CN105177143B - 一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于鱼类育种技术领域，具体涉及一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法。其步骤包括：1）构建线纹海马家系，并将每一个家系的子代进行单独饲养；2）亲本和子代DNA提取；3）微卫星标记在亲本和子代中进行PCR扩增；4）采用基因分析仪对微卫星进行基因型分型；5）数据分析，鉴定各子代的亲本来源；6）依据子代海马实际的家系信息对该方法进行可靠性检测。本发明首次在线纹海马中建立了亲子鉴定的方法，其鉴定准确率达到了97.37%。通过该方法，可以控制在线纹海马驯养和选育中的近亲繁殖现象，提高种质水平，促进我国海马养殖产业可持续、健康高效的发展。
Description
技术领域：
本发明属于鱼类育种技术领域，更具体地，涉及一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法。
背景技术：
海马，属海龙科(Syngthidae)、海马属(Hippocampus)，是一种名贵海洋中药材，在我国素有“南方人参”之称，具有补肾壮阳、强心催产、止血镇痛、镇静安神的功效，同时还很高的观赏价值和收藏装饰品的功能。在过去几十年中，由于长期过度捕捞、环境污染和气候变化等因素，海马种质资源受到严重退化的威胁，有些海马种甚至到了灭绝的边缘。为了有效保护海马的种质资源，38种海马被列入《世界自然保护联盟》(IUCN)2012年濒危动物红色名录。线纹海马(Hippocampus erectus Perry,1810)主要分布在大西洋西岸，是典型的热带亚热带型海马种群，其繁殖力强、个体较大、体型优美，其生长速率最快，目前已经发展为我国主要的养殖品种之一。然而，在没有科学***的计划下的生产经营，海马经过多代的繁殖后，经常会表现出体型变小、性早熟、生长速度减缓、繁殖效率及抗病力下降等现象，种质退化的现象非常严重。发明人所在团队在2010-2014年期间，连续对我国部分沿海的海马资源及其养殖现状进行综合调研后，发现我国海马繁殖和养殖模式极其原始，还是非常传统的混养、混交，遗传 谱系不清晰，近交衰退严重，直接导致了大部分海马繁殖效率、后代生活力和生长速度降低。根据实际调查发现，亲本的产卵数量较原代下降了30-60％，幼体成活率仅15-25％，幼海马的生长速度较原代下降30％左右。因此，为了避免或最大限度降低线纹海马的近交衰退，保持清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。
传统的水产动物选择育种中，不同的家系需要分养来维持家系信息，所需水体大且不便管理，而且，每个分养池之间在环境因子上会存在一些差异，对育种相关的遗传参数估计会产生偏差。在混合养殖群体中保持家系信息，大多数畜牧以物理标记为手段，而物理标记对于水产动物存在操作繁琐、对生长有一定影响及对幼体伤害较大等局限性。分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。已应用到虹鳟、罗非鱼、黄颡鱼、团头鲂、大菱鲆和凡纳滨对虾等水产经济动物育种中。目前，尚未见微卫星标记应用于线纹海马家系鉴定的报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是克服现有线纹海马家系鉴定中的不足，提供了一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法，包括如下步骤：
S1.构建线纹海马家系，并将子代进行单独饲养；
S2.对步骤S1中的亲本和子代进行DNA提取；
S3.微卫星标记在S2步骤中的亲本和子代的DNA进行PCR扩增；
S4.采用基因分析仪对步骤S3的微卫星PCR产物进行基因型分型；
S5.对步骤S4中的数据读取和分析，鉴定各子代的亲本来源；
S6.依据海马子代实际的家系信息对步骤S5的分析结果进行可靠性检测；。
优选地，所述S3中采用的微卫星标记的引物序列如下所示：
H.ere-6引物：F：ACCTGCTACCAACCACAA
R：AACAAGGCAACCACTCATT
H.ere-17引物：F：GTTGATGCGACCCACGAT
R：GCCTTGCTCCTTCTCTACG
H.ere-18引物：F：CCAGTTAGCATTGCGTCT
R：TCTTAGCCAGCGAGTGTT
H.ere-15引物：F：TGATGGTTGTGTGAGAAGGA
R：GAGAGAAAAAGACGGCGA
H.ere-20引物：F：CGGGGTAGCAAGGTGAGC
R：CAAGGGGACATTGAAGTAGG
H.ere-22引物：F：TGCCATCATCGCTAACTAA
R：TGCCAAAGACACAAAAAGG
H.ere-30引物：F：TGCCGAATGATGATACAC
R：AATGACGCAATGAGAACA
H.ere-14引物：F：TGAGTCGGTGATGGTTGTG
R：AAAGACGGCGAGAGATAGG
H.ere-26引物：F：AGTGGGTGTCTCTGTAAAC
R：CCTTCGCAGTATTCATTG。
优选地，步骤S3中微卫星标记的引物是在一个扩增体系中进行扩增，S4中PCR扩增产物进行混合再进行基因型分型。
优选地，对步骤S1中的子代进行单独饲养，保持谱系清晰。
优选地，利用醋酸铵/异戊醇法对步骤S2中的亲本和子代的鳍条进行DNA提取。
优选地，步骤S3中的微卫星标记的引物进行5’端荧光基团修饰。
优选地，步骤S3中的微卫星标记PCR扩增的反应体系为10μL，包括：50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mmol/L)，1U Taq酶，dNTPs 0.2mmol/L，正反引物均为0.25μmol/L。
优选地，步骤S3中的微卫星标记PCR扩增的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
优选地，步骤S4中基因型分型的方法为ABI3730XL基因分析仪毛细管电泳分型。
优选地，步骤S5中用GeneScanTM 500ROXTM Size Standard作为内参，并用GeneMapper 4.0软件读取基因型；步骤S5中所读取的数据采用CERVUS 3.0软件对亲本和子代的基因型进行分析，判定子代的亲本。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次在线纹海马上利用多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了97％以上，基于所述多态微卫星标记的线纹海马家系鉴定方法能快速、准确地鉴别线纹海马不同家系，为线纹海马的亲本选配、遗传育种及行为生态学研究提供强有力工具；本发明的应用可使得在生产中不需要将各家系子代分开饲养，节约了养殖设备和管理成本；同时很大程度上减少了环境误差，遗传参数的估计更加准确。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1、线纹海马微卫星标记及特异性引物的获得及验证：
线纹海马样品收集及RNA提取：
从海马养殖公司中挑选30条健康、性腺发育良好的海马，剪取其背鳍鳍条，立即提取total RNA，具体步骤如下：(1)将线纹海马的鳍条约50mg放入预冷的研钵中，利用液氮迅速研磨成粉末，放入2mL离心管中，并加入1mLTRIzol；(2)离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min，待溶液分层；(3)4℃，12,000r/min离心15min，吸取上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min；(5)4℃，12,000r/min离心10min，弃去上清，短暂离心，吸去剩余异丙醇；(6)加入1mL 75％的乙醇，充分洗涤沉淀，4℃，7,500r/min离心5min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该步骤；(7)室 温晾干乙醇，加入20μLDEPC处理水使RNA充分溶解，-80℃保存备用；(8)取1uL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测RNA浓度和质量。
线纹海马转录组的测序、拼接及组装并查找微卫星位点：
应用SMARTTMcDNA文库构建技术，对RNA样品进行cDNA的双链合成，用Trimmer-direct cDNA normalization kit对全长cDNA进行均一化处理。采用Illumina HiSeqTM2000进行测序，获得原始序列。去除原始序列的接头和低质量序列，获得高质量序列，采用Trinity软件对其进行从头组装，得到117327个线纹海马的Unigenes。
用MISA软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，得到39848个微卫星位点，微卫星位点查找时重复次数为5～64，其中22582个单核苷酸重复序列，9311个二核苷酸重复序列，7218个三核苷酸重复序列，645个四核苷酸重复序列，59个五核苷酸重复序列，33个六核苷酸重复序列。
线纹海马基因组DNA提取：
线纹海马DNA的制备采用醋酸铵/异戊醇法进行，具体步骤如下：(1)将线纹海马的鳍条约50mg放入2mL离心管中；(2)离心管中加入600μL的组织裂解液(Tris-HCl 100mM，pH8.0；EDTA 50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl125mM)，用干净的剪刀将组织剪碎；(3)65℃水浴2～4h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀；(4)冷却到室温；(5)向离心管中加入200μL的7.5M的醋酸铵(NH4AC)，混匀，冰上放置5～10min；(6)4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约 500μL)到另一干净1.5mL离心管中；(7)加入等体积的异丙醇，轻摇，放置1～2min；(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；(9)加入1ml 70％预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量TE溶液(200-500μL)溶解DNA样品，每个DNA样品加入10mg/mL RNA酶1μL；(10)取1uL左右的样品进行电泳检测DNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量；(11)将得到的DNA用双蒸水稀释成100ng/μL的工作液，-20℃备用。
微卫星位点PCR扩增和多态性验证：
以线纹海马的DNA为模板，在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列，利用Primer5软件设计微卫星位点的特异性引物，进行PCR扩增，体系为10μL，包括50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1U Taq酶，dNTPs 0.2mM，正反引物均为0.25μM。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(各个微卫星位点的最佳退火温度不同)，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
PCR扩增完成后，利用8％的非变性聚丙烯凝胶电泳验证其多态性，具体步骤如下：(1)胶的制备：用自来水和洗涤剂把玻璃长板和耳板洗净晾干后夹紧，配制PAGE胶(纯水41mL，5×TBE Buffer 14mL,40％丙烯酰胺14mL，10％APS650μL，TEMED65μL)并沿灌胶口灌进两个板中间，轻轻插上梳子，聚合至少2h。(2)电泳：将玻璃板放入电泳槽，上下槽分别加入0.5×TBE Buffer，将梳子拔出并加样，150V恒电压电泳120min。(3)银染：电泳完成后将胶取出，用纯水浸泡片刻；用0.1％AgNO3浸泡并轻摇20min左右；用纯水摇晃洗涤；称 取10gNaOH和0.4gNa2CO3配制0.5L显色液，量取1.5mL甲醛加入其中，轻摇显色；待显色完毕，条带清晰，将胶放在纯水中终止显色；(4)置于凝胶成像***中拍照，筛选出不同位点扩增稳定，条带清晰的微卫星扩增产物(表2)。
表2.实施例1提供的线纹海马微卫星引物信息
实施例2.线纹海马的家系鉴定试验：
线纹海马家系建立及样品收集：
从海马养殖公司中挑选30对健康、性腺发育良好的海马，每一个桶中放入1雌1雄的海马，在人工仿生态条件下诱导其***、产卵、怀孕和产幼。待雄海马孵出幼海马后，立即剪取该配对组的雌、雄海马的背鳍鳍条，并收集刚出生的海马，每个家系10-15条，保存于100％的酒精中，作为家系鉴定的材料。
线纹海马亲本和子代DNA提取：
线纹海马DNA的制备采用醋酸铵/异戊醇法进行，具体步骤如下：(1)将线纹亲本的鳍条约50mg和整只幼海马放入2mL离心管中；(2)离心管中加入600μL的组织裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM)，用干净的剪刀将组织剪碎；(3)65℃水浴2～4h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀。(4)冷却到室温；(5)向离心管中加入200μL的7.5M的醋酸铵(NH4AC)，混匀，冰上放置5～10min；(6)4℃，12000r/min离心10min，并转移上清液(约500μL)到另一干净1.5mL离心管中；(7)加入等体积的异丙醇，轻摇，放置1～2min；(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液；(9)加入1ml 70％预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量TE溶液(200-500μL) 溶解DNA样品，每个DNA样品加入10mg/mL RNA酶1μL。(10)取1uL左右的样品进行电泳检测DNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量；(11)将得到的DNA用双蒸水稀释成100ng/μL的工作液，-20℃备用。
微卫星位点PCR扩增和基因型分型：
以亲本和子代的DNA为模板，用9对微卫星引物(H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14、26)(详见表2)对所有亲本和子代进行PCR扩增，体系为10μL，包括50ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，Mg2+(1.5mM)，1U Taq酶，dNTPs0.2mM，正反引物均为0.25μM。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(各个微卫星位点的最佳退火温度和荧光修饰基团见表2)，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
PCR扩增完成后，从每个个体的每个位点的PCR产物中吸出0.5μL，根据片段的大小和荧光标记的颜色，按照表2的组合所示，将每一个位点的PCR产物混合在一起，作为上机检测的样品。将混合1.5μL的PCR产物样品加入到ABI3730基因分析仪配置的96孔板内，每个孔内加入0.5μL的GeneScanTM350ROXTM标准片段(ABI)，另外在每个孔内加入8μL的GenescanHi-DiTM甲酰胺(ABI)，将96孔板放入PCR仪器内于95℃变性10min，变形后立即置于冰上，然后上样到ABI3730XL型基因分析仪分析。待基因分析仪电泳结束后，用软件GeneMapper4.0做基因型分析，读取各个体在各微卫星位点的基因型。
数据分析：
在线纹海马繁殖亲本在9个微卫星位点的PCR产物经基因分析仪待基因分析仪电泳结束后，根据荧光标记的颜色，用软件GeneMapper 4.0(ABI)做基因型分析，读取各个体在各个微卫星位点的基因型(片段大小)。
用Microsoft Excel统计亲本和子代在9个微卫星位点的基因型，采用软件CERVUS3.0计算子代在各微卫星座位上的等位基因频率、期望杂合度(HE)、观测杂合度(HO)和多态信息含量(PIC)、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率等参数，具体结果见表3。跟据LOD值(亲子鉴定似然比的对数转换值)鉴定152尾个体的父母本。
将鉴定的结果与海马实际家系信息相比较，148尾被准确鉴定，准确率为97.37％。其中4尾没有被准确鉴定，其原因是由于DNA质量问题和操作原因，该样品有的微卫星位点没能够成功分型。
表3.实施例2中9个微卫星引物在线纹海马家系中的检测值
| 微卫星引物 | n | Na | HO | HE | HW | Excl 1 | Excl 2 | F(null) |
| H.ere-6 | 152 | 5 | 0.763 | 0.668 | ** | 0.255 | 0.289 | +0.001 |
| H.ere-17 | 152 | 6 | 0.822 | 0.785 | NS | 0.315 | 0.404 | +0.003 |
| H.ere-18 | 152 | 6 | 0.842 | 0.761 | ** | 0.324 | 0.375 | +0.004 |
| H.ere-15 | 152 | 7 | 0.888 | 0.767 | NS | 0.432 | 0.368 | -0.001 |
| H.ere-20 | 152 | 5 | 0.789 | 0.678 | NS | 0.268 | 0.289 | +0.012 |
| H.ere-22 | 152 | 6 | 0.739 | 0.682 | NS | 0.366 | 0.368 | +0.008 |
| H.ere-30 | 152 | 6 | 0.645 | 0.612 | ** | 0.322 | 0.354 | -0.007 |
| H.ere-14 | 152 | 8 | 0.743 | 0.674 | ** | 0.452 | 0.486 | +0.005 |
| H.ere-26 | 152 | 4 | 0.895 | 0.822 | ** | 0.218 | 0.225 | +0.011 |
| Totalexclusion | 5.89 | 0.995 | 0.999 |
注：Na为等位基因数目，n为检测家系子代个体数目，HO为观察杂合度，HE为期望杂合度，HW为哈迪温伯格平衡检验，NS表示符合，**表示偏离显著，Excl 1表示父本排除率，Excl 2表示母本排除率，F(null)表示无效等位基因频率，Total exclusion表示累积排除率。
对比例1：
方法同实施例2，不同的是采用的引物为表2中的H.ere-1、2、3、4、5、8、9、24和25，其结果显示如表4：
表4.对比例1中9个微卫星引物在线纹海马家系中的检测值
| 微卫星引物 | n | Na | HO | HE | HW | Excl 1 | Excl 2 | F(null) |
| H.ere-1 | 152 | 2 | 0.691 | 0.732 | ** | 0.078 | 0.058 | +0.005 |
| H.ere-2 | 152 | 3 | 0.711 | 0.756 | ** | 0.189 | 0.228 | +0.024 |
| H.ere-3 | 152 | 2 | 0.809 | 0.821 | ** | 0.112 | 0.125 | +0.004 |
| H.ere-4 | 152 | 2 | 0.842 | 0.867 | ** | 0.145 | 0.142 | -0.008 |
| H.ere-5 | 152 | 3 | 0.724 | 0.762 | ** | 0.215 | 0.252 | +0.002 |
| H.ere-8 | 152 | 3 | 0.513 | 0.622 | ** | 0166 | 0.168 | +0.014 |
| H.ere-9 | 152 | 2 | 0.559 | 0.582 | ** | 0.085 | 0.096 | -0.0015 |
| H.ere-24 | 152 | 2 | 0.737 | 0.789 | ** | 0.0788 | 0.105 | +0.0000 |
| H.ere-25 | 152 | 2 | 0.888 | 0.856 | ** | 0.112 | 0.124 | +0.0004 |
| Totalexclusion | 2.33 | 0.435 | 0.576 |
从表中看出，利用该9对微卫星引物进行家系鉴定，其等位基因数量、父本和母本的排除率远远低于本发明所采用的H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14和26这9对微卫星标记的排除率。在实际应用中，利用该9对微卫星引物进行家系鉴定的准确率仅为54.25％，远低于本发明所采用的H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14和26这9对微卫星标记的准确率(97.37％)。因此，在进行线纹海马家系鉴定时，本发明所采用的微卫星引物远远优于其他引物。
同时，本发明发现，本发明所提供的9对引物在应用于PCR扩增后，需要将全部PCR产物进行混合，才能获得最佳的家系鉴定效果。
通过本实验，筛选到了9对(H.ere-6、17、18、15、20、22、30、14、26)多态性高、扩增稳定、杂带少的微卫星标记；而其他的微卫星标记不能达到该家系鉴定的效果。
其中，根据实施例2各引物分别扩增获得的微卫星序列如SEQ.ID.NO:1～9所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法
<130>
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 1
<400> 1
atccaagaga agacatttga atgttgcacc gctacaattg tcttgcaacc gcagaatgtc 60
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<212> DNA
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ggtggtccct tcatgctcta gttggtggtc gtagagaagg agcaaggcac tcagcatctc 360
cctgctgccg atgatggtgg ccacatcctg gaggggggaa gccggccttg gaaagcgagt 420
cactacaatg gcaaatacat gctaacagca actgaacaca aagctgaaac aagaaaccaa 480
caggctgaag tttcatcc 498
<210> 3
<211> 423
<212> DNA
<213> 3
<400> 3
ccccaaaaac aattcaaaca gaaaaaaaca gaggcgtatt tggcaaatgg atccacactg 60
tatgcttaaa tgtcttctag acgttgagaa gcagctgtgg gcgtggccac agctagcgat 120
gctatcatga gccagttagc attgcgtctc acatgcccac aaaaaacccc cccaacaaca 180
acaacaacaa tgaaggatac acaatgagga gtaaggttat aacactcgct ggctaagagc 240
acttttcgaa cgtggagagc tagcatagac tagcgaagca tagcatcacc tcaccaaatg 300
attacaacgg caagctcttg tgtctgtttt cgtcagtgcg caacaagtga gaacttgtgg 360
aaaaaagaaa caatctttat gattccaaac atacatacag acttttccgt tacacatttt 420
cta 423
<210> 4
<211> 498
<212> DNA
<213> 4
<400> 4
gcttcgaccc cgcccactca ctctccacag cctccggctg ccccgcctcc ggtgccatcc 60
ccgacatcct cggccacgca aaacgccctc gaccagcaga gggagatggc gcgccgtcgt 120
gagcaggaga ggcgcaggag ggaggcgatg gccgacacca ttgacattaa cttccagagc 180
gacctgatgg ccatttttga agagaatctc ttctgagtcg gtgatggttg tgtgagaagg 240
acctacacac acacacacac acacactgag gtggtgagct tatatacagt acatgccccc 300
acatgatcat ccgcatacgg actacatagt acctgtcccc tatctctcgc cgtctttttc 360
tctcggagcg cagatacgtt ttggtgtctg acgtgatgtt tatagttgtt ggctcgcaaa 420
gtggagttta aaaaaaaaaa agtcctataa aaggcagagt catagtcaag gggggtgcga 480
caaaactaaa ctgaagaa 498
<210> 5
<211> 507
<212> DNA
<213> 5
<400> 5
aaaaacaggt taaaacgaaa aagtgtctca ccattgtatg agttaaaaaa accttaaaac 60
aataacaaag gggttttact gtgtcgaggg gcggggtagc aaggtgagcg cttacctgga 120
tggtggcagt gctgcttcgg ctcaaggata atcagtcctc cagatttaga gcatattatg 180
tccgcacgtg gggtgtctcg ccgaattgag tagtctccca agcactgtaa ttaggcaccc 240
aatattccgg taccagatcg tgtgtgtgtg tgtgtttgga aaaacgtaat tccaaaactt 300
gttagccagg cccagtagtc tcttctttat gggcgtggta tcatagacat gaaacctact 360
tcaatgtccc cttgagcgtt tggcaacgtt gctaaaatac gccagcgcgc ccgccatatt 420
ggatgtgtcc tctctcatcc gtaggtaaat acaacctgat gggcaaaata ccaagcgcaa 480
taaaatgaat taatataacc cgattac 507
<210> 6
<211> 491
<212> DNA
<213> 6
<400> 6
cagcaaccgt tggtggacgc aggagggttg gggaggcacg accccctcac ctccaaaaac 60
aagacaccag gatgagactc cacccggacg aggtcgcctc cgctgaaggg aagcgggccg 120
atgccaacga cgggggttgc gggaccgcgc gcatgccatc atcgctaact aaacagatgt 180
acacacaaca cacccataga acaaaagcac acacccacag tcacacacac atggaacaaa 240
agcacacaca aacacgcaca catccacaca cacacacgag tggatcggca ggacgagttt 300
gtccacgccg gacatcctcc caagtccacg cgaggctttt tcgtggcctt tttgtgtctt 360
tggcaaatct gagggtgagc gaggaccctg cagtggtcgg gtgacttgga agattgaatt 420
cctcactatt tctttccttg ctgaggaaga cgacgaggac gtctaaacat gtaaatgcgc 480
aaaagatggg a 491
<210> 7
<211> 289
<212> DNA
<213> 7
<400> 7
cttgccgaat gatgatacac cctgcacgtg tagcacatct gcgcgcacgc acacacacac 60
acacacacac acgcatgcat gcagcagaca cacaaactcc aacctcatta cacttaaaag 120
tgtaaaaata aaataaacac aagtcgtgtc agttctgccc aaaaactcaa acaggagtcc 180
cggctccgct tgggcacttt gacccattta gtgtgctttg ttctcattgc gtcatttaag 240
gtgcaagctt ccttttcttt taaaacacag ctcaacccgt tccatacaa 289
<210> 8
<211> 498
<212> DNA
<213> 8
<400> 8
gcttcgaccc cgcccactca ctctccacag cctccggctg ccccgcctcc ggtgccatcc 60
ccgacatcct cggccacgca aaacgccctc gaccagcaga gggagatggc gcgccgtcgt 120
gagcaggaga ggcgcaggag ggaggcgatg gccgacacca ttgacattaa cttccagagc 180
gacctgatgg ccatttttga agagaatctc ttctgagtcg gtgatggttg tgtgagaagg 240
acctacacac acacacacac acacactgag gtggtgagct tatatacagt acatgccccc 300
acatgatcat ccgcatacgg actacatagt acctgtcccc tatctctcgc cgtctttttc 360
tctcggagcg cagatacgtt ttggtgtctg acgtgatgtt tatagttgtt ggctcgcaaa 420
gtggagttta aaaaaaaaaa agtcctataa aaggcagagt catagtcaag gggggtgcga 480
caaaactaaa ctgaagaa 498
<210> 9
<211> 510
<212> DNA
<213> 9
<400> 9
ggatcagttt caccctgaag tcattttgtg acggatcaga aggcgtccga gttggatgga 60
ggtgaatgga acacaagtag caggatgcga cgtgtgccat atgtgcgagg ccattgcatt 120
gcgacgcctc tgtctgtctg tctgtctgtg agtgggtgtc tctgtaaaca cgtgtgcggc 180
ttacacgggg tgtggaattc accaacgaat gagaaagcac tgtgcagggt gcggccttat 240
tgcttactaa gggcaggccc ttttgtttgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gagtgcgtgt 300
gcgtgtgtcg tactatgcgt atgactaaat gtagacatca ctgaatgagg aatgtacagc 360
aatgaatact gcgaagggaa tattaacttg cactaaaaaa aaaataaaaa aaagattaaa 420
aaaacccaac aaaactgaaa aaaaaaatgg acacacactc acacacacaa tacttgattc 480
catgagtcag ttttatcata ggtctccgtc 510
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 10
<400> 10
acctgctacc aaccacaa 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 11
<400> 11
aacaaggcaa ccactcatt 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 13
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gttgatgcga cccacgat 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 13
<400> 13
gccttgctcc ttctctacg 19
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 14
<400> 14
ccagttagca ttgcgtct 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 15
<400> 15
tcttagccag cgagtgtt 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 16
<400> 16
tgatggttgt gtgagaagga 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 17
<400> 17
gagagaaaaa gacggcga 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 18
<400> 18
cggggtagca aggtgagc 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 19
<400> 19
caaggggaca ttgaagtagg 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 20
<400> 20
tgccatcatc gctaactaa 19
<210> 21
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<212> DNA
<213> 21
<400> 21
tgccaaagac acaaaaagg 19
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 22
<400> 22
tgccgaatga tgatacac 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 23
<400> 23
aatgacgcaa tgagaaca 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 24
<400> 24
tgagtcggtg atggttgtg 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 25
<400> 25
aaagacggcg agagatagg 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 26
<400> 26
agtgggtgtc tctgtaaac 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 27
<400> 27
ccttcgcagt attcattg 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 28
<400> 28
tcggcataga ttttgaggc 19
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 29
<400> 29
gacccgctga cattttcg 18
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 30
<400> 30
ccagccagta gtctttcctt 20
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 31
<400> 31
accctccctt gctttcat 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 32
<400> 32
tccaccaaac attgagtaac 20
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 33
<400> 33
gccagcagga ccataaag 18
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 34
<400> 34
cccacaggaa atgccaatc 19
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 35
<400> 35
gacccaacca gggaacca 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 36
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agagcgggaa ggatgtga 18
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 37
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tgtggaatga ggaggaaggt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
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atgttgcctc ttttgatttg 20
<210> 39
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<212> DNA
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ctctggtgcg atgtggtg 18
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 40
<400> 40
cggaagccac atctaaaca 19
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 41
<400> 41
catccacatc cacccact 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 42
<400> 42
acaaaagcca agtgacca 18
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 43
<400> 43
agcagttccg tgtaagtaat c 21
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 44
<400> 44
cctgctggca aatctgtt 18
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 45
<400> 45
ggagtggtcc tcggtaaag 19
Claims (8)
1.一种线纹海马微卫星家系鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 构建线纹海马家系，并将子代进行单独饲养；
S2. 对步骤S1中的亲本和子代进行DNA提取；
S3. 微卫星标记在S2步骤中的亲本和子代的DNA进行PCR扩增；
S4. 采用基因分析仪对步骤S3的微卫星PCR扩增产物进行基因型分型；
S5. 对步骤S4中的数据读取和分析，鉴定各子代的亲本来源；
S6. 依据海马子代实际的家系信息对步骤S5的分析结果进行可靠性检测；
其中，所述S3中微卫星标记的引物如下所示：
H.ere-6 引物：F：ACCTGCTACCAACCACAA
R：AACAAGGCAACCACTCATT
H.ere-17 引物：F：GTTGATGCGACCCACGAT
R：GCCTTGCTCCTTCTCTACG
H.ere-18 引物：F：CCAGTTAGCATTGCGTCT
R：TCTTAGCCAGCGAGTGTT
H.ere-15 引物：F：TGATGGTTGTGTGAGAAGGA
R：GAGAGAAAAAGACGGCGA
H.ere-20 引物：F：CGGGGTAGCAAGGTGAGC
R：CAAGGGGACATTGAAGTAGG
H.ere-22 引物：F：TGCCATCATCGCTAACTAA
R：TGCCAAAGACACAAAAAGG
H.ere-30 引物：F：TGCCGAATGATGATACAC
R：AATGACGCAATGAGAACA
H.ere-14 引物：F：TGAGTCGGTGATGGTTGTG
R：AAAGACGGCGAGAGATAGG
H.ere-26 引物：F：AGTGGGTGTCTCTGTAAAC
R：CCTTCGCAGTATTCATTG。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中PCR扩增产物进行混合再进行基因型分型。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用醋酸铵/异戊醇法对步骤S2中的亲本和子代的鳍条进行DNA提取。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中的微卫星标记的引物进行5’端荧光基团修饰。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中的微卫星标记PCR扩增的反应体系为10 μL，包括：50 ng基因组DNA，1× PCR缓冲液，浓度为1.5 mmol/L的Mg2+，1 U Taq酶，dNTPs 0.2 mmol/L，正反引物均为0.25 μmol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中的微卫星标记PCR扩增的PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸8min，最后4℃保存。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中基因型分型的方法为ABI3730XL基因分析仪毛细管电泳分型。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中用GeneScanTM 500 ROXTM SizeStandard作为内参，并用GeneMapper 4.0软件读取基因型；步骤S5中所读取的数据采用CERVUS 3.0软件对亲本和子代的基因型进行分析，判定子代的亲本。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |