CN117487931B - 一种多鳞鱚耐低氧性状相关snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记，为以下5个SNP分子标记中的一个或几个，分别位于如SEQ ID NO：1所示SsMGST3b基因核苷酸序列自5’端起的第583、611、629、633和937位，第583位碱基为T或C，第611位碱基为A或G，第629位碱基为T或A，第633位碱基为T或A，第937位碱基为A或G，基因型为CT，AG，AT，AT和AA的个体耐低氧能力显著强于其他基因型个体，还公开了用于扩增SNP分子标记的引物和包括所述引物的试剂盒以及利用所述引物检测多鳞鱚耐低氧能力的方法，以及上述SNP分子标记、引物、试剂盒或检测方法在鉴别或选育耐低氧性状多鳞鱚品种中的应用。

Description

一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记及其应用。
背景技术
多鳞鱚(Sillago sihama)隶属鲈形目、鱚科、鱚属，为热带印度-西太平洋浅海鱼类，广泛分布于我国沿海地区。该鱼肉质细嫩，味道鲜美，不饱和脂肪酸含量十分丰富，营养价值高，深受消费者喜爱，具有重要的经济价值。多鳞鱚对环境应激敏感，因此培育出具有耐低氧的优良性状品系是保障多鳞鱚养殖业可持续发展的必要条件。
本申请发明人所在课题组早期突破了多鳞鱚全人工繁育技术，实现了其全人工规模化育苗，为下一步多鳞鱚良种选育奠定了基础。然而，多鳞鱚养殖苗种缺乏定向选育，存在因近亲繁殖导致的生长速度减慢、抗逆性能下降等性状退化风险，严重限制了其养殖业的健康发展，亟需开展分子遗传育种研究，解析重要经济性状相关遗传机制。近年来，学界在多鳞鱚缺氧、盐度的耐受性，群体遗传学，人工繁殖，基因组学等方面进行了探索研究，但尚未见分子标记开发及相关应用报道。
分子标记辅助选择育种是近年发展起来的一种结合传统遗传育种与现代分子生物学的鱼类遗传育种方法，针对改良选育物种的重要经济性状，利用DNA分子标记对育种材料进行选择的育种方法。随着分子生物技术的发展，分子标记辅助育种在鱼类育种工作中越来越重要，为鱼类育种开辟了一条新的途径，并表现出其独特的优越性。
单核酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)标记作为第三代分子标记具有多态性高、遗传稳定和检测方便等优点，可以用于研究基因型与表型之间的关联，已广泛应用于动植物分子育种研究领域。
目前尚未见到有关多鳞鱚耐低氧性状相关基因的SNP分子标记的报道。SNP分子标记可以用于分析多鳞鱚的耐低氧性状，对多鳞鱚进行遗传改良，提高其养殖效率和适应性，增加其经济价值和生态价值，揭示其遗传机制和分子调控网络，为理解动物对缺氧环境的适应机制提供新的视角和思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记，所述SNP分子标记与低氧胁迫下多鳞鱚的存活率显著相关。
本发明的目的还在于提供一种用于扩增所述SNP分子标记的引物和包括所述引物的试剂盒以及利用所述引物检测多鳞鱚耐低氧能力的方法。
本发明的最后一个目的在于提供上述SNP分子标记、引物、试剂盒或检测方法在鉴别或选育耐低氧性状多鳞鱚品种中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记，所述SNP分子标记为以下5个SNP分子标记中的一个或几个，所述5个SNP分子标记分别位于如SEQIDNO：1所示SsMGST3b基因核苷酸序列自5’端起的第583、611、629、633和937位，其中第583位的碱基为T或C，第611位的碱基为A或G，第629位的碱基为T或A，第633位的碱基为T或A，第937位的碱基为A或G。
本发明以多鳞鱚SsMGST3b基因的SNP位点为研究目标，发现位于SsMGST3b基因的内含子区域5个SNP位点(g.583T>C；g.611A>G；g.629T>A；g.633T>A；g.937A>G)与多鳞鱚耐低氧性状显著相关，因此筛选获得了上述5个SNP分子标记。
本发明经过进一步的试验发现，所述多鳞鱚SsMGST3b基因的SNP位点鉴定中：
g.583T>C的CT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体；
g.611A>G的AG基因型个体的耐低氧性状显著高于AA基因型个体；
g.629T>A的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体；
g.633T>A的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体；
g.937A>G的AA基因型个体的耐低氧性状显著高于AG基因型个体。
位于多鳞鱚SsMGST3b基因的内含子区域的5个SNP位点的各基因型耐低氧性状具有显著差异(P<0.05)。
即本发明第583位SNP分子标记的CT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体，第611位SNP分子标记的AG基因型个体的耐低氧性状显著高于AA基因型个体，第629位SNP分子标记的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体，第633位SNP分子标记的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体，第937位SNP分子标记的AA基因型个体的耐低氧性状显著高于AG基因型个体。
所述耐低氧性状为可以在较低溶解氧的环境中存活，例如溶解氧浓度从窒息点溶解氧浓度(1.5mg/L左右)至正常溶解氧浓度(7mg/L左右)范围区间内。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于扩增所述SNP分子标记的引物，所述引物正向引物SsMGST3b-F和反向引物SsMGST3b-R，所述正向引物SsMGST3b-F的碱基序列如SEQID NO：2所示，所述反向引物SsMGST3b-R的碱基序列如SEQ IDNO：3所示。
具体地，正向引物SsMGST3b-F和反向引物SsMGST3b-R的核苷酸序列如下：
正向引物SsMGST3b-F:5’-ACAGCGACAAGGAGCAAGTATTCAA-3’(如SEQID NO：2所示)；
反向引物SsMGST3b-R:5’-CAGTGGCAGATGAGAAGGTGGATG-3’(如SEQID NO：3所示)。
本发明还提供了一种用于检测多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。
本发明还进一步提供了一种多鳞鱚耐低氧能力的检测方法，包括以下步骤：
(S1)提取待测多鳞鱚尾鳍的基因组DNA；
(S2)采用上述的引物，将待测多鳞鱚尾鳍的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(S3)对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP分子标记的基因型；
(S4)通过基因型确定待测多鳞鱚的耐低氧能力。
在该多鳞鱚耐低氧能力的检测方法中：
优选地，步骤(S2)中PCR扩增时采用的PCR反应体系为40μL，包括：PCRSuperMix 20μL，10mM正向引物和反向引物各2μL，40ng/μL DNA模板2μL，ddH2O 14μL。
优选地，步骤(S2)中PCR扩增时，采用的PCR反应程序共计35个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环结束后于72℃延伸10min。
优选地，步骤(S4)中通过基因型确定待测多鳞鱚的耐低氧能力，其中g.583T>C的CT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体；g.611A>G的AG基因型个体的耐低氧性状显著高于AA基因型个体；g.629T>A的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体；g.633T>A的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体；g.937A>G的AA基因型个体的耐低氧性状显著高于AG基因型个体。
位于多鳞鱚SsMGST3b基因的内含子区域的5个SNP位点的各基因型耐低氧性状具有显著差异(P<0.05)。
本发明提供的检测多鳞鱚耐低氧性状的方法，通过对待测多鳞鱚进行上述SNP分子标记的检测，确定待测多鳞鱚的耐低氧能力。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述SNP分子标记、上述引物、上述试剂盒或上述检测方法在鉴别或选育耐低氧性状多鳞鱚品种中的应用。
总的来说，本发明公开了一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记及其应用，本发明通过对多鳞鱚的耐低氧性状进行筛选，发现了5个与多鳞鱚耐低氧性状显著相关的SNP位点以及用于扩增所述SNP位点的一对引物(碱基序列分别如SEQID NO：2所示和SEQ ID NO：3所示)。所述SNP位点分别位于SsMGST3b基因核苷酸序列(如SEQ NO：1所述)自5’端起的第583、611、629、633和937位，SNP位点表示为g.583T>C；g.611A>G；g.629T>A；g.633T>A和g.937A>G。本发明公开的SNP位点与低氧胁迫下多鳞鱚的存活率显著相关，SNP位点中基因型为CT，AG，AT，AT和AA的个体耐低氧能力显著强于其他基因型个体，可以用于进行多鳞鱚分子标记辅助育种和遗传改良，提高多鳞鱚的耐低氧能力，增加养殖效益。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明以多鳞鱚SsMGST3b基因的SNP位点为研究目标，发现位于SsMGST3b基因的内含子区域5个SNP位点(g.583T>C；g.611A>G；g.629T>A；g.633T>A；g.937A>G)与多鳞鱚耐低氧性状显著相关；
(2)其中g.583T>C的CT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体(P<0.05)；g.611A>G的AG基因型个体的耐低氧性状显著高于AA基因型个体(P<0.05)；g.629T>A的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体(P<0.05)；g.633T>A的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体(P<0.05)；g.937A>G的AA基因型个体的耐低氧性状显著高于AG基因型个体(P<0.05)；
(3)本发明公开的SNP位点与低氧胁迫下多鳞鱚的存活率显著相关，SNP位点中基因型为CT，AG，AT，AT和AA的个体耐低氧能力显著强于其他基因型个体，可以用于进行多鳞鱚分子标记辅助育种和遗传改良，提高多鳞鱚的耐低氧能力，增加养殖效益；
(4)在以耐低氧性状为选育指标的多鳞鱚遗传育种研究过程中，可以优先选择g.583T>C位点为CT，g.611A>G位点为AG，g.629T>A位点为AT，g.633T>A位点为AT，和g.937A>G位点为AA的个体作为育种亲本，这对多鳞鱚优良耐低氧性状新品种的选育具有重要的指导意义。
附图说明
图1为实施例1中利用SsMGST3b-F引物对PCR扩增产物进行测序的测序峰图，测序采用正向引物SsMGST3b-F，A中所示为g.583T>C位点位置，B中所示为g.611A>G位点位置，C中所示为g.629T>A和g.633T>A位点位置，D中所示为g.937A>G位点位置。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。除非特别说明，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。
实施例1
本实施例提供的多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记的筛选及验证方法，包括以下步骤：
(S1)多鳞鱚群体的获得
试验在广东海洋大学东海岛养殖基地进行。实验开始前，挑选体型良好的性成熟雌雄个体为亲本，一对一繁殖构建F1全同胞家系。在此条件下，将育苗场地设置在一个混凝土水池(5.8m×4.8m×1.8m)，温度为27±0.5℃，pH值为7.2±0.6，溶解氧7.1±0.5mg/L。经过一年的饲养，随机选择109尾12月龄多鳞鱚进行低氧胁迫处理，测量并记录耐低氧性状(min)表型数据。
(S2)对多鳞鱚进行低氧胁迫处理
向水体中注入氮气降低溶解氧的含量，使溶解氧水平保持在1.5mg/L(窒息点溶解氧浓度)以达到低氧的环境，每尾鱼从开始低氧处理到产生浮头现象的时间作为耐低氧表型性状数据。根据记录的实验鱼浮头时间的长短，从刚开始浮头到最后一条鱼浮头的个体中，收集109尾个体，用于基因组DNA提取。
(S3)提取待测多鳞鱚DNA
剪取109尾个体的鳍条组织，根据CTAB法提取样本基因组DNA，具体操作步骤如下：
(1)用浓度为100mg/L的MS-222将空腹一天的鱼全部麻醉。为了进行后续的DNA提取，剪取每尾个体的鳍条，鳍条样本于液氮中冷冻保存；
(2)用CTAB技术对样本进行DNA的分离，样本在液氮的条件下经过适当地研磨，将大约0.1g的液体输送到一个预先冷却的离心管内，再添加CTAB和β-巯基乙醇溶液；
(3)将该混合样本置于65℃的水浴中大约1小时，确保在水浴中搅拌均匀，随后将样本移至离心机，12,000rpm离心10min；
(4)加入苯酚、氯仿、异丙醇的混合液，混匀后12,000rpm离心10min，将上层水相移至新的离心管中；
(5)加入氯仿和异丙醇的混合液，混匀后12,000rpm离心10min，将上层水相移至新的离心管中；
(6)用异丙醇和无水乙醇对样品进行沉淀与洗涤，离心，弃上清液；
(7)上述步骤反复进行一次，进行短暂离心，吸干乙醇，干燥，然后添加适当的ddH2O，放置-20℃下保存；
(8)最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性，用NanoDrop2000微量分光光度计检测其浓度及纯度。
(S4)PCR扩增目的片段
多鳞鱚SsMGST3b基因(如SEQIDNO：1所示)在低氧胁迫下显著差异表达，属于谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因超家族，在鱼类对环境胁迫的反应中具有重要作用。
多鳞鱚SsMGST3b基因核苷酸序列(如SEQIDNO：1所示)如下：
利用Primer6从多鳞鱚SsMGST3b基因核苷酸序列中设计引物，引物包括正向引物SsMGST3b-F和反向引物SsMGST3b-R，分别如下所示：
正向引物SsMGST3b-F:5’-ACAGCGACAAGGAGCAAGTATTCAA-3’(如SEQIDNO：2所示)；
反向引物SsMGST3b-R:5’-CAGTGGCAGATGAGAAGGTGGATG-3’(如SEQIDNO：3所示)。
以步骤(S3)提取的多鳞鱚DNA为模板，用DNA聚合酶对目的片段(769bp)进行PCR扩增，特异性引物PCR扩增目的片段如SEQIDNO：4所示所示，其中SNP分子标记序列在方括号中。
acagcgacaaggagcaagtattcaactgcatccagagagcacaccagaacaccctggaggtgtaccctcagtggcttgttttccagaccattgcagctcttgtctacccggtatgtgcaatttatcca[t(g.583T>C)]acagtcataattaagtttgtgcgggat[a(g.611A>G)]cctacattcttttacaa[t(g.629T>A)]gtt[t(g.633T>A)]cttggacttattagcgcatatcaagtacaaatctcacctcacacactcaccgtgccgtgtgtgtgggaggggcatgcagcactcgggatcatgatctttgccatacattcacagataacagtcatacacaaaaaccactcactgtgaataagcatattttcaccccagtctgttgcagtgttgcatttcctcttgtgtaattctgtgtttctttgttcaccgtctcagttatcagcatcggtgctgggggctatttgggtgaccagcaggttttcctacgcctggggctattacacaggaggt[a(g.937A>G)]agactgacaatacattgacttaaaataataataatataaaatagaagcacttcatgggggccaaaagcacctaaactgagttcacctacacttctactagatttccacacatctgtattgaaaatttgatacatgtaaaacatagaacacctagggttgaatgtaattcaataaagtaaatgtgtgaaatggtttggggatatagtcatttgtgctggaggctgcagtgctttataatgcgcattgacttaaggtcatagttcatccaccttctcatctgc cactg(SEQIDNO：4所示)。
其中下划线表示正向引物和反向引物(正向序列，反向互补后即SsMGST3b-R的碱基序列)所在位置，方括号表示检测的SNP位点。
其中：
PCR反应体系为40μL：PCRSuperMix20μL，10mM正向引物和反向引物各2μL，40ng/μLDNA模板2μL，ddH2O14μL。
PCR反应程序共计35个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环结束后于72℃延伸10min。
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后产物进行测序反应。
(S5)对PCR扩增产物进行测序，确定SNP位点的基因型
基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的多鳞鱚109尾个体的PCR扩增产物于ABI3730XL测序仪上进行双向测序，基于测序结果，将多鳞鱚SNP位点进行基因分型。
图1是利用SsMGST3b-F引物对PCR扩增产物进行毛细管电泳检测的峰型例图，测序采用正向引物SsMGST3b-F，图1中A图所示为g.583T>C位点位置，图1中B图所示为g.611A>G位点位置，图1中C图所示为g.629T>A和g.633T>A位点位置，图1中D图所示为g.937A>G位点位置。
因此，本实施例得到了一种多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记，包括5个SNP分子标记中的一个或几个，其中5个SNP分子标记如下：g.583T>C；g.611A>G；g.629T>A；g.633T>A；g.937A>G。
(S6)SNP位点基因型与多鳞鱚耐低氧性状的相关性分析
采用SPSS26的一般线性模型中的单因素方差分析，检测各SNP位点的基因型与耐低氧数量性状的相关分析，对于表达显著的SNP位点，采用Ducan法进行多重比较分析，分析结果如下：
表1多鳞鱚SsMGST3b基因SNP位点与耐低氧性状的相关性
结果显示：多鳞鱚SsMGST3b基因上5个SNP位点(g.583T>C；g.611A>G；g.629T>A；g.633T>A；g.937A>G)上CT，AG，AT，AT，AA为优势基因型，且各位点的基因型与耐低氧性状之间呈显著性差异(P<0.05)，具有统计学意义。表明在培育耐低氧性状多鳞鱚群体的过程中，上述5个SNP位点是与耐低氧能力显著相关的SNP位点。
因此，基因型为CT，AG，AT，AT，AA的多鳞鱚个体低于窒息点溶解氧水体中存活时间均值与基因型为CC或TT，GG或AA，TT或AA，TT或AA，GG或AG的多鳞鱚个体达到显著性差异。
所以，可以将SNP分子标记应用于耐低氧多鳞鱚群体筛选中，多鳞鱚SsMGST3b基因上5个SNP位点(g.583T>C；g.611A>G；g.629T>A；g.633T>A；g.937A>G)基因型为CT，AG，AT，AT，AA的个体可以作为养殖对象，培育耐低氧多鳞鱚群体。
本发明还可以进一步开发用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，包括上述的引物。
本发明所述的SNP分子标记应用在多鳞鱚耐低氧性状的选育过程时，具体是在多鳞鱚选育过程中，对多鳞鱚育种的候选群体进行该SNP位点的基因型检测，再结合其他与生长性状、抗病、抗逆性状相关的位点的基因型，优先选择本发明所述SNP基因型为CT，AG，AT，AT，AA的个体作为选育耐低氧性状的多鳞鱚亲本。
因此，本发明中的SNP分子标记、引物对或试剂盒可以在多鳞鱚低氧性状的鉴别以及选择育种方面应用。
此外，本发明上述SNP分子标记、引物以及试剂盒在评价多鳞鱚耐低氧能力的应用，也属于本发明的保护范围。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

Claims (4)

1.一种多鳞鱚耐低氧性状的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（S1）提取待测多鳞鱚尾鳍的基因组DNA；
（S2） 采用用于扩增多鳞鱚耐低氧性状相关SNP分子标记的引物，将待测多鳞鱚尾鳍的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
（S3）对PCR扩增产物进行测序，基于测序结果，确定SNP分子标记的基因型；
（S4）通过基因型确定待测多鳞鱚的耐低氧性状；
步骤（S2）中所述引物包括正向引物SsMGST3b-F和反向引物SsMGST3b-R，所述正向引物SsMGST3b-F的碱基序列如SEQID NO：2所示，所述反向引物SsMGST3b-R的碱基序列如SEQ IDNO：3所示；
步骤（S2）中所述SNP分子标记为以下5个SNP分子标记，所述5个SNP分子标记分别位于如SEQIDNO：1所示SsMGST3b基因核苷酸序列自5，端起的第583、611、629、633和937位，其中第583位的碱基为T或C，第611位的碱基为A或G，第629位的碱基为T或A，第633位的碱基为T或A，第937位的碱基为A或G；
步骤（S4）中：第583位SNP分子标记的CT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体，第611位SNP分子标记的AG基因型个体的耐低氧性状显著高于AA基因型个体，第629位SNP分子标记的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体，第633位SNP分子标记的AT基因型个体的耐低氧性状显著高于TT基因型个体，第937位SNP分子标记的AA基因型个体的耐低氧性状显著高于AG基因型个体。
2.根据权利要求1所述的多鳞鱚耐低氧性状的检测方法，其特征在于：步骤（S2）中PCR扩增时采用的PCR反应体系为40μL，包括：2×EasyTaq® PCR SuperMix 20μL，10 mM正向引物和反向引物各2μL，40 ng/μL DNA模板2μL，ddH2O 14μL。
3.根据权利要求1所述的多鳞鱚耐低氧性状的检测方法，其特征在于：步骤（S2）中PCR扩增时，采用的PCR反应程序共计35个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，循环结束后于72℃延伸10min。
4.权利要求1-3任一项所述检测方法在鉴别或选育耐低氧性状多鳞鱚品种中的应用。
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