

本文披露了化学缀合的方法，该方法包含使溶酶体酶与第一交联剂接触以引入醛基；使溶酶体靶向肽与第二交联剂接触以在N-末端残基处引入酰肼基；使步骤a.中具有醛基的溶酶体酶与步骤b中在N-末端残基处具有酰肼基的溶酶体靶向肽接触；并且形成溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物。

Description

化学交联剂
本申请要求于2013年3月15日提交的美国序列号61/794,784的权益。
发明领域
所披露的发明包总体上涉及用于化学交联的组合物和方法。
背景技术
溶酶体是细胞内专门的细胞器，这些细胞器降解并再循环蛋白质、各种脂质(包括糖脂类和胆固醇)以及碳水化合物类成为它们的主要成分，这些成分使新蛋白质、膜成分和其他分子能够合成。细胞也会利用溶酶体通过称为自体吞噬的自适应细胞过程来帮助维持内环境稳定以及细胞健康，该过程增加溶酶体的活性来提供额外的氨基酸用于增加多种蛋白质(例如抗体和干扰素类)的生物合成并且来供给营养素用于能量产生以应对营养不足或者病毒感染的应激时期。每个代谢过程被一种特异的驻留溶酶体酶催化。基因突变能够导致溶酶体生物活性的缺陷，其改变代谢过程而且引起临床疾病。溶酶体贮积失调(LSD)是一类大约50种不同的人类代谢疾病，其由特定的溶酶体蛋白的缺失引起，导致内涵体/溶酶体隔室内各种物质的积累。许多此类疾病已经得到良好表征以理解溶酶体蛋白不足和其导致的代谢缺陷。例如，存在许多具有改变的糖脂分解代谢的LSD，例如戈谢氏病(Gaucher)、法布里氏病(Fabry)以及泰-萨克斯病/山德霍夫氏病(Tay-Sachs/Sandhoff)。尼曼-皮克病C(Neimann-PickC)的特征是受损的脂质和胆固醇代谢，而例如糖原贮积症II型(蓬佩病(Pompe))和III型(科里-福布斯病(Corey-Forbes))等具有改变的碳水化合物代谢的疾病也已经得到了表征。其他LSD改变骨骼或细胞外基质代谢(例如，黏多糖沉积症(MPSI-VII)，戈谢氏病(Gaucher))以及蛋白质周转(神经元蜡样脂褐质沉积症；巴登氏病(Batten)，等)。而LSD相对少见，它们能够引起严重的慢性疾病并且如果没有有效的治疗经常会导致死亡。
尚无溶酶体贮存病的治愈法，但是针对各种LSD已进行了大量不同治疗方法的研究，包括骨髓和脐带血移植、酶替代疗法(ERT)、底物还原疗法(SRT)以及药物分子伴侣疗法。基因治疗也正在研发但还没有在临床中测试。在这些治疗方法中，ERT是最为成熟的，多种ERT被批准用于治疗各种LSD，包括戈谢氏病、法布里氏病、蓬佩病、MPSI、MPSII以及MPSVI，而一种SRT药物被批准用于治疗戈谢氏病。
ERT治疗溶酶体贮存病的理念相当简单，即将一种重组的人类溶酶体酶施用于患者以补充缺乏的生物活性并且改善临床症状。然而，不像其他主要在细胞表面或细胞外发挥作用的蛋白质治疗处理(例如抗-VEGF和其他抗体、***、凝血因子等)，溶酶体酶必须在细胞内发挥作用，在溶酶体内，因此要使用一种从外部进入细胞随后递送至这些内部隔室的机制。在哺乳动物中，用于大多数可溶的溶酶体酶的在某些天冬酰胺残基(N联寡糖；N-聚糖)的蛋白质骨架上的分支碳水化合物结构是在翻译后修饰形成被称为甘露糖6-磷酸(M6P)的专门碳水化合物结构。M6P是鉴别和运输通过膜结合的M6P受体从高尔基体向溶酶体的新合成的溶酶体蛋白的天然生物信号。一类M6P受体(不依赖阳离子的M6P受体；CI-MPR)也循环至质膜并且具有结合和内化外源溶酶体蛋白的功能性活性。据认为CI-MPR已经进化到重新俘获逃离细胞的溶酶体蛋白(通过细胞向外分泌)，因此提供了一种内化外源溶酶体蛋白的靶向机制并且是针对各种LSD的酶替代疗法的基础。
已经显示，重组的溶酶体酶替代疗法是总体上安全的，但是它们用于减少临床症状的效力差异很大。例如：法布瑞酶TM(FabrazymeTM)(重组酸性α-半乳糖苷酶A；基因酶公司(GenzymeCorp.))ERT以每两周1mg/kg体重的剂量足以从内皮细胞清除法布里病中累积的底物，而以每两周40mg/kg的孤儿药TM(MyozymeTM)(重组人类酸性α-葡糖苷酶，rhGAA；基因酶公司)的剂量对蓬佩病仅仅中度有效。疗效差异主要归因于M6P含量的不同，以至于低水平的M6P与药物靶向性差和疗效低相关。重组溶酶体酶的生产非常具有挑战性，因为控制碳水化合物加工，尤其是哺乳动物表达***中的M6P水平，是极为困难的。两种专门的高尔基体酶催化M6P修饰；N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶添加磷酸联N-乙酰葡糖胺至某些末端甘露糖残基，而N-乙酰葡糖胺-l-磷酸二酯α-乙酰葡糖胺糖苷酶(也称为去覆盖酶)移除覆盖N-乙酰葡糖胺以揭示M6P信号。然而，N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶在细胞中是限制性的，而且该生化反应对于各种溶酶体蛋白是固有地低效的。在生产过程中，溶酶体蛋白的过度表达极大地加重了这一问题并且导致M6P量高度可变。因此，碳水化合物加工通常是不完整的并且导致重组溶酶体酶的生产伴有N-聚糖混合物，这些混合物含M6P、非M6P结构的高甘露糖型N-聚糖和络合物类型N-聚糖(对分泌性蛋白是典型的)。使事情复杂化的是死细胞或受损细胞释放出例如磷酸酶的酶进入细胞培养基，其移除M6P。因此，减少的M6P含量降低重组溶酶体酶对M6P受体的结合亲和力并且降低其细胞摄取并且因此降低药物疗效。死细胞或受损细胞释放出其他糖苷酶移除其他碳水化合物(例如唾液酸、半乳糖等)，以显示通常不显露的内部的碳水化合物，并且这些N-聚糖易于被鉴定为异常。这些不完整的N-聚糖结构增加重组的溶酶体蛋白从循环中的清除率，这也会降低药物疗效。因此就需要较高的药物剂量来补偿降低的疗效。然而，较高的药物剂量需求具有多项负面影响：(1)较高的药物剂量对增加一项原本已经昂贵的治疗是成本高昂的；(2)较高的药物剂量需要长的输注时间；(3)大量的循环药物导致显著的抗体反应(可见于大多数蓬佩病患者)并且在输注过程中大量患者也经历了过敏反应。美国食品药品管理局(FDA)已经针对孤儿药(Myozyme)发布了“黑标签警告”，该药物是典型的最初给药十分缓慢但是在输注过程中提升。这一举措有助于减轻过敏反应但是显著地延长了输注时间，12-hr输注不是罕见的。
一种潜在的用于改善各种溶酶体ERT药物寻靶的策略采用靶向肽有效地让ERT靶向溶酶体，无需要传统的M6P碳水化合物结构。这从概念上说是可行的，因为不依赖阳离子的M6P受体包含了针对一种被称为***2(IGF-2)的小肽的独特的结合域，并且因此这种受体被称为IGF-2/(IGF-2/CI-MPR)。实际上，该受体对内化外源具有M6P的溶酶体蛋白全权负责，因为IGF-2/CI-MPR存在并且在细胞表面具有生物活性。另外一类M6P受体，依赖阳离子的M6P受体(CD-MPR)，仅参与细胞内溶酶体蛋白的运输，因为它在细胞表面不具有生物活性而且缺少IGF-2肽结合域。该IGF-2/CI-MPR针对M6P具有两个分离的结合位点(分别是域1-3和7-9)以使得其以适度的亲和性结合单-M6PN-聚糖(N-聚糖上的1个M6P残基)或者以大约3000倍的更高的亲和性结合双-M6PN-聚糖(同一个N-聚糖上的两个M6P残基)。由于溶酶体蛋白包含复合(无M6P)、单-以及双-M6PN-聚糖的混合物，它们对于IGF-2/CI-MPR的亲和性根据具有M6P的N-聚糖的类型和量广泛地变化。
仍然需要发展策略创造IGF-2-联蛋白用于改善蛋白质靶向。仍然需要维持正确蛋白质构象的构造。
发明概述
本文公开化学缀合的方法，其包含：a)使溶酶体酶与第一交联剂接触以引入醛基；b)使与第二交联剂接触以在N-末端残基处引入酰肼基；使步骤a)中具有醛基的溶酶体酶与步骤b)中在N-末端残基处具有酰肼基的溶酶体靶向肽接触；并且形成溶酶体酶-溶酶体靶向肽的缀合物。
本文中还提供了双功能交联剂，其包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。本文中还提供了修饰的溶酶体靶向肽，其包含一个保护的酰肼基。
本文公开制备修饰的溶酶体靶向肽的方法，其包含：使溶酶体靶向肽与交联剂接触以在其N-末端残基引入酰肼基。还提供了将一个或多个溶酶体靶向肽连接至溶酶体酶的方法，其包含：脱保护溶液中酰肼修饰的溶酶体靶向肽，以形成脱保护的酰肼修饰的溶酶体靶向肽，并且将至少一个脱保护的酰肼修饰的溶酶体靶向肽连接至溶酶体酶。
本文公开溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物，其包含：一种经由一个或多个双功能交联剂交联至一个或多个溶酶体靶向肽的溶酶体酶。
附图简述
在结合所附的附图进行阅读时，本披露将被进一步地理解。出于阐述其主题的目的，在附图中展示了其主题的示例性实施例；然而，目前披露的主题不限于所披露的方法、装置以及***。此外，这些附图未必按比例。在附图中：
图1显示如在高效液相层析(HPLC)***监测下vIGF2肽的修饰。
图2显示在结合板测定中vIGF2-GAA缀合物结合IGF2-CI-MPR受体的能力。
图3显示一些所披露的交联剂的化学结构。
图4.(A)显示相对于起始的未修饰vIGF2肽(上图)，在附连于tBoc-保护的酰肼连接物时(中图)vIGF2肽的存留时间，以及显示了移除tBoc保护基引起了在C4RP-HPLC上存留方面的另一个移位(减少)(下图)。(B)显示在IGF2/CI-MPR受体板结合测定法中vIGF2肽-缀合的rhGAA(通过产生的腙连接)的结果。
图5显示在L6大鼠骨骼肌成肌细胞中通过内化外源的未缀合的rhGAA(10-500nM)和vIGF2-rhGAA(2-50nM)对于腙连接的vIGF2-rhGAA摄取的评估。(A).显示出在所有测试的蛋白质浓度中vIGF2-rhGAA在L6成肌细胞中的内化明显好于未缀合的rhGAA。(B)通过蛋白质印迹法使用兔抗人GAA多克隆第一抗体分析L6成肌细胞溶解产物。
图6显示了纯化的vIGF2肽在C4RP-HPLC测定中的存留时间，vIGF2肽用20倍摩尔过量的双功能交联剂甲基苯甲氧基羰基(BOM)-保护的酰肼基(NHS-PEG4-BOM-hydrazide)进行了化学修饰以在肽的N-末端引入BOM-保护的酰肼基团。
图7.(A)显示了纯化的vIGF2肽在C4RP-HPLC测定中的存留时间，vIGF2肽用20倍摩尔过量的双功能交联剂苯二甲酰亚氨基氧基-PEG12-NHS酯进行了化学修饰以在肽的N-末端引入苯二甲酰亚胺基氧基官能团。(B)显示肟联的vIGF2-rhGAA在IGF2/CI-MPR受体板结合测定法中的亲和性测定以确定附接的vIGF2肽是否改善了rhGAA对于IGF2/CI-MPR受体的亲和性。
图8显示了纯化的vIGF2肽在C4RP-HPLC测定中的存留时间，vIGF2肽用20倍摩尔过量的双功能交联剂tBoc-氨氧基-PEG12-PFB进行了化学修饰以在肽的N-末端引入tBoc保护的氨氧基官能团。
图9显示直接缀合至被化学地氧化的rhGAA(在碳水化合物上含有化学反应性醛基)以形成产生的肟连接的氨氧基修饰的vIGF2肽的IGF2/CI-MPR受体板结合测定。
说明性实施方案的详述
通过参考以下的详细说明(其形成本披露的一部分)可更容易地理解本发明主题。应了解的是，本发明并不限于本文所描述和/或示出的具体的产品、方法、条件或参数，并且本文所使用的术语仅为了通过举例描述本发明特定的实施方式而不是限制所要求的发明。
除非本文另有定义，连同本申请使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。
当在以上和全文中使用时，除非另有说明，下列术语以及缩写应当理解为具有下列含义。
在本文中，单数形式“一个/一种(a/an)”、以及“该(the)”包括复数指代，并且提及具体的数值至少包括该具体的值，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如，在谈到“化合物”时，就是指一个或多个这类化合物，并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。如在此所使用，术语“多个”是指多于一个。当表达一种数值范围时，另一个实施例包括从该一个具体值和/或至该另一个具体值。类似地，当值通过使用上述的“大约”而表达为近似时，应理解，该具体值形成另一个实施例。所有范围都是包含在内和可组合的。
该化学缀合方法可以通过新型的双功能交联剂改善，其可以用于vIGF2肽的修饰以引入一个保护的酰肼基。使用温和的酸性缓冲液可以有效地移除酸不稳定保护基以更好地回收修饰的vIGF2肽。然后，脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽可以被冻干并作为干燥的粉末贮藏以保存其酰肼基部分的化学反应性。脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽可以被无限贮藏直到化学偶联至溶酶体酶。因此，这些新型的交联剂能提供明显更稳定的组分以及对化学缀合过程更好的控制以能够使得过程放大。
该化学缀合方法涉及使用第一交联剂修饰重组人类溶酶体酶上的氨基(N)-末端以及一个或多个赖氨酸残基以引入重组人类溶酶体酶上的新型丙酮-保护的酰肼基。然后，该第一交联剂修饰的重组人类溶酶体酶可以被纯化以移除过量的交联剂和反应副产物。可以使用酸性pH缓冲剂实施纯化，其保存了对于溶酶体酶的催化活性并且置换该丙酮保护基以显露化学反应性的酰肼基。单独地，可以使用第二交联剂修饰在vIGF2肽前的短的延伸连接区域的氨基(N)-末端以在vIGF2肽上引入新型的化学反应性醛基。然后，修饰的vIGF2肽可以经过纯化以移除过量的交联剂和反应副产物，之后被冻干。在最终的缀合反应中，酰肼修饰的重组人类溶酶体酶可以被直接添加到该冻干的醛-修饰的vIGF2肽上以生成vIGF2-酶缀合物。尽管该方法能有效地生成vIGF2-酶缀合物，该最终的化学缀合反应优选地迅速进行，因为引入的酰肼基在水溶液中不稳定，因此其化学反应性在相当短的时间内(1-2天内)减弱。因此，如果使用双功能交联剂的溶酶体酶修饰和酰肼修饰的溶酶体酶的纯化不能迅速地完成(优选1天内)，放大过程是困难的。
应优选改变修饰的顺序，其中可以用交联剂修饰溶酶体酶以引入醛基并且应使用交联剂修饰vIGF2肽以引入酰肼基。然而，大部分含酰肼基的交联剂，例如琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸盐丙酮(S-Hynic)或者相关的交联剂，导致vIGF2肽的聚集和/或沉淀并引起显著的肽损失。本文中提供了合适的交联剂和方法使用双功能交联剂修饰vIGF2肽以在vIGF2肽上引入保护的酰肼基。该保护基可以通过在酸性缓冲液中孵育被随后移除，并且酰肼修饰的vIGF2肽可以通过HPLC上的反相色谱法纯化。然后，经过纯化的酰肼修饰的vIGF2肽可以被冻干并作为干燥的粉末贮藏。这一举措保证了酰肼基保持化学活性用于偶联至溶酶体酶。在一个单独的反应中，重组溶酶体酶可以用交联剂修饰以引入新型的醛基。在移除过量的交联剂和反应副产物的纯化之后，醛-修饰的溶酶体酶可以贮藏直到偶联至vIGF2肽，因为该引入的醛基在水溶液中化学稳定。该新举措在过程中提供了“保留步骤”，其中各组分(修饰的溶酶体酶以及修饰的vIGF2)可以被无限贮藏直到偶联以生成vIGF2-酶缀合物。因此，该新方法生成具有实质上更高稳定性的各组分，并且提供对缀合过程更好的总体控制，其有利于过程放大。
合适的化学缀合的方法可以包含：a)使溶酶体酶与第一交联剂接触以引入醛基；b)使溶酶体靶向肽与第二交联剂接触以在其N-末端残基处引入酰肼基；使步骤a)中具有醛基的溶酶体酶与步骤b)中在其N-末端残基具有酰肼基的溶酶体靶向肽接触；并且形成溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物。
溶酶体靶向肽可适合地包含：变体***2(vIGF2)，优选人类***2的变体。在一个实施例中，这样一个变体IGF2可以包含氨基酸缺失和取代，其允许vIGF2肽维持对IGF-2/CI-MPR的高亲和性同时降低对IGF-1和胰岛素受体的肽结合亲和性。例如，缺失和取代可以包含以下变化中的一个或多个：N端氨基酸残基1-4的缺失，因为不需要这些残基结合预期的IGF2/CI-MPR受体并且还消除在4位的脯氨酸以及其在蛋白质的氨基末端关联的弯曲或扭结；野生型人类IGF2的在6位的谷氨酸残基被精氨酸取代用以减少或消除结合至血清IGF结合蛋白(IGFBPs)的肽，野生型人类IGF2的在27位的酪氨酸残基被亮氨酸取代用以减少或消除结合至胰岛素和IGF-1受体的肽，以及人类IGF-2的在65位的赖氨酸残基被精氨酸取代以防止在该位置的肽的化学修饰。
在又另外的实施例中，该变体IGF2可以包含或是以下序列之一：
SEQIDNO:1
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE
SEQIDNO:2
SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE
SEQIDNO:3
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SEQIDNO:4
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合适的第一交联剂包含N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(S-4FB)。一种合适的第二交联剂包含N-叔丁氧基羰基(tBoc)保护的酰肼交联剂(NHS-PEG4-tBoc-hydrazide)或者一种甲氧基苄氧基羰基(BOM)保护的酰肼(NHS-PEG4-BOM-hydrazide)。在其他合适的实施例中，该第二交联剂可以包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。在其他合适的实施例中，该双功能交联剂可以包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，或其任意的组合。
合适的溶酶体酶包含酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)，酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)，酸性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，酸性α-艾杜糖醛酸酶A(IduA)，酸性艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)，β-己糖胺酶A(HexA)，β-己糖胺酶B(HexB)，酸性α-甘露糖苷酶A，β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)，酸性脂酶(LPA)，或其任意的组合。在其他合适的实施例中，该溶酶体酶可以是哺乳动物的并且该哺乳动物的溶酶体酶可以是人类的。
将该N-末端残基具有酰肼基的溶酶体靶向肽典型地添加至约4倍摩尔过量的溶酶体酶。苯胺也可以适合地在彼时添加。此处提供的方法可以进一步包括溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物的一个或多个纯化步骤。例如，纯化可利用尺寸排阻层析进行。
此处提供的方法可以进一步包括评估溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物结合IGF2/CI-MPR受体的能力。溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物的结合典型地在或约高于25nM的溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物处饱和。因此，溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物可以通过使得能够达成结合IGF2/CI-MPR受体的高亲和性而维持正确的蛋白质构象。
合适的双功能交联剂可以包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。在其他合适的实施例中，该双功能交联剂可以包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，或其任意的组合。
合适的修饰的溶酶体靶向肽可以包含保护的酰肼基。在其他合适的实施例中，该修饰的溶酶体靶向肽可以包含修饰的vIGF2肽。在其他合适的实施例中，该酰肼基受丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-基团，或其任意的组合的保护。在其他合适的实施例中，该修饰的溶酶体靶向肽处于一种粉末形式。在其他合适的实施例中，该修饰的溶酶体靶向肽是冻干的。
合适的制备修饰的溶酶体靶向肽的方法包含使溶酶体靶向肽与交联剂接触以在N-末端残基处引入酰肼基。合适的溶酶体靶向肽为vIGF2。一种合适的交联剂包含N-叔丁氧基羰基(tBoc)保护的酰肼交联剂(NHS-PEG4-tBoc-hydrazide)。该交联剂可以包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。该双功能交联剂可以包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，或其任意的组合。此处提供的方法可以进一步包括对修饰的溶酶体靶向肽的受保护的酰肼基进行脱保护。同样地，可以进行一个另外的、冻干修饰的溶酶体靶向肽的步骤以形成粉末。
合适的将一个或多个溶酶体靶向肽连接至溶酶体酶的方法可以包含：脱保护溶液中酰肼修饰的溶酶体靶向肽，以形成脱保护的酰肼修饰的溶酶体靶向肽，并且将至少一个脱保护的肼修饰的溶酶体靶向肽连接至溶酶体酶。该溶酶体靶向肽可以包含vIGF2，并且该溶酶体酶可以包含酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)，酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)，酸性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，酸性α-艾杜糖醛酸酶A(IduA)，酸性艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)，β-己糖胺酶A(HexA)，β-己糖胺酶B(HexB)，酸性α-甘露糖苷酶A，β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)，酸性脂酶(LPA)，或其任意的组合。
合适的溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物可以包含一种经由一个或多个双功能交联剂交联至一个或多个溶酶体靶向肽(例如，vIGF2)的溶酶体酶。合适的双功能交联剂可以包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(S-4FB)，或其任意的组合。该溶酶体酶合适地包含酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)，酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)，酸性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，酸性α-艾杜糖醛酸酶A(IduA)，酸性艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)，β-己糖胺酶A(HexA)，β-己糖胺酶B(HexB)，酸性α-甘露糖苷酶A，β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)，酸性脂酶(LPA)，或其任意的组合。
实例
以下实例，同说明性各个实施方案，不意图限制所描述的发明范围，并且读者不应以这种方式限制理解它们。
实例1
一个新型的化学缀合方法被用于vIGF2肽至溶酶体酶的化学偶联以增加其对IGF2/CI-MPR受体的结合。该方法不同于早先的所描述的，使得溶酶体酶被第一交联剂修饰以引入醛基，而vIGF2肽被第二交联剂修饰以在N-末端残基处引入酰肼基。确切地说，经由配备有一个50kDa分子量截留膜的浓缩设备，重组野生型人类酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)被浓缩至7.5mg/ml，然后缓冲液通过透析在4摄氏度下过夜交换成50mM磷酸钠(pH6.5)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80。然后，在环境温度下，用20倍摩尔过量的N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(S-4FB；Solulink)交联剂化学修饰rhGAA持续2hrs以引入新的苯甲醛基团。然后，该苯甲醛修饰的rhGAA在50mMNaOAc(pH4.8)/50mMNaCl缓冲液中纯化，以移除过量的交联剂和反应副产物，并且在4摄氏度下贮藏直到化学偶联至vIGF2肽。
在一个单独的反应中，经过纯化的vIGF2肽在50mM磷酸钠(pH7.5)/50mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80中在0.6mg/ml下重构并且用20至40倍摩尔过量的N-叔丁氧基羰基(tBoc)保护的酰肼交联剂(NHS-PEG4-tBoc-hydrazide；QuantaBiodesign)修饰。如图1所示，通过使用在安捷伦科技(帕洛阿尔托，加州)高效液相层析***(C4RP-HPLC)上的4.6X250mm，5μm，C4朱庇特柱(菲罗门，托伦斯，加州)监测vIGF2肽的修饰。由缓冲液A(在水中0.1％的TFA)和缓冲液B[在乙腈(MeCN)中0.1％的TFA]构成的流动相。该分析的方法，被指定为C4反相高效液相层析(C4RP-HPLC)，被用于通过以2mL/min将5-100μL的样品注射在用74％缓冲液A和26％缓冲液B预平衡的C4柱上而表征IGF2肽样品。样品注射两分钟后，缓冲液B的26％至33％的线性梯度经13分钟发展。在这些条件下，未修饰的vIGF2肽洗脱大约11.5分钟。当该交联剂在修饰反应过程中被化学附接至vIGF2时，修饰的IGF2肽具有不同的层析图并且在C4RP-HPLC上呈现一个新的随后的洗脱峰，其明显的存留时间为～13.5min。当vIGF2肽>95％被交联剂修饰时，该反应通过添加TFA(15％终浓度)被停止并且孵育长达4hrs。该孵育步骤被用于移除tBoc保护基，如通过在C4RP-HPLC上vIGF2的存留时间的显著移位证明的。在这些实验条件下，大约50％的tBoc被移除。修饰的vIGF2肽的显著损失在使用更长的孵育时间或更高的TFA浓度时发生。然后，酰肼修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化，冻干并且作为干燥的粉末贮藏，并且在4摄氏度下贮藏直到化学偶联至rhGAA。
在最终的反应中，通过将溶酶体酶直接添加至处于4倍摩尔过量的肽的冻干肽，苯甲醛去修饰的rhGAA被化学缀合至脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽。苯胺，该反应的一种化学催化剂，被添加至10mM的终浓度，而且该反应在环境温度下孵育过夜，伴随温和摇动。次日，通过使用尺寸排阻色谱法纯化vIGF2-rhGAA缀合物以通过使用50mM磷酸钠(pH6.2)/100mMNaCl/0.05％(v/v)聚山梨酯-80缓冲液移除过量的vIGF2肽。
如图2所示，为了确定在移除tBoc保护基之后修饰的vIGF2肽是否保持了正确的蛋白质结构，评估vIGF2-GAA缀合物在板结合测定法中结合IGF2/CI-MPR受体的能力。简言之，用结合缓冲液[40mMHEPES(pH6.7)，150mMNaCl，10mMEDTA以及0.02％(v/v)吐温-20]连续地稀释未缀合的rhGAA和vIGF2-rhGAA，以得到范围从0.01至10μg/ml的GAA终浓度，并且在37摄氏度下在IGF2/CI-MPR受体覆盖的板中孵育30min。用结合缓冲液洗涤受体板3x以移除未结合的酶，并且使用荧光4-甲基伞形酮基-α-葡萄糖底物[4-MU-α-Glc；在50μL0.1MNaOAc(pH4.8)中1mM底物终浓度]测量结合的GAA酶的量。然后，四十五μL的反应样品被转移至新的96-孔黑色的透明测定底板，并且添加125μL，0.5MNaOH以停止酶促反应和提高pH。然后，在荧光读板仪(分别使用370nm激发以及460发射波长)中对从单个酶促反应中释放的4-MU荧光进行量化。如图2所示，在所有测试的浓度中vIGF2-rhGAA结合IGF2/CI-MPR受体明显好于rhGAA起始材料。如所预期的，vIGF2-GAA的结合显示在或高于25nM时是饱和的。因此，这些结果显示vIGF2肽在移除tBoc脱保护基之后能够维持正确蛋白质构象，其使得实现结合IGF2/CI-MPR受体的高亲和性。
实例2
NHS-PEG4-tBoc-酰肼交联剂显示有效地修饰vIGF2肽以引入新的酰肼基同时保持肽的良好的溶解度。然而，使用温和酸性条件、所使用的高浓度TFA(15％)以及4-hr孵育以脱保护很难移除tBoc保护基。在这些苛刻的条件下，我们仍然只能回收～50％的脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽。如果交联剂可以设计成具有更不稳定的保护基团用以有效的移除和更好的回收修饰的肽，该方法将进一步改进。
已开发出新型双功能交联剂用以有效地附接至vIGF2肽，并且以引入酰肼基保护的同时保持肽的良好的溶解度。如图3所示，这些新交联剂包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、或三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基。这些保护基比tBoc更不稳定，并且能使用温和酸性条件(例如，<5％的TFA)用以修饰的肽的有效移除和高回收。此外，这些新交联剂应该允许在纯化和冷冻干燥后长期贮存脱保护的修饰的vIGF2肽。因此，这些新交联剂会使得实现放大试验并且更好的控制化学缀合过程。
实例3
使用离心浓缩设备(例如，具有50kDa标称分子量截留(MWCO)膜的AmiconUltra；米利波尔公司(Millipore))将小规模(即，<100mg)重组人类酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)浓缩至8-10mg/ml，然后缓冲液通过透析在4摄氏度下过夜交换成修饰缓冲液[50mM磷酸钠(pH6.5)/100mMNaCl/100mM葡萄糖/2％甘露醇/0.05％聚山梨酯-80]。对于大规模制备(即，>200mgrhGAA)，可以使用具有50kDaMWCO膜的切向流过滤(TFF)***经由渗滤/浓缩实现蛋白浓缩和缓冲液交换。通过UV吸收光谱在280nm使用166,117M-1cm-1的摩尔消光系数(ε)确定rhGAA蛋白浓度。然后，通过用修饰缓冲液稀释将rhGAA蛋白质浓度调整到7.5mg/ml并且用25倍摩尔过量的双功能交联剂琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)在约20摄氏度下孵育4小时以向rhGAA引入新的苯甲醛基团(芳族醛)。在4摄氏度下用50mMNaOAc(pH4.8)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80透析苯甲醛修饰的rhGAA，其中缓冲液有多种变化，以移除过量的交联剂和反应副产物。化学修饰的rhGAA在该缓冲液中是稳定的，并且能被无限贮藏直到化学缀合至vIGF2肽。重要的是，引入rhGAA上的苯甲醛基团保持化学反应性用以缀合至酰肼-或氨氧基-修饰的vIGF2肽。我们还确定苯甲醛修饰的rhGAA能够被贮存在50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80中，其对GAA稳定性或偶联效率没有不良作用。
为了确定化学修饰的程度和识别被修饰的特定氨基酸残基，产生来自苯甲醛修饰的rhGAA的肽图并且直接与起始未修饰的起始rhGAA样品经由液相色谱法-质谱法分析(LC-MS)来比较。简言之，通过将rhGAA消化成肽碎片，使用特定蛋白酶的混合物，然后经由C18反相高效液相层析以及通过质谱法分析单个肽碎片，产生用于起始未修饰的rhGAA样品的参考肽图。将制备苯甲醛修饰的rhGAA的四种不同制品以相同的方式消化和处理，并且与用于未修饰的起始rhGAA的该参考肽图比较。我们的LC-MS结果指示使用该化学修饰流程平均大约2个新苯甲醛基团被引入rhGAA。此外，该LC-MS结果显示rhGAA的化学修饰在rhGAA中的不同的赖氨酸残基上不是随机分布的。相反地，如表1所示，rhGAA的化学修饰显得更为有序并且被局限于极少几个赖氨酸残基。LC-MS数据显示～90％的Lys902被苯甲醛修饰而大约50％的Lys732和Lys838被修饰。在这些实验条件下，显著更少部分的Lys113(8％)以及Lys161(17％)被修饰。对于该LC-MS分析，据估计其实验误差是±10％。
表1.在rhGAA中化学修饰的氨基酸残基的鉴定修饰的残基
该LC-MS数据是提供信息的并且对所描述的化学缀合方法具有十分重要的意义。在rhGAA中有15个不同赖氨酸残基；理论上每个都具有相同的化学修饰的潜力。然而，我们的经验数据与该假设相反并且表明该化学修饰过程比预期显得更为有序，其中针对4个不同批次的SFB修饰的rhGAA使用在此描述的方法仅几个挑选出来的赖氨酸残基始终被苯甲醛基团修饰。此外，该LC-MS数据指示，存在赖氨酸残基的优先修饰使得Lys902总是被交联剂修饰而大约一半的Lys732和Lys838残基被交联剂修饰。只有小部分的Lys113和Lys161被苯甲醛基团修饰。这些数据表明，观测到的优先修饰依赖于各个赖氨酸残留对于用交联剂进行化学修饰的可达到性和化学能力。例如，赖氨酸残基可以被质子化并且参与与带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸残基形成盐桥(即，静电相互作用)，而不是用于化学修饰。该LC-MS数据表明，Lys902是最可及和最能胜任化学修饰的，并且可能是第一个被修饰的残基。此外，Lys732和Lys838在化学修饰上比Lys902更不可及，但是Lys732和Lys838相对于彼此具有相似的可达到性，由于它们有大约相等的部分被修饰。这些数据表明，不是Lys732就是Lys838是第二个被修饰的赖氨酸残基。Lys113和Lys161在化学修饰上仅仅是是部分可及的，使得只有小部分的rhGAA在这些赖氨酸残基包含苯甲醛。对于rhGAA没有观察到氨基(N-)末端的化学修饰，但已知这种酶是在细胞中自然修改(环化)的，以形成焦谷氨酸酯，其不能胜任与双官能交联剂的化学修饰。
这些汇总数据指示，所描述的化学修饰流程可以被用于重复性地生产用于偶联至vIGF2肽的具有平均2.12个被引入苯甲醛基团的rhGAA。由于缀合至rhGAA的vIGF2肽的数目依赖于被引入的苯甲醛基团的数目，这些结果指示，平均2个vIGF2肽可以缀合至rhGAA。
在用SFB化学修饰后，苯甲醛-修饰的rhGAA在例如50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80或50mMNaOAc(pH4.8)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80的微酸性缓冲液中十分稳定，并且在化学修饰前可以被长期贮存，这对于使得该缀合过程的放大是高度令人希望的。
实例4
通过特定的化学基团，例如酰肼，苯甲醛修饰的rhGAA可以被用于化学缀合至vIGF2肽以形成如下的腙连接。冻干的、经过纯化的vIGF2肽在50mM磷酸钠(pH7.5)/50mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80中在0.6mg/ml下重构并且用20倍摩尔过量的双官能交联剂N-叔丁氧基羰基(tBoc)保护的酰肼交联剂(NHS-PEG4-tBoc-hydrazide；QuantaBiodesign)在环境温度下孵育以在N-末端引入新的tBoc-保护的酰肼基团。通过C4反相高效液相层析(C4RP-HPLC)监测该反应以评估其进展和vIGF2修饰的程度。C4RP-HPLC法使用在安捷伦科技(帕洛阿尔托，加州)高效液相层析***上的4.6X250mm，5μm，C4朱庇特柱(菲罗门，托伦斯，加州)，其由一个1100系列四元液相泵、自动采样器、温度固定的柱室以及配备有安捷伦化学工作站软件(Rev.B.04.03)的二极管阵列检测器(DAD)组成。流动相由缓冲液A：在水中0.1％的三氟醋酸(TFA)以及缓冲液B：在乙腈(MeCN)中0.1％的TFA所构成。将肽样品装载到用26％乙腈(MeCN/0.1％TFA)预平衡的C4柱上。2分钟后，使用26％-33％线性梯度的MeCN/0.1％TFA将该柱经13分钟发展。如图4A所示，在vIGF2肽的化学修饰附连PEG4-tBoc-酰肼(中图)时观察到存留时间显著的移位(增加)。vIGF2肽的化学修饰完成后(典型地经过2hrs)，tBoc-酰肼修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化以移除过量的交联剂和反应副产物，并且被冻干以移除挥发性溶剂。然后，干燥的肽在2％TFA(在dH2O中)重构并且在环境温度下孵育长达72hrs以移除tBoc保护基并将用于随后缀合至溶酶体酶的酰肼基暴露。tBoc脱保护的进展也通过C4RP-HPLC监测，并典型地示出，肽的存留时间在移除tBoc时减少到接近起始未修饰vIGF2肽的存留时间(图4A，底部图)。在这些实验条件下，tBoc基团的完全的脱保护典型的需要大约60hrs。然后，tBoc脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化，并且被冻干和干燥贮存直到化学缀合至苯甲醛修饰的rhGAA。使用更高的TFA浓度(例如，4％TFA)以及其他酸和有机溶剂也测试出tBoc保护基的移除，但是那些条件导致更低的酰肼基修饰的vIGF2肽的回收。脱保护的酰肼基vIGF2肽通过如下产生的腙连接被化学缀合至苯甲醛修饰的rhGAA(使用4倍摩尔过量的vIGF2肽至rhGAA)。典型地用50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80缓冲液将苯甲醛修饰的rhGAA的蛋白质浓度调节至4-5mg/ml，而且该酶被直接添加到冻干的脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽(摩尔比率是1摩尔rhGAA:4摩尔vIGF2肽)并且在约20摄氏度下孵育大约16小时。也可以添加苯胺(5-10mM)以提高偶联率，但是我们发现，在这些实验条件下，其不是偶联所绝对必要的。然后，在50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/2％甘露醇/0.05％聚山梨酯-80缓冲液中用尺寸排阻色谱法纯化vIGF2肽缀合的rhGAA以移除过量的vIGF2肽。使用具有30kDa标称分子量截留醋酸纤维素膜的AmiconUltra合并并浓缩vIGF2-rhGAA的峰级分。vIGF2-rhGAA由受体板结合测定表征以确定腙联vIGF2肽是否增加rhGAA结合至预期的IGF2/CI-MPR受体。如图4B所示，vIGF2-rhGAA结合IGF2/CI-MPR受体显著地好于未缀合的rhGAA，而且在骨骼肌细胞模型中与实质上更好的外源溶酶体酶的细胞摄取相关(图5A)。这些结果显示，在靶肌细胞中，改善的受体结合对于提高的外源治疗性药物的细胞摄取的功能重要性。肌细胞溶解产物的蛋白质印迹分析显示，递送内化的vIGF2-rhGAA给溶酶体，在这里vIGF2肽被移除而且如针对未缀合的rhGAA酶所观察到的正常处理rhGAA(图5B)。已经预期到了这些结果，因为先前已报告IGF2肽被驻留溶酶体蛋白酶自然降解。重要的是，免疫印迹数据指示，化学偶联的vIGF2肽被移除并没有阻碍溶酶体中的GAA处理。(高亲和性结合和用于水解天然糖原底物的最佳的GAA酶动力学需要GAA处理)。
因此，这些汇总数据证实，该替代的化学缀合可以被用于生成vIGF2-rhGAA酶缀合物，其具有实质上更好的结合至预期的IGF2/CI-MPR受体，用于改善的细胞摄取和递送治疗性药物至靶细胞的溶酶体。该替代的化学修饰/缀合流程生成稳定的中间组分，其可以在最终化学缀合和纯化前被无限贮存。也可以合并不同批次的稳定中间组分以形成较大批用于最终的缀合反应。因此，在此描述的方法代表使得放大用于生产改善的ERTs的化学缀合过程的重大进展。
实例5
除了使用tBoc保护的酰肼交联剂用于vIGF2肽的修饰，还可以使用其它具有不同保护基的交联剂。我们已经化学合成了一种包含甲基苯甲氧基羰基(BOM)保护的酰肼基(NHS-PEG4-BOM-hydrazide)的双功能交联剂用于在vIGF2肽的N-末端引入新酰肼基团。在移除tBoc保护基之后，该化学反应性的酰肼基被暴露用于通过如下产生的腙连接随后缀合至苯甲醛修饰的溶酶体酶。冻干的、经过纯化的vIGF2肽在50mM磷酸钠(pH7.5)/50mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80中在0.6mg/ml下重构并且用20倍摩尔过量的NHS-PEG4-tBoc-酰肼在环境温度下孵育以在N-末端引入新的BOM保护的酰肼基团。通过C4RP-HPLC监测该反应以评估其进展和vIGF2修饰的程度。在vIGF2肽的化学修饰以附接PEG4-BOM-酰肼(图6，中图)时观察到存留时间显著的移位(增加)。vIGF2肽的化学修饰完成后(典型地经过2hrs)，BOM酰肼修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化以移除过量的交联剂和反应副产物，并且被冻干以移除挥发性溶剂。然后，干燥的肽在2％TFA(在dH2O中)中重构并且在环境温度下孵育长达72hrs以移除BOM保护基并将用于随后缀合至溶酶体酶的酰肼基暴露。BOM脱保护的进展也通过C4RP-HPLC监测，并典型地示出，肽的存留时间在移除BOM时减少到接近起始的未修饰vIGF2肽的存留时间(图6，底部图)。在这些实验条件下，完全的BOM基团的脱保护典型的需要大约60hrs。然后，BOM脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化，并且被冻干和干燥贮存直到化学缀合至苯甲醛去修饰的rhGAA。
然后，脱保护的酰肼修饰的vIGF2肽可以如以上实例2中所述被化学缀合至苯甲醛修饰的rhGAA，用于tBoc脱保护的酰肼基vIGF2肽。这些数据显示，可以用包含不同受保护的酰肼基的双功能交联剂化学修饰vIGF2肽，并且在移除保护基之后，相同的化学反应性的酰肼基被生成用于将vIGF2肽缀合至苯甲醛修饰的溶酶体酶。
实例6
也可以通过如下的十分稳定的肟连接将苯甲醛修饰的rhGAA用于化学缀合至氨氧基修饰的vIGF2肽。冻干的、经过纯化的vIGF2肽在50mM磷酸钠(pH7.5)/50mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80中在0.6mg/ml下重构并且用20倍摩尔过量的苯二甲酰亚胺基氧基-PEG12-NHS酯(QuantaBiodesign)在环境温度下孵育以在N-末端引入新的苯二甲酰亚胺基氧基团。vIGF2肽的化学修饰完成后(典型地经过2hrs)，用0.5M肼在环境温度下孵育苯二甲酰亚胺基氧基修饰的vIGF2肽30-60min，以将中间体苯二甲酰亚胺基氧基团转化为所期望的氨氧基团。C4RP-HPLC被用于监测该化学修饰反应以及苯二甲酰亚胺基氧基团转化为氨氧基团。如图7A所示，相比于未修饰的vIGF2肽，氨氧基修饰的vIGF2肽在C4RP-HPLC上的存留时间略微更长。氨氧基修饰的vIGF2肽被TFA酸化，然后通过制备型C4RP-HPLC被纯化以移除过量的交联剂和反应副产物，并且被冻干以移除挥发性溶剂。通过产生的肟连接，干燥的氨氧基修饰的酰肼vIGF2肽被直接用于化学缀合至苯甲醛修饰的rhGAA。简言之，典型地用50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80缓冲液将苯甲醛修饰的rhGAA的蛋白质浓度调节至4-5mg/ml，而且该酶被直接添加到干燥的氨氧基修饰的vIGF2肽(摩尔比率是1摩尔rhGAA:4摩尔vIGF2肽)并且在约20摄氏度下孵育大约16小时。然后，如上所述，在50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/2％甘露醇/0.05％聚山梨酯-80缓冲液中用尺寸排阻色谱法纯化vIGF2肽缀合的rhGAA以移除过量的vIGF2肽。
vIGF2-rhGAA由受体板结合测定表征以确定肟联vIGF2肽是否增加rhGAA结合至预期的IGF2/CI-MPR受体。如图7B所示，vIGF2-rhGAA结合IGF2/CI-MPR受体明显好于未缀合的rhGAA。此外，肟连接十分稳定，且保证了vIGF2肽保持缀合至rhGAA并且只在治疗性药物递送后其在溶酶体降解时被移除。
实例7
也可以使用tBoc保护的氨氧基双功能交联剂通过肟连接将vIGF2肽化学缀合至溶酶体酶。该方法产生氨氧基修饰的vIGF2肽用于化学缀合至苯甲醛修饰的溶酶体酶，无需使用潜在危险的肼的化学转化。简言之，冻干的、经过纯化的vIGF2肽在50mM磷酸钠(pH7.5)/50mMNaCl/0.05％聚山梨酯-80中在0.6mg/ml下重构并且用20倍摩尔过量的双官能交联剂tBoc保护的氨氧基交联剂(具有NHS-或五氟苯基团)在环境温度下孵育以在N-末端引入新的tBoc保护的氨氧基并且被C4RP-HPLC监测。如图8所示(中图)，在vIGF2肽的化学修饰以附接聚乙二醇化的tBoc氨氧基交联剂(中图)时观察到存留时间显著的移位(增加)。vIGF2肽的化学修饰完成后(典型地经过2hrs)，tBoc-氨氧基修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化以移除过量的交联剂和反应副产物，并且被冻干以移除挥发性溶剂。然后，干燥的肽在2％TFA(在dH2O中)中重构并且在环境温度下孵育长达72hrs以移除tBoc保护基并将用于随后缀合至溶酶体酶的氨氧基暴露。tBoc脱保护的进展也通过C4RP-HPLC监测，并典型地示出，肽的存留时间在移除tBoc时减少到接近起始是未修饰vIGF2肽的存留时间(图8，底部图)。在这些实验条件下，完全的tBoc基团的脱保护典型的需要大约50hrs。然后，tBoc脱保护的氨氧基修饰的vIGF2肽通过制备型C4RP-HPLC被纯化，并且被冻干和干燥贮存直到化学缀合至苯甲醛-修饰的溶酶体酶。
实例8
一种如下使用单个的交联剂生成肟连接的vIGF2-rhGAA的替代方法可以通过将氨氧基修饰的vIGF2肽偶联至被化学地氧化的rhGAA实现。通过透析或尺寸排阻色谱法(SEC)将rhGAA缓冲液更换至0.1MNaOAc(pH5.2)，而使用相同的缓冲液将蛋白质浓度调整到5mg/ml。然后，用2mM偏高碘酸钠在4摄氏度下孵育rhGAA30min，以氧化在rhGAA的N-聚糖上的碳水化合物(主要是末端唾液酸和半乳糖)以生成化学反应性醛基用于化学缀合至氨氧基修饰的vIGF2肽。然后，将化学地氧化的rhGAA用0.1MNaOAc(pH5.2)透析或经受SEC以移除过量的偏高碘酸钠。直接以1摩尔rhGAA：4摩尔vIGF2肽的摩尔比率将氧化的rhGAA(在大约4mg/ml下贮存)添加至干燥的氨氧基修饰的vIGF2肽并且在约20摄氏度下孵育大约16小时以形成产生的肟连接。然后，在50mM磷酸钠(pH6.0)/100mMNaCl/2％甘露醇/0.05％聚山梨酯-80缓冲液中用SEC纯化vIGF2肽缀合的rhGAA以移除过量的vIGF2肽。
vIGF2-rhGAA由受体板结合测定表征以确定腙联vIGF2肽是否增加rhGAA结合至预期的IGF2/CI-MPR受体。如图9所示，vIGF2-rhGAA结合IGF2/CI-MPR受体明显好于未缀合的rhGAA。改善的受体结合依赖于vIGF2的存在，因为氧化的rhGAA(缺乏vIGF2肽)显示具有与起始的未缀合的rhGAA酶相似的结合。该受体结合数据还表明，相比SFB(苯甲醛)修饰的rhGAA，更多的vIGF2肽被缀合至化学氧化的rhGAA。由于N-聚糖上有更多的完全可及的并且可以被化学地氧化以形成醛的末端碳水化合物，相比较于SFB修饰的rhGAA(其使用此处所述的流程引入平均2个苯甲醛基团用于缀合至vIGF2肽)，对于缀合至更多的vIGF2肽有高潜力。因此，这些结果证实，氨氧基修饰的vIGF2肽可以被用于偶联至包含醛的溶酶体酶用于至预期的IGF2/CI-MPR受体的改善的结合，以更好的递送治疗性药物。

Claims (28)

1.一种化学缀合的方法，包括：
a.使溶酶体酶与第一交联剂接触以引入醛基；
b.使溶酶体靶向肽与第二交联剂接触以在N-末端残基处引入酰肼基；
c.使步骤a.中具有醛基的溶酶体酶与步骤b中在N-末端残基处具有酰肼基的溶酶体靶向肽接触；并且
d.形成溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中该溶酶体靶向肽包含变体***2(vIGF2)。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一交联剂包含N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(S-4FB)。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第二交联剂包含N-叔丁氧基羰基(tBoc)保护的酰肼交联剂(NHS-PEG4-tBoc-hydrazide)。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该第二交联剂包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。
6.如权利要求1-3或5中任一项所述的方法，其中该双功能交联剂包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，或其任意的组合。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该溶酶体酶包含酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)，酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)，酸性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，酸性α-艾杜糖醛酸酶A(IduA)，酸性艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)，β-己糖胺酶A(HexA)，β-己糖胺酶B(HexB)，酸性α-甘露糖苷酶A，β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)，酸性脂酶(LPA)，或其任意的组合。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该溶酶体酶是人类的。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在N-末端残基处具有酰肼基的该溶酶体靶向肽在步骤c以约4倍摩尔过量进行添加。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中苯胺是在步骤c进行添加。
11.一种双功能交联剂，包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。
12.如权利要求11所述的双功能交联剂，其中该双功能交联剂包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，或其任意的组合。
13.一种修饰的溶酶体靶向肽，包含保护的酰肼基。
14.如权利要求12所述的修饰的溶酶体靶向肽，其中该修饰的溶酶体靶向肽包含修饰的vIGF2肽。
15.如权利要求13或14所述的修饰的溶酶体靶向肽，其中该酰肼基受丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基基团，或其任意的组合的保护。
16.一种制备修饰的溶酶体靶向肽的方法，该方法包含使溶酶体靶向肽与交联剂接触以在N-末端残基处引入酰肼基。
17.如权利要求16所述的方法，其中该溶酶体靶向肽是vIGF2。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中该交联剂包含N-叔丁氧基羰基(tBoc)保护的酰肼交联剂(NHS-PEG4-tBoc-hydrazide)。
19.如权利要求16或17所述的方法，其中该交联剂包含丙酮-、二甲基苄基氧基羰基-、三甲基苄基氧基羰基-保护的酰肼基，或其任意的组合。
20.如权利要求16，17或19中任一项所述的方法，其中该双功能交联剂包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，或其任意的组合。
21.如权利要求16-20所述的方法，该方法进一步包括对该修饰的溶酶体靶向肽的受保护的酰肼基进行脱保护。
22.一种将一个或多个溶酶体靶向肽连接至溶酶体酶的方法，该方法包含：
a.对溶液中酰肼修饰的溶酶体靶向肽进行脱保护，以形成脱保护的酰肼修饰的溶酶体靶向肽；
b.并且将至少一个脱保护的肼修饰的溶酶体靶向肽连接至溶酶体酶。
23.如权利要求22所述的方法，其中该溶酶体靶向肽是vIGF2。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中该溶酶体酶包含酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)，酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)，酸性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，酸性α-艾杜糖醛酸酶A(IduA)，酸性艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)，β-己糖胺酶A(HexA)，β-己糖胺酶B(HexB)，酸性α-甘露糖苷酶A，β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)，酸性脂酶(LPA)，或其任意的组合。
25.一种溶酶体酶-溶酶体靶向肽缀合物，该缀合物包含：一种经由一个或多个双功能交联剂交联至一个或多个溶酶体靶向肽的溶酶体酶。
26.如权利要求25所述的方法，其中该双功能交联剂包含丙酮-保护的NHS-PEG4-酰肼，二甲基苄基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，三甲基苄基氧基羰基-保护的NHS-PEG4-酰肼，N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺(S-4FB)，或其任意的组合。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中该溶酶体酶包含酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)，酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)，酸性β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，酸性α-艾杜糖醛酸酶A(IduA)，酸性艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)，β-己糖胺酶A(HexA)，β-己糖胺酶B(HexB)，酸性α-甘露糖苷酶A，β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)，酸性脂酶(LPA)，或其任意的组合。
28.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中该溶酶体靶向肽包含vIGF2。
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