CN105143470A - 用于将癌症分类为易感于tmepai定向疗法以及治疗所述癌症的方法 - Google Patents

用于将癌症分类为易感于tmepai定向疗法以及治疗所述癌症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于将癌症分类为易感于雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)定向疗法的方法和用于治疗所述癌症的方法。本发明的领域总体上属于医学、病理学和肿瘤学。更具体地，其涉及使用雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)定向疗法来治疗乳腺癌，例如三阴性乳腺癌。

Description

用于将癌症分类为易感于TMEPAI定向疗法以及治疗所述癌症的方法
本申请要求于2013年2月28日提交的美国临时申请序列号61/770,723的优先权权益，其整个内容通过引用并入本文。
发明背景
1.技术领域
本发明的领域总体上属于医学、病理学和肿瘤学。更具体地，其涉及使用雄激素诱导的***跨膜蛋白(transmembraneprostateandrogeninduced，TMEPAI)定向疗法治疗乳腺癌，例如三阴性乳腺癌(triple-negativebreastcancer)。
2.背景技术
尽管三阴性乳腺癌(triple-negativebreastcancer，TNBC)代表了总乳腺癌病例中相对小的百分比(15-25％)，但是它却是年轻女性和少数民族中具有较短复发时间和较少治疗选择的不成比例的更高数目乳腺癌死亡的原因。TNBC是***受体(ER)、孕酮受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)阴性的，并且以频繁的导管参与、高等级和高生长速率为特征。尽管在ER阳性和HER2阳性乳腺癌的治疗中有了进步，但是由于缺少关键性地决定其生长、侵袭和转移的关注的靶标，ER阴性TNBC治疗中的进展较少。
迄今为止，在文献和专利中，焦点是将抑制TGF-β/Smad信号转导作为治疗方法(参见，Bonafoux&Lee，2009)。相比之下，本发明人之前的研究探究了TNBC的生长、侵袭和转移对于TGF-β的依赖性。他们假设由TGF-β造成的绕过复制性衰老中隐含的基因可能是涉及将TGF-β从肿瘤阻抑物转变为肿瘤促进物(TGF-β矛盾)的“缺失的环节”。由于癌症中Chr20q13的扩增通常与无限增殖化和逃脱细胞衰老有关，他们关注了位于Chr20q13上的TGF-β可诱导基因TMEPAI(雄激素诱导的***跨膜蛋白)。引人注目地，TMEPAI在97例乳腺癌中的47例(48.5％)中表现出基因扩增，包括45/85(53％)的侵袭性导管癌和2/11(18％)的侵袭性小叶癌。大多数具有TMEPAI拷贝数增加的肿瘤(72.3％)是组织学等级3(34/47)。在31例TNBC中，其中18例(58.1％)中TMEPAI扩增。本发明人之前的工作表明，扩增的TMEPAI促进了TNBC生长和侵袭，并且TMEPAI基因敲减纠正了原型TNBC的攻击行为(1)。
发明内容
因此，根据本发明，提供了抑制癌细胞的方法，与正常对照细胞相比所述癌细胞过表达雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)，所述方法包括使所述癌细胞与抑制TMEPAI表达或活性的药剂接触。所述癌细胞可以选自脑癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、睾丸癌细胞或皮肤癌细胞。所述癌细胞可以是乳腺癌细胞，例如三阴性乳腺癌细胞。所述药剂可以是siRNA或反义分子、胞内抗体或小分子(例如三萜化合物(triterpenoid))。所述方法还包括使所述细胞与第二抗癌剂或疗法接触。所述癌细胞可以是转移的、复发的或多重抗药性(multi-drugresistant)的癌细胞。所述药剂可被包埋在纳米颗粒中或包被在纳米颗粒上。
在另一个实施方案中，提供了治疗患有癌症的对象的方法，其中与正常细胞相比所述癌症的细胞过表达雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)，所述方法包括向对象施用抑制TMEPAI表达或活性的药剂。所述癌细胞可以选自脑癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、睾丸癌细胞或皮肤癌细胞。所述癌细胞可以是乳腺癌细胞，例如三阴性乳腺癌细胞。所述药剂可以是siRNA或反义分子、胞内抗体或小分子(例如三萜化合物)。所述癌细胞可以是转移的、复发的或多重抗药性的癌细胞。所述药剂可被包埋在纳米颗粒中或包被在纳米颗粒上。
所述方法还可以包括使所述细胞与第二抗癌剂或疗法接触。可以在所述药剂之前、在所述药剂之后或与所述药剂同时递送所述第二抗癌剂。所述方法还可以包括测量来自所述对象癌细胞中的TMEPAI水平。可以静脉内、动脉内、皮下或经口施用所述药剂，或者所述药剂可以瘤内、局部或区域性施用到肿瘤部位，或者全身性施用所述药剂。所述药剂可以施用多于一次。所述对象可以是人类对象。治疗可导致以下的一种或更多种：降低肿瘤负荷、减慢肿瘤生长、延长存活时间、使不可切除的肿瘤可被切除或提高生活质量。所述方法还包括获得来自所述对象的癌细胞中TMEPAI表达的信息，例如，通过获得癌细胞或组织活检物并且评估TMEPAImRNA水平，或者通过获得癌细胞或组织活检物并且评估TMEPAI蛋白水平来实现。可在用所述药剂治疗之前或用所述药剂治疗之后或在这二者情况下获得所述信息。
还提供了用于将患者分类为受益于TMEPAI抑制疗法的方法，其包括a)从癌症患者获得样品，其中所述样品包含癌细胞；以及b)评估所述患者中的TMEPAI水平，其中来自所述样品的癌细胞中TMEPAI水平的提高指示所述患者将受益于TMEPAI抑制疗法。所述癌细胞可选自脑癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、睾丸癌细胞或皮肤癌细胞。所述乳腺癌细胞可以是三阴性乳腺癌细胞。所述方法还可以包括用a)抑制TMEPAI表达或活性的药剂和/或b)基于TGF-β的疗法治疗所述患者。
此外，提供了用于监测患者中的癌症疗法的方法，其包括a)从经历了癌症疗法的癌症患者获得样品，其中所述样品包含癌细胞；b)评估所述癌细胞中的TMEPAI水平；以及c)与治疗前或较早评估的TMEPAI水平相比来比较所述癌细胞中的水平，其中来自所述样品的癌细胞中TMEPAI水平的降低指示所述患者受益于所述癌症疗法。所述癌细胞可选自脑癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、睾丸癌细胞或皮肤癌细胞。所述乳腺癌细胞可以是三阴性乳腺癌细胞。所述疗法可以是a)抑制TMEPAI表达或活性的药剂，和/或b)基于TGF-β的疗法。
还提供了用于将患者分类为受益于TMEPAI抑制疗法的方法，其包括a)从癌症患者获得血液、血浆或血清样品；以及b)评估所述血液、血浆或血清样品中的TMEPAI水平，其中所述血液、血浆或血清样品中TMEPAI水平的提高指示所述患者将受益于TMEPAI抑制疗法。所述方法还可以包括用抑制TMEPAI表达或活性的药剂和/或基于TGF-β的疗法治疗对象。
另一个实施方案包括用于监测患者中的癌症疗法的方法，其包括a)从经历了癌症疗法的癌症患者获得血液、血浆或血清样品；b)评估所述血液、血浆或血清样品中的TMEPAI水平；以及c)与治疗前或较早评估的TMEPAI水平相比来比较所述血液、血浆或血清样品中的水平，其中所述血液、血浆或血清样品中TMEPAI水平的降低指示所述患者受益于所述癌症疗法。所述方法还可以包括用抑制TMEPAI表达或活性的药剂和/或基于TGF-β的疗法治疗对象。
预期本文描述的任何方法或组合物均可关于本文描述的任何其他方法或组合物来实施。
当在权利要求书中和/或说明书中结合术语“包括/包含”使用时，未用数量词限定的名词可以意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。词语“约”意指加上或减去指定数值的5％。
通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。但是，应理解的是，尽管指示了本发明的一些具体实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图简述
以下附图形成了本说明书的一部分，并且其被包括在内以进一步证明本发明的某些方面。通过结合详述来参考一个或更多个这些附图，将能够更好地理解本发明。
图1A-B：正常细胞和癌细胞中TMEPAImRNA和蛋白质的相对表达。图1A.正常人乳腺上皮细胞(HMEC)和MDA-MB-231乳腺癌细胞中，通过QPCR的TGF-β对TMEPAImRNA表达的作用，其被TGF-β受体I激酶抑制剂SB431542(SB)抑制。图1B.在不具有或具有TGF-β刺激的情况下，HMEC和MDA-MB-231细胞中TMEPAI蛋白的相对表达。
图2：多种乳腺癌细胞中TMEPAI、ER-α和HER2蛋白的相对表达。侵袭性和非侵袭性乳腺癌细胞系中TMEPAI、***受体-α(ER)、孕酮受体(PR)和Her2受体(Her2)的Western印记分析。
图3A-B：乳腺肿瘤中TMEPAI蛋白的免疫组织化学(IHC)。图3A.通过免疫组织化学(IHC)分析多种乳腺肿瘤中的TMEPAI蛋白水平。图3B.在17种不同的乳腺肿瘤中，通过阵列比较基因组杂交(aCGH)比较基因扩增，以及通过IHC比较蛋白质表达。
图4A-H：TMEPAI下调经典Smad信号转导。图4A.用12×CAGA-Luc和TMEPAI或对照表达构建体瞬时转染三阴性BT-20、MDA-MB-231和HCC1937乳腺癌细胞。不用TGF-β处理或用TGF-β(2ng/ml)处理细胞16小时。将海肾荧光素酶(Renillaluciferase)活性归一化的萤火虫荧光素酶活性的相对光单位(RLU)的倍数变化表示为来自三个转染的平均值±SD。星号表示在TGF-β的存在下pcDNA相对于pTMEPAI的p＜0.001。图4B.TMEPAI敲减对MDA-MB-231细胞中Smad信号转导的作用，其通过12×CAGA-Luc报道蛋白活性来测量并且表示为上述归一化RLU。插图示出稳定表达两种不同shRNA(ShRNA1和shRNA2)的两种不同克隆中TMEPAI的相对表达。星号表示在TGF-β的存在下CONshRNA相对于TMEPAIshRNA的p＜0.001。图4C.表达对照或TMEPAIshRNA的MDA-MB-231细胞中磷酸化的以及总Smad2和Smad3、Smad4、Smad7、TMEPAI和GADPH蛋白的Western印迹。在具有或不具有2ng/ml的TGF-β情况下对细胞进行孵育。图4D.在TGF-β存在或不存在下，表达对照shRNA(MDA-MB-231)或TMEPAIshRNA(231-TMKD)的HMEC和乳腺癌细胞系中归一化的12×CAGA驱动的萤火虫荧光素酶活性之相对光单位(RLU)的倍数变化。人TMEPAI基因在HMEC和MDA-MB-231细胞中表达，小鼠TMEPAI在231-TMKD细胞中表达。星号表示在TGF-β的存在下pcDNA相对于pTMEPAI的p＜0.001。图4E.在TGF-β的存在或不存在下，表达对照pcDNA或pTMEPAI的HMEC中磷酸化的和总Smad2/3的Western印迹。图4F.不用TGF-β处理或用TGF-β处理的表达对照和TMEPAIshRNA的HCC1937细胞中归一化的12×CAGA-Luc报告蛋白活性的倍数变化。星号表示在TGF-β的存在下CONshRNA相对于TMEPAIshRNA的p＜0.001。图4G.在TGF-β不存在或存在下，表达对照和TMEPAIshRNA(分别为HCC1937和HCC1937_TMEPAI_KD)的HCC1937细胞的生长曲线。图4H.表达对照或TMEPAIshRNA的HCC1937细胞中Smad信号转导分子、Smad2、pSmad2、Smad3、pSmad3、Smad4、Smad7和TMEPAI的相对表达。
图5A-C：TMEPAI上调乳腺癌细胞中的非经典信号转导。图5A.通过Western印迹，表达对照(CONshRNA)或TMEPAIshRNA的MDA-MB-231细胞中PTEN、磷酸化Akt(pAkt)、总Akt、p21、p27和GAPDH的相对表达。shRNA降低TMEPAI的表达，导致MDAMB-231乳腺癌细胞中PTEN、p27和p21提高，以及pAkt降低。图5B.表达对照或TMEPAIshRNA的HCC1937细胞中PTEN、pAkt、总Akt、p21、p27和微管蛋白的相对表达。另外，在另一种三阴性乳腺癌细胞系HCC1937中，TMEPAI水平的降低导致PTEN、p27和p21蛋白水平提高以及pAkt降低。图5C.通过Western印迹，表达对照(pcDNA)或TMEPAI(pTMEPAI)载体的HMEC中PTEN、pAkt、总Akt、p21、p27和GAPDH的相对表达。正常乳腺上皮细胞中TMEPAI的被迫表达导致PTEN、p27和P21降低以及pAkt提高。
图6：高TMEPAI表达在ER阴性/***阳性乳腺癌患者中具有不利的预后意义。在中位数截断值下，通过初步分析具有根据TMEPAI表达分类的ER/PR阴性和***阳性患者之基因表达数据和存活信息的公众可获得数据库(GEO：AffymetrixHGU133A和HGU133+2微阵列)来确定无复发的存活，表明TMEPAI表达的升高与具有2.69风险比(HR)和0.002对数秩(log-rank)P值的较短存活相关。
图7A-D：通过微阵列分析的多种癌症中TMEPAI的相对mRNA表达。图7A.相对于对照乳腺，乳腺导管原位癌示出TMEPAImRNA表达的～6倍提高。图7B.相对于正常肺，肺腺癌示出TMEPAImRNA的～2.6倍提高。图7C.胰腺导管癌示出TMEPAI表达的～3倍提高。图7D.相对于正常结肠，直肠乙状结肠腺癌示出TMEPAI表达的～4倍提高。括号中的数字表示样品的数目。
图8A-D：TMEPAI表达的抑制降低了裸小鼠中人乳腺肿瘤的生长：图8A.通过测量肿瘤体积，TMEPAI敲减细胞的体内乳腺肿瘤发生潜力降低(＊P＜0.05)。插图示出了代表性肿瘤。图8B.与表达对照shRNA的细胞相比，TMEPAI敲减细胞形成的肿瘤中VEGF和Ki67的表达降低。图8C.对照和TMEPAI敲减细胞以及异种移植乳腺肿瘤中HIF-1α的相对表达。使用经氯化钴处理的HeLa细胞作为HIF-1α表达的阳性对照。图8D.表达对照shRNA和TMEPAIshRNA的细胞中pAkt、PTEN、p27kip1和HIF-1α以及TMEPAI的表达。
图9A-D：TMEPAI和Snail在乳腺癌转移中的作用。图9A-B.在TGF-β的存在或不存在下，表达对照(CON)或TMEPAIshRNA的MDA-MB-231细胞中Snai1和TMEPAI蛋白(图9A)以及mRNA(图9B)的相对表达。星号表示在TGF-β的存在下对照shRNA相对于TMEPAIshRNA的p＜0.001。图9C.表达对照(CON)或TMEPAIshRNA的MDA-MB-231细胞的肺转移。图9D.来自用表达对照(CON)或TMEPAIshRNA的MDA-MB-231细胞注射之小鼠的肺的组织学切片。
图10A-D：南蛇藤醇(celastrol)是通过增强生长阻抑性TGF-β信号转导的TMEPAI表达和癌细胞生长的新的抑制剂。图10A.即使在1微摩尔的浓度下，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中南蛇藤醇抑制生长并且诱导死亡。图10B.南蛇藤醇对于正常乳腺上皮细胞MCF-10A的生长没有作用。图10C.南蛇藤醇通过抑制TMEPAI表达来抑制非Smad信号转导(左图)并增强Smad信号转导(右图)。图10D.南蛇藤醇增加Smad信号转导，如通过12×CAGA-荧光素酶报道蛋白测定来测量。
图11A-D：南蛇藤醇体内抑制人MDA-MB-231乳腺肿瘤的生长。图11A.用2mg/kg南蛇藤醇或仅用载剂每周3次，连续4周处理具有皮下MDA-MB-231肿瘤的无胸腺小鼠。图11B.南蛇藤醇处理后的肿瘤重量，P＜0.001。插图示出了从载剂和南蛇藤醇处理的小鼠中分离的肿瘤的相对尺寸。图11C.南蛇藤醇处理的肿瘤经过形成pSmad2和pSmad3以及减少TMEPAI表达而表现出提高的TGF-β信号转导。图11D.通过测量总体重来监测施用的南蛇藤醇的毒性。
图12A-D.装载南蛇藤醇的卵磷脂(lecithin)纳米颗粒体内抑制肿瘤生长。(图12A)从具有人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)之异种移植物的裸小鼠切除的肿瘤的代表性图片。在总计两周的时间段中，通过在第一周每隔一天以及接下来的一周每两天间隔腹膜内注射来施用(Veh-NP)2mg/kg无药物脂质体、0.2mg/kg含南蛇藤醇的脂质体(CLST-NP)或仅2mg/Kg南蛇藤醇(CLST)。(图12B)示出了肿瘤重量，＊p＜0.01，相对于载剂对照组。(图12C)处死动物前测量的肿瘤体积。＊p＜0.01，相对于载剂对照组。(图12D)用载剂或药物处理的动物体重的相似性，表明在施用剂量下CLST-NP和CLST无毒。
图13A-B.TMEPAI存在于由乳腺癌细胞分泌到外部培养基中的外来体(exosome)中。(图13A)将细胞在具有或不具有TGF-β的情况下培养24小时和48小时后，在无细胞培养基中分离的外来体中TMEPAI蛋白的代表性Western印迹图。(图13B)在培养野生型和TMEPAI缺陷型(TMEPAIKD)MDA-MB-231细胞后，在培养基中分离的外来体中存在的蛋白质的比较(通过Western印迹)。
示例性实施方案的描述
TGF-β在肿瘤进展中具有矛盾的功能。鉴定这两种功能之间的分子开关可对其在乳腺癌进展中如何作用提供新的机理性认识以及提供新的治疗靶标。本发明人之前报道了TMEPAI基因表达将转化生长因子-β(TGF-β)从肿瘤阻抑物转变为肿瘤促进物。充当了TGF-β两种功能之间的分子开关的TMEPAI可用于鉴定将受益于基于TGF-β的抗癌疗法的患者，并且还可作为替代标志物(surrogatemarker)以监测用所述疗法治疗的患者的进展。现在，本发明人表明，TMEPAI通过刺激TGF-β介导的非经典信号转导通路同时阻抑TGF-β介导的经典信号转导来促进乳腺癌细胞增殖和迁移。三阴性乳腺癌细胞中TMEPAI基因敲减重建了高Smad信号转导(经典信号转导)并且阻抑了非经典信号传导，因此恢复了TGF-β的体内稳态调节。本发明人还鉴定了来自植物的三萜化合物(triterpinoid)具有阻抑TMEPAI表达和刺激经典Smad信号转导的能力。这种药剂在乳腺癌细胞中抑制细胞增殖以及诱导细胞死亡。因此，通过恢复TGF-β介导的经典和非经典信号转导通路之间的正常平衡，TMEPAI的化学治疗拮抗作用可以恢复TGF-β的抑制细胞功能。事实上，临床前研究确认了表达TMEPAI的乳腺癌对于这种萜(terpinoid)引起的TMEPAI表达的药理学抑制易感。为了促进药物的生物利用度，可使用这种药剂的纳米颗粒制剂。
下文将更详细地描述本发明的这些和另一些方面。
I.TMEPAI
已经报道，雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)(或称为PMEPA1、STAG1、ERG1.2或N4wbp4)通过睾酮或其衍生物诱导并且与肿瘤发生有关。还示出TMEPAI的转录本被TGF-β诱导。TMEPAI是含有两个可与HECT型E3泛素连接酶相互作用之PY基序的Ib型跨膜蛋白。已经报道TMEPAI参与p53介导的凋亡和细胞生长抑制。然而，对于其作用机制和生理学功能尚未完全理解。
TMEPAI是TGF-β信号转导的直接靶基因，其通过干扰TGF-βI型受体(TβRI)诱导的R-Smad磷酸化而拮抗TGF-β信号转导。TMEPAI可通过Smad相互作用基序直接与R-Smad相互作用。TMEPAI与用于受体激活的Smad锚竞争与R-Smad的结合，从而隔绝TβRI激酶对R-Smad的激活。在哺乳动物细胞中，TMEPAI的异位表达抑制纤溶酶原激活物抑制剂1、JunB、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和c-myc表达的TGF-β依赖性调节，而特异性敲减TMEPAI表达延长了TGF-β诱导的Smad2和Smad3磷酸化的持续时间并同时加强了对TGF-β的细胞响应性。一致地，TMEPAI在非洲爪蟾属(Xenopus)胚胎中抑制激活蛋白介导的中胚层形成。因此，TMEPAI参与负反馈环以控制TGF-β/Smad信号转导的持续时间和强度。还示出TMEPAI与NEDD4相互作用。
II.癌症
癌症由来自组织的细胞之克隆群的过度生长(outgrowth)造成。癌症的发生(称为致癌作用)可以以多种方式建模和表征。很早以前就已经理解了癌症发生和炎症之间的联系。炎性反应参与对抗微生物感染的宿主防御，并且还驱动组织修复和再生。大量证据指出了炎症和癌症发生风险之间的联系，即，慢性炎症可能导致发育不良。
可以应用本发明方法的癌细胞通常包括表达并且更特别地过表达TMEPAI的任何细胞。合适的癌细胞可以是乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液学癌症(例如，白血病或淋巴瘤)、神经组织癌症、黑素瘤、卵巢癌、睾丸癌、***癌、***、***癌或膀胱癌细胞。此外，本发明方法可应用于多种物种，例如，人、非人灵长类动物(例如，猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。癌症还可以是复发的、转移的和/或多重抗药性的，并且本发明方法可特别地应用于这样的癌症以使其可切除、延长或重新诱导缓解、阻止或限制转移、和/或治疗多重抗药性癌症。
III.抑制剂
A.抗体
1.一般方法
应理解，与TMEPAI结合的单克隆抗体将可用于多种应用。这些包括生产用于检测和诊断癌症的诊断试剂盒。在这些情况下，可以将这样的抗体与诊断剂或治疗剂连接，使用它们作为竞争性测定中的竞争物或捕获剂，或者单独使用它们而无与其连接的额外试剂。如下文进一步讨论的，抗体可以被突变或修饰。另外，如在本文件其他地方描述的，抗体可用作治疗剂。用于制备和表征抗体的方法是本领域中公知的(参见，例如Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988；美国专利4,196,265)。
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常沿着与用于制备多克隆抗体的方法相同的线开始。用于这两种方法的第一步是对合适的宿主进行免疫或鉴定由于之前的自然感染而被免疫的对象。如本领域中公知的，用于免疫的给定组合物的免疫原性可能不同。因此，通常有必要加强宿主的免疫***，如可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性和优选的载体是钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或大鼠血清白蛋白也可用作载体。用于使多肽与载体蛋白质缀合的方式是本领域中公知的，并且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimideester)、碳二亚胺和双重氮联苯胺(bis-biazotizedbenzidine)。同样如本领域中公知的，特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有灭活结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的免疫应答非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而不同。可使用多种途径来施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。可通过在免疫后的不同时间点对免疫的动物采血来监测多克隆抗体的产生。还可以给予第二加强注射。重复加强和滴定过程，直到获得合适的滴度。当获得期望的免疫原性水平时，可对免疫的动物采血并且分离和储存血清，和/或可将所述动物用于产生MAb。
在免疫之后，选择具有产生抗体(特别是B淋巴细胞(B细胞))潜力的体细胞以用于MAb产生方案。这些细胞可从活检脾或***或者从循环血液中获得。然后使来自免疫的动物之产生抗体的B淋巴细胞与无限增殖骨髓瘤细胞融合，其通常为与免疫的动物相同的一个物种或者是人或人/小鼠嵌合细胞。适合用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选地为不产生抗体、具有高融合效率和酶缺陷的细胞系，这然后使得其不能在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。
可使用本领域技术人员已知的若干骨髓瘤细胞中的任意一种(Goding，第65-66页，1986；Campbell，第75-83页，1984)。例如，当免疫的动物是小鼠时，可使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，可使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；而U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6全部可用于人细胞融合。一种具体的小鼠骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，其可通过请求细胞系储存号GM3573容易地从NIGMS人类遗传突变细胞库(HumanGeneticMutantCellRepository)获得。另一种可使用的小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生产细胞系。最近，已经描述了用于人B细胞的另外的融合伴侣系，包括KR12(ATCCCRL-8658)；K6H6/B5(ATCCCRL-1823)SHM-D33(ATCCCRL-1668)和HMMA2.5(Posner等，1987)。使用SP2/0/mIL-6细胞系产生本发明中的抗体，该细胞系是SP2/0系的分泌IL-6的衍生物。
用于制备产生抗体的脾或***细胞与骨髓瘤细胞之杂合体的方法通常包括在促进细胞膜融合的试剂(化学或电学)的存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，但是该比例可分别从约20∶1至约1∶1变化。Kohler和Milstein(1975；1976)已经描述了使用仙台病毒的融合方法，而Gefter等(1977)描述了使用聚乙二醇(PEG)(例如37％(v/v)PEG)的那些方法。使用电诱导的融合方法也是合适的(Goding，第71-74页，1986)。融合程序通常以约1×10-6至1×10-8的低频率产生活的杂合体。然而，这并不会造成问题，因为通过在选择培养基中培养，将活的融合杂合体与亲本输注的细胞(特别是输注的将正常地持续无期分化的骨髓瘤细胞)区分开。选择培养基通常是在组织培养基中含有阻断核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性且优选的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶二者的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。当使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基中补充次黄嘌呤。如果B细胞来源是EB病毒(EpsteinBarrvirus，EBV)转化的人B细胞系，则添加乌木苷(ouabain)以清除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
优选的选择培养基是HAT或具有乌木苷的HAT。仅能够进行核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶(如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT))中有缺陷，因此它们不能存活。B细胞可进行该途径，但是其在培养中具有有限的寿命并且通常在约两周内死亡。因此，只有可以在选择培养基中存活的细胞才是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当这里用于融合的B细胞的来源是EBV转化的B细胞系时，还将乌木苷用于杂合体的药物选择，因为EBV转化的B细胞对药物杀伤易感，而选择所使用的骨髓瘤伴侣为乌木苷抗性。
培养提供了由其选择特定杂交瘤的杂交瘤群。通常如下进行杂交瘤的选择：通过在微量滴定板中的单克隆稀释来培养细胞，随后测试单个克隆上清液(约2至3周后)中的期望反应性。测定必须灵敏、简单并且迅速，例如放射免疫测定、酶免疫测量、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定(dotimmunobindingassay)等。然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并且克隆到产生单个抗体的细胞系中，然后将克隆无限繁殖以提供mAb。细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可以将杂交瘤的样品注射(通常是腹膜腔中)到动物(例如，小鼠)中。任选地，在注射之前将动物用烃，特别是油(例如，姥鲛烷(四甲基十五烷))致敏(prime)。当以这种方使用人杂交瘤时，最好注射免疫低下的小鼠(例如SCID小鼠)，以防止肿瘤排斥。经注射动物形成分泌由融合细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后可放出动物的体液(如血清或腹水)以提供高浓度MAb。单个细胞系还可以在体内培养，其中MAb自然地分泌到培养基中，从中可以容易地获得高浓度的MAb。或者，可体内使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。可将细胞系调整为在无血清培养基中生长以优化回收高纯度人单克隆免疫球蛋白的能力。
如需要，以任一种手段产生的MAb可使用过滤、离心和多种色谱方法(如FPLC或亲和色谱法)进一步纯化。可通过方法从纯化的单克隆抗体获得本发明单克隆抗体的片段，所述方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化，和/或通过化学还原切割二硫键。或者，可使用自动化肽合成仪合成本发明所涵盖的单克隆抗体片段。
还预期了可使用分子克隆方法来产生单克隆。为此，可从杂交瘤系分离RNA，通过RT-PCR获得抗体基因并且克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，由从细胞系分离的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库并且通过使用病毒抗原淘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。这种方法相对于常规杂交瘤技术的优点在于可以在单轮中产生和筛选多达约104倍的抗体，并且通过H链和L链的组合产生了新的特异性，其进一步增加了找到合适抗体的机会。
教导产生可用于本发明的抗体的其他美国专利(各自通过引用并入本文)包括：美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；以及美国专利4,867,973，其描述了抗体治疗剂缀合物。
2.抗体序列加工
在多个实施方案中，可由于多种原因而选择对经鉴定的抗体序列进行加工，这些原因例如提高表达、提高交叉反应性、减少脱靶结合或消除一种或更多种天然效应子功能，例如激活补体或募集免疫细胞(例如，T细胞)。以下是用于抗体加工的相关技术的一般讨论。
可培养杂交瘤，然后裂解细胞，并且提取总RNA。可使用随机六聚体和RT一起来产生RNA的cDNA拷贝，然后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。可以将PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集并且使用G蛋白柱通过FPLC纯化的抗体进行结合和中和的测定。
如下来产生重组全长IgG抗体：将来自克隆载体的重链和轻链FvDNA亚克隆到LonzapConIgG1或pConK2质粒载体中，转染到293Freestyle细胞或LonzaCHO细胞中，并且从CHO细胞上清液收集和纯化抗体。在与最终cGMP生产过程相同的宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的迅速可用性具有降低过程开发计划的持续时间的潜力。Lonza已经开发了使用生长在CDACF培养基中的合并的转染子以用于在CHO细胞中迅速产生少量(至多50g)抗体的一般方法。尽管比真正的瞬时***稍慢，但是其优点包括更高的产物浓度和使用与生产细胞系相同的宿主和过程。一次性生物反应器中表达模型抗体之GS-CHO库的生长和生产力的实例为：在以补料分批模式进行的一次性袋状生物反应器培养(5L工作体积)中，在转染9周内达到了2g/L的收获抗体浓度。
pCon载体TM是重表达整个抗体的容易方式。恒定区载体是提供克隆到pEE载体中的一系列免疫球蛋白恒定区载体的一组载体。这些载体提供了对具有人恒定区全长抗体的容易构建性和GSSystemTM的便利性。
抗体分子将包含例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(例如，F(ab’)、F(ab’)2)或者例如可经由重组手段产生的单链免疫球蛋白。这样的抗体衍生物是单价的。在一个实施方案中，这样的片段可彼此组合，或者与其他抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。明显地，这样的嵌合分子可包含能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
可能需要在非人宿主中产生“人源化”抗体以减弱在用于人类疗法时的任何免疫反应。这样的人源化抗体可在体内或体内背景下研究。人源化抗体可以例如通过将抗体的免疫原性部分替换为相应的非免疫原性部分(即，嵌合抗体)来产生。PCT申请PCT/US86/02269；EP申请184,187；EP申请171,496；EP申请173,494；PCT申请WO2086/01533；EP申请125,023；Sun等(1987)；Wood等(1985)；以及Shaw等(1988)；其全部通过引用并入本文。“人源化”嵌合抗体的综述由Morrison(1985)提供，其也通过引用并入本文。或者，“人源化”抗体可以通过CDR或CEA替换产生。
Jones等(1986)；Verhoeyen等(1988)；Beidler等(1988)；其全部通过引用并入本文。在一些相关实施方案中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合、人源化或CDR移植抗体)。在另一个实施方案中，抗体是全人重组抗体。
或者，可能希望进行修饰，例如向抗体分子中引入保守变化。在进行这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常理解的(Kyte和Doolittle，1982)。已接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。
本领域中还应理解的是，可基于亲水性进行有效的相似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性支配)与蛋白质的生物学特性有关。如在美国专利4,554,101中描述的，向氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应理解的是，氨基酸可以被替换为具有类似亲水性的另一个氨基酸并且产生生物学或免疫学上修饰的蛋白质。在这种变化中，优选亲水性值在±2内的氨基酸的替换，特别优选在±1内的那些，并且甚至更特别优选在±0.5内的那些。
如上文概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑多种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明还预期了同种型修饰。通过修饰Fc区域以具有不同同种型，可实现不同功能。例如，改变为IgG4可以降低与其他同种型相关的免疫效应子功能。可通过本领域技术人员已知的任何技术制备经修饰的抗体，包括通过标准分子生物学技术表达，或者化学合成多肽。用于重组表达的方法在本文其他地方涉及。
3.单链抗体
单链可变片段(scFv)是用短(通常丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起的免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合物。虽然移除了恒定区并且引入了接头肽，但是这种嵌合分子保持了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常留下未改变的特异性。历史上(historically)产生这些分子以有利于噬菌体展示，其中非常方便将抗原结合结构域表达为单个肽。
或者，可由衍生自杂交瘤的亚克隆重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺少完整抗体分子中的恒定Fc区，因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如，A/G蛋白)。这些片段通常可使用L蛋白纯化/固定，因为L蛋白与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常由促进螺旋和转角的氨基酸残基(如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸)构成。然而，其他残基也可以很好地作用。Tang等(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库快速选择用于单链抗体(scFv)的专用接头的手段。构建随机接头文库，其中用于重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组成的18个氨基酸多肽的区段连接。在丝状噬菌体上展示scFv库(约5×106个不同成员)并且用半抗原进行亲和选择。所选择的变体群表现出显著增加的结合活性，但是保留了相当大的序列多样性。随后筛选1054个单独变体产生了以可溶形式有效产生的催化活性scFv。序列分析揭示，VHC末端后2个残基处的接头中的保守脯氨酸以及其他位置处大量的精氨酸和脯氨酸是所选择栓系(tether)的仅有的共同特征。
本发明的重组抗体还可包含允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。这样的序列包括衍生自IgA的那些，其允许与J链联合形成多聚体。另一个多聚化结构域是Ga14二聚化结构域。在另一些实施方案中，可以用允许两个抗体组合的试剂(如生物素/抗生物素蛋白)对链进行修饰。
在一个独立的实施方案中，可通过使用非肽接头或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常，在不同细胞中产生轻链和重链，纯化，并且随后以合适的方式连接在一起(即，通过合适的化学桥将重链的N末端与轻链的C末端连接)。
使用交联试剂形成缚结(tie)两个不同分子官能团的分子桥，例如，稳定剂和凝结剂。然而，预期了可产生相同类似物的二聚体或多聚体或者包含不同类似物的异聚复合体。为了以逐步方式连接两个不同化合物，可使用异双官能交联剂，其消除了不想要的均聚物的形成。
一种示例性的异双官能交联剂包含两个反应性基团：一个与伯胺基(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应并且另一个与巯基(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应基团，交联剂可与一个蛋白质(例如，所选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过巯基反应基团，已经缚结在第一蛋白质上的交联剂与另一蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选地，交联剂在将使用的血液中具有合理的稳定性。已知多种类型含二硫键的接头可成功用于缀合靶标和治疗/预防剂。可证明含有为空间位阻之二硫键的接头在体内产生更高稳定性，防止了在达到作用位点之前释放靶向肽。因此，这些接头是一组连接剂。
另一种交联试剂是SMPT，这是一种含有的二硫键的双官能交联剂，所述二硫键由邻近的苯环和甲基“空间位阻”。认为二硫键的空间位阻发挥了保护键不被可能存在于组织和血液中的硫醇盐阴离子(如谷胱甘肽)攻击的作用，从而有助于防止在连接的药剂递送到靶部位之前缀合物的解偶联。
与许多其他已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂为交联官能团(例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基))提供了能力。另一种可能的交联剂类型包括含有可切割二硫键的异双官能光反应性叠氮基苯，例如2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1，3′-二硫代丙酸磺基琥珀酰亚胺酯。N-羟基琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且叠氮基苯(光分解后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了位阻交联剂，非位阻交联剂也可以如此使用。不考虑含有或产生被保护的二硫化物，其他合适的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak&Thorpe，1987)。这样的交联剂的使用是本领域中非常了解的。另一个实施方案涉及使用柔性接头。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物的双官能接头，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双官能接头。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在多种温和条件下可切割之不稳定键的可切割缀合物。这种接头特别可用于，目的药剂可直接与接头连接，其切割导致活性剂的释放。特别的用途包括向蛋白质(如抗体或药物)添加游离氨基或游离巯基。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(如单链抗体)的肽接头。所述接头长度为至多约50个氨基酸，包含带电氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)接着脯氨酸出现至少一次，并且以更高的稳定性和聚集减少为特征。美国专利5,880,270公开了含氨基氧基的接头，其可用于多种免疫诊断和分离技术。
4.胞内抗体(intrabody)
在一个特定实施方案中，抗体是适于在细胞内部作用的抗体，这样的抗体也被称为“胞内抗体”。这些抗体可通过多种机理干扰目标功能，例如通过改变细胞内蛋白质运输、干扰酶促功能和阻断蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用来干扰目标功能。在许多方面，其结构模拟或类似于上文讨论的那些单链和单结构域抗体。事实上，单转录本/单链是允许在靶细胞中细胞内表达的重要特征，并且还使得蛋白质跨细胞膜运输更容易。然而，需要另外的特征。
影响实施胞内抗体治疗的两个主要问题是递送(包括细胞/组织靶向)和稳定性。对于递送，已经使用了多种方法，例如使用细胞类型特异性启动子的组织定向递送，基于病毒的递送和使用细胞渗透性/膜异位肽。对于稳定性，方法通常是通过强力(bruteforce)来筛选，包括涉及噬菌体展示并且可包括共有序列的序列成熟或发展的方法，或者更多定向修饰，例如***稳定化序列(例如，Fc区域、伴侣蛋白序列、亮氨酸拉链)以及二硫化物替代/修饰。
胞内抗体可能需要的一个另外的特征是用于细胞内靶向的信号。已经设计了可以将胞内抗体(或其他蛋白质)靶向至亚细胞区域(如细胞质、细胞核、线粒体和ER)的载体并且可商业获得(InvitrogenCorp.；Persic第，1997)。借助其进入细胞的能力，胞内抗体具有其他类型抗体不能实现的额外用途。在本发明抗体的情况下，与mdsc表面上的DC-HIL相互作用的能力可能干扰与DC-HIL相关的功能，例如信号转导功能(与其他分子结合)或寡聚体形成。特别地，预期了这样的抗体可用于抑制DC-HIL与T细胞的相互作用。尽管这些抗体的靶标是天然在细胞内的，最近的报道暗示甚至完全完整抗体的大尺寸不一定是其功效的障碍。
Guo等(2011)报道可通过完整抗体来靶向过表达的内部肿瘤抗原(包括人造的和非转化的(eGFP)的那些)，所述抗体继而可表现出抗肿瘤活性(抑制转移、抑制肿瘤进展、增加患者存活、减少肿瘤负荷)。因此，尽管可证明使用胞内抗体或抗体缀合物是有用的，但是修饰似乎不是治疗功效所需的。
5.纯化
在某些实施方案中，本发明的抗体可以被纯化。本文使用的术语“纯化的”意在指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质被纯化为相对于其天然可获得状态的任何程度。因此，纯化的蛋白质也指这样的蛋白质，所述蛋白质脱离了其天然存在的环境。当使用术语“基本上纯化的”时，该指定将指这样的组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，例如组成组合物中所述蛋白质约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个水平上包括细胞环境粗分级至肽和非肽级分。多肽与其他蛋白质分离后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化目的多肽以实现部分纯化或完全纯化(或纯化至均质)。特备适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电点聚集。其他用于蛋白质纯化的方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性沉淀，然后离心；凝胶过滤、反向、羟基磷灰石和亲和色谱法；以及这些和其他技术的组合。在本发明抗体的纯化中，可能需要在原核或真核表达***中表达多肽并且使用变性条件提取蛋白质。可使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其他细胞组分纯化多肽。如本领域中通常已知的，认为进行各纯化步骤的顺序可改变，或者可省略某些步骤，并且仍然得到适合制备基本上纯化的蛋白质或肽的方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的试剂(即，A蛋白)对完整抗体分级。或者，可使用抗原以同时纯化和选择合适的抗体。这样的方法通常使用结合在支持物(如柱、过滤器或珠)上的选择剂。抗体与支持物结合，除去(例如，冲掉)污染物，并且通过施加条件(盐、热等)释放抗体。根据本公开内容，本领域技术人员将知道多种用于量化蛋白质或肽之纯化程度的方法。这些包括例如测定活性级分的比活性，或者通过SDS/PAGE分析来评估级分内的多肽量。另一种用于评估级分的纯度的方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性比较，从而计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位取决于根据纯化而选择的特定测定技术，以及所表达蛋白质或肽是否表现出可检测活性。
已知多肽的迁移可随着不同的SDS/PAGE条件改变，有时候显著地改变(Capaldi等，1977)。因此，应理解的是，在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子量可能改变。
B.核酸抑制剂
在某些实施方案中，USP5抑制剂是针对USP5mRNA的双链RNA(dsRNA)。在这样的实施方案中，dsRNA介导USP表达的降低，这导致减少的去泛素化。
RNA干扰(也称为“RNA介导的干扰”或RNAi)是一种可以降低或消除基因表达的机制。已经观察到双链RNA(dsRNA)介导这种降低，这是一个多步骤过程。dsRNA激活转录后基因表达监督机制，其的功能似乎为保护细胞免受病毒感染和转座子活性(Fire等，1998；Grishok等，2000；Ketting等.，1999；Lin和Avery等，1999；Montgomery等，1998；Sharp和Zamore，2000；Tabara等，1999)。这些机制的激活靶向成熟的，与dsRNA互补的mRNA以用于破坏。RNAi提供了用于研究基因功能的主要的实验优点。这些优点包括非常高的特异性、易于穿过细胞膜运动和延长的靶基因下调(Fire等，1998；Grishok等，2000；Ketting等，1999；Lin和Avery等，1999；Montgomery等，1998；Sharp等，1999；Sharp和Zamore，2000；Tabara等，1999)。普遍接受的是，RNAi在转录后作用，靶向RNA转录本用于降解。似乎核和细胞质RNA二者均可被靶向(Bosher和Labouesse，2000)。
1.siRNA
必须设计siRNA以使得其特异性地并且有效地阻抑目的基因的表达。选择靶序列(即，存在于目的基因中的那些序列，siRNA将向所述基因引导降解机器)的方法涉及避免可能干扰siRNA的引导功能的序列同时包括对所述基因具有特异性的序列。通常，长度为约21至23个核苷酸的siRNA靶序列最有效。该长度反映了从如上所述之长得多的RNA的加工得到的消化产物的长度(Montgomery等，1998)。siRNA是本领域中公知的。例如，siRNA和双链RNA已经在美国专利6,506,559和6,573,099，以及美国专利申请2003/0051263、2003/0055020、2004/0265839、2002/0168707、2003/0159161和2004/0064842中描述，其全部通过引用以其整体并入本文。
已经建议了多种对siRNA序列的进一步修饰，以改变其稳定性或提高其效率。已表明，具有双核苷酸突出端的合成的互补21-merRNA(即，19个互补核苷酸+3’非互补二聚体)可提供最高的阻抑水平。这些方案主要使用两个(2’-脱氧)胸苷核苷酸的序列作为二核苷酸突出端。这些二核苷酸突出端通常写作dTdT以与并入到RNA中的典型核苷酸区别开。文献已经表明，使用dT突出端的主要动机是减少化学合成RNA的成本的需要。还表明dTdT突出端可能比UU突出端更稳定，尽管可获得的数据仅表明与具有UU突出端的siRNA相比dTdT突出端稍微(＜20％)改善。
2.shRNA
短发夹RNA(shRNA)是产生可用于使基因表达沉默的紧密发夹弯的RNA序列。shRNA由RNA聚合酶III转录。哺乳动物细胞中shRNA的产生有时候可能造成细胞进行干扰素应答，因为细胞将其感知为病毒攻击时尝试自身防御。Paddison等(2002)检查了茎和环的长度、序列特异性以及突出端的存在对于确定shRNA活性的重要性。作者发现了一些有趣的结果。例如，他们发现功能性shRNA的茎和环的长度可能改变。茎长度可以为25nt至29nt的任意值，而环尺寸可以在4nt至23nt之间，其不会影响沉默活性。shRNA茎的两条链之间G-U错配的存在不会导致效力的降低。另一方面，发现与靶mRNA结合的茎的部分(反义链)与mRNA之间的互补性很关键。茎反义链与mRNA之间的单个碱基错配会消除沉默。已经报道，2nt3′突出端的存在对于siRNA活性很关键(Elbashir等，2001)。然而，shRNA上突出端的存在似乎并不重要。例如，一些化学合成或体内转录的功能性shRNA并不具有预料的3′突出端。
3.抑制性核酸的产生
可使用完善描述的方法合成dsRNA(Fire等.，1998)。简单地说，使用T7聚合酶(MEGAscript，Ambion)由DNA模板合成有义RNA和反义RNA。在合成完成后，用DNaseI消化DNA模板并且通过苯酚/氯仿提取和异丙醇沉淀来纯化RNA。在变性琼脂糖凝胶上测定RNA大小、纯度和完整性。将有义RNA和反义RNA在柠檬酸钾缓冲液中稀释并且在80℃下退火3分钟以形成dsRNA。如DNA模板文库的构建一样，可使用程序来帮助这种时间密集型程序。单独dsRNA种类的总和称为“dsRNA文库”。
siRNA的制备主要通过直接化学合成；通过暴露于果蝇(Drosophila)胚胎裂解物来加工较长的双链RNA；或者通过来源于S2细胞的体内***。细胞裂解物或体内加工的使用可进一步包括随后从裂解物分离21-23个核苷酸的短siRNA等等，这使得所述过程有些繁琐和昂贵。通过制备两个单链RNA寡聚体然后使两个单链寡聚体退火成双链RNA来进行化学合成。化合合成方法是多样的。非限制性实例提供于美国专利5,889,136、4,415,723和4,458,066中(其明确地通过引用并入本文)和Wincott等(1995)中。
WO99/32619和WO01/68836建议可以化学或酶促合成用于siRNA的RNA。这两篇文献均通过引用以其整体并入本文。这些文献中预期的酶促合成是通过使用和产生本领域中已知的表达构建体来通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)进行。例如，参见美国专利5,795,715。预期的构建体提供了产生含有与靶基因的一部分相同的核苷酸序列之RNA的模板。这些文献提供的相同序列的长度为至少25个碱基，并且长度可以为多达400个或更多个碱基。该文献的一个重要方面是作者预期了用内源核酸酶复合物消化21-25mer长度的较长dsRNA，其在体内将长dsRNA转变为siRNA。他们并没有描述或呈现合成和使用体内转录的21-25merdsRNA的数据。化学或酶促合成的dsRNA在其用于RNA干扰的预期性质之间没有差别。
类似地，WO00/44914(通过引用并入本文)表明可以酶促地或通过部分/完全地有机合成来产生RNA的单链。优选地，由DNA模板(优选克隆的cDNA模板)的PCR产物酶促合成单链RNA，并且RNA产物是可以包含数百个核苷酸的cDNA的完整转录本。WO01/36646(通过引用并入本文)，对于合成siRNA的方式没有任何限制，只要可以使用手动和/或自动程序在体内或体内合成RNA即可。该文献还提出体内合成可以是化学的或酶促的，例如，使用用于转录内源DNA(或cDNA)模板或其二者混合物的克隆的RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)。同样地，化学或酶促合成的siRNA在用于RNA干扰的预期性质之间没有差别。
美国专利5,795,715报道了在单个反应混合物中同时转录两个互补DNA序列链，其中两种转录本立即杂交。使用的模板优选地为40至100个碱基对，并且每端均配有启动子序列。这种模板优选地连接在固体表面。在用RNA聚合酶转录后，所得dsRNA片段可用于检测和/或分析核酸靶序列。
多个组已经开发了在稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达siRNA的表达载体(Brummelkamp等，2002；Lee等，2002；Miyagishi和Taira，2002；Paddison等，2002；Paul等，2002；Sui等，2002；Yu等，2002)。这些质粒中的一些被加工以表达缺少聚(A)尾的shRNA(Brummelkamp等，2002；Paddison等，2002；Paul等，2002；Yu等，2002)。shRNA的转录由聚合酶III(polIII)启动子起始，并且被认为终止于4-5胸腺嘧啶转录终止位点的2位。认为shRNA折叠为具有3’UU突出端的茎-环结构。随后，这些shRNA的末端被加工，将shRNA转化成～21nt的siRNA样分子(Brummelkamp等，2002)。siRNA样分子可以继而在转染的哺乳动物细胞中引起基因特异性沉默。
更一般地，大部分的任意寡核苷酸或多核苷酸可通过本领域普通技术人员已知的任意技术制备，例如化学合成，酶促产生或生物学产生。合成核酸(例如，合成寡核苷酸)的非限制性实例包括使用例如EP266,032(通过引用并入本文)中描述的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术通过体内化学合成来制备核酸，或者通过Froehler等，1986和美国专利5,705,629(均通过引用并入本文)中描述的脱氧核苷H-膦酸酯中间物来制备核酸。在本发明方法中，可以使用一种或更多种寡核苷酸。已经公开了多种不同的寡核苷酸合成机制，例如美国专利4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244，其均通过引用并入本文。
酶促产生的核酸的一个非限制性实例包括在扩增反应(如PCRTM)中通过酶产生的核酸(参见，例如，美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，均通过引用并入本文)，或者美国专利5,645,897(其通过引用并入本文)中描述的寡核苷酸的合成。生物学产生的核酸的一个非限制性实例包括在活细胞中产生(即，复制)的重组核酸，例如在细菌中复制的重组DNA载体(参见，例如Sambrook等2001，通过引用并入本文)。
4.核碱基、核苷、核苷酸和核酸类似物(nucleicanalog)
本文使用的“核碱基”是指杂环碱基，例如在至少一种天然存在的核酸(即，DNA和RNA)中发现的天然存在的核碱基(即，A、T、G、C或U)，以及这样的核碱基的天然或非天然存在的衍生物和类似物。核碱基通常可以与至少一种天然存在的核算基以可替换天然存在的核碱基对(例如，A和T、G和C以及A和U之间的氢键)的方式形成一个或更多个氢键(“退火”或“杂交”)。
“嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基涵盖天然存在的嘌呤和/或嘧啶核碱基及其衍生物和类似物，包括但不限于嘌呤或嘧啶被一个或更多个烷基、羧烷基、氨基、羟基、卤素(即，氟、氯、溴或碘)、巯基或烷基巯基部分取代的那些。优选的烷基(例如，烷基、羧烷基等)部分包含从约1、约2、约3、约4、约5至约6个碳原子。可使用本文描述的或本领域普通技术人员已知的任何化学或天然合成方法将核碱基包含在核苷中或核苷酸中。
本文使用的“核苷”是指包含与核碱基接头部分共价连接之核碱基的单个化学单元。“核碱基接头部分”的一个非限制性实例是含有5个碳原子的糖(即，“5-碳糖”)，包括但不限于脱氧核糖、核糖、***糖或者5-碳糖的衍生物或类似物。5-碳糖的衍生物或类似物的非限制性实例包括2’-氟-2’-脱氧核糖或者糖环中的碳被氧原子取代的碳环糖。
核碱基与核碱基接头部分的不同类型的共价连接是本领域中已知的。通过非限制性实例，含有嘌呤(即，A或G)的核苷或含有7-脱氮嘌呤核碱基的核苷通常将嘌呤或7-脱氮嘌呤的9位与5碳糖的1’位共价连接。在另一个非限制性实例中，含有嘧啶核碱基(即，C、T或U)的核苷通常将嘧啶的1位与5碳糖的1’位共价连接(Kornberg和Baker，1992)。
本文使用的“核苷酸”是指还包含“骨架部分”的核苷。骨架部分通常将核苷酸与含有核苷酸的另一分子或另一核苷酸共价连接以形成核酸。天然存在的核苷酸中的“骨架部分”通常包含与5碳糖共价连接的磷部分。骨架部分的连接通常发生在5碳糖的3’或5’位。然而，其他类型的连接是本领域中已知的，特别在核苷酸包含天然存在的5碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。
核酸可包含以下或完全地由以下构成：可存在于天然存在的核酸中的核碱基的衍生物或类似物、核碱基接头部分和/或骨架部分。本文使用的“衍生物”是指天然存在的分子的化学修饰或改变的形式，而术语“模拟物”或“类似物”是指与天然存在的分子或部分可以是或可以不是结构类似的，但是具有类似的功能的分子。本文使用的“部分”通常是指较大化学或分子结构的较小化学或分子组成。核碱基、核苷和核苷酸类似物或衍生物是本领域中公知并且已经描述的(参见，例如Scheit，1980，通过引用并入本文)。
包含5碳糖和/或骨架部分衍生物或类似物的核苷、核苷酸或核酸的另外的非限制性实例包括美国专利5,681,947中的那些，其描述了包含形成三螺旋的嘌呤衍生物并且具有和/或阻止dsDNA表达的寡核苷酸；美国专利5,652,099和5,763,167，其描述了并入在DNA或RNA发现的核苷之荧光类似物的特别用作荧光核酸探针的核酸；美国专利5,614,617，其描述了在嘧啶环上具有取代的寡核苷酸类似物，其具有增强的核酸酶稳定性；美国专利5,670,663、5,872,232和5,859,221，其描述了用于核酸检测的具有经修饰的5碳糖(即，经修饰的2’-脱氧呋喃糖基(deoxyfuranosyl)部分)的寡核苷酸类似物；美国专利5,446,137，其描述了可用于杂交测定的包含至少一个在4’位被氢以外的取代基取代的5碳糖部分的寡核苷酸；美国专利5,886,165，其描述了包含具有3’-5’核苷酸间键的脱氧核糖核苷酸和具有2’-5’核苷酸间键的核糖核苷酸二者的寡核苷酸；美国专利5,714,606，其描述了经修饰的核苷酸间键，其中核苷酸间键的3’位氧被碳代替以增强核酸的核酸酶抗性；美国专利5,672,697，其描述了含有一个或更多个增强了核酸酶抗性的5’亚甲基膦酸酯/盐核苷酸间键的寡核苷酸；美国专利5,466,786和5,792,847，其描述了可含有药物或标记的取代基部分与寡核苷酸的2’碳的连接，以提供增强的核酸酶稳定性和递送药物或检测部分的能力；美国专利5,223,618，其描述了具有连接邻近5碳糖部分的4’位和3’位之2或3碳骨架连接的寡核苷酸类似物，以增强细胞摄取，对核酸酶的抗性以及与靶RNA的杂交；美国专利5,470,967，其描述了包含至少一个氨基磺酸或磺酰胺核苷酸间键的可用作核酸杂交探针的寡核苷酸；美国专利5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289和5,602,240，其描述了具有代替磷酸二酯骨架部分之3或4原子接头部分的寡核苷酸，用于改善核酸酶抗性、细胞摄取和调节RNA表达；美国专利5,858,988，其描述了与寡核苷酸的2’-O位连接的疏水载体剂，以增强其膜渗透性和稳定性；美国专利5,214,136，其描述了在5’末端与蒽醌缀合的寡核苷酸，其具有增强的与DNA或RNA的杂交；增强的对核酸酶的稳定性；美国专利5,700,922，其描述了PNA-DNA-PNA嵌合体，其中DNA包含2’-脱氧-赤式-戊呋喃糖基核苷酸，以增强核酸酶抗性、结合亲和力与激活RnaseH的能力；以及美国专利5,708,154，其描述了与DNA连接以形成DNA-RNA杂合体的RNA。
肽核酸(PNA)是具有识别双链体DNA之突出潜力的非离子DNA模拟物(Kaihatsu等，2004；Nielsen等，1991)。PNA可容易地合成并且通过标准沃森-克里克碱基配对与互补序列结合(Egholm等，1993)，从而允许其靶向基因组内的任何序列而不需要复杂的合成方案或设计考虑。PNA对双链体DNA的链侵袭不受磷酸-磷酸排斥(phosphate-phosphaterepulsion)的阻碍并且是迅速和稳定的(Kaihatsu等，2004；Nielsen等，1991)。PNA的链侵袭的应用包括产生人造引发体(Demidov等，2001)、抑制转录(Larsen和Nielsen，1996)、激活转录(Mollegaard等，1994)和定向诱变(Faruqi等，1998)。如果PNA优秀的链侵袭能力可以有效应用于细胞内部的话，PNA将提供用于探测活***中染色体DNA的结构和功能的一般和有效的策略。
锁核酸(LNA)通常也称为不易接近的RNA，是一种经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2’和4’碳的额外桥修饰。所述桥将核糖“锁定”3’内结构构象中的核糖，其常见于A形式的DNA或RNA中。LNA核苷酸可以在任何需要的时候与寡核苷酸中的DNA或RNA碱基混合。这样的寡聚物是市售的。锁定的核糖构象增强了碱基堆积和骨架预组织化。这显著增加了寡核苷酸的热稳定性(溶解温度)(Kaur等，2006)。LNA碱基可以被引入到DNA骨架中，但是其也可以在LNA、2’-O-甲基RNA、2’-甲氧基乙基RNA或2’-氟RNA的骨架中。这些分子可以利用磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架。
可进行其他寡核苷酸修饰以产生本发明的寡聚物。例如，通过在3′端引入硫代磷酸酯(P＝S)骨架键用于外切核酸酶抗性以及引入2′修饰(2’-OMe、2’-F和相关修饰)用于内切核酸酶抗性，可以取得针对核酸酶降解的稳定性(WO2005115481；Li等，2005；Choung等，2006)。已经示出具有完整的2′-O-甲基和2′-氟核苷酸的基序具有增强的血浆稳定性和增加的体内效力(Allerson等，2005)。2’-O-Me和2’-O-MOE的并入对活性没有明显作用(Prakash等，2005)。
已经示出含有4’-硫代核糖修饰的序列具有比天然RNA高600倍的稳定性(Hoshika等，2004)。晶体结构研究表明，4’-硫代核糖采取与在天然双链体未经修饰的糖中观察到的C3’-内折叠非常类似的构象(Haeberli等，2005)。4’-硫代-RNA的伸展是引导链和非引导链二者中很好耐受的。然而，对4’-硫代核糖核苷的数目和布置进行优化是使效力最大化必需的。
在硼代磷酸酯键中，非桥磷酸二酯氧被等电子硼烷(BH3-)部分代替。已经在转录反应中使用T7RNA聚合酶和硼代磷酸酯核糖核苷三磷酸通过酶促途径合成了硼代磷酸酯siRNA(BNA)。如果引导链的中央不被修饰，则硼代磷酸酯siRNA比天然siRNA活性更高，并且其可以具有比未修饰siRNA高至少十倍的核酸酶抗性(Hall等，2004；Hall等，2006)。
已经报道某些末端缀合物改善或指导细胞摄取。例如，与胆固醇缀合的NAA提高了肝细胞中的体内和体内细胞渗透(Rand等，2005)。Soutschek等(2004)已经报道了使用化学稳定和胆固醇缀合的siRNA具有明显改善的体内和体内药学性质。在有义链和反义链上具有部分硫代磷酸酯骨架和2’-O-甲基糖修饰的化学稳定的siRNA(上文讨论的)示出对血清和组织匀浆中的外切核酸酶和内切核酸酶降解之显著增强的抗性，并且通过吡咯烷接头在寡核苷酸有义链的3’端缀合胆固醇并不导致在细胞培养物中之基因沉默活性的显著丧失。这些研究证明，胆固醇缀合显著改善了寡核苷酸的体内药理学性质。
美国专利公开No.2008/0015162提供了可用于本发明的核酸类似物的另外实例。以下节选来自该文献并且在性质上仅为示例性。在某些实施方案中，寡聚化合物包含一个或更多个经修饰的单体，包括2’-修饰的糖，例如BNA的以及具有2’取代基的单体(例如核苷和核苷酸)，所述2’取代基例如烯丙基、氨基、叠氮基、巯基、O-烯丙基、O--C1-C10烷基、--OCF3、O--(CH2)2--O--CH3、2′-O(CH2)2SCH3、O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn)或O--CH2--C(＝O)--N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地为H或者经取代的或未经取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，包括但不限于本发明的短反义化合物的寡聚化合物包含一个或更多个高亲和力单体，只要所述寡聚化合物不包含含有2′-O(CH2)nH的核苷酸，其中n是1至6。在某些实施方案中，包括但不限于本发明的短反义化合物的寡聚化合物包含一个或更多个高亲和力单体，只要所述寡聚化合物不包含含有2’-OCH3或2’-O(CH2)2OCH3的核苷酸。在某些实施方案中，包括但不限于本发明的短反义化合物的寡聚化合物包含一个或更多个高亲和力单体，只要所述寡聚化合物不包含α-L-亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA。在某些实施方案中，寡聚化合物包含一个或更多个高亲和力单体，只要所述寡聚化合物不包含β-D-亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA和/或β-D-亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA。
已经在专利文献以及科学文献中制备和公开了某些BNA(Singh等，1998；Koshkin等，1998；Wahlestedt等，2000；Kumar等，1998；WO94/14226；WO2005/021570；Singh等，1998)。公开了BNA的公布的美国专利和公开的申请的实例包括例如：美国专利7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；和6,525,191；以及美国专利公开No.2004/0171570；2004/0219565；2004/0014959；2003/0207841；2004/0143114；和2003/0082807。
本文还提供了BNA，其中核糖基糖环的2’-羟基与糖环的4′碳原子连接，从而形成亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)键以形成二环糖部分(综述于Elayadi等，2001；Braasch等，2001和Orum等，2001；还参见美国专利6,268,490和6,670,461)。所述键可以是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(--CH2--)，其中术语亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA用于二环部分；在该位置为乙烯基的情况下，使用术语乙烯基氧基(4’-CH2CH2--O-2’)BNA(Singh等，1998；Morita等，2002)。乙烯基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA和其他二环糖类似物展现出与互补的DNA和RNA之非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)，对于3’-外切核酸酶降解的稳定性以及良好的溶解性。已经描述了有效并且无毒的含BNA的反义寡核苷酸(Wahlestedt等，2000)。
一种已经讨论的亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA的异构体是α-L-亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA，已经发现其具有优异的抗3’外切核酸酶的稳定性。将α-L-亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA并入到示出有效反义活性的反义gapmer和嵌合体中(Frieden等，2003)。
已经描述了亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备，以及其寡聚化和核酸识别特性(Koshkin等，1998)。BNA及其制备还描述在WO98/39352和WO99/14226中。
还制备了亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA、硫代磷酸酯-亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA和2’-硫代-BNA的类似物(Kumar等，1998)。还描述了作为核酸聚合酶底物之含有寡脱氧核糖核苷酸双链体的锁定的核苷类似物的制备(Wengel等，WO99/14226)。另外，本领域中描述了2’-氨基-BNA的合成，这是一种新的构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物(Singh等，1998)。此外，还制备了2’-氨基-BNA和2’-甲基氨基-BNA，并且之前已经报道了其与互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
经修饰的糖部分是公知的，并且可用于改变(通常为增加)寡聚体对于其靶标的亲和力和/或增加核酸酶抗性。经修饰糖的代表性列表包括但不限于：二环经修饰的糖(BNA的)，包括亚甲基氧基(4’-CH2--O-2’)BNA和乙烯氧基(4’-(CH2)2--O-2’桥)BNA；经取代的糖，尤其是具有2’-F、2’-OCH3或2’-O(CH2)2--OCH3取代基的2′-取代的糖；以及4′-硫代修饰的糖。糖也可以由糖模拟基团等代替。用于制备经修饰的糖的方法是本领域技术人员公知的。教导了这样经修饰糖的制备的一些代表性专利和出版物包括但不限于：美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；6,531,584；和6,600,032；以及WO2005/121371。
核苷的天然存在的碱基部分通常是杂环碱基。这样的杂环碱基的两个最常见类别是嘌呤和嘧啶。对于包含戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸中，那些磷酸基团与邻近核苷彼此共价相连以形成线性聚合化合物。在寡核苷酸内，磷酸基团通常被认为形成寡核苷酸的核苷酸间骨架。RNA和DNA的天然存在的键或骨架是3’至5’磷酸二酯键。
除了“未经修饰的”或“天然”核碱基(如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))之外，许多本领域技术人员已知的经修饰核碱基或核碱基模拟物符合本文所述化合物。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是在结构上与母体核碱基非常类似的核碱基，例如，7-脱氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G-形钳(G-clamp)。在某些实施方案中，核碱基模拟物包含更复杂的结构，例如，三环吩嗪核碱基模拟物。用于制备上述经修饰核碱基的方法是本领域技术人员公知的。
本文描述了将单体(包括但不限于经修饰和未经修饰核苷和核苷酸)连接在一起从而形成寡聚化合物的连接基团。通过是否存在磷原子定义了两个主要类别的连接基团。代表性含磷键包括但不限于磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、磷酰胺和硫代磷酸酯(P＝S)。代表性不含磷的连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(--CH2--N(CH3)--O--CH2--)、硫代二酯(--O--C(O)--S--)、硫羰氨基甲酸酯(--O--C(O)(NH)--S--)；硅氧烷(--O--Si(H)2--O--)；和N，N′-二甲基肼(--CH2--N(CH3)--N(CH3)--)。具有无磷连接基团的寡聚化合物被称为寡核苷。与天然的磷酸二酯键相比，经修饰的键可用于改变(通常增加)寡聚化合物的核酸酶抗性。在某些实施方案中，可以将具有手性原子的键制备为外消旋混合物，作为单独的对映异构体。代表性手性键包括但不限于膦酸烷基酯和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷键的方法是本领域技术人员公知的。
5.核酸的纯化
核酸可以在聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯离心梯度上或通过本领域普通技术人员已知的任何其他手段纯化(参见例如，Sambrook等，2001，通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，本发明涉及的核酸为分离的核酸。本文使用的术语“分离的核酸”是指已经从一种或更多种细胞的总基因组和转录的核酸的块(bulk)中分离或以其他方式脱离的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)。在某些实施方案中，“分离的核酸”是指已经从细胞组分或体内反应组分(例如大分子如脂质或蛋白质、小生物学分子等)的块中分离或以其他方式脱离的核酸。
C.小分子
通过角鲨烯的环化在植物中生物合成的三萜化合物被在许多亚洲国家中用于药物目的，并且已知一些(如乌索酸和齐墩果酸)是抗炎和抗致癌的(Huang等，1994；Nishino等，1988)。然而，这些天然存在的分子的生物学活性相对较弱，因此进行新类似物的合成以增强其效力(Honda等，1997；Honda等，1998)。一个用于提高齐墩果酸和乌索酸类似物之抗炎和抗增殖活性的持续努力导致发现了2-氰基-3，12-二氧代-1，9(11)-二烯-28-齐墩果酸(CDDO)及相关化合物(Honda等，1997，1998，1999，2000a，2000b，2002；Suh等，1998；1999；2003；Place等，2003；Liby等，2005)。鉴定了齐墩果酸的多种有效衍生物，包括甲基-2-氰基-3，12-二氧代-1，9-二烯-28-齐墩果酸(CDDO-Me)。CDDO-Me阻抑激活的巨噬细胞中多种重要炎性介体(如iNOS、COX-2、TNFα和IFNγ)的诱导。还报道CDDO-Me激活Keap1/Nrf2/ARE信号转导通路，从而导致产生多种抗炎和抗氧化蛋白质，例如血红素加氧酶-1(HO-1)。这些特性使得CDDO-Me以及其他三萜化合物成为用于治疗赘生性和增殖性疾病(如癌症)的候选物。
IV.药物制剂和施用途径
A.药物制剂
当预期在治疗疼痛中的临床应用时，有必要制备适合预期应用之形式的药物组合物。通常，这将必需制备基本上不含热原以及其他可能对人或动物有害的杂质的组合物。
通常希望使用合适的盐和缓冲剂以赋予材料稳定性并允许被靶细胞摄取。本发明的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水介质中的有效量的用于细胞的载体。这样的组合物也称为接种物(inocula)。短语“药学上或药理上可用”是指在向动物或人施用时不产生不利的、***性的或其他不良反应的分子实体和组合物。本文使用的“可药用载体”包括任何以及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂在药物活性物质中的用途是本领域中公知的。除非在任何常规介质或试剂与本发明的载体或细胞不相容的范围内，否则其在治疗组合物中的用途也是预期的。还可以向组合物中并入补充的活性成分。
本发明的活性组合物可以包括经典药物制剂。根据本发明的这些组合物的施用可以通过任何常用途径，只要通过该途径能够达到靶组织即可。这样的途径包括经口、鼻、颊、直肠、***或表面途径。或者，可以通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鞘内或静脉内注射施用。这样的组合物通常可作为上述可药用组合物施用。特别感兴趣的是直接瘤内施用，肿瘤输注或向肿瘤局部或区域性施用，例如，在局部或区域性脉管或淋巴***中，或者在切除的肿瘤床中。
活性化合物还可以肠胃外或腹膜内施用。作为游离碱或可药用盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散剂。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散剂以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须是流体，其要达到存在容易的可注射性的流动程度。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须不受微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。合适的流动性可以例如通过以下来维持：使用例如卵磷脂的包衣，在分散剂情况下维持所需的颗粒尺寸，以及使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(如苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等)实现。在许多情况下，优选的包含等渗剂(如糖或氯化钠)。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
如下制备无菌可注射溶液剂，将所需量的活性化合物与根据需要的多种上文列举的其他成分并入到合适的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，将多种无菌活性成分并入到含有基础分散介质和来自上文列举的那些所需的其他活性成分的无菌载剂中来制备分散剂。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其之前无菌过滤的溶液的任何额外的所期望成分。
本文使用的“可药用载体”包括任何以及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂在药物活性物质中的用途是本领域中公知的。除了在任何常规介质或试剂与活性成分不相容的范围内，否则其在治疗组合物中的用途也是预期的。还可以向组合物中并入补充的活性成分。
对于经口施用，本发明多肽可以与赋形剂合并并且以不可吸收的漱口水和牙膏形式使用。可以将所需量的活性成分并入合适的溶剂(如硼酸钠溶液(多贝尔溶液))中来制备漱口水。或者，可以将活性成分并入到含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的消毒洗剂中。还可以将活性成分分散在包括凝胶、糊剂、粉末和浆液的牙膏中。可以以治疗有效量将活性成分添加至糊剂牙膏，其可以包含水、粘合剂、研磨剂、矫味剂、发泡剂和湿润剂。
本发明的组合物还可以配制为中性或盐的形式。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且由无机酸(如盐酸或磷酸)或者有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。
配制之后，可以以与剂型相容的方式并且以治疗有效的量施用溶液。制剂以多种剂型容易地施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。例如对于水溶液中的肠胃外施用，所述溶液应当适当地缓冲(如果需要)，并且首先用足够的盐水或葡糖糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，根据本公开内容，可以使用无菌水介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中并且添加至1000ml皮下输液流体中或者在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington′sPharmaceuticalSciences，”第15版，第1035-1038页以及第1570-1580页)。根据被治疗对象的病症，剂量的一些变化是有必要的。在任何情况下，负责施用的人将决定用于个体对象的合适的剂量。此外，对于人施用，制剂应满足FDA生物学标准办公室(FDAOfficeofBiologicsstandards)所要求的无菌性、热原性、一般安全性及纯度的标准。
一种用于递送的特殊制剂是纳米颗粒。纳米颗粒(NP)是大小为1nm至100nm的颗粒。脂质体是作为封闭的球状囊泡的脂质双层，其可包封药物。脂质体的一般直径为400nm至2.5mm。可以开发这两个独特的物理和化学性质以通过药物缀合和产生固体脂质纳米颗粒(SLNP)来递送药物。SLNP由分散在水性介质中并且由表面活性剂稳定的固体脂质构成。SLNP的平均颗粒尺寸为约40nm至1000nm。可通过高压混合和过滤来获得40nm至100nm尺寸的纳米颗粒。许多纳米材料(如考虑分别用作用于将药物转运到其靶位点之中空球体和管的富勒烯以及碳纳米管)的缺乏生物降解性是其毒性的一个重要因素。脂质纳米颗粒的主要优点在于其可容易且完全地生物降解，因为脂质是所有生物体的天然组分。
B.对象
本发明方法可应用于多种物种，例如人、非人灵长类动物(例如，猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。
C.作为生物标志物的TMEPAI的测量
本文的结果表明，TMEPAI表达的升高在癌症患者(包括三阴性乳腺癌)中具有不利的预后意义。抑制TMEPAI表达阻止了转移并且体内抑制肿瘤生长。因此，TMEPAI的测量提供了有价值的生物标志物以鉴定对于抑制其TMEPAI表达将是有益的患者。由于在启动子下的基因扩增和/或表观遗传改变可成为TMEPAI表达提高的基础，有必要分析肿瘤样品中TMEPAI的基因剂量和表达。
通过表观遗传修饰、点突变、易位、扩增和缺失改变基因功能从而使细胞信号转导失调，导致癌症表型。在将正常细胞转化成癌细胞后，通过造成生长停滞或死亡，由转化生长因子-β阻断其向明显的癌症的进展。因此，TGF-β代表了体内针对肿瘤发生的重要障碍以及免疫监督。尽管TGF-β是肿瘤阻抑性的并且抑制上皮增殖，然而在一些癌症中，TGF-β的肿瘤阻抑被颠覆成肿瘤促进，并因此使得癌症依赖TGF-β和临床上有攻击性。这些癌症中的TGF-β拮抗可以充当潜在的治疗选择。然而，这样的介入可能不利地影响依赖于TGF-β用于体内稳态的正常组织。一种更好的方法是鉴定TGF-β下游的信号转导异常并且形成特异性纠正其功能障碍同时保留TGF-β肿瘤阻抑作用的策略。早些时候，本发明人示出通过阵列比较基因组杂交发现雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)基因座作图定位(map)到原位导管癌(DCIS)的20q13，以及多种侵袭性乳腺癌细胞系中高的TMEPAI表达。TMEPAI在高等级乳腺癌中扩增，并且在侵袭性乳腺癌细胞中被TGF-β诱导至甚至更高的水平。TMEPAI敲减降低了体内癌细胞的基础和TGF-β诱导的增殖和迁移以及体内肿瘤生长。此外，在正常人乳腺上皮细胞(HMEC)中，TGF-β仅诱导少量TMEPAI并且抑制其生长。因此，充当了TGF-β两种功能之间的分子开关的TMEPAI可潜在地用作新的生物标志物以分类出将受益于基于TGF-β的抗癌疗法的患者，并且还可以充当替代标志物以监测用所述疗法治疗的患者的进展。
可以使用多种方法来测量作为生物标志物的TMEPAI：
·可以在冷冻的肿瘤样品上通过定量RT-PCR测量TMEPAImRNA，以及通过免疫印迹测量蛋白质。
·对于原位测量，可使用冷冻的或石蜡包埋的样品的切片用于原位杂交(ISH)以检测mRNA或用免疫组织化学(IHC)以检测蛋白质。
·本发明人已经鉴定了适合用于IHC的TMEPAI抗体以及用于mRNA的寡核苷酸探针。可以通过二进制(阴性和阳性)评分法和/或H评分法＝(细胞百分比(0-100％)×强度(0-未染色，1-弱染色，2-中度染色，3-强染色))对样品评分。
·为了测定肿瘤中的TMEPAI基因扩增，可以在石蜡包埋的样品上进行荧光原位杂交(FISH)。探针混合物将含有染色体20q13.31上的光谱橙色标记的TMEPAI探针和用于染色体20的光谱绿色标记的着丝粒探针(D20Z1)。该测试将允许同时检测TMEPAI拷贝数和倍性二者。由于这两种基因探针的正常拷贝数是2，因此正常结果将是2个绿色信号和2个红橙色信号。相对于预期比的任何变化都指示了扩增或多拷贝。
·为确定TMEPAI蛋白在血清中的存在，可能通过表达TMEPAI蛋白的肿瘤将其分泌到血液中。
V.组合疗法
当前癌症研究的一个目标是寻找改善效力、降低副作用以及防止形成抗性的方式。一种方式是将这样的传统疗法与本发明的疗法组合。在本发明的上下文中，预期了抗TMEPAI疗法可同样地用于与更多标准癌症治疗结合。
将以有效减少对象中的疼痛、降低与一种或更多种其他单独药剂相关的副作用或避免患者耐受或上瘾的组合量提供疗法。该过程可以涉及使患者同时与药剂/疗法接触。这可以如下实现：使患者与包含两种药剂的单一组合物或药物制剂接触，或者使细胞同时与两种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物包含USP5治疗剂，而另一种包含所述药剂。
或者，根据本发明的治疗可以在另一种治疗之前或之后间隔数分钟至数周。在一些实施方案中，其中标准治疗和抗TMEPAI治疗分别向细胞施加，通常确保每次递送时间之间的有效时间段没有期满，以使得疗法仍能够对细胞/对象发挥有利的组合作用。在这种情况下，预期使细胞与彼此相隔约12-14小时内、彼此相隔约6-12小时内，或仅相隔约12小时的延迟时间内接触这两种治疗。然而在一些情况下，希望显著延长治疗时间段，其中各施用之间经过数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
还可能希望抗TMEPAI治疗或其他疗法施用多于一次。可以使用多种组合，如下文所示，其中TMEPAI疗法为“A”，而另一种疗法为“B”：
A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BB/B/B/AB/B/A/B
A/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BB/B/B/A
A/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/A/B
预期了其他组合，包括一种或两种药剂的长期给药。
适合用于组合疗法的药剂或因素包括在向细胞施加时诱导DNA损伤的任何化合物或治疗方法。这样的药剂和因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如辐照、微波、电子发射等。多种化合物(也称为“化学治疗剂”或“基因毒性剂”)旨在用于本文公开的组合治疗方法。在根据本发明治疗癌症时，除了与表达构建体接触外，还使肿瘤细胞与药剂接触。这可以通过辐照局部肿瘤部位来实现；或者，可以通过向对象施用治疗有效量的药物组合物来使肿瘤细胞与药剂接触。
预期了多种用于与本发明肽组合的化学治疗剂。例如，选择性***受体拮抗剂(“SERM”)，例如他莫西芬、4-羟基他莫西芬(Afimoxfene)、Falsodex、雷洛昔芬、巴多昔芬(Bazedoxifene)、氯米芬、Femarelle、拉索昔芬、奥美昔芬和托瑞米芬。
预期使用的化学治疗剂包括例如喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C。本发明还涵盖使用一种或更多种DNA损伤剂的组合，不管是基于辐射还是真实化合物，例如使用X射线与顺铂或使用顺铂与依托泊苷。如上所述，通过将其与上述抗TMEPAI疗法组合，可以将药剂作为组合的治疗组合物或试剂盒制备和使用。
热休克蛋白90是发现于许多真核细胞中的调节蛋白。已经示出HSP90抑制剂可用于治疗癌症。这样的抑制剂包括格尔德霉素、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、PU-H71和利福布汀。
还设想了直接交联DNA或形成加合物的药剂。可以使用药剂(如顺铂)以及其他DNA烷化剂。顺铂已经广泛用于治疗癌症，临床应用中使用的有效剂量为每三周20mg/m25天，总共三个疗程。顺铂经口不吸收，因此必须通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。
损伤DNA的药剂还包括干扰DNA复制、有丝***和染色体分离的化合物。这样的化学治疗剂包括阿霉素(也称为多柔比星)、依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素(podophyllotoxin)等。在治疗赘生物的临床环境中广泛使用时，这些化合物通过静脉内快速推注(bolusinjection)施用，剂量对于多柔比星为每隔21天25-75mg/m2，对于依托泊苷为静脉内35-50mg/m2或者经口施用为静脉内的2倍。还预期了微管抑制剂，例如紫杉烷。这些分子是红豆杉(Taxus)属植物产生的二萜，包括紫杉醇和多西他赛。
具有本文要求保护的肽的另一种可能的组合疗法是TNF-α(肿瘤坏死因子-α)，这是一种参与全身炎症的细胞因子并且是刺激急性期反应的一组细胞因子的成员。TNF的主要作用是调节免疫细胞。TNF还能够诱导凋亡细胞死亡，诱导炎症以及抑制肿瘤发生和病毒复制。
破坏核酸前体和亚单位的合成和保真度的药剂也导致DNA损伤。因此，已经开发了许多核酸前体。特别有用的是经历过广泛测试并且容易得到的药剂。因此，药剂(如5-氟尿嘧啶(5-FU))优先被赘生性组织所使用，使得这种药剂特别可用于靶向赘生性细胞。尽管具有非常大的毒性，5-FU可适用于多种载体中(包括表面)，但是常用的是以3至15mg/kg/天的剂量静脉内施用。
其他造成DNA损伤并且已经广泛使用的因素包括通常已知的γ-射线、x-射线和/或直接向肿瘤细胞递送放射性同位素。还预期了其他形式的DNA损伤因素，例如微波和UV辐照。最可能的是所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛的损伤。X射线的剂量范围为从50至200伦琴的每日剂量持续延长的一段时间(3至4周)到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、放射发射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
技术人员受“Remington’sPharmaceuticalSciences”第15版，第33章，特别是第624-652页的指导。根据被治疗对象的病症，有必要对剂量进行一些改变。在任何情况下，负责施用的人将决定用于个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应满足FDA生物学标准办公室的所要求的无菌性、热原性、一般安全性及纯度的标准。
除了将TMEPAI疗法与化学和放射疗法组合外，还预期了与免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术的组合。
V.实施例
包括以下实施例以证明本发明的一些特定实施方案。本领域技术人员应理解，下面实施例中公开的技术代表了本发明人发现在本发明的实施中良好发挥作用的技术，因此可以被认为构成了用于实施本发明的特定模式。然而，本领域技术人员应理解，根据本公开内容，可以对公开的特定实施方案进行许多改变并且依然获得相同或类似的结果，而且不脱离本发明的精神和范围。
实施例1-材料和方法
CLST-NP的制备。由卵磷脂乳剂制备纳米颗粒。为了制备装载载剂的纳米颗粒(Veh-NP)和装载南蛇藤醇(CLST-NP)的纳米颗粒，将乙醇中的10mg南蛇藤醇添加到含有4mg卵磷脂的玻璃小瓶中，并且使用氮气完全蒸发掉乙醇。以逐滴方法添加去离子水中的Tween20至2％(w/v)终浓度，并且利用小的磁子(magneticflee)在磁性搅拌器热板中于50-55℃下将其加热，直到形成乳白色分散的较不透明但是不澄清的溶液。在没有药物的情况下重复相同的程序以制备装载有载剂的卵磷脂纳米颗粒(Veh-NP或Veh)。将Veh-NP和CTR-NP二者通过一系列0.4μ、0.2μ、0.1μ的膜过滤并且添加5％葡萄糖作为冻干保护剂。将总体积的Veh-NP和CLST-NP二者冻干并且溶解在去离子水中。在425nm下对纳米颗粒进行量化。在扫描电子显微术(SEM)下观察纳米颗粒并且通过动态光散射(DLS)测量粒径。
实施例2-结果
正常乳腺上皮细胞相对于乳腺癌细胞中的TMEPAI表达。处理6小时内，在暴露于肿瘤阻抑细胞因子TGF-β的MDA-MB-231细胞中极大诱导了雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)mRNA(＞40倍)和蛋白质(～9倍)(图1A-B)。相比之下，响应于TGF-β，正常人乳腺上皮细胞(HMEC)不良地诱导TMEPAIRNA和蛋白质(图1A-B)。本发明人通过免疫印迹测试了多种乳腺癌细胞系中TMEPAI的表达。尽管大部分攻击性三阴性(MDA-MB-231、BT20、HCC1937)细胞表达TMEPAI蛋白，ER+ve但是非侵袭性的MCF-7、T47D和CAMA-1细胞没有显著表达这种蛋白(图2)。另外，共表达***受体的攻击性HER2阳性乳腺癌细胞(BT-474)或不共表达***受体的攻击性HER2阳性乳腺癌细胞(SK-BR-3)也表达TMEPAI(图2)。
乳腺肿瘤中TMEPAI蛋白的表达。之前，本发明人通过阵列比较基因组杂交(aCGH)证明，与小叶原位癌LCIS(2/11)相比，导管原位癌(DCIS)(43/85)中作图定位在20q13(1，2)的TMEPAI扩增频率更高。他们还鉴定了多种侵袭性乳腺癌细胞系中TMEPAI是高度表达的(2)。为了进一步探究TMEPAI在乳腺致癌作用中可能的作用，通过免疫组织化学(IHC)筛选多种乳腺肿瘤的TMEPAI表达。为了验证基因扩增的aCGH数据为真实蛋白质表达，随机选择17例DCIS，其中8例(47％)示出TMEPAI基因座中基因扩增(图3A-B)。在这些中，在3例(18％)中发现很少或没有发现TMEPAI蛋白的表达。在17例中的4例(24％)中，发现低的TMEPAI蛋白表达(+)，而17例中的10例(59％)示出中等至明显(++/+++)的TMEPAI蛋白表达。与其中仅47％(8/17)例为TMEPAI基因扩增阳性的aCGH相比，IHC鉴定82％(14/17)的DCIS病例具有升高的TMEPAI蛋白表达。这些结果表明，遗传事件和表观遗传事件(epigeneticevent)均可参与提高导管瘤中的TMEPAI表达。
乳腺肿瘤中TMEPAI蛋白表达改变了TGF-β信号转导。TGF-β信号通过Smad依赖性步骤和参与丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的非经典途径。非经典信号转导可以是非Smad依赖性的，但是通常需要Smad依赖性输入(input)1。在这一点上，依然不知道扩增的TMEPAI如何使正常肿瘤阻抑性Smad信号转导改变为促进癌细胞的生长和转移。TMEPAI与Smad2/3相互作用以隔绝其不被TGF-β受体激活(Watanabe等，2010)，表明TMEPAI通过降低TGF-β的生长阻抑来促进肿瘤生长。然而，如果用该机制解释癌症中TGF-β介导的生长，其依然是未经检验的。本发明人现鉴定了三阴性癌细胞中TGF-β的肿瘤促进不仅涉及TMEPAI依赖性地消除生长阻抑性Smad信号转导(图4A-H)(如通过TMEPAI-Smad相互作用预测)，还涉及强力并且未被怀疑的Smad3驱动的通过PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)以及Akt的TMEPAI激活非经典信号转导(图5A-C)。扩增的TMEPAI不仅介导允许肿瘤发生之增殖的提高(图8A-D)，还增强有利于体内转移之TGF-β对Snail的诱导(图9A-D)。TMEPAI降低生长阻抑性Smad信号转导以及Smad3-TMEPAI介导的对促进生长和转移之PTEN-Akt的作用的协作作用构成了根本上由正常状态改变的信号转导病理学，其可为多种癌症(包括三阴性乳腺癌)中TGF-β肿瘤促进的基础。
高TMEPAI表达在ER阴性/***阳性乳腺癌患者中具有不利的预后意义。通过在公众可获得数据库和在线工具(Gyorffy，2010)进行初步分析来确定TMEPAI的预后意义，所述在线工具使用从GEO(AffymetrixHGU133A和HGU133+2微阵列)下载的基因表达数据和存活信息建立。使用中位数作为用于TMEPAI表达的参考来分类的ER阴性且***阳性患者的无复发存活表明，高TMEPAI表达与具有1.4-5.16的95％置信区间的2.6风险比(HR)和0.002的对数秩P值的较短生存相关(图6)。总之，这些结果表明TMEPAImRNA表达的升高在三阴性乳腺癌患者中具有不利的预后意义。
正常HMEC中TMEPAI的表达降低了TGF-β诱导的Smad信号转导，并且抑制MDA-MB-231癌细胞中TMEPAI表达根本地使低Smad信号转导恢复至高水平。在TGF-β的存在或不存在下，MDA-MB-231、BT-20和HCC1937细胞中TMEPAI的过表达导致Smad信号转导严重降低，如通过12×CAGA驱动的荧光素酶(Luc)报告蛋白活性确定(图4A)。因为TMEPAI可以隔绝R-Smad并减少经典TGF-β信号转导，所以本发明人检查了MDA-MB-231细胞中低TMEPAI以及HMEC中过表达的TMEPAI的作用。TGF-β在HMEC中引起稳健的信号转导应答：Smad2/3的C-末端磷酸化(图4E)以及增加的12×CAGA-Luc活性(图4D)。HMEC(具有少量基础TMEPAI)中TMEPAI的表达阻抑TGF-β诱导的Smad2/3的磷酸化(图4E)并且降低12×CAGA-Luc活性(图4D)。具有对照shRNA的MDA-MB-231细胞中对于TGF-β的经典信号转导应答弱，如通过Smad2/3的C-末端磷酸化和12×CAGA-Luc活性评估(图4B、4C、4D)。另一方面，通过两种不同shRNA对MDA-MB-231细胞中的TMEPAI敲减恢复了响应于TGF-β的高12×CAGA-Luc活性(图4B和4D)并且增加了R-Smad磷酸化而不改变Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白(图4C)。此外，通过在这些细胞中表达小鼠TMEPAI，在MDA-MB-231细胞中通过TMEPAI敲减得到的提高的12×CAGA-Luc活性被降低(图4D)。因此，MDA-MB-231细胞具有与病理学高TMEPAI相关的缺陷性Smad信号转导，并且所述缺陷可以通过靶向TMEPAI校正。与MDA-MB-231细胞类似(Singha等，2010；图4C和4D)，在一种不同的三阴性乳腺癌细胞系HCC1937(其抵抗TGF-β的生长阻抑作用)中TMEPAI敲减导致在TGF-β的存在下Smad3驱动的12×CAGA信号转导(图4F)以及R-Smad磷酸化增加(图4H)，并且降低生长(图4G)。
抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中TMEPA的表达阻断通过PTEN和Akt的非经典TGF-β信号转导并且正常HMEC中TMEPAI的表达促进通过PTEN和Akt的非经典TGF-β信号转导。已知TGF-β信号转导使用非经典效应物(如Akt，其是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径中的一种原癌基因中间物)。肿瘤阻抑物PTEN通过使PI3K产物磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸去磷酸化来拮抗Akt信号转导。本发明人发现，具有对照shRNA的三阴性乳腺癌细胞中基础的以及TGF-β治疗后具有低PTEN水平，而具有TMEPAIshRNA的细胞具有升高的PTEN水平(图5A-5B)。相应地，具有对照shRNA和低PTEN水平的癌细胞中响应于TGF-β的Akt磷酸化高，但是Akt磷酸化在具有TMEPAI敲减和更大量PTEN的细胞中被阻抑(图5A和5B)。
通过shRNA抑制TMEPAI的表达防止了肿瘤转移。本发明人示出，与具有对照shRNA的相应细胞相比，在MDA-MB-231细胞中通过shRNA的TMEPAI敲减明显降低了肿瘤异种移植物的尺寸(图8A)，其与TMEPAI在培养物(Singha等，2010；图4G)以及体内(图8A)的TGF-β依赖性生长中的重要作用一致。除了其在细胞生长和存活中的作用以外，PI3K/Akt途径的激活还参与癌细胞迁移并且与许多肿瘤的侵袭性增加有关。PI3K/Akt的这些作用受到肿瘤抑制物PTEN的拮抗，本发明人现在示出PTEN为TMEPAI的靶标。PI3K信号转导的增加导致转录因子Snail上调并且降低了细胞-细胞接触以及促进了上皮到间充质的转变。他们发现通过用TGF-β处理细胞，SnailmRNA和蛋白质二者均明显增加，以及预期的TMEPAI的诱导。TGF-β增加Snail的作用被TMEPAI敲减所阻断(图9A和9B)。Snail表达可以控制肿瘤侵袭性。事实上，他们之前使用Matrigel测定示出TMEPAI敲减降低MDA-MB-231细胞通过胞外基质的运动性和侵袭(Singha等，2010)。事实上，他们发现与具有对照shRNA的相应细胞相比，静脉内注射后MDA-MB-231细胞中的TMEPAI敲减也极大降低了体内肿瘤肺转移(图9C和9D)。
萜衍生物南蛇藤醇阻断TMEPAI的表达并反转TMEPAI介导的作用。在筛选了其结构中具有反应性α，β-不饱和酮的多种萜衍生物后，本发明人鉴定出三萜化合物雷公藤红素(南蛇藤醇)具有阻断TGF-β诱导的TMEPAI表达的能力。在低浓度(1μM)下，南蛇藤醇显著降低MDA-MB-231癌细胞增殖并且增加细胞死亡，并且对正常MCF-10A细胞没有生长阻抑作用(图10A和10B)。即使是在高10倍的南蛇藤醇剂量下，仅观察到轻微降低的正常MCF10A细胞的增殖(未示出)。与其阻断TMEPAI表达的能力一致，南蛇藤醇显著提高Smad信号转导，如通过Smad2和Smad3磷酸化测量(图10C，右图)。同样地，南蛇藤醇抑制非Smad信号转导(图10C，左图)。还通过12×CAGA-荧光素酶报告蛋白活性的提高确认了Smad信号转导的增强(图10D)。
TMEPAI表达的药理学抑制降低体内肿瘤生长。南蛇藤醇降低接种有表达GFP荧光素酶以及高内源TMEPAI水平的攻击性MDA-MB-231细胞的小鼠中的肿瘤负荷。在仅用载剂处理的肿瘤中，发光信号极大提高(10000-60000RLU)，而南蛇藤醇显著阻断了这些小鼠中的肿瘤生长(500-2500RLU)(图11A)。与载剂处理相比，南蛇藤醇处理导致肿瘤负荷降低约6倍(图11B)。相比之下，用载剂和南蛇藤醇处理的小鼠的总体重保持相同(图11D)，表明在给定剂量下南蛇藤醇对小鼠没有毒性作用。由于磷酸-Smad2和磷酸-Smad3的表达水平提高而TMEPAI表达降低，因此南蛇藤醇处理显著提高了肿瘤中的TGF-β信号转导(图11C)。因此，这些临床前研究证实，表达TMEPAI的乳腺癌通过阻抑肿瘤阻抑性TGF-β信号转导而兴旺，因此易受南蛇藤醇对TMEPAI表达的药理学抑制的影响。
装载南蛇藤醇的纳米颗粒在肿瘤靶向和肿瘤抑制中有效。因为南蛇藤醇低的水溶解度(LogPo/w5.63)，已知的全身毒性，所以通过将其悬浮在纳米颗粒中可以取得比溶液更高的雷公藤红素(tripterine)剂量。纳米颗粒制剂还将增强不溶性疏水药物的生物利用度(Merisko-Liversidge，2008)。本发明人由包封有南蛇藤醇的水包卵磷脂(lecithin-in-water)乳剂制备了固体脂质纳米颗粒，对其进行了表征并且在细胞培养和动物研究中对其进行了测试，以了解对于肿瘤靶向和药物摄取的有效性。终点是体外细胞死亡以及动物康复和体内肿瘤体积。
不同于使用Tween80和脱氧胆酸盐作为表面活性剂的之前的南蛇藤醇纳米颗粒的制剂(Song，2011；Huang，2012)，本发明人在制备期间使用Tween20作为表面活性剂并且用合适的过滤器通过LIPEXTMExtruder过滤以产生约50至100nm单层脂质体的均匀群，从而实现脂质体尺寸最大的减小。减小的尺寸在从毛细血管渗出到靶部位中更有效。计算的南蛇藤醇进入纳米颗粒(CLST-NP)中的包埋效率为91.8％。
如图12A-D所示，装载有南蛇藤醇的卵磷脂纳米颗粒体内抑制肿瘤生长。事实上，0.2mg/kg含南蛇藤醇的脂质体(CLST-NP)比2mg/Kg单独南蛇藤醇(CLST)在降低肿瘤尺寸、肿瘤重量和肿瘤体积上更有效。用载剂或药物处理的动物中体重的相似性表明在施用剂量下CLST-NP和CLST没有毒性。
MDA-MB-231细胞释放含TMEPAI的外来体(exosome)到培养基中表明TMEPAI是优异的癌症生物标志物。在生理和病理条件下，许多细胞类型(特别是肿瘤细胞)分泌不同类型的膜囊(membranevesicle)，特别是纳米级膜囊(术语“外来体”)。这些囊形成于起泡的细胞质膜的表面上或内部细胞区室内(Denzer，2000)。本发明人测试了在被TGF-β刺激时产生TMEPAI的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231是否以外来体的形式向胞外培养基中释放这种蛋白质。从用TGF-β处理的MDA-MB-231细胞的培养基中分离的外来体含有大量TMEPAI(图13A)。在不存在TMEPAI的情况下，TMEPAI缺陷细胞(TMEPAIKD)分泌的外来体中存在更多Hsp70(图13B)。由于TMEPAI是发现于大部分癌细胞(包括乳腺癌、结肠癌、***癌和肺癌)上的分子，但是未发现于正常细胞上。TMEPAI可用于血液测试以确定患者是否患有癌症或者在癌症治疗后残余癌症。TMEPAI可以用作早期肿瘤标志物以及晚期转移癌标志物二者。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
根据本公开内容，不需要过度实验就可以制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管按照一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，然而对于本领域技术人员明显的是，可以对本文所述组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不脱离本发明的理念、精神和范围。更具体地，明显的是，可以用在化学和生理学两个方面相关的某些药剂代替本文所述药剂，同时实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似代替和修改被认为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和理念内。
VI参考文献
在为本文给出的那些内容提供示例性程序或其他细节补充的程度上，以下参考文献特别地通过引用并入本文。
MoustakasA，HeldinCH.Non-SmadTGF-βsignals.JCellSci.2005；118：3573-84.
Kangetal.NewregulatorymechanismsofTGF-betareceptorfunction.TrendsCellBiol.2009；19：385-94.
Parvanietal.NoncanonicalTGF-betaSignalingDuringMammaryTumorigenesis.J.MammaryGlandBiolNeoplasia2011；16：127-46.
Xuetal.Anovelandrogenregulatedgene，PMEPA1，locatedonchromosome20q13exhibitshighlevelexpressioninprostate.Genomics2000；66：257-63.
Brunschwigetal.PMEPA1，atransforminggrowthfactor-beta-inducedmarkerofterminalcolonocytedifferentiationwhoseexpressionismaintainedinprimaryandmetastaticcoloncancer.CancerRes.2003；63：1568-75.
BonafouxD，LeeWC.StrategiesforTGF-betamodulation：areviewofrecentpatents.ExpertOpinTherPat.2009；19(12)：1759-69.
Samarnthaietal.，TMEPAIGeneAmplificationinTripleNegativeBreastCancers.Mod.Pathol.；23：70A，2010.
Singhaetal.，Transforminggrowthfactor-beta(TGF-beta)-induciblegeneTMEPAIconvertsTGF-betafromatumorsuppressortoatumorpromoterinbreastcancer.CancerRes.；70：6377-83，2010.
Watanabeetal.TMEPAI，atransmembraneTGF-β-inducibleprotein，sequestersSmadproteinsfromactiveparticipationinTGF-βsignaling.MolCell.；37(1)：123-34.4，2010.
etal.Anonlinesurvivalanalysistooltorapidlyassesstheeffectof22,277genesonbreastcancerprognosisusingmicroarraydataof1,809patients.BreastCancerResTreat.；123(3)：725-31，2010.
Merisko-LiversidgeEM，LiversidgeGG.Drugnanoparticles：formulatingpoorlywater-solublecompounds.ToxicolPathol.Jan；36(1)：43-8，2008.
SongJ，etal.Formulationandevaluationofcelastrol-loadedliposomes.Molecules13；16(9)：7880-92，2011.
Huangetal.，Preparation，characterization，andassessmentoftheantigliomaeffectsofliposomalcelastrol.AnticancerDrugs；23(5)：515-24，2012.
Denzeretal.，Exosome：frominternalvesicleofthemultivesicularbodytointercellularsignalingdevice.JCellSci113Pt19，3365-3374，2000.

Claims (44)

1.抑制癌细胞的方法，与正常对照细胞相比所述癌细胞过表达雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)，所述方法包括使所述癌细胞与抑制TMEPAI表达或活性的药剂接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞选自脑癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、睾丸癌细胞或皮肤癌细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌细胞是三阴性乳腺癌细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂是siRNA或反义分子。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂是胞内抗体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂是小分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述药剂是三萜化合物。
9.根据权利要求1所述的方法，其还包括使所述细胞与第二抗癌剂或疗法接触。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞是转移的、复发的或多重抗药性的癌细胞。
11.治疗患有癌症的对象的方法，其中与正常细胞相比所述癌症的细胞过表达雄激素诱导的***跨膜蛋白(TMEPAI)，所述方法包括向对象施用抑制TMEPAI表达或活性的药剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症选自脑癌、***癌、肺癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、***、睾丸癌或皮肤癌。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述药剂是siRNA或反义分子。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述药剂是胞内抗体。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述药剂是小分子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述药剂是三萜化合物。
19.根据权利要求11所述的方法，其还包括向所述对象施用第二抗癌剂或疗法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二抗癌剂或疗法是化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或手术。
21.根据权利要求19所述的方法，其中在所述药剂之前递送所述第二抗癌剂。
22.根据权利要求19所述的方法，其中在所述药剂之后递送所述第二抗癌剂。
23.根据权利要求19所述的方法，其中与所述药剂同时递送所述第二抗癌剂。
24.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症是转移的、复发的或多重抗药性的癌症。
25.根据权利要求11所述的方法，其还包括测量来自所述对象癌细胞中的TMEPAI水平。
26.根据权利要求11所述的方法，其中静脉内、动脉内、皮下或经口施用所述药剂。
27.根据权利要求11所述的方法，其中将所述药剂瘤内、局部或区域性施用到肿瘤部位，或全身性施用所述药剂。
28.根据权利要求11所述的方法，其中将所述药剂施用多于一次。
29.根据权利要求11所述的方法，其中所述对象是人对象。
30.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗导致以下的一种或更多种：降低肿瘤负荷、减慢肿瘤生长、延长存活时间、使不可切除的肿瘤可被切除或提高生活质量。
31.根据权利要求11所述的方法，其还包括获得来自所述对象癌细胞中之TMEPAI表达的信息。
32.根据权利要求31所述的方法，其中获得信息包括获得癌细胞或组织活检物以及评估TMEPAImRNA水平。
33.根据权利要求31所述的方法，其中获得信息包括获得癌细胞或组织活检物以及评估TMEPAI蛋白水平。
34.根据权利要求31所述的方法，其中在用所述药剂治疗之前获得所述信息。
35.根据权利要求31或34所述的方法，其中在用所述药剂治疗之后获得所述信息。
36.用于将患者分类为受益于TMEPAI抑制疗法的方法，其包括：
a)从癌症患者获得样品，其中所述样品包含癌细胞；以及
b)评估所述癌细胞中的TMEPAI水平，
其中来自所述样品的癌细胞中TMEPAI水平的提高指示所述患者将受益于TMEPAI抑制疗法。
37.用于监测患者中的癌症疗法的方法，其包括：
a)从经历癌症疗法的癌症患者获得样品，其中所述样品包含癌细胞；
b)评估所述癌细胞中的TMEPAI水平；以及
c)与治疗前或较早评估的TMEPAI水平相比来比较所述癌细胞中的水平，
其中来自所述样品的癌细胞中TMEPAI水平的降低指示所述患者受益于所述癌症疗法。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述癌细胞选自脑癌细胞、***癌细胞、肺癌细胞、头颈癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、***细胞、睾丸癌细胞或皮肤癌细胞。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
40.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述乳腺癌细胞是三阴性乳腺癌细胞。
41.根据权利要求36所述的方法，其还包括用以下来治疗所述患者：
a)抑制TMEPAI表达或活性的药剂，和/或
b)基于TGF-β的疗法。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述疗法是：
a)抑制TMEPAI表达或活性的药剂，和/或
b)基于TGF-β的疗法。
43.用于将患者分类为受益于TMEPAI抑制疗法的方法，其包括：
a)从癌症患者获得血液、血浆或血清样品；以及
b)评估所述血液、血浆或血清样品中的TMEPAI水平，
其中所述血液、血浆或血清样品中TMEPAI水平的提高指示所述患者将受益于TMEPAI抑制疗法。
44.用于监测患者中的癌症疗法的方法，其包括：
a)从经历癌症疗法的癌症患者获得血液、血浆或血清样品；
b)评估所述血液、血浆或血清样品中的TMEPAI水平；以及
c)与治疗前或较早评估的TMEPAI水平相比来比较所述血液、血浆或血清样品中的水平，
其中所述血液、血浆或血清样品中TMEPAI水平的降低指示所述患者受益于所述癌症疗法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114524872A (zh) * 2022-03-09 2022-05-24 广州诺诚生物技术研发有限公司 一种用于乳腺癌检测的单克隆抗体及其试剂盒

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106411455A (zh) * 2015-07-30 2017-02-15 中兴通讯股份有限公司 信道状态信息测量方法及装置
IT201700015178A1 (it) * 2017-02-10 2018-08-10 Univ Degli Studi Di Sassari Nanoparticelle polimeriche incapsulanti una combinazione di molecole bioattive naturali, un procedimento per la loro preparazione e loro uso per il trattamento del tumore prostatico
WO2020257658A1 (en) * 2019-06-20 2020-12-24 University Of Iowa Research Foundation Nanoparticles comprising quinone w methides and compositions for use
US11904006B2 (en) 2019-12-11 2024-02-20 University Of Iowa Research Foundation Poly(diaminosulfide) particle-based vaccine
WO2023097293A2 (en) * 2021-11-23 2023-06-01 President And Fellows Of Harvard College Anti-pmepa-1 antibodies or antigen binding fragments thereof, compositions, and uses thereof

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US4415723A (en) 1982-03-19 1983-11-15 General Electric Company Randomly branched aromatic polycarbonate from triphenol
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4682195A (en) 1985-09-30 1987-07-21 General Electric Company Insulated gate device with configured emitter contact pad
US4959463A (en) 1985-10-15 1990-09-25 Genentech, Inc. Intermediates
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
EP0266032A1 (en) 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme
US4816571A (en) 1987-06-04 1989-03-28 Applied Biosystems, Inc. Chemical capping by phosphitylation during oligonucleotide synthesis
US5141648A (en) 1987-12-02 1992-08-25 Neorx Corporation Methods for isolating compounds using cleavable linker bound matrices
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
US5602244A (en) 1988-05-26 1997-02-11 Competitive Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5708154A (en) 1989-02-24 1998-01-13 City Of Hope RNA-DNA hybrid molecules of nucleic acid
US5141813A (en) 1989-08-28 1992-08-25 Clontech Laboratories, Inc. Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5872232A (en) 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5652099A (en) 1992-02-12 1997-07-29 Conrad; Michael J. Probes comprising fluorescent nucleosides and uses thereof
CA2129105A1 (en) 1992-02-12 1993-08-19 Michael J. Conrad Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides
DE4204650C1 (zh) 1992-02-15 1993-07-08 Hoffmeister, Helmut, Dr., 4400 Muenster, De
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5438131A (en) 1992-09-16 1995-08-01 Bergstrom; Donald E. 3-nitropyrrole nucleoside
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
RU95114435A (ru) 1992-12-14 1997-05-20 Ханивелл Инк. (Us) Система с бесщеточным двигателем постоянного тока
US5858988A (en) 1993-02-24 1999-01-12 Wang; Jui H. Poly-substituted-phenyl-oligoribo nucleotides having enhanced stability and membrane permeability and methods of use
EP0691968B1 (en) 1993-03-30 1997-07-16 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5574146A (en) 1994-08-30 1996-11-12 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide synthesis with substituted aryl carboxylic acids as activators
US5554744A (en) 1994-09-23 1996-09-10 Hybridon, Inc. Method for loading solid supports for nucleic acid synthesis
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5889136A (en) 1995-06-09 1999-03-30 The Regents Of The University Of Colorado Orthoester protecting groups in RNA synthesis
US5705629A (en) 1995-10-20 1998-01-06 Hybridon, Inc. Methods for H-phosphonate synthesis of mono- and oligonucleotides
US5670663A (en) 1996-02-14 1997-09-23 Regents Of The University Of California Recovery of taxanes from conifers
US5886165A (en) 1996-09-24 1999-03-23 Hybridon, Inc. Mixed backbone antisense oligonucleotides containing 2'-5'-ribonucleotide- and 3'-5'-deoxyribonucleotides segments
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
CN1273476C (zh) 1997-09-12 2006-09-06 埃克西康有限公司 寡核苷酸类似物
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
BRPI9908967B1 (pt) 1998-03-20 2017-05-30 Benitec Australia Ltd processos para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
CA2361201A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
ES2234563T5 (es) 1999-02-12 2018-01-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Nuevos análogos de nucleósidos y oligonucleótidos
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
JP4151751B2 (ja) 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
JP2003526367A (ja) 2000-03-16 2003-09-09 ジェネティカ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の方法とｒｎａ干渉組成物
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US20040219565A1 (en) 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7427672B2 (en) 2003-08-28 2008-09-23 Takeshi Imanishi Artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
EP1765847A4 (en) 2004-05-27 2010-10-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc NUCLEASERESISTENT DOUBLE-STRANDED RIBONUCLEIC ACID
JP2008501693A (ja) 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物
AU2006203830A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-13 The Johins Hopkins University Biomarkers for melanoma
WO2007117466A2 (en) 2006-03-31 2007-10-18 Massachusetts Institute Of Technology Celastrol, gedunin, and derivatives thereof as hsp90 inhibitors
AU2007257093A1 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of PCSK9
AU2009234259A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Bionovo, Inc. Anticancer methods employing extracts of Gleditsia sinensis Lam
GB0821787D0 (en) * 2008-12-01 2009-01-07 Univ Ulster A genomic-based method of stratifying breast cancer patients
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione
SG187965A1 (en) 2010-08-27 2013-04-30 Stem Centrx Inc Notum protein modulators and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SINGHA P. K.等: "TGF-β-Inducible Gene TMEPAI Converts TGF-β from a Tumor Suppressor to a Tumor Promoter in Breast Cancer", 《CANCER RES.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114524872A (zh) * 2022-03-09 2022-05-24 广州诺诚生物技术研发有限公司 一种用于乳腺癌检测的单克隆抗体及其试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014134179A1 (en) 2014-09-04
EP2961853B1 (en) 2018-09-19
US10398661B2 (en) 2019-09-03
US20160000735A1 (en) 2016-01-07
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EP2961853A4 (en) 2016-08-17
EP2961853A1 (en) 2016-01-06

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