CN101932604A - EphB4作为诊断标记和作为卵巢癌的治疗靶标的用途 - Google Patents

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Abstract

在某些实施方案中，本发明提供用于抑制卵巢癌中EphB4活性的组合物和方法。在其它实施方案中，本发明提供用于治疗卵巢癌的方法和组合物。

Description

EphB4作为诊断标记和作为卵巢癌的治疗靶标的用途
相关申请
该申请要求2007年3月12日提交的美国临时申请号60/906,727及2007年3月12日提交的美国临时申请号60/906,764的优先权。该引用申请的全部教导此处以其整体引入作为参考。
发明背景
卵巢癌是妇女中第二常见的妇科癌，在2005年美国约有22,220例新病例(American Cancer Society，2005)。卵巢癌比女性生殖***的其它任何癌引起更高的死亡。绝大多数卵巢癌起源于上皮。卵巢癌在携带BRCA或错配修复基因突变的妇女中具有更高的发病率(Matais-Guiu，1998)。也已经研究了***在卵巢癌发展中的作用。相信***的某些代谢物可能帮助肿瘤生长，而孕酮可能具有保护作用(Seeger，2006)。不存在有效的卵巢癌筛选工具，并且在超过80％的病例中，直至疾病晚期才能做出诊断，这使得治疗非常具有挑战性。目前总体5年存活率是44％；然而，患有该疾病的妇女的相对5年存活率仅为29％(American Cancer Society，2005)。因此需要鉴定在卵巢癌发病机理中起作用的新的分子标记，希望提供新的靶向生物疗法。
本公开内容的目标是提供用于抑制卵巢癌的血管发生和肿瘤生长的试剂和治疗性治疗。
发明概述
在某些方面，本公开内容提供了治疗卵巢癌的方法，所述方法包括向需要治疗卵巢癌的患者施用有效量的EphB4抑制剂。在某些实施方案中，所述抑制剂可以是多肽、多肽类似物、拟肽、抗体、核酸、RNAi构建体、核酸类似物或小分子。在某些实施方案中，所述EphB4抑制剂是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体或抗体片段、双抗体、嵌合的或嵌合抗体或抗体片段、人源化抗体或抗体片段、去免疫化人抗体或抗体片段、完全人类抗体或抗体片段、单链抗体、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab’)2。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合EphB4的胞外域。
在某些实施方案中，EphB4的存在是EphB4的可检测水平。在某些实施方案中，样品选自：组织样品、血液样品或血清样品。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段共价连接额外的功能部分。在某些实施方案中，所述额外的功能部分是可检测标记。在某些实施方案中，所述可检测标记选自荧光标记或生色标记。在某些实施方案中，所述可检测标记选自辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在某些实施方案中，所述额外的功能部分包含聚乙二醇(PEG)部分。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段抑制EphB4活性。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段激活EphB4激酶活性。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合到位于EphB4胞外部分中的表位上。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合到位于人EphB4序列的氨基酸16-198内的表位上。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合到位于人EphB4的氨基酸327-427或428-537内的表位上。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中所述重链可变区包含一个或更多个CDR区，所述CDR区具有选自SEQ IDNO：261、SEQ ID NO：262和SEQ ID NO：263的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含一个或更多个CDR区，所述CDR区具有选自SEQ ID NO：264、SEQID NO：265和SEQ ID NO：266的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，其中所述重链包含：包含SEQ ID NO：8的CDR1、包含SEQ ID NO：9的CDR2和包含SEQ ID NO：10的CDR3；并且其中所述轻链包含：包含SEQ ID NO：11的CDR1、包含SEQ ID NO：12的CDR2和包含SEQ ID NO：13的CDR3。在某些实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，其中所述重链包含：包含SEQ ID NO：14的CDR1、包含SEQ ID NO：15的CDR2和包含SEQ ID NO：16的CDR3；并且其中所述轻链包含：包含SEQ ID NO：17的CDR1、包含SEQ ID NO：18的CDR2和包含SEQ ID NO：19的CDR3。
在另一实施方案中，EphB4抑制剂是可溶性多肽，其选自(i)包含EphB4蛋白质胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述EphB4多肽是单体并特异性结合Ephrin B2多肽；和(ii)包含Ephrin B2蛋白质胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述可溶性Ephrin B2多肽是单体并以高亲和力结合EphB4多肽。在某些实施方案中，所述可溶性多肽包含EphB4蛋白质的球形结构域。在其它方面，所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的1-522残基至少90％同一的序列。在另一方面，所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的1-412残基至少90％同一的序列。在其它实施方案中，所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的1-312残基至少90％同一的序列。此外，所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的1-225残基至少90％同一的序列。所述可溶性多肽还可以是融合蛋白，或可以包含一个或更多个修饰的氨基酸残基。在某些优选实施方案中，所述可溶性多肽抑制Ephrin B2和EphB4之间的相互作用，或抑制Ephrin B2和EphB4的聚集。在其它实施方案中，所述可溶性多肽抑制Ephrin B2或EphB4的磷酸化。
在其它实施方案中，所述EphB4抑制剂选自核酸化合物和核酸类似物。在某些实施方案中，所述核酸化合物的长度为约15-100个核苷酸，在生理条件下与SEQ ID NO：267中阐明的EphB4核酸序列杂交并降低所述EphB4的表达。在某些实施方案中，所述核酸选自：RNAi构建体和反义寡核苷酸。在某些实施方案中，所述RNAi构建体选自：dsRNA或siRNA。在某一实施方案中，所述siRNA的长度约为19-30个核苷酸。在某一实施方案中，所述siRNA的长度约为21-23个核苷酸。在某一实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度约为19-30个核苷酸。在某些方面，所述siRNA序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
在某些方面，EphB4抑制剂具有抗癌活性。在某些实施方案中，所述抗癌活性选自抑制肿瘤生长、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移、抑制癌细胞的转移、抑制血管发生和引起肿瘤细胞死亡。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞死亡归因于程序性细胞死亡。在某些实施方案中，所述EphB4抑制剂通过胱天蛋白酶-8的活化来引起程序性细胞死亡。在某些实施方案中，卵巢癌包含一个或更多个表达EphB4的癌细胞。在某些实施方案中，用药学上可接受的载体配制所述EphB4抑制剂。
在本公开内容方法的某些实施方案中，相比于来自相当组织的非癌细胞，卵巢癌细胞表达更高水平的EphB4。在某些实施方案中，所述卵巢癌是转移的。在其它实施方案中，所述卵巢癌依赖血管发生。在其它实施方案中，所述卵巢癌不依赖血管发生。
在某些方面，本公开内容的方法还包括至少一种额外的抗癌化学治疗剂，其与EphB4抑制剂以累加或协同方式抑制卵巢癌细胞。在某些实施方案中，所述化学治疗剂和所述EphB4抑制剂顺序施用。在某些实施方案中，所述化学治疗剂和所述EphB4抑制剂同时施用。
在某些实施方案，本公开内容的方法还包括至少一种额外的抗血管发生剂，其与EphB4抑制剂以累加或协同的方式抑制血管发生。在某些实施方案中，所述抗血管发生剂和所述EphB4抑制剂顺序施用。在某些实施方案中，所述抗血管发生剂和所述EphB4抑制剂同时施用。
在某些方面，本公开内容提供了在受试者中降低卵巢癌生长速率的方法，所述方法包括施用一定量的EphB4抑制剂以降低卵巢癌的生长速率。在其它方面，所述公开内容提供了治疗患有卵巢癌患者的方法，所述方法包括：(a)在患者中鉴定具有表达EphB4的大量癌细胞的肿瘤；和(b)向所述患者施用EphB4抑制剂。在某些方面，本公开内容提供了在受试者中降低卵巢癌生长速率的方法，所述方法包括施用足以降低卵巢癌生长速率的量的EphB4抑制剂。
在某些方面，本公开内容提供了EphB4抑制剂在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途。
在另一方面，本申请提供了检测受试者是否患有卵巢癌或是否具有发生卵巢癌风险的方法，所述方法包括：(a)从所述受试者中获得样品；和(b)评估样品中EphB4蛋白质和/或mRNA的水平，其中EphB4蛋白质和/或mRNA的水平升高表明所述受试者患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中。在一些实施方案中，EphB4蛋白质或mRNA的水平是正常卵巢组织中水平的至少两倍。在某些实施方案中，哺乳动物是人类。在某些实施方案中，所述卵巢癌是转移性卵巢癌。在一些方面，在基于抗体的测定中评估EphB4蛋白质的表达水平。在某些实施方案中，所述方法可在处于发生卵巢癌风险的受试者、患有早期疾病的受试者和患有晚期疾病的受试者中进行辨别。
在某些方面，本公开内容提供对患有卵巢癌的患者进行预后的方法，所述方法包括：(a)从所述受试者中获得样品；(b)评估样品中EphB4蛋白质和/或mRNA的表达水平，其中EphB4蛋白质和/或mRNA的水平升高表示预后不良。在某些实施方案中，EphB4蛋白质和/或mRNA的高水平是正常卵巢组织中EphB4水平的两倍。在某些实施方案中，EphB4的高水平是正常卵巢组织中EphB4水平的四倍。在某些实施方案中，EphB4的高水平是正常卵巢组织中EphB4水平的十倍。在某些实施方案中，EphB4的高水平是正常卵巢组织中可检测水平的EphB4。在某些实施方案中，样品选自：组织样品、血液样品或血清样品。
在某些实施方案中，所述哺乳动物是人类。在某些实施方案中，所述卵巢癌是转移性卵巢癌。
在另一方面，本申请提供EphB4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO：261的CDR1、包含SEQ ID NO：262的CDR2和包含SEQ ID NO：263的CDR3；并且其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO：264的CDR1、包含SEQ IDNO：265的CDR2和包含SEQ ID NO：266的CDR3。在某些实施方案中，所述重链可变区包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体或其抗体片段。
在另一方面，本申请提供用于诊断卵巢癌的试剂盒，其包含抗EphB4抗体或抗EphB4结合抗体片段、可检测标记和使用所述试剂盒的说明书。在某些实施方案中，所述可检测标记是荧光的或生色的。在某些实施方案中，所述试剂盒包含辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在某些实施方案中，所述抗体或其抗体片段结合EphB4的C末端部分。
本申请涵盖了任何上述方面和实施方案的组合。
附图简述
图1A-1C显示EphB4在人卵巢肿瘤样品中表达并与晚期、腹水存在及低存活率相关。(A)阴性(缺少一级抗体)对照(a)、正常卵巢上皮(b)和侵入性卵巢癌(c)中EphB4的代表性免疫组织化学过氧化物酶染色。在X200的原始放大倍数下获取所有图片。(B)临床和病理学变量与卵巢癌中EphB4的过表达之间的相关性。(C)患有侵入性卵巢癌的患者使用log-rank统计方法，基于EphB4染色强度的Kaplan-Meier存活。
图2A-2D显示卵巢癌细胞系表达受孕酮下调的功能EphB4。(A)来自各卵巢癌细胞系的20μg总细胞裂解物在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上跑胶并转移到PVDF膜上。该膜依次用抗EphB4、抗EphrinB2和抗β肌动蛋白抗体探测。(B)Hey细胞血清饥饿过夜并在所示的多个时期用3μg/ml聚集的EphrinB2/Fc或单独用Fc进行刺激。EphB4从100μg全细胞裂解物中免疫沉淀下来并通过抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹(上图)分析磷酸化状态。以一式两份的膜探测EphB4，以记载免疫沉淀作用的效率(下图)。(C)用不同剂量的孕酮和***处理Hoc-7(卵巢癌)和MCV-50(卵巢囊腺瘤)细胞36小时并通过免疫印迹分析细胞裂解物的EphB4、EphrinB2和β肌动蛋白的表达。(D)将1×104 Hoc-7细胞接种于48孔板的各孔中并用不同剂量的孕酮和***处理72小时。通过MTT测定评估细胞活力并将存活表述为相对于未处理细胞的吸光度的百分比。
图3A-3E显示EphB4击倒(knockdown)导致肿瘤细胞程序性死亡。(A)用EphB4特异性siRNA(EphB4-siRNA)瞬时转染Hev细胞，并在48小时后，通过免疫印迹分析20μg全细胞裂解物的EphB4和β肌动蛋白水平(上图)。用突变的EphB4 siRNAΔ或天然的EphB4-siRNA转染1×104Hey细胞并接种于48孔板中。在48小时，通过MTT测定评估细胞活力，并将存活表述为吸光度相对于未处理细胞的百分比(下图)。(B)用多种剂量的EphB4特异性ODN(AS-10)处理Hey细胞。72小时后，通过免疫印迹分析20μg总细胞裂解物的EphB4和β肌动蛋白水平(上图)。用乱序的或AS-10 ODN处理1×104 Hey细胞。在72小时，通过MTT测定评估细胞活力，并将存活表述为吸光度相对于未处理细胞的百分比。(C)用EphB4特异性siRNA(EphB4-siRNA)或突变的siRNA(EphB4-siRNAΔ)瞬时转染Hey细胞。如方法部分中详细说明，使用全细胞裂解物通过ELISA分析程序性细胞死亡的胞质核小体。(D)在这些细胞中通过比色分析法测定胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-9的激活并将其表述为相对于脂质转染胺(lipofectamine)处理细胞的百分比活性。(E)wit脂质转染胺单独处理(对照)或25nM EphB4特异性siRNA(EphB4 siRNA)或突变体siRNA(EphB4siRNAΔ)处理36小时的Hey细胞的细胞周期分析。指出了G0、G1、S、G2和M期中细胞的％。在三组独立实验中获得了类似的结果。
图4A-4B显示EphB4有助于肿瘤细胞迁移和侵入。(A)用塑料巴斯德吸管刮Hey细胞的汇合培养物，以产生3mm宽的单层无细胞区。超过9小时后评估转染25nM EphB4特异性(EphB4 siRNA)或突变体siRNA(EphB4 siRNAΔ)后细胞迁移并闭合伤口的能力。(B)如方法中所述，研究了Hey细胞向基质胶(Matrigel)包被的inserts的侵入。将响应下层室中10μg/ml EGF侵入insert下面的细胞固定并用吉姆萨(Giemsa)染色。显示了代表性的显微照片。
图5A-5B显示EphB4特异性反义ODN在鼠类卵巢癌异种移植模型中抑制肿瘤生长。(A)将2×106 Hey细胞植入10到12周大雌性Balb/C裸鼠的胁腹中，并如方法部分详细说明来测定肿瘤体积。从细胞植入后第4天开始每天经腹膜内向小鼠单独施用载体(载体)，或10mg/kg乱序ODN(乱序的)或EphB4特异性反义ODN(AS-10)。5周后处死动物并收集肿瘤。(B)用苏木精/曙红对***固定的石蜡包埋切片的5μm切片进行染色并通过免疫组织化学分析Ki-67和CD31的表达。使用原位程序性细胞死亡染色试剂盒通过TUNEL来评估程序性细胞死亡。不知情的观察者在5个随机高倍视野下将阳性染色的细胞数进行平均，并在各显微照片中进行了说明。AS-10与对照组之间＊p＜0.05。左下图中的标尺在H/E中表示200μm，在CD31中表示100μm，在其它显微照片中表示75μm。
图6显示MAB265可变轻链序列与种系序列的比对。
图7显示MAB265可变重链序列与种系序列的比对。
图8显示针对EphB4产生的单克隆抗体和这些抗体表位作图。显示了EphB4胞外域的拓扑结构，包括球形结构域(G)、富含半胱氨酸的结构域(C)和两个纤连蛋白类型3结构域(F1和F2)。
图9显示了B4ECv3蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割Eph B4前导肽的前体序列)。
图10显示了B4ECv3NT蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割EphB4前导肽的前体的序列)。
图11显示了B4ECv3-FC蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割Eph B4前导肽的前体的序列)。
图12显示了B2EC蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割EphrinB2前导肽的前体的序列)。
图13显示了B2EC-FC蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割Ephrin B2前导肽的前体的序列)。
图14显示了人Ephrin B2的氨基酸序列。
发明详述
I.综述
本发明部分基于这样的发现，通过ephrin/ephrin受体(ephrin/eph)途径的信号转导促进卵巢肿瘤发生。申请人检测了卵巢肿瘤组织中EphB4的表达，并开发了用于阻断通过eph的信号转导的抗肿瘤治疗剂。因此，在某些方面，本公开内容提供了可用于治疗卵巢癌的许多化合物(试剂)。
卵巢癌是由一个或两个卵巢生殖腺内细胞快速生长和***产生的疾病，在所述生殖腺中产生卵，或卵子和***。卵巢含有在正常环境下生殖以维持组织健康的细胞。当失去了生长控制并且细胞***太多并太快时，就会形成细胞块或肿瘤。如果所述肿瘤限制在少数细胞层中，例如表面细胞中，并且它并不侵入周围组织或器官，认为它是良性的。如果所述肿瘤扩散到周围组织或器官中，认为它是恶性的或癌性的。当癌细胞从最初的肿瘤中逃选出来，经血液或***前进，并在身体其它部分内生长时，该过程称作转移。
可以将卵巢肿瘤广义地分为三种类别，来自表面上皮、生殖细胞和特化基质的那些肿瘤。来自卵巢表面的肿瘤占卵巢肿瘤的绝大多数(大约80％)并被称作表面上皮肿瘤。这些肿瘤组成了通常认为的“卵巢癌”。表面上皮肿瘤进一步细分为三种类别：良性的、边缘的(低恶性潜在性[LMP]或不规则增殖)和侵入性癌。良性肿瘤和侵入性癌的行为是很好理解的，但围绕中间(边缘)组的诊断、预后和治疗却有大量的争论。这些肿瘤倾向于在更年轻的妇女中发生并可经常进行保守治疗。保守治疗允许妇女保持她们的生育力并保留***的产生，在侵入性癌治疗进行时，如果去除两个卵巢，则所述***的产生将会丧失。然而，保守治疗依赖于正确的组织学(病理学)诊断。卵巢肿瘤诊断的大多数失误发生在“边缘”肿瘤范畴内。表面上皮肿瘤基于细胞分化模式和肿瘤级别也可进行细分。最后，手术后残留肿瘤的阶段和量提供了用于预测行为并设计后续治疗的重要信息(交叉参考)。
生殖细胞肿瘤是最不常见的卵巢肿瘤，占卵巢肿瘤的大约10-15％。它们来自***(卵子)。这些肿瘤，像表面上皮肿瘤也可以是良性的或恶性的。然而没有中间组。良性肿瘤几乎总是成熟的囊性畸胎瘤或所谓的“皮样囊肿”，并通过去除肿瘤的同时保留未涉及的卵巢组织而得到成功治疗。其它治疗不是必需的。恶性生殖细胞肿瘤在去除后需要加强的多剂化学疗法。所述治疗与手术治疗表面上皮肿瘤后施用的化学治疗完全不同。
最后，占卵巢肿瘤大约5-10％的最少见类型的卵巢肿瘤是来自卵巢基质成分的那些肿瘤。因为激素的产生(***如***和孕酮，雄性激素如睾酮、脱氢表雄酮[DHEA]和androstendione)在基质中发生，来自卵巢该部分的肿瘤可与性类固醇激素的异常产生相关。这可导致在生殖年龄和绝经后妇女中异常的***出血和儿童的性早熟。产生雄性激素的卵巢肿瘤可引起多毛症(身体多个部位毛发生长增快)，并且在极端情况下会引起男性化，其特征在于体毛增多、声音深沉、秃头、肌肉块增大和***增大。
如此处所用，术语“Ephrin”和“Eph”分别用于指配体和受体。它们可来自多种动物(例如，哺乳动物/非哺乳动物、脊椎动物/无脊椎动物，包括人类)中的任何一种。
此处描述的工作(尤其是在实施例中描述的工作)指Ephrin B2和EphB4。然而，本发明涵盖了它们各自家族中的任何ephrin配体和/或Eph受体，所述家族在卵巢肿瘤中表达。所述ephrin(配体)有两种结构类型，其在序列关系的基础上可进一步细分，并且在优先结合的基础上，它们在功能上显示出两种相应的受体亚组。在结构上，有两种类型的ephrin：通过甘油磷脂酰肌醇(GPI)连接膜锚定的那些类型和通过跨膜结构域锚定的那些类型。通常，配体分成Ephrin-A亚类，其为优先结合EphA受体的GPI连接的蛋白质，和Ephrin-B亚类，其为一般优先结合EphB受体的跨膜蛋白质。
Eph家族受体是受体蛋白酪氨酸激酶家族，其与Eph相关，所述Eph以其在产生***的人类肝细胞癌细胞系中的表达命名。在它们胞外域序列的亲缘关系和优先结合Ephrin-A蛋白质或Ephrin-B蛋白质的能力的基础上，可将它们分成两个亚组。优先与Ephrin-A蛋白质相互作用的受体是EphA受体，优先与Ephrin-B蛋白质相互作用的那些受体是EphB受体(参阅出版的美国专利申请20050164965和20050249736)。
Eph受体具有胞外域，其由配体结合球形结构域、富含半胱氨酸区域后连一对纤连蛋白类型III重复序列组成。胞质区由含有两个保守酪氨酸残基的近膜区域；蛋白质酪氨酸激酶结构域；无效的α-基序(SAM)和PDZ-结构域结合基序组成。EphB4对膜结合配体Ephrin B2是特异性的(Sakano，S.等1996；Brambilla R.等1995)。Ephrin B2属于Eph配体类，所述配体具有跨膜结构域和具有5个保守酪氨酸残基和PDZ结构域的胞质区。Eph受体通过结合聚集的膜附着的ephrin而被激活(Davis S等，1994)，这说明Eph的激活需要表达受体的细胞与表达配体的细胞之间的接触。
配体结合后，Eph受体二聚体化并将近膜酪氨酸残基自磷酸化，以获得完全的激活(Kalo MS等，1999，Binns KS，2000)。除上述通过Eph受体的正向信号转导外，反向信号转导可通过ephrin B发生。Ephrin的Eph衔接导致保守胞内酪氨酸的快速磷酸化(Bruckner K，1997)和PDZ结合蛋白质的些许较慢募集(Palmer A 2002)。近来，若干研究已经显示Eph/ephrin的高表达可能与肿瘤生长、致肿瘤性和转移的潜力提高相关(Easty DJ，1999；Kiyokawa E，1994；Tang XX，1999；Vogt T，1998；Liu W，2002；StephensonSA，2001；Steube KG 1999；Berclaz G，1996)。
II.核酸治疗剂
本公开内容涉及用于抑制或降低卵巢癌中ephrin和/或ephrin受体(Eph)的基因表达的方法。“抑制”或“降低”指基因的表达，或核酸或编码一种或更多种蛋白质或蛋白质亚基(如Ephrin B2和/或EphB4)的等同核酸的水平降低到在本公开内容核酸治疗剂缺失下观察到的水平之下。“基因”指编码RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于编码多肽的结构基因。
如此处所用，术语“核酸治疗剂”或“核酸试剂”或“核酸化合物”指任何基于核酸的化合物，其含有核苷酸并对靶基因上具有想要的作用。核酸治疗剂可以是单链、双链或多链的，并可包含修饰的或未修饰的核苷酸或非核苷酸或多种混合物，及其组合。本公开内容的核酸治疗剂的实例包括，但不限于，反义核酸、dsRNA、siRNA和酶核酸化合物。
在一个实施方案中，本公开内容描述了一种或更多种核酸治疗剂，所述核酸治疗剂单独或组合调节编码Ephrin B2蛋白质(例如，Genbank登录号：NP_004084)的Ephrin B2基因或编码EphB4蛋白质(例如，Genbank登录号：NP_004435)的EphB4受体基因的表达。在出版的美国专利申请20050164965和20050249736中列出了可根据该申请的方法使用的核酸构建体的实例，如下文列出的那些在本文中以其整体引入作为参考。
表1.通过EphB4反义探针抑制EphB4基因表达
Figure G20088001509760121
Figure G20088001509760131
Figure G20088001509760141
Figure G20088001509760151
Figure G20088001509760161
表2.通过EphB4 RNAi探针抑制EphB4基因表达
Figure G20088001509760162
Figure G20088001509760181
A.反义核酸
在某些实施方案中，本公开内容涉及反义核酸。“反义核酸”指非酶核酸化合物，其通过RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白质核酸)相互作用结合靶核酸并改变所述靶核酸的活性(对于综述，参阅Stein和Cheng，1993 Science 261，1004和Wool等，美国专利号5,849,902)。通常，反义分子沿反义分子的单一相邻序列与靶序列互补。然而，在某些实施方案中，反义分子可形成环并结合形成环的底物核酸。因此，反义分子可与两个(或更多)不相邻的底物序列互补，或者反义分子的两个(或更多)不相邻的序列部分可与靶序列互补，或者两者均可。对于目前反义策略的综述，参阅Schmajuk等，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas等，1997，Nature，15，751-753，Stein等，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，Methods Enzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.Genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49。
此外，反义DNA通过DNA-RNA相互作用可用于靶定核酸，由此激活RNA酶H，其消化双链体中的靶核酸。反义寡核苷酸可包含一个或更多个RNA酶H激活区，其能够激活RNA酶H以切割靶核酸。可以化学合成反义DNA或通过使用单链DNA表达载体或其等同物表达反义DNA。“RNA酶H激活区”指能够结合靶核酸以形成被细胞RNA酶H酶识别的非共价复合体的核酸化合物的区域(通常长度大于或等于4-25个核苷酸，优选长度为5-11个核苷酸)(参阅例如Arrow等，美国专利号5,849,902；Arrow等，美国专利号5,989,912)。所述RNA酶H酶结合核酸化合物-靶核酸复合体并切割所述靶核酸序列。
RNA酶H激活区包含，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、5′-硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或甲基膦酸酯骨架化学或其组合。除上述一种或更多种骨架化学外，RNA酶H激活区还可包含多种糖化学。例如，所述RNA酶H激活区可包含脱氧核糖、***糖、氟代***糖或其组合、核苷酸糖化学。本领域技术人员将认识到上述为非限制性实例，并且核酸的磷酸、糖和碱基化学的任何组合(其支持RNA酶H酶的活性)处于RNA酶H激活区的定义和本公开内容的范围内。
因此，本公开内容的反义核酸包括天然类型的寡核苷酸和修饰寡核苷酸，其包括硫代磷酸酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、二硫代磷酸酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、甲基膦酸酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、氨基磷酸酯-类型的寡脱氧核糖核苷酸、H膦酸酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、三酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、α异头物类型的寡脱氧核糖核苷酸、肽核酸、其它人造核酸和核酸修饰的化合物。
其它修饰包括寡核苷酸分子内部的或末端的那些修饰，并包括向分子添加核苷酸间磷酸键，如胆固醇、胆固醇基或在氨基和末端核糖之间具有不同数目碳残基的二胺化合物、脱氧核糖和磷酸修饰，其切割或与相反链或结合的酶或结合基因组的其它蛋白质交联。这种修饰的寡核苷酸的实例包括具有修饰碱基和/或糖(如***糖替代核糖)的寡核苷酸，或3′，5′取代的寡核苷酸，其具有在其3′和5′位置附着到除了羟基(在其3′位置)和磷酸基团(在其5′位置)之外的化学基团的糖。
糖修饰的其它实例包括核糖部分2′位置的修饰，其包括但不限于用含有1-6个饱和或不饱和碳原子的--O--低级烷基、或--O-芳基、或具有2-6碳原子的烯丙基取代的2′-O-，其中该--O-烷基、芳基或烯丙基可以是未被取代或被取代的(例如被卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代)，或被氨基或卤素取代。本公开内容的十分重要的寡核苷酸的非限制性实例在其3′、5′或31和5′末端具有2′-O-烷基化的核糖核苷酸，其中至少4个或5个相邻核苷酸被如此修饰。2′-O-烷基化基团的实例包括，但不限于，2′-O-甲基、2′-O-乙基、2′-O-丙基和2′-O-丁基。
在某些情况下，例如可利用ABI(Applied Biosystems Inc.)制造的381ADNA合成仪或394DNA/RNA合成仪，根据亚磷酰胺方法进行天然类型反义核酸和修饰的反义核酸的合成(参阅从ABI，或F.Eckstein，Oligonucleotidesand Analogues：A Practical Approach，IRL Press(1991)获得的说明书)。在所述亚磷酰胺方法中，通过使用含受基团(如氰基乙基)保护的亚磷酰胺的试剂，在修饰的脱氧核糖核苷或修饰的核糖核苷的3′-末端与另一修饰的脱氧核糖核苷、修饰的核糖核苷、修饰的寡脱氧核糖核苷酸或修饰的寡核糖核苷酸的5′-末端之间进行缩合来合成核酸相关分子。完成该合成的最后一个循环，以产生具有结合到糖部分5′-末端的羟基上的保护基(例如，二甲氧基三苯甲基基团)的产物。在室温下合成的寡聚物从支持物上切割下来，并且其核苷酸和磷酸部分被去保护。在该方式中，天然类型的寡核酸化合物以原始形式获得。也可以通过亚磷酰胺方法，使用来自ABI的合成仪以类似于上述天然类型的方式合成硫代磷酸酯类型的核酸。合成的最后一个循环后的程序也与天然类型的相同。
可以常见方式，例如乙醇沉淀，或反相层析、高效液相层析(HPLC)中的离子交换层析和凝胶过滤层析、超临界流体层析来纯化因此获得的原始核酸(天然类型或被修饰的)，并可以通过电泳进一步纯化。也可以使用用于反相层析的柱体，如tC18-packed SepPak Plus(long body/ENV)(Waters)。可通过HPLC来分析天然类型的和被修饰的(例如，硫代磷酸酯类型的)核酸的纯度。
在某些实施方案中，本公开内容的反义核酸例如可以作为表达质粒进行递送，当在细胞中转录时，所述表达质粒产生与细胞mRNA的至少独特部分互补的RNA，所述细胞mRNA编码ephrin B2或EphB4多肽。或者，所述构建体是寡核苷酸，其离体产生，并且当引入细胞中时，通过与编码ephrin B2或EphB4多肽的mRNA和/或基因组序列杂交引起对表达的抑制。这种寡核苷酸探针是任选被修饰的寡核苷酸，其对内源核酸酶(例如外切核酸酶和/或内切核酸酶)有抵抗力，并因此在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸的示例性核酸化合物是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(也参阅美国专利号5,176,996；5,264,564；和5,256,775)。此外，例如，van der Krol等，(1988)Biotechniques 6：958-976；和Stein等，(1988)Cancer Res 48：2659-2668已经综述了构建用于核酸疗法的寡聚体的一般方法。
B.dsRNA和RNAi构建体
在某些实施方案中，本公开内容涉及双链RNA(dsRNA)和RNAi构建体。如此处所用，术语“dsRNA”指能够RNA干扰(RNAi)的双链RNA分子，包括siRNA(参阅例如，Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等，PCT公布号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等，PCT公布号WO 01/36646；Fire，PCT公布号WO99/32619；Plaetinck等，PCT公布号WO 00/01846；Mello和Fire，PCT公布号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，PCT公布号WO 99/07409；和Li等，PCT公布号WO 00/44914)。此外，RNAi是最初应用于在植物和蠕虫中观察到的现象的术语，在所述植物和蠕虫中双链RNA(dsRNA)以特异的和转录后的方式阻断基因表达。RNAi提供了在体外或在体内抑制基因表达的有用方法。
如此处所用，术语“短干扰RNA”、“siRNA”或“短干扰核酸”指当适当处理细胞时能够介导RNAi或基因沉默的任何核酸化合物。例如，所述siRNA可以是包含自身互补的有义和反义区的双链多核苷酸分子，其中所述反义区包含与靶核酸化合物(例如Ephrin B2或EphB4)的互补性。所述siRNA可以是具有自身互补的有义和反义区的单链发夹多核苷酸，其中所述反义区包含与靶核酸化合物的互补性。所述siRNA可以是环形单链多肽，其具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中所述反义区包含与靶核酸化合物的互补性，并且其中可以在体内或在体外处理所述环形多核苷酸，以产生能够介导RNAi的活性siRNA。所述siRNA也可包含与靶核酸化合物具有互补性的单链多核苷酸，其中所述单链多核苷酸可进一步包含末端磷酸基，如5′-磷酸基(参阅例如Martinez等，2002，Cell.，110，563-574)，或5′，3′-二磷酸基。
任选地，本公开内容的siRNA含有核苷酸序列，所述核苷酸序列在细胞生理条件下与待抑制的基因(“靶”基因)的mRNA转录物至少一部分的核苷酸序列杂交。双链RNA仅需要与具有介导RNAi能力的天然RNA足够类似。因此，本公开内容具有能够承受可能由于遗传突变、品系多态性或进化趋异而造成序列变异的优势。靶序列与siRNA序列之间耐受的核苷酸错配的数目不超过5个碱基对中1个、或10个碱基对中1个、或20个碱基对中1个、或50个碱基对中1个。siRNA双链体中心的错配是最重要的并可能基本上破坏靶RNA的切割。相反，与靶RNA互补的siRNA链3′末端的核苷酸并不显著促进靶标识别的特异性。可通过本领域已知的序列比较和比对算法(参阅Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，及其中引用的参考文献)并通过如BESTFIT软件程序中实现的Smith-Waterma算法(例如University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)使用默认参数计算核苷酸序列之间的百分比差异来优化序列同一性。优选siRNA和靶基因部分之间高于90％的序列同一性，或甚至100％的序列同一性。或者，RNA的双链体区可在功能上被定义为核苷酸序列，其能够与靶基因转录物的部分进行杂交(例如，400mM NaCl，40mM PIPESpH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时，然后进行洗涤)。
可通过单条自身互补的RNA链、两条互补RNA链，或DNA链和互补RNA链形成dsRNA的双链结构。任选地，可在细胞内或细胞外开始RNA双链体形成。可以以允许递送每个细胞至少一个拷贝的量引入RNA。更高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的双链材料可产生更有效的抑制，而更低剂量也可用于特定应用。因为对应于RNA双链体区的核苷酸序列是遗传抑制的靶标，所以抑制是序列特异性的。
如此处所用，目的siRNA长度大约19-30个核苷酸，甚至更优选长度为21-23个核苷酸。所述siRNA理解为募集核酸酶复合体并通过与特异性序列配对将所述复合体引至靶mRNA。结果，所述靶mRNA被蛋白质复合体中的核酸酶降解。在特定实施方案中，21-23个核苷酸的siRNA分子包含3′羟基。在某些实施方案中，可通过更长双链RNA，例如在切丁酶的存在下进行加工产生所述siRNA构建体。在一个实施方案中，使用果蝇体外***。在该实施方案中，dsRNA与来自果蝇胚胎的可溶性提取物混和，由此产生混合物。在将dsRNA被加工成约21到约23个核苷酸的RNA分子的条件下维持所述混合物。可使用本领域技术人员已知的许多技术来纯化所述siRNA分子。例如，凝胶电泳可用于纯化siRNA。或者，非变性方法，如非变性柱层析可用于纯化siRNA。此外，层析(例如，大小排阻层析)、甘油梯度离心、使用抗体的亲和纯化可用于纯化siRNA。
可通过化学合成方法或通过重组核酸技术进行目的dsRNA(例如，siRNA)的制备。被处理细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或者克隆的RNA聚合酶可用于体外转录。如此处所用，本公开内容的dsRNA或siRNA分子不必局限于仅含有RNA的那些分子，还包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。例如，所述dsRNA可包括对磷酸-糖骨架或核苷的修饰，例如以降低对细胞核酸酶的敏感性、提高生物利用率、改善配制特性，和/或改变其它药物代谢动力学性质。为了说明，可修饰天然RNA的磷酸二酯键以包括至少一个氮或硫杂原子。可对RNA结构中的修饰进行定制，以避免在对dsRNA一般性响应的同时允许特异性的遗传抑制。同样，可修饰碱基，以阻断腺苷脱氨酶的活性。可通过酶促产生dsRNA或通过部分/完全的有机合成产生dsRNA，可通过体外酶促合成或有机合成引入任何被修饰的核糖核苷酸。可调整化学修饰RNA分子的方法用于修饰dsRNA(参阅，例如，Heidenreich等(1997)Nucleic Acids Res，25：776-780；Wilson等(1994)JMol Recog 7：89-98；Chen等(1995)Nucleic Acids Res 23：2661-2668；Hirschbein等(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7：55-61)。仅为了说明，可使用硫代硫酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核酸、含5-丙炔基嘧啶的寡聚体或糖修饰(例如，2’-取代的核糖核苷，a-构型)修饰dsRNA的骨架。在某些情况下，本公开内容的dsRNA缺少含2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。
在特定实施方案中，siRNA分子的至少一条链具有长度约1到约6个核苷酸的3′突出端，然而也可以为2到4个核苷酸长。更优选地，所述3′突出端长度为1-3个核苷酸。在某些实施方案中，一条链具有3′突出端，另一条链是平末端或也可以具有突出端。对于每条链，突出端的长度可以相同或不同。为了进一步提高siRNA的稳定性，可将3′突出端稳定化以防止降解。在一个实施方案中，通过包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鸟苷核苷酸来稳定RNA。或者，通过修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如2′-脱氧胸苷取代3′突出端尿苷核苷酸可被耐受并且不影响RNAi的效率。2′羟基的缺失显著增强了组织培养基中突出端的核酸酶抵抗力，并可能在体内是有益的。
在另一特定实施方案中，目的dsRNA也可以是长双链RNA的形式。例如，所述dsRNA为至少25、50、100、200、300或400个碱基。在一些情况下，所述dsRNA长度为400-800个碱基。任选地，所述dsRNA在细胞内被消化，例如以在细胞中产生siRNA序列。然而，在体内长的双链RNA的使用并不总是现实的，可能是因为由不依赖序列的dsRNA响应引起的有害作用。在这样的实施方案中，优选使用降低干扰素或PKR效应的局部递送***和/或试剂。
在其它特定实施方案中，dsRNA是发夹结构形式(命名为发夹RNA)。可外源合成发夹RNA或通过在体内从RNA聚合酶III启动子转录来形成发夹RNA。例如在Paddison等，Genes Dev，2002，16：948-58；McCaffrey等，Nature，2002，418：38-9；McManus等，RNA，2002，8：842-50；Yu等，ProcNatl Acad Sci U S A，2002，99：6047-52)中描述了产生和使用这种发夹RNA用于哺乳动物细胞中基因沉默的实例。优选地，在细胞或动物中改造这种发夹RNA，以保证对想要基因持续并稳定的抑制。本领域已知的是可通过在细胞中加工发夹RNA来产生siRNA。
PCT申请WO 01/77350描述了用于转基因双向转录以在真核细胞中产生同一转基因的有义和反义RNA转录物的示例性载体。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了具有以下独特性质的重组载体：其包含具有以相反方向排列的两个重叠转录单位并位于目的dsRNA的转基因侧翼的病毒复制子，其中所述两个重叠转录单位在宿主细胞中从同一转基因片段产生有义和反义RNA转录物。
C.酶核酸化合物
在某些实施方案中，本公开内容涉及酶核酸化合物。“酶核酸化合物”指在底物结合区与特定靶基因具有互补性，并还具有有效地特异性切割靶核酸的酶促活性的核酸化合物。理解所述酶核酸化合物能够在分子间切割核酸，并由此灭活靶核酸化合物。这些互补区允许酶核酸化合物与靶核酸之间充分杂交，并因此允许切割。优选100％互补性(同一性)，但低至50-75％的互补性也可用于该公开内容(参阅例如Werner和Uhlenbeck，1995，Nucleic Acids Research，23，2092-2096；Hammann等，1999，Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.，9，25-31)。可在碱基、糖和/或磷酸基处修饰酶核酸。如此处所述，术语“酶核酸”与短语如核酶、催化性RNA、酶RNA、催化性DNA、aptazyme或适配体结合核酶、调节性核酶、催化性寡核苷酸、nucleozyme、DNA酶、RNA酶、内切核糖核酸酶、内切核酸酶、“小”核酶、leadzyme、oligozyme或DNA酶可互换使用。所有这些术语均描述了具有酶促活性的核酸化合物。本申请中描述的特异性酶核酸化合物不限于在本公开内容中，并且本领域技术人员将认识到在本公开内容的酶核酸化合物中重要的是它具有与一个或更多个靶核酸区互补的特异性底物结合位点，并且它在赋予核酸分子核酸切割和/或连接活性的底物结合位点内或周围具有核苷酸序列(Cech等，美国专利号4,987,071；Cech等，1988，260 JAMA3030)。
目前已知若干种天然发生的酶核酸。每种均可在生理条件下反式催化核酸磷酸二酯键的水解(并因此切割其它核酸化合物)。通常，酶核酸首先通过结合到靶核酸上起作用。这种结合通过酶核酸的靶结合部分发生，所述酶核酸保持在切割靶核酸的分子的酶促部分附近。因此，所述酶核酸首先识别靶核酸，然后通过互补碱基配对结合靶核酸，并且一旦结合到正确的位点上，其酶促切割所述靶核酸。这种靶核酸的策略切割将破坏其指导编码蛋白质进行合成的能力。酶核酸已经结合并切割其核酸靶标后，所述酶核酸从该核酸释放，以寻找另一靶标并可以重复结合并切割新靶标。
在特定实施方案种，目的酶核酸是设计来催化切割mRNA转录物以防止mRNA翻译的核酶(参阅，例如PCT国际公开WO90/11364，1990年10月4日公开；Sarver等，1990，Science 247：1222-1225；和美国专利号5,093,246)。尽管在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶可用于破坏特定mRNA，但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域指出的位置处切割mRNA。唯一需要的是所述靶mRNA具有以下两碱基序列：5′-UG-3′。锤头状核酶的构建和产生为本领域所熟知并在Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334：585-591中有更详尽的描述。本公开内容的核酶也包括RNA内切核糖核酸酶(下文称“Cech-类型核酶”)，如在嗜热四膜虫中天然存在并已经被广泛描述的一种酶(称作IVS或L-19IVSRNA)(参阅，例如，Zaug，等，1984，Science，224：574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231：470-475；Zaug，等，1986，Nature，324：429-433；UniversityPatents Inc.的国际专利申请号WO88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47：207-216)。
在另一特定实施方案中，主题酶核酸是DNA酶。DNA酶整合了反义和核酶技术的一些机械学特征。设计DNA酶，使得它们识别特定靶核酸序列，十分像反义寡核苷酸，然而更像核酶，它们催化性并特异性切割靶核酸。简言之，为了设计特异性识别并切割靶核酸的理想DNA酶，本领域技术人员必须首先鉴定独特的靶序列。优选地，独特地或大体上序列是富含G/C的大约18到22个核苷酸。高G/C含量帮助保证DNA酶与靶序列之间更强的相互作用。当合成所述DNA酶时，将靶定酶到信息上的特异性反义识别序列被分开，使得其包含DNA酶的两个臂，并且所述DNA酶环置于所述两个特异性臂之间。制备和施用DNA酶的方法可见于例如美国专利号6,110,462中。
在某些实施方案中，本公开内容的核酸治疗剂长度可以在12到200个核苷酸之间。在一个实施方案中，本公开内容的示例性酶核酸化合物长度在15到50个核苷酸之间，包括例如长度在25到40个核苷酸之间(例如参阅Jarvis等，1996，J.Biol.Chem.，271，29107-29112)。在另一实施方案中，本公开内容的示例性反义分子长度在15到75个核苷酸之间，包括例如长度在20到35个核苷酸之间(参阅例如Woolf等，1992，PNAS.，89，7305-7309；Milner等，1997，Nature Biotechnology，15，537-541)。在另一实施方案中，本公开内容的示例性siRNA长度在20到27个核苷酸之间，包括例如长度在21到23个核苷酸之间。本领域技术人员将认识到所有需要的是主题核酸治疗剂的长度和构型足够并适合催化此处涵盖的反应。本公开内容的核酸治疗剂的长度不限于所述的一般极限。
III.核酸靶位点
可以如Draper等30WO 93/23569；Sullivan等，WO 93/23057；Thompson等，WO 94/02595；Draper等，WO 95/04818；McSwiggen等，美国专利号5,525,468中描述来确定本公开内容的有用的核酸化合物(例如，反义核酸、dsRNA和酶核酸化合物)的靶标。其它实例包括疾病相关基因表达灭活的以下PCT申请：WO 95/23225、WO 95/13380、WO 94/02595。此处并非重复那些文件中提供的指导，下文提供了这些方法的特定实例，不限于本领域中的那些。
如那些申请中描述来设计这些靶标的酶核酸化合物、siRNA和反义，并同样如所述来合成以在体外和体内进行检测。例如，使用计算机折叠算法来筛选人Ephrin B2和/或EphB4RNA的序列的最佳核酸靶标位点。鉴定了潜在的核酸结合/切割位点。例如，对于本公开内容的酶核酸化合物，通过计算机折叠(Jaeger等，1989Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，7706)分别对所述核酸化合物进行了分析，以评估所述序列是否折叠成正确的二级结构。如在结合臂与催化中心之间具有不利分子内相互作用的那些核酸化合物可以不予考虑。
鉴定了目的核酸(例如，反义、RNAi和/或酶核酸化合物)结合/切割位点并将其设计以退火至核酸靶标(例如Ephrin B2和/或EphB4)中的多个位点。本公开内容的酶核酸化合物的结合臂与上述靶位点序列互补。设计反义和RNAi序列，以与所述核酸靶标具有部分或完全互补性。可化学合成所述核酸化合物。所用的合成方法遵循如下文及Usman等，1987J Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等，1990 Nucleic Acids Res.，18，5433；和Wincott等，1995 Nucleic Acids Res.23，2677-2684；Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19中所述的用于正常DNA/RNA合成的程序。
此外，预计具有CpG基序的核酸治疗剂引起非特异性免疫应答的可能性增加。通常，CpG基序包括与5’方向的一个或更多个嘌呤及3’方向的一个或更多个嘧啶相邻的CG(胞嘧啶-鸟苷)。在本领域中可获得已知CpG基序的列表。将选择优选的核酸疗法，以对靶基因具有选择性效应(可能影响其它紧密相关的基因)，而不触发全身免疫应答。通过避免具有CpG基序的核酸治疗剂，降低特定核酸将触发免疫应答的可能性是可能的。
IV.核酸治疗剂的合成
使用自动化方法合成长度超过100个核苷酸的核酸是困难的，并且这些分子的治疗成本令人望而却步。在本公开内容中，小核酸基序(小是指长度少于约100个核苷酸，优选长度少于约80个核苷酸，并更优选长度少于约50个核苷酸的核酸基序(例如，反义寡核苷酸、酶核酸和RNAi构建体))优选用于外源递送。这些分子的简单结构增强了核酸侵入RNA结构靶区域的能力。
化学合成本公开内容的示例性分子，并且可类似地合成其它分子。为了说明，如Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等，国际PCT公布号WO 99/54459，Wincott等，1995，NucleicAcids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，美国专利号6,001,311中所述，使用本领域已知的方案合成寡核苷酸(例如，DNA)。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基团，如5′末端的二甲氧基三苯甲基，和3′末端的亚磷酰胺。在非限制性实例中，在394 AppliedBiosystems，Inc.合成仪上，以2′-O-甲基化核苷酸的2.5分钟偶联步骤和2′-脱氧核苷酸的45秒偶联步骤进行小规模合成。或者，可在96孔板合成仪(如由Protogene(Palo Alto，CA)生产的仪器)上，对循环做最小修改后进行合成。
任选地，可分别合成本公开内容的核酸化合物，并且例如通过连接在合成后连接在一起(Moore等，1992，Science 256，9923；Draper等，国际PCT公布号WO 93/23569；Shabarova等，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等，1997，Bioconj ugate Chem.8，204)。
优选地，广泛修饰本公开内容的核酸化合物，以通过用核酸酶抗性基团，例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H进行修饰来提高稳定性(对于综述，参阅Usman和Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman等，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。使用普通方法通过凝胶电泳来纯化核酶或通过高压液相层析(HPLC；见Wincott等，上文，此处其整体引入作为参考)来纯化核酶，并在水中将其重悬浮。
V.优化核酸化合物的活性
具有修饰(例如，碱基、糖和/或磷酸)的核酸化合物可防止被血清核糖核酸酶降解，并由此提高它们的效能。本领域中有若干实例描述糖、碱基和磷酸修饰，其可被引入核酸化合物，显著提高它们的核酸酶稳定性和功效。例如，通过用核酸酶抗性基团，例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H、核苷酸碱基修饰来修饰寡核苷酸，以提高稳定性和/或增强生物活性(对于综述，参阅Usman和Cedergren，1992，TIBS 17，34；Usman等，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163；Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090)。已经在本领域中广泛描述了核酸化合物的糖修饰(参阅Eckstein等，PCT公布号WO 92/07065；Perrault等Nature，1990，344，565-568；Pieken等Science，1991，253，314-317；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.，1992，17，334-339；Usman等PCT公布号WO93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman等，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等，PCT公布号WO 97/26270；Beigelman等，美国专利号5,716,824；Usman等，美国专利号5,627,053；Woolf等，PCT公布号WO 98/13526；Thompson等，在1998年4月20日提交的U.S.S No.60/082,404；Karpeisky等，1998，Tetrahedron Lett.，39，1131；Earnshaw和Gait，1998，Biopolymers(Nucleic acid Sciences)，48，39-55；Verma和Eckstein，1998，Annu.Rev.Biochem.，67，99-134；和Burlina等，1997，Bioorg.Med.Chem.，5，1999-2010)。类似的修饰可用于修饰本公开内容的核酸化合物。
虽然用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5′-甲基膦酸酯键进行寡核苷酸核苷酸间键的化学修饰提高了稳定性，但过度修饰可产生毒性。因此，当设计核酸化合物时，应评估这些核苷酸间键的量并适当将其降到最少。这些键浓度的降低应降低毒性，引起这些分子的功效提高并且特异性更高。
在一个实施方案中，本公开内容的核酸化合物包括一个或更多个G-夹环核苷酸。G-夹环核苷酸是被修饰的胞嘧啶类似物，其中所述修饰赋予双链体内互补性鸟嘌呤Watson-Crick和Hoogsteen面形成氢键的能力，参阅例如，Lin和Matteucci，1998，J.Am.Chem.Soc.，120，8531-8532。寡核苷酸内单个G-夹环类似物取代可导致当与互补性寡核苷酸杂交时实质提高的螺旋热稳定性和错配辨别。本公开内容的核酸化合物中这些核苷酸的包含导致与核酸靶标的亲和力和特异性增强。在另一实施方案中，本公开内容的核酸化合物包括一个或更多个LNA(锁定核酸)核苷酸，如2′，4′-C亚甲基二环核苷酸(参阅例如Wengel等，PCT公布号WO 00/66604和WO99/14226)。
在另一实施方案中，本公开内容描述了靶向Ephrin B2和/或EphB4的核酸化合物的缀合物和/或复合物。这种缀合物和/或复合物可用于促进核酸化合物递送至生物***，如细胞中。本公开内容提供的缀合物和复合物可通过细胞膜转移治疗化合物、改变药物代谢动力学和/或调整本公开内容的核酸化合物的定位来赋予治疗活性。
本公开内容包括设计并合成用于跨细胞膜递送分子的新缀合物和复合物，所述分子包括但不限于小分子、脂类、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、带负电荷的聚合物和其它聚合物，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或多胺。通常，设计所述转运子以单独使用或作为多组分***的一部分使用，其具有或没有可降解接头。预计这些化合物能在血清存在或缺失的情况下提高本公开内容核酸化合物的递送和/或定位至来自不同组织的许多细胞类型中(参阅Sullenger和Cech，美国专利号5,854,038)。此处所述的分子的缀合物可经接头附着到生物活性分子上，所述接头是生物可降解的，如生物可降解的核酸接头分子。
如此处所用，术语“生物可降解核酸接头分子”指设计用作生物可降解接头以连接一个分子与另一分子(例如，生物活性分子)的核酸化合物。可通过使用核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸，例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基和其它2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸的多种组合来调节生物可降解核酸接头分子的稳定性。所述生物可降解核酸接头分子可以是二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸化合物，例如长度约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷连接，例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单个核苷酸。所述生物可降解核酸接头分子也可包含核酸骨架、核酸糖，或核酸碱基修饰。如此处所用，术语“生物可降解的”指生物***中的降解，例如酶促降解或化学降解。
外源递送的治疗性核酸化合物，如此处所述的分子在细胞内最理想为稳定的，直至靶RNA的翻译已被抑制到足以降低不想要的蛋白质的水平。该时间期间根据疾病状态为数小时到数天之间。这些核酸化合物应该对核酸酶具有抗性，以作为有效的细胞内治疗剂起作用。在本公开内容和本领域中所述的核酸化合物的化学合成的改进已经增强了通过引入核苷酸修饰来修饰核酸化合物以如上所述提高它们的核酸酶稳定性的能力。
在另一方面，所述核酸化合物包含5′和/或3′帽结构。“帽结构”指已经整合到寡核苷酸任一末端的化学修饰(参阅例如Wincott等，WO97/26270)。这些末端修饰保护核酸化合物免受外切核酸酶的降解，并可帮助在细胞内的递送和/或定位。所述帽子可存在于5′末端(5′帽子)或3′末端(3′帽子)或存在于两个末端。在非限制性实例中，所述5′帽子包括反向的无碱基残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-erythrofuranosyl)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯连接；threo-pentofuranosyl核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向无碱基部分；′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向无碱基部分；1，4-磷酸丁二醇；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥或非桥甲基膦酸酯部分(对于更多细节参阅Wincott等，PCT公开号WO 97/26270)。在其它非限制性实例中，所述3′帽子包括，例如，4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-erythrofuranosyl)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯，3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；a-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；threopentofuranosy核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥或非桥5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥或非桥甲基膦酸酯和5′-巯基部分(对于更多细节参阅Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925)。
VI.可溶性多肽
在某些方面，本发明涉及可溶性多肽，其包含Ephrin B2蛋白质的胞外域(此处称作Ephrin B2可溶性多肽-见图12和13)，或包含EphB4蛋白质的胞外域(此处称作EphB4可溶性多肽-见图9-11)。优选地，目的可溶性多肽是单体，并能够以高亲和力结合Ephrin B2或EphB4。在特定实施方案中，本发明的EphB4可溶性多肽包含EphB4蛋白质的球形结构域。在公布的美国专利申请号20050249736中提供了EphB4可溶性多肽的特定实例。
如此处所用，目的可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽或Ephrin B2可溶性多肽的片段、功能变体和修饰形式。目的可溶性多肽的这些片段、功能变体和修饰形式拮抗EphB4、Ephrin B2或EphB4和Ephrin B2的功能。
在某些实施方案中，可通过筛选从编码EphB4或Ephrin B2可溶性多肽的核酸相应片段重组产生的多肽获得目的可溶性多肽的分离片段。此外，可使用本领域已知的技术，如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学合成片段。可以产生(重组或通过化学合成)所述片段并检测所述片段以鉴定那些肽基片段，所述肽基片段可作用于抑制EphB4或Ephrin B2的功能，例如通过检测所述片段抑制血管发生或肿瘤生长的能力。
在某些实施方案中，EphB4可溶性多肽的功能变体包含与氨基酸序列的残基1-197、29-197、1-312、29-132、1-321、29-321、1-326、29-326、1-412、29-412、1-427、29-427、1-429、29-429、1-526、29-526、1-537和29-537至少90％、95％、97％、99％或100％同一的氨基酸序列。此类多肽可以加工形式使用，因此在某些实施方案中，EphB4可溶性多肽包含与氨基酸序列的残基16-197、16-312、16-321、16-326、16-412、16-427、16-429、16-526和16-537至少90％、95％、97％、99％或100％同一的氨基酸序列。
在其它实施方案中，Ephrin B2可溶性多肽的功能变体包含与氨基酸序列的1-225残基至少90％、95％、97％、99％或100％同一的序列或加工形式，如包含与氨基酸序列的26-225残基至少90％、95％、97％、99％或100％同一的序列的加工形式。
在某些实施方案中，本发明涵盖了通过修饰目的可溶性多肽的结构产生功能变体，用于如提高治疗或预防功效或稳定性(例如，离体货架期和体内对蛋白水解降解的抵抗力)的目的。认为这种被修饰的可溶性多肽是天然发生的EphB4或Ephrin B2可溶性多肽的功能等同物。例如可通过氨基酸替代、缺失或添加来产生被修饰的可溶性多肽。例如，可以预计例如异亮氨酸或缬氨酸单独替换亮氨酸、谷氨酸替换天冬氨酸、丝氨酸替换苏氨酸，或结构相关氨基酸对氨基酸的类似替换(例如，保守突变)将对所得分子的生物活性没有关键影响。保守替换是在其侧链相关的氨基酸家族内发生的那些替换。
本发明还涵盖了产生EphB4或Ephrin B2可溶性多肽的组合突变体，以及截短突变体组的方法，并尤其用于鉴定功能变体序列。筛选这种组合文库的目的是产生例如可溶性多肽变体，其可作为EphB4、EphB2或EphB4和EphB2的拮抗剂起作用。可产生组合来源的变体，其相对于天然发生的可溶性多肽具有选择潜力。当从重组DNA构建体表达时，这种变体蛋白质可用于基因治疗方案。同样，诱变可产生变体，其具有与相应野生型可溶性多肽显著不同的细胞内半衰期。例如，可致使改变的蛋白质对蛋白水解降解或导致目的蛋白质(例如，可溶性多肽)降解或失活的其它细胞过程更稳定或更不稳定。这些变体及编码它们的基因可用于通过调节它们的半衰期来改变目的可溶性多肽水平。例如，短的半衰期可产生更短暂的生物学效应，并且当为可诱导表达***的部分时，其允许对细胞内重组可溶性多肽水平更严格的控制。如上，这些蛋白质，尤其是它们的重组核酸构建体可用于基因治疗方案。
有许多方式，可通过所述方式从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物的文库。可在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后将所合成的基因连接到适当基因中用于表达。简并组基因的目的是在混合物中提供编码想要组的潜在可溶性多肽序列的所有序列。简并寡核苷酸的合成为本领域所熟知(参阅例如，Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等，(1981)Recombinant DNA，Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，编辑AG Walton，Amsterdam：Elsevier第273-289页；Itakura等，(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，(1984)Science198：1056；Ike等，(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。这些技术已经用于其它蛋白质的定向进化(参阅，例如，Scott等.，(1990)Science 249：386-390；Roberts等，(1992)PNAS USA 89：2429-2433；Devlin等，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等，(1990)PNAS USA 87：6378-6382；及美国专利号：5,223,409、5,198,346和5,096,815)。
或者，可利用其它形式的诱变产生组合文库。例如，可通过使用例如丙氨酸扫描诱变等(Ruf等，(1994)Biochemistry 33：1565-1572；Wang等，(1994)J.Biol.Chem.269：3095-3099；Balint等，(1993)Gene 137：109-118；Grodberg等，(1993)Eur.J.Biochem.218：597-601；Nagashima等，(1993)J.Biol.Chem.268：2888-2892；Lowman等，(1991)Biochemistry30：10832-10838；和Cunningham等，(1989)Science 244：1081-1085)、通过接头扫描诱变(Gustin等，(1993)Virology 193：653-660；Brown等，(1992)Mol.Cell Biol.12：2644-2652；McKnight等，(1982)Science 232：316)；通过饱和诱变(Meyers等，(1986)Science 232：613)；通过PCR诱变(Leung等，(1989)Method Cell Mol Biol 1：11-19)；或通过随机诱变，包括化学诱变等(Miller等，(1992)A Short Course in Bacterial Genetics，CSHL Press，Cold SpringHarbor，NY；and Greener等，(1994)Strategies in Mol Biol 7：32-34)从文库中筛选并分离可溶性多肽变体(例如，拮抗剂形式)。接头扫描诱变，尤其是组合环境中的接头扫描诱变是用于鉴定目的可溶性多肽的截短(生物活性的)形式的有吸引力的方法。
本领域已知多种技术用于筛选通过点诱变和截短产生的组合文库的基因产物，并且在这方面，用于筛选具有某一特性的基因产物的cDNA文库。这些技术通常适用于快速筛选通过目的可溶性多肽的组合诱变产生的基因文库。最广泛用于筛选大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆至复制表达载体、用所得载体文库转化适当的细胞并在想要的活性检测利于载体相对容易分离的条件下表达组合基因，其中所述载体编码其产物被检测的基因。下文所述的各说明性测定易于高通量分析(如需要)，以便通过组合诱变技术产生大量简并序列。
在某些实施方案中，本发明的目的可溶性多肽包括小分子，如肽和拟肽。如此处所用，术语“拟肽”包括化学修饰肽和肽类分子，其含有非天然发生的氨基酸、类肽等。拟肽提供了优于肽的多种优势，包括当向受试者施用时稳定性提高。用于鉴定拟肽的方法为本领域所熟知并包括筛选含有潜在拟肽的文库的数据库。例如，Cambridge Structural Database含有超过300,000种化合物，所述化合物已知具有晶体结构(Allen等，ActaCrystallogr.Section B，35：2331(1979))。不能获得靶分子的晶体结构时，可使用例如程序CONCORD产生结构(Rusinko等，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))。另一数据库Available Chemicals Directory(MolecularDesign Limited，Informations Systems；San Leandro Calif.)含有大约100,000种化合物，所述化合物可通过商业途径获得并还可以进行搜索以鉴定EphB4或Ephrin B2可溶性多肽的潜在拟肽。
为了说明，通过使用扫描诱变来为参与结合到另一蛋白质上的可溶性多肽的氨基酸残基作图，可产生拟肽化合物，其模拟参与结合的那些残基。例如，可使用苯并二氮杂
Figure G2008800150976D00361
(例如，参阅Freidinger等，Peptides：Chemistryand Biology，G.R.Marshall编辑，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)、氮杂
Figure G2008800150976D00362
(例如，参阅Huffman等，Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall编辑，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)、取代的γ内酰胺环(Garvey等，Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall编辑，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)、酮-亚甲基假肽(Ewenson等，(1986)J.Med.Chem.29：295；和Ewenson等，Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th American PeptideSymposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)、b-转角二肽核(Nagai等，(1985)Tetrahedron Lett 26：647；和Sato等，(1986)J Chem SocPerkin Trans 1：1231)和b-氨基醇(Gordon等，(1985)Biochem Biophys ResCommun 126：419；和Dann等，(1986)Biochem Biophys Res Commun134：71)产生这些残基的非水解肽类似物。
在某些实施方案中，本发明的可溶性多肽可进一步包含翻译后修饰。这种修饰包括，但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。结果，所述修饰的可溶性多肽可含有非氨基酸元件，如聚乙二醇、脂类、多糖或单糖和磷酸。可以检测这种非氨基酸元件对可溶性多肽功能性的影响在EphB4或Ephrin B2功能中的拮抗作用，例如其对血管发生或肿瘤生长的抑制效果。
在某些方面，目的可溶性多肽的功能变体或修饰形式包括具有至少一部分可溶性多肽和一个或更多个融合结构域的融合蛋白。这种融合结构域的众所周知的实例包括，但不限于，多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、A蛋白、G蛋白和免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)，其尤其用于通过亲和层析分离融合蛋白。根据亲和纯化的目的，使用亲和层析的有关基质，如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴缀合的树脂。本领域众所周知的另一融合结构域是绿色荧光蛋白(GFP)。融合结构域也包括“表位标签”，其通常是短的肽序列，针对该序列可获得特异性抗体。针对其容易获得特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，所述融合结构域具有蛋白酶切割位点，如因子Xa或凝血酶的切割位点，其允许相关蛋白酶部分消化所述融合蛋白质，并由此释放重组蛋白。然后可通过后续的层析分离从融合结构域中分离所释放的蛋白质。在某些实施方案中，本发明的可溶性多肽含有能够稳定所述可溶性多肽的一种或更多种修饰。例如，这些修饰增加了所述可溶性多肽的体外半衰期、增加了所述可溶性多肽的循环半衰期或降低了所述可溶性多肽的蛋白水解降解。
在某些实施方案中，通过多种本领域已知的技术产生本发明的可溶性多肽(未修饰的或修饰的)。例如，可使用标准的蛋白质化学技术，如在Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant G.A.(编辑)，Synthetic Peptides：A User′s Guide，W.H.Freeman and Company，New York(1992)中描述的那些技术来合成这种可溶性多肽。此外，自动肽合成仪可通过商业途径获得(例如AdvancedChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。或者，可使用本领域(也见下文)所熟知的多种表达***重组产生所述可溶性多肽、其片段或变体。
VII.编码可溶性多肽的核酸
在某些方面，本发明涉及编码EphB4或Ephrin B2可溶性多肽的分离的和/或重组核酸。主题核酸可以是单链或双链DNA或RNA分子。这些核酸可用作治疗剂。例如，这些核酸用于制备作为治疗剂向细胞或个体施用的重组可溶性多肽。或者，这些核酸可作为基因疗法中的治疗剂向细胞或个体直接施用。
在某些实施方案中，本发明提供分离的或重组核酸序列，其与所述核苷酸序列的区域至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一。本领域普通技术人员将理解与主题核酸互补的核酸序列，及主题核酸的变体也在本发明的范围内。在其它实施方案中，本发明的核酸序列可以是分离的、重组的、和/或与异源核苷酸序列融合的，或在DNA文库中的序列。
在其它实施方案中，本发明的核酸也包括在高严格条件下与核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。如上讨论，本领域普通技术人员将容易地理解促进DNA杂交的适当严格条件可以变化。本领域普通技术人员将容易地理解促进DNA杂交的适当严紧条件可以变化。例如，可以在大约45℃6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，接着在50℃2.0x SSC中洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃大约2.0x SSC的低严紧性到50℃大约0.2x SSC的高严紧性。此外，洗涤步骤中的温度可从室温大约22℃的低严紧条件升高到大约65℃的高严紧条件。温度和盐两者均可变化，或者温度或盐浓度之一保持恒定而另一变量改变。在一个实施方案中，本发明提供了核酸，其在室温下6x SSC的低严紧条件下杂交，接着在室温2x SSC中洗涤。
因遗传密码的简并性而与主题核酸不同的分离核酸也在本发明范围内。例如，许多氨基酸由多于一个三联体指定。指定同一氨基酸的密码子，或同义密码子(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)可导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。然而，预计导致主题蛋白质的氨基酸序列改变的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员将理解编码特定蛋白质的核酸的一个或更多个核苷酸(高达约3-5％的核苷酸)中的这些变异因天然等位基因变异可以存在于给定物种的个体中。任何和全部这些核苷酸变异和所得的氨基酸多态性均在本发明范围内。
在某些实施方案中，本发明的重组核酸可有效连接到表达构建体中的一种或更多种调节性核苷酸序列上。调节性核苷酸序列将通常适合于用于表达的宿主细胞。对多种宿主细胞而言，许多类型的合适表达载体和合适的调节性序列为本领域所知。通常，所述一种或更多种调节性核苷酸序列包括，但不限于，启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。本发明涵盖本领域已知的组成型或诱导型启动子。所述启动子可以是天然发生的启动子，或组合多于一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中游离基因，如质粒上，或者所述表达构建体可***染色体中。在优选的实施方案中，表达载体含有可选择标记基因，以允许选择所转化的宿主细胞。可选择标记基因为本领域所熟知并将根据所用的宿主细胞变化。
在本发明的某一方面，在包含编码EphB4或Ephrin B2可溶性多肽的核苷酸序列的表达载体中提供主题核酸并将其有效连接到至少一种调节性序列上。调节性序列为本领域所公知的并进行选择以指导可溶性多肽的表达。因此，术语调节性序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性调节性序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。例如，当有效连接DNA序列时，控制DNA序列表达的任何宽范围的表达控制序列可用于这些载体中，以表达编码可溶性多肽的DNA序列。此类重要的表达控制序列包括，例如SV40的早期启动子和后期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、lac***、trp***、TAC或TRC***、T7启动子(其表达受T7 RNA聚合酶的指导)、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒***的多角体蛋白启动子和已知控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的其它序列，及其多种组合。应理解表达载体的设计可根据这样的因素，如待转化的宿主细胞的选择和/或想要表达的蛋白质的类型。此外，也应该考虑载体拷贝数、控制拷贝数的能力和载体编码的任何其它蛋白质(如抗生素标记)的表达。
本发明还涉及重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括一个或更多个主题可溶性多肽的编码序列。所述宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，本发明的可溶性多肽可以在细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达***)、酵母或哺乳动物细胞中进行表达。其它合适的宿主细胞为本领域技术人员所知。
VIII.抗体
本公开内容部分提供EphB4分子的确定部分，其可被多肽结合剂，如抗体、抗体的抗原结合部分和非免疫球蛋白抗原结合支架有效靶定。此处所述的EphB4多肽结合剂可用于治疗多种疾病，尤其是癌和与不想要的血管发生相关的疾病。本公开内容提供了抗体及其抗原结合部分，其抑制一种或更多种EphB4介导功能，如EphrinB2结合或EphB4激酶活性。这些结合剂可用于在体外和体内抑制EphB4功能，并优选用于治疗癌或与不想要的血管发生相关的疾病。本公开内容还提供了抗体及其抗原结合部分，其激活EphB4激酶活性(通常通过评估EphB4磷酸化状态进行评估)。令人惊奇的是，这些抗体还用于在基于细胞的体内测定中抑制EphB4的功能。因此，这些结合剂可用于在体外和体内抑制EphB4的功能，并优选用于治疗癌或与不想要的血管发生相关的疾病。不希望受限于任何特定机理，预计这些抗体不仅刺激EphB4的激酶活性，还刺激EphB4从膜上移去，因此降低总体EphB4水平。
EphB4属于跨膜受体蛋白酪氨酸激酶家族。EphB4的细胞外部分由配体结合域(也称作球形结构域)、半胱氨酸富集区域和一对纤连蛋白类型III重复组成。胞质区由含有两个保守酪氨酸残基的近膜域；蛋白酪氨酸激酶结构域；无效α-基序(SAM)和PDZ结构域结合基序组成。EphB4对膜结合配体Ephrin B2特异(Sakano，S.等1996；Brambilla R.等1995)。EphB4通过结合聚集的膜附着的ephrin配体而被激活(Davis S等，1994)，这说明Eph受体的激活需要表达受体的细胞与表达配体的细胞之间的接触。配体结合后，EphB4受体二聚体化并将近膜酪氨酸残基自磷酸化以获得完全激活。
如此处所用，术语“EphB4”指来自哺乳动物(包括人)的EphB4多肽。在一个实施方案中，抗体(免疫球蛋白)针对分离的和/或重组的哺乳动物EphB4或其部分(例如肽)或针对表达重组哺乳动物EphB4的宿主细胞产生。在某些方面，本发明的抗体特异结合EphB4蛋白(此处称作EphB4可溶性多肽)的胞外域。例如，EphB4可溶性多肽包含球形结构域并能够结合Ephrin B2。如此处所用，所述EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能变体和修饰形式。
“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然发生的免疫球蛋白中，每一四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100到110或更多氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分定义了主要负责效应功能的恒定区。将人轻链分类为κ和λ轻链。将重链分类为μ、δ、γ、α、或ε，并分别定义抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，并且所述重链也包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常参阅，Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.，编辑，第二版Raven Press，N.Y.(1989))(为全部目的以其整体引入作为参考)。每一轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。免疫球蛋白可组织成更高度有序的结构。IgA通常是两个四聚体的二聚体。IgM通常是五个四聚体的五聚体。
免疫球蛋白链显示了通过三个高变区(也称作互补决定区或CDR)连接的相对保守构架区(FR)的相同的一般结构。来自每对两条链的CDR通过构架区排列，使得能够结合特定表位。从N末端到C末端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每一结构域的氨基酸分配根据Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等.Nature342：878-883(1989)的定义。
“抗体”指完整的免疫球蛋白或指其抗原结合部分，其与完整抗体竞争特异性结合，并旨在包括单克隆抗体和多克隆抗体。“分离的抗体”只是基本纯化或产生以不含结合同一靶标的其它类抗体的抗体。单克隆抗体和大多数重组抗体形式是分离的，而多克隆抗体混合物中存在的抗体种类不是分离的。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学切割完整的抗体产生抗原结合部分。抗原结合部分包括，尤其是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体和含有足以赋予多肽特异性抗原结合的至少部分免疫球蛋白的多肽。术语“抗EphB4抗体”和“EphB4抗体”此处可互换使用。
Fab片段是由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的单价片段；F(ab′)2片段是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由抗体单条臂的VL和VH结构域组成；并且dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989)由VH结构域组成。
单链抗体(scFv)是其中VL和VH区通过使得它们能够成为单条蛋白质链的合成接头配对以形成单价分子的抗体(Bird等，Science 242：423-426，1988和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VL和VH结构域在单条多肽链上表达，但使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参阅例如，Holliger，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993，和Poljak，R.J.，等，Structure 2：1121-1123，1994)。一个或更多个CDR可共价或非共价整合到分子中。
抗体可具有一个或更多个结合位点。如果多于一个结合位点，所述结合位点可以与另一个相同或不同。例如，天然发生的免疫球蛋白具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段具有一个结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有来自人免疫球蛋白序列的一个或更多个可变区和恒定区的所有抗体。在优选的实施方案中，所有可变区和恒定区来自人免疫球蛋白序列(完全的人抗体)。这些抗体可以多种方式制备，如下文所述。
术语“嵌合抗体”指含有来自一个抗体的一个或更多个区域和来自一个或更多个其它抗体的一个或更多个区域的抗体。在优选的实施方案中，一个或更多个CDR来自人抗EphB4抗体。在更优选的实施方案中，所有的CDR来自人抗EphB4抗体。在另一优选实施方案中，将来自多于一个人抗EphB4抗体的CDR混和并在嵌合抗体中匹配。例如，嵌合抗体可包含来自第一个人抗EphB4抗体的轻链的CDR1，可与来自第二个人抗EphB4抗体的轻链的CDR2和CDR3组合，并且来自重链的CDR可来自第三个抗EphB4抗体。另外，构架区可来自一个相同的抗EphB4抗体，来自一个或更多个不同的抗体，如人抗体，或来自人源化抗体。
“中和抗体”是当过量抗EphB4抗体将结合EphrinB2的EphB4(可溶性)的量降低至少约20％，优选至少40％，更优选60％，甚至更优选80％，或甚至更优选85％时，抑制EphB4结合EphrinB2的抗体。结合降低可通过本领域普通技术人员已知的任何手段来测定，例如在体外竞争结合测定中测定。
“EphB4激酶激活抗体”是当向表达EphB4的细胞、组织或生物体中加入时激活EphB4激酶活性至少约20％的抗体。在优选的实施方案中，所述抗体激活EphB4激酶活性至少40％，更优选60％，甚至更优选80％，或甚至更优选85％。通常，激酶活性测定为EphB4本身的磷酸化状态(酪氨酸自磷酸化)。
如此处所用，术语“标记”或“标记的”指抗体中另一分子的掺入。在一个实施方案中，所述标记是可检测标记，例如放射标记的氨基酸的掺入或可通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或比色方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生素)检测的生物素基部分附着到多肽上。在另一实施方案中，所述标记或标记物可以是治疗剂，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法为本领域所知并可使用。多肽标记的实例包括，但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基、由二级报告子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性试剂，如钆螯合剂、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素及其类似物或同系物。在一些实施方案中，标记附着多种长度的间隔臂以减少潜在的位阻。
申请人已经产生了许多针对EphB4的单克隆抗体和产生EphB4单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗体的进一步在许多方面表征，如它们抑制EphB4及其配体(例如，Ephrin B2)之间相互作用的能力、它们抑制EphB4受体二聚化或多聚化的能力、它们减少EphB4酪氨酸磷酸化的能力、它们与其它Eph家族成员的交叉反应性、它们抑制血管发生的能力、和它们抑制肿瘤生长的能力。另外，表位作图研究揭示这些EphB4抗体可以特异性结合EphB4的一个或更多个区域(例如，球形结构域、半胱氨酸富集结构域或纤连蛋白类型III结构域)。例如，EphB4抗体可结合两个纤连蛋白类型3结构域。
在某些方面，本发明的抗体特异性结合EphB4蛋白质的胞外域(ECD)(此处也称作可溶性EphB4多肽；也见图9-11)。可溶性EphB4多肽可包含这样的序列，所述序列包括球形(G)结构域(SEQ ID NO：29-197)、和任选额外结构域，如半胱氨酸富集结构域(SEQ ID NO：
Figure G2008800150976D00442
Figure G2008800150976D00443
239-321)、第一个纤连蛋白类型3结构域(SEQ ID NO：
Figure G2008800150976D00444
324-429)和第二个纤连蛋白类型3结构域(SEQ ID NO：
Figure G2008800150976D00445
434-526)。示例性EphB4可溶性多肽提供于图9-11。如此处所用，所述EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能变体和修饰形式。
在某些方面，本发明提供对EphB4或EphB4部分具有结合特异性的抗体(抗EphB4)。这些抗体的实例包括，但不限于，EphB4 Mab 1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138，如图8中所示。也包括的是Mab 265(图表中未显示)。任选地，免疫球蛋白可以至少约1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9M或更低的亲和力结合EphB4。任选地，抗体及其部分以大致等于包含球形配体结合域的可溶性细胞外EphB4多肽的亲和力结合EphrinB2。此处公开的抗体将优选为对EphB4特异，对Eph或Ephrin家族的其它成员具有最小的结合。
在本发明的另一方面，抗EphB4抗体显示了物种和分子选择性。在一个实施方案中，所述抗EphB4抗体结合人、短尾猴或猕猴EphB4。在优选的实施方案中，所述抗EphB4抗体不结合小鼠、大鼠、豚鼠、狗或兔EphB4。任选地，所述抗体结合来自不同物种，如人和小鼠的多个不同的EphB4。根据说明书的教导，可以使用本领域熟知的方法确定抗EphB4抗体的物种选择性。例如，可以使用Western印迹、FACS、ELISA或RIA确定物种选择性。在优选的实施方案中，可以使用Western印迹确定物种选择性。在另一实施方案中，所述抗EphB4抗体具有结合EphB4的倾向，其比结合来自相同物种的EphB家族其它成员倾向高至少50倍，并优选高100或200倍。可根据说明书的教导使用本领域已知的方法确定选择性。例如，可使用Western印迹、FACS、ELISA或RIA确定选择性。在优选的实施方案中，可使用Western印迹确定分子选择性。
在某些实施方案中，本发明的抗体结合EphB4的一个或更多个特异性结构域。例如，抗体结合EphB4的一个或更多个胞外域(如球形结构域、半胱氨酸富集结构域和第一个纤连蛋白类型3结构域和第二个纤连蛋白类型3结构域)。例如，EphB4抗体(Mab)No.1、23、35和79结合横跨SEQ IDNO：7中序列的氨基酸16-198的区域中的表位，横跨球形结构域。EphB4抗体No.85L、85H、91和131结合横跨氨基酸324-429(包括第一个纤连蛋白类型3结构域)的区域中的表位。EphB4抗体No.47、57、85H、78、121和138结合横跨氨基酸430-537(包括第二个纤连蛋白类型3结构域)的区域中的表位。任选地，主题抗体(例如，EphB4抗体No.85H)可结合EphB4的至少两个结构域(图8)。
抗EphB4抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在优选实施方案中，所述抗体是IgG，并且是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在更优选实施方案中，所述抗EphB4抗体是IgG2亚类。可使用本领域已知的任何方法确定EphB4抗体的种类和亚类。一般地，可使用抗体的特定种类和亚类特异的抗体确定抗体的种类和亚类。可以通过商业途径获得这些抗体。可通过ELISA、Western印迹及其它技术确定种类和亚类。或者，可通过对抗体重链和/或轻链的恒定区全部或部分进行测序、将它们的氨基酸序列与免疫球蛋白多个种类和亚类的已知氨基酸序列比较并确定所述抗体的种类和亚类来确定种类和亚类。为了说明，示例性EphB4抗体的种类和亚类示于下文表3中。
在某些实施方案中，单链抗体，和嵌合的、人源化的或灵长类化(CDR-移植的)抗体，以及嵌合的或CDR-移植的单链抗体(包含来自不同物种的部分)也作为抗体的抗原结合部分被本发明包括在内。这些抗体的多个部分可通过常规技术化学连接在一起，或可使用遗传改造技术制备成相邻蛋白质。例如，可表达编码嵌合或人源化链的核酸，以产生相邻蛋白质。参阅，例如，Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利号0,125,023
Figure G2008800150976D00461
Boss等，美国专利号4,816,397；Boss等，欧洲专利号0,120,694
Figure G2008800150976D00462
Neuberger，M.S.等，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等，欧洲专利号0,194,276 B1；Winter，美国专利号5,225,539；和Winter，欧洲专利号0,239,400 B1。关于primatized抗体也参阅，Newman，R.等，BioTechnology，10：1455-1460(1992)。关于单链抗体参阅例如Ladner等，美国专利号4,946,778；和Bird，R.E.等，Science，242：423-426(1988))。
此外，也可产生抗体的功能片段，包括嵌合的、人源化的或灵长类化的或单链抗体的片段。主题抗体的功能片段保留了其来源全长抗体的至少一种结合功能和/或调节功能。优选的功能片段保留了相应全长抗体的抗原结合功能(例如，对EphB4的特异性)。某些优选功能片段保留了抑制EphB4一种或更多种功能特性(如结合活性、信号转导活性和/或细胞响应的刺激)的能力。例如，在一个实施方案中，EphB4抗体的功能片段可抑制EphB4与一个或更多个其配体(例如Ephrin B2)的相互作用，和/或抑制一种或更多种受体介导的功能，如细胞迁移、细胞增殖、血管发生和/或肿瘤生长。
例如，能够结合EphB4受体或其部分的抗体片段(包括但不限于，Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段)包括在本发明内。可通过酶切割或通过重组技术产生这样的片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分别产生Fab或F(ab′)2片段。也可使用抗体基因产生多种截短形式的抗体，在所述抗体基因中在天然终止位点上游已经引入了一个或更多个终止密码子。例如，可设计编码F(ab′)2重链部分的嵌合基因，以包括编码重链的CH1结构域和铰链区的DNA序列。
如此处所用，术语“人源化免疫球蛋白”指包含不同来源免疫球蛋白部分的免疫球蛋白，其中至少一部分是人来源的。因此，本发明涉及对EphB4(例如，人EphB4)具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含非人来源(例如，啮齿类)的抗原结合部分和人来源免疫球蛋白的至少一部分(例如，人构架区，人恒定区或其部分)。例如，所述人源化抗体可包含来自具有必需特异性的非人来源(如小鼠)的免疫球蛋白的部分，和来自人来源的免疫球蛋白序列的部分(例如，嵌合免疫球蛋白)，这两部分通过常规技术(例如合成)化学连接在一起或使用遗传改造技术制备成相邻多肽(例如，编码可表达的嵌合抗体的蛋白质部分的DNA，以产生相邻多肽链)。
本发明人源化免疫球蛋白的另一实例是含有一条或更多条免疫球蛋白链的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白链包含非人来源的CDR(例如，来自非人来源的抗体的一个或更多个CDR)和来自人来源轻链和/或重链的构架区(例如构架区改变或未改变的CDR移植抗体)。在一个实施方案中，所述人源化免疫球蛋白可与鼠类单克隆抗体竞争结合EphB4多肽。嵌合的或CDR移植的单链抗体也包括在术语人源化免疫球蛋白内。
在某些实施方案中，本发明提供EphB4拮抗剂抗体。如此处所述，术语“拮抗剂抗体”指能抑制EphB4的一种或更多种功能，如结合活性(例如，配体结合)和信号转导活性(例如，EphB4的聚集或磷酸化、对细胞应答的刺激，如对细胞迁移或细胞增殖的刺激)的抗体。例如，拮抗剂抗体可抑制(降低或防止)EphB4受体与天然配体(例如Ephrin B2或其片段)的相互作用。优选地，针对EphB4的拮抗剂抗体可抑制EphB4介导的功能，包括上皮细胞迁移、细胞增殖、血管发生，和/或肿瘤生长。任选地，所述拮抗剂抗体结合EphB4的胞外域。
在其它实施方案中，本发明提供EphB4激酶激活抗体。这种抗体增强EphB4激酶活性，甚至不依赖于EphrinB2。在一些情况下，这种抗体可用于刺激EphB4。然而，申请人注意到在大多数基于细胞的体内测定中，这种抗体令人惊奇地像拮抗剂抗体一样。这种抗体看起来结合纤连蛋白类型III结构域，尤其是EphB4的氨基酸327-427的区域。
在某些实施方案中，也提供抗独特型抗体。抗独特型抗体识别与另一抗体的抗原结合位点相关的抗原决定簇。可通过免疫相同物种，优选相同品系的动物(如用于产生第二抗体的动物)针对第二抗体制备抗独特型抗体。参阅例如美国专利号4,699,880。在一个实施方案中，针对受体或其部分产生抗体，并且这些抗体反过来用于产生抗独特型抗体。由此产生的抗独特型抗体可结合化合物，所述化合物结合受体，如受体功能的配体，并可用于免疫测定，以检测或鉴定或定量这种化合物。此类抗独特型抗体也可以是EphB4受体功能的抑制剂，尽管其本身不结合受体。这种抗独特型抗体也可称作拮抗剂抗体。
在某些方面，本发明提供杂交瘤细胞系，以及由这些杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。本发明的细胞系具有除产生单克隆抗体之外的用途。例如，本发明的细胞系可与其它细胞(如适当药物标记的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠异源骨髓瘤或人的类淋巴母细胞)融合产生额外的杂交瘤，并因此提供编码单克隆抗体的基因的转移。此外，所述细胞系可用作编码抗EphB4免疫球蛋白链的核酸的来源，可分离并表达所述抗EphB4免疫球蛋白链(例如使用任何合适的技术在转移到其它细胞后(参阅例如Cabilly等，美国专利号4,816,567；Winter，美国专利号5,225,539))。例如，可分离包含重排抗EphB4轻链或重链的克隆(例如通过PCR)或从细胞系分离的mRNA中制备cDNA文库，并可分离编码抗EphB4免疫球蛋白链的cDNA克隆。因此，可获得编码抗体或其部分的重链和/或轻链的核酸并根据重组DNA技术将其用于在多种宿主细胞或体外翻译***中产生特定的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其变体(例如，人源化免疫球蛋白)。例如，编码变体，如人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的核酸，包括cDNA或其衍生物可置于合适的原核或真核载体中(例如表达载体)并通过适当方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)引入合适的宿主细胞中，使得所述核酸有效连接到一个或更多个表达控制元件上(例如，载体中或整合到宿主细胞基因组中)。对于制备，可在适合于表达的条件(例如，存在诱导物、补充有适当盐类、生长因子、抗生素、营养补充物等的合适培养基中)维持宿主细胞，由此产生所编码的多肽。如果需要，可回收和/或分离(例如从宿主细胞或培养基中)所述编码的蛋白质。将理解制备方法包括在转基因动物的宿主细胞中进行表达(参阅例如，WO 92/03918，GenPharmInternational，1992年3月19日公开)。
如此处所述，或使用其它合适技术进行免疫抗原的制备，以及多克隆抗体和单克隆抗体的制备。已经描述了多种方法。参阅例如Kohler等，Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等，美国专利号4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，N.Y.)；Current ProtocolsIn Molecular Biology，第2卷(附录27，Summer′94)，Ausubel，F.M.等，编辑，(John Wiley&Sons：New York，N.Y.)，第11章，(1991)。通常，可通过融合合适的无限增殖细胞系(例如骨髓瘤细胞系，如SP2/0)与产生抗体的细胞来产生杂交瘤。从免疫有目的抗原的动物中获得产生抗体的细胞，优选那些脾或***的细胞。可使用选择性培养条件分离所述融合细胞(杂交瘤)，并通过有限稀释进行克隆。可通过合适测定(例如ELISA)来选择产生具有想要的特异性的抗体的细胞。
可使用产生或分离具有必需特异性的抗体的其它合适方法，包括，例如，从文库中选择重组抗体的方法，或依赖于免疫能够产生人抗体所有组成成分的转基因动物(例如，小鼠)的方法。参阅例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Lonberg等，美国专利号5,545,806；Surani等，美国专利号5,545,807。
为了说明，来自EphB4多肽(例如EphB4多肽或其抗原片段，其能够诱发抗体反应，或EphB4融合蛋白)的免疫原可用于免疫动物，如小鼠、仓鼠或兔。参阅，例如，Harlow和Lane编辑的Antibodies：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press：1988)。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括缀合到载体上或本领域所熟知的其它技术。可在佐剂的存在下施用EphB4多肽的免疫原性部分。可通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测免疫接种的进程。标准的ELISA或其它免疫测定可与作为抗原的免疫原用于评估抗体水平。在一个实施方案中，本发明的抗体对EphB4蛋白质的胞外部分或其片段特异。在另一实施方案中，本发明的抗体对EphB4蛋白质的胞内部分或跨膜部分特异。
用EphB4多肽的抗原制备物免疫动物后，可获得抗血清，并且如果需要，可从血清中分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可从被免疫的动物中收集产生抗体的细胞(淋巴细胞)并通过标准的体细胞融合操作将其与无限增殖细胞(如骨髓瘤细胞)融合，以产生杂交瘤细胞。这些技术为本领域所熟知，并包括例如杂交瘤技术(最初由Kohler和Milstein，(1975)Nature，256：495-497开发)、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbar等，(1983)Immunology Today，4：72)、和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.页77-96)。可经免疫化学筛选杂交瘤细胞，用于产生与EphB4多肽特异反应的抗体并从包含这种杂交瘤细胞的培养物中分离单克隆抗体。
在某些实施方案中，可使用常规技术将本发明的抗体片段化并如上文对整个抗体所述以相同方式筛选所述片段的效用。例如，可用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab)2片段。可处理所得F(ab)2片段以减少二硫键而产生Fab片段。
在某些实施方案中，本发明的抗体进一步旨在包括双特异性分子、单链分子和嵌合分子及人源化分子，其对EphB4多肽具有由抗体的至少一个CDR区赋予的亲和力。用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)也可适合于产生单链抗体。同样，转基因小鼠或包括其它哺乳动物的其它生物可用于表达人源化抗体。产生这些抗体的方法为本领域已知。参阅，例如，Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利号0,125,023B1；Queen等，欧洲专利号0,451,216 B1；Boss等，美国专利号4,816,397；Boss等，欧洲专利号0,120,694 E1；Neuberger，M.S.等，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等，欧洲专利号0,194,276 B1；Winter，美国专利号5,225,539；winter，欧洲专利号0,239,400 B1；Padlan，E.A.等，欧洲专利申请号0,519,596 A1。也参阅，Ladner等，美国专利号4,946,778；Huston，美国专利号5,476,786；和Bird，R.E.等，Science，242：423-426(1988)。
可使用合成的和/或重组的核酸制备这种人源化免疫球蛋白，以制备编码想要的人源化链的基因(例如，cDNA)。例如，可使用PCR诱变方法构建编码人源化可变区的核酸(例如，DNA)序列，以改变编码人或人源化链的DNA序列，如来自先前人源化可变区的DNA模板(参阅例如，Kamman，M.，等，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989))；Sato，K.，等，CancerResearch，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L.等，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；和Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。使用这些或其它合适方法，也可容易地制备变体。在一个实施方案中，可诱变克隆的可变区，并可选择编码具有想要的特异性的变体的序列(例如，来自噬菌体文库；参阅例如，Krebber等，美国专利号5,514,548；Hoogenboom等，WO 93/06213，1993年4月1日出版)。
在某些实施方案中，抗体还附着到能够被检测的标记上(例如，所述标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。活性部分可以是放射性物质，如：放射性重金属，如铁螯合剂、钆或锰的放射性螯合物、氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。附着到该部分上的结合试剂可用作显像剂并以对哺乳动物(如人)中的诊断用途有效的量施用，然后检测显像剂的定位和累积。可通过放射性闪烁显像、核磁共振显像、计算层析X射线照相术或正电子发射断层显象来检测显像剂的定位和累积。针对EphB4的抗体或其它结合多肽的免疫闪烁成像可用于检测和/或诊断癌和脉管***。例如，针对标记有99锝、111铟、125碘的EphB4标记的单克隆抗体可有效用于这种成像。如将对技术人员显而易见的是，待施用的放射性同位素的量依赖于放射性同位素。本领域技术人员可基于用作活性部分的给定放射性核素的比活性和能量容易地配制待施用的显像剂的量。通常，施用每剂量显像剂0.1-100毫居，优选1-10毫居，最经常2-5毫居。因此，用作显像剂的本发明的组合物(其包含缀合到放射性部分上的靶部分)包含0.1-100毫居，在一些实施方案中优选1-10毫居，在一些实施方案中优选2-5毫居，在一些实施方案中更优选1-5毫居。
在某些优选实施方案中，本发明抗体是单克隆抗体，在某些实施方案中，本发明可获得用于产生新抗体的方法。例如，用于产生特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的方法可包括向小鼠施用有效刺激可检测免疫反应的免疫原性组合物(其包含EphB4多肽)的量，从小鼠中获得产生抗体的细胞(例如，来自脾的细胞)并将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤，并检测产生抗体的杂交瘤以鉴定产生特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的杂交瘤。一旦获得，可在细胞培养中，任选地在其中来自杂交瘤的细胞产生特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的培养条件中繁殖杂交瘤。可从细胞培养物中纯化所述单克隆抗体。
此外，用于筛选抗体以鉴定想要的抗体的技术可影响所得抗体的性质。例如，待用于某些治疗目的的抗体将优选能够靶向特定的细胞类型。因此，为了获得该类型的抗体，可期望筛选结合表达目的抗原的细胞的抗体(例如，通过荧光激活细胞分选)。同样，如果抗体待用于结合溶液中的抗原，期望检测溶液结合。可获得多种不同技术检测抗体：抗原相互作用，以鉴定尤其想要的抗体。这些技术包括ELISA、表面等离振子共振结合测定(例如，Biacore结合测定，Bia-core AB，Uppsala，Sweden)、夹层测定(例如，IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland的顺磁珠***)、western印迹、免疫沉淀测定和免疫组织化学。
本发明的抗体用于多种应用，包括研究、诊断和治疗应用。例如，它们可用于分离和/或纯化受体或其部分，并用于研究受体结构(例如，构象)和功能。
在某些方面，本发明的多种抗体可用于检测或测定例如上皮细胞(例如静脉上皮细胞)或转染了EphB4受体基因的细胞上的EphB4受体的表达。因此，为了诊断或研究目的，它们也用于如细胞分选和成像(例如，流式细胞术和荧光激活细胞分选)的应用中。
在某些实施方案中，为了诊断目的，抗体或抗体的抗原结合片段可以被标记或不被标记。通常，诊断测定可以检测得自抗体与EphB4结合的复合体的形成。可直接标记所述抗体。可使用多种标记，包括，但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。许多合适的免疫测定为技术人员所知(参阅，例如，美国专利号3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876)。当未被标记时，所述抗体可用于测定，如凝集作用测定。未被标记抗体也可与另外的(一个或更多个)合适试剂(其可用于检测抗体，如与第一抗体(例如，抗独特型抗体或对未标记免疫球蛋白特异的其它抗体)反应的标记抗体(例如，第二抗体))或其它合适试剂(例如标记的A蛋白)组合使用。
在一个实施方案中，可在酶免疫测定中利用本发明的抗体，其中主题抗体，或第二抗体缀合到酶上。当包含EphB4蛋白质的生物样品与主题抗体组合时，在抗体和EphB4蛋白质之间发生结合。在一个实施方案中，含有表达EphB4蛋白质的细胞(例如，上皮细胞)的样品与主题抗体组合，在抗体和携带EphB4蛋白质(其包含被该抗体识别的表位)的细胞之间发生结合。这些结合的细胞可从未结合的试剂中分离，并例如通过将样品与当通过酶起作用时产生颜色或其它可检测变化的酶底物接触测定特异性结合细胞的抗体-酶缀合物的存在。在另一实施方案中，可不标记主题抗体，并可加入识别主题抗体的第二个标记的抗体。
在某些方面，也可制备用于检测生物样品中EphB4蛋白质存在的试剂盒。这种试剂盒将包括结合EphB4蛋白质或所述受体部分的抗体，以及适合于检测抗体与EphB4或其部分之间复合体存在的一种或更多种辅助试剂。这些抗体的实例包括，但不限于，EphB4 Mab 1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131、138和265(参阅出版的美国专利申请20050249736)。可以冻干形式单独或与对其它表位特异的额外抗体组合提供本发明的抗体组合物。可以被标记或不被标记的抗体可以与附加成分(例如，缓冲液，如Tris、磷酸盐和碳酸盐、稳定剂、赋形剂、杀生物剂和/或惰性蛋白，例如牛血清白蛋白)一起包含在所述试剂盒中。例如，所述抗体可提供为与附加成分的冻干混合物，或所述附加成分可由使用者单独提供用于组合。通常，以活性抗体的量计，这些附加材料将以低于约5％重量存在，并且通常以抗体浓度计，其将以至少约0.001％重量的总量存在。使用能够结合单克隆抗体的第二抗体时，可在试剂盒中提供这种抗体，例如在单独的小瓶或容器中。如果存在，第二抗体通常被标记，并可以用上述抗体配方，以类似方式配制。
类似地，本发明还涉及检测和/或定量细胞的EphB4或受体部分表达的方法，其中将包含细胞或其级分(例如膜级分)的组合物在适合于结合抗体的条件下与结合EphB4或受体部分的抗体接触，并监测抗体结合。指示抗体与EphB4或其部分之间复合体形成的抗体检测指出受体的存在。可通过标准方法，如在工作实施例中描述的那些方法确定抗体与细胞的结合。所述方法可用于检测来自个体的细胞上EphB4的表达。任选地，例如通过流式细胞术评估上皮细胞表面上EphB4的定量表达，并且染色强度与疾病易感性、进展或风险相关。
本发明还涉及检测哺乳动物对某些疾病的易感性的方法。为了说明，所述方法可用于检测哺乳动物对疾病的易感性，所述疾病基于细胞上存在的EphB4的量和/或哺乳动物中EphB4阳性细胞的数量发展。在一个实施方案中，本发明涉及检测哺乳动物对肿瘤易感性的方法。在该实施方案中，待检测的样品与EphB4或其部分的抗体在适合于结合所述抗体的条件下接触，其中所述样品包含在正常个体中表达EphB4的细胞。检测了抗体的结合和/或结合的量，其指示个体对肿瘤的易感性，其中受体的较高水平与个体对肿瘤的易感性增加相关。申请人和其它小组已经发现EphB4的表达与肿瘤生长和进展相关。本发明的抗体还可用于进一步阐明EphB4表达与个体中血管发生相关疾病进展的相关性。
可用于本公开内容的方法中的EphB4抗体的实例包括小鼠单克隆抗体47和131，其已经描述并表征于US2005/0249736中，特此以其整体引入作为参考。
小鼠单克隆抗体(Mab)47的重链的CDR区定义为SEQ ID NO：8(CDR1)、SEQ ID NO：9(CDR2)和SEQ ID NO：10(CDR3)。小鼠单克隆抗体47的轻链的CDR区定义为SEQ ID NO：11(CDR1)、SEQ ID NO：12(CDR2)和SEQ ID NO：13(CDR3)。
小鼠单克隆抗体131的重链的CDR区定义为SEQ ID NO：14(CDR1)、SEQ ID NO：15(CDR2)和SEQ ID NO：16(CDR3)。小鼠单克隆抗体131的轻链的CDR区定义为SEQ ID NO：17(CDR1)、SEQ ID NO：18(CDR2)和SEQID NO：19(CDR3)。
以下为抗体可变域和CDR的序列。小鼠单克隆抗体47(47VH)的重链，47H1(SEQ ID NO：20)、47H2(SEQ ID NO：21)、47H3(SEQ ID NO：22)、47H4(SEQ ID NO：23)和47H5(SEQ ID NO：24)。#47(47VL)的轻链，47K1(SEQ ID NO：25)、47K2(SEQ ID NO：26)、47K3(SEQ ID NO：27)和47K4(SEQ ID NO：28)。小鼠单克隆抗体131(131VH)的重链，131HV1(SEQ IDNO：29)、131HV2(SEQ ID NO：30)、131HV3(SEQ ID NO：31)、131HV4(SEQ ID NO：32)和131HV5(SEQ ID NO：33)。#131(131VL)的轻链，131KV1(SEQ ID NO：34)、131KV2(SEQ ID NO：35)、131KV3(SEQ IDNO：36)和131KV4(SEQ ID NO：37)。
IX.小分子
本申请的抑制剂也包括小分子，其可抑制具有酶功能的蛋白质的活性，和/或所述蛋白质的相互作用。本领域称作“小分子”化合物的化学剂通常为有机非肽分子，其具有低于10,000、低于5,000、低于1,000或低于500道尔顿的分子量。该类型的抑制剂包括化学合成分子，例如来自组合化学文库的化合物。可基于EphB4蛋白质的已知或推测性质合理，推理性设计或鉴定合成的化合物，或可通过筛选化合物文库进行鉴定。该类型的备选合适抑制剂是天然产物，尤其是来自生物(如植物或真菌)的次级代谢产物，其也可通过筛选化合物文库的EphB4抑制活性进行鉴定。用于产生并获得化合物的方法为本领域所熟知(Schreiber SL，Science 151：1964-1969(2000)；Radmann J.和Gunther J.，Science 151：1947-1948(2000))。
X.诊断方法
此处公开的抗体和核酸组合物用于疾病和病征，尤其是与EphB4表达相关的癌的诊断和预后评价。在疾病各阶段，组合物可用于提高诊断准确率并利于治疗决定。与用于肿瘤和癌的标准诊断方法(如计算机化断层显像(CT)扫描，其依赖于器官或***的大小或结构的改变)不同，因肿瘤抗原(如EphB4)的表达，标记抗体可检测早期阶段的异常细胞。一旦癌被诊断，准确的疾病分期在确定最合适疗法中是重要的。稍后，在手术的追踪观察过程中，肿瘤抗原的血清水平升高可在通过常规方法检测之前指出复发。这些方法可与此处所述的任何组合物一起使用。
诊断方法可使用来自患者的细胞样品(例如，血液样品、***活组织检查或组织)在体外进行，或通过体内成像进行。
在特定实施方案中，本申请提供抗体缀合物，其中本申请的抗体缀合到诊断成像剂上。包含本申请抗体的组合物可以例如通过放射免疫测定、ELISA、FACS等用于检测EphB4。一种或更多种可检测标记可附着到抗体上。示例性标记部分包括不透X射线染料、放射性造影剂、荧光分子、自旋标记分子、酶或具有诊断价值的其它标记部分，尤其是放射学或核磁共振影像技术中的标记。
根据本公开内容的放射标记抗体可用于体外诊断检测。抗体、其结合部分、探针或配体的比活性依赖于放射性标记的半衰期、同位素纯度，和所述标记怎样掺入到生物试剂中。在免疫测定实验中，比活性越高，通常灵敏度越高。用作标记的放射性同位素，例如用于诊断的放射性同位素包括碘(131I或125I)、铟(111In)、锝(99Tc)、磷(32P)、碳(14C)和氚(3H)，或上文列出的治疗同位素之一。
可向患者施用放射标记的抗体，其中所述抗体定位在携带与所述抗体反应的抗原的癌细胞中，并使用已知技术如放射性核素扫描(其使用例如γ射线照相机)或发射断层在体内检测或“成像”。参阅例如，Bradwell等，″Developments in Antibody Imaging″，Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy，Baldwin等，(编辑)，65-85页(Academic Press1985)，其特此引入作为参考。或者，正电子发射轴向体层成像扫描仪，如可以使用位于Brookhaven National Laboratory的所称作的Pet VI，其中放射性标记发射正电子(例如，11C、18F、15O和13N)。
可从本领域已知的标准部分制备荧光基团和生色团标记的生物试剂。因为抗体和其它蛋白质吸收具有高达约310nm波长的光，所以可选择荧光部分，以在高于310nm(例如高于400nm)波长处具有实质吸收。Stryer，Science，162：526(1968)和Brand等，Annual Review of Biochemistry，41：843-868(1972)描述了多种合适的荧光剂和生色团，其特此引入作为参考。可通过常规程序，如在美国专利号3,940,475、4,289,747和4,376,110(其特此引入作为参考)中公开的那些程序，用荧光生色基团标记抗体。
本申请提供检测癌的方法，所述方法包括在需要这种检测的受试者中检测所述癌细胞中EphB4的mRNA或蛋白质的差别表达。在一个示例性实施方案中，检测癌的方法包括：a)从患者中分离样品；b)使所述样品的细胞与本申请的抗体接触；c)使相同类型所述样品细胞的非癌细胞与本申请的抗体接触；和d)检测并比较所述样品细胞与非癌细胞中EphB4的表达差异。
在某些实施方案中，用于本申请中诊断用途的抗体缀合物或核酸组合物旨在在体外使用，其中所述组合物连接到第二结合配体或酶(酶标签)上，所述酶与显色底物接触后将产生有色产物。合适酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、  (辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。在某些实施方案中，第二结合配体是生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生素蛋白化合物。
在某些实施方案中，本申请的诊断方法可与其它卵巢癌诊断检测组合。
本申请还提供包含抗EphB4抗体或结合EphB4的核酸组合物的诊断试剂盒。该诊断试剂盒还包含预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书的包装组合。抗体用酶标记时，所述试剂盒将包括酶所需要的底物和辅因子。此外，可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲剂等。多种试剂的相对量可在很大程度上变化，以提供基本优化测定灵敏性的试剂溶液的浓度。尤其是，所述试剂可提供为干粉，通常是冻干的干粉，包括溶解后将提供具有合适浓度的试剂溶液的赋形剂。
在另一方面，本申请涉及用于结合、纯化、定量的免疫测定，或者通常涉及检测EphB4蛋白质成分。如下文详细说明，免疫测定在其最简单和直接意义上是结合测定。在某些实施方案中，免疫测定是本领域已知的多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也是十分有用的。然而，将容易地理解检测不限于这些技术，并且也可使用Western印迹、点印迹和狭线印迹、FACS分析等。
多种有用的免疫测定的步骤已经描述于科学文献，例如Nakamura等，Enzyme Immunoassays：Heterogeneous and Homogeneous Systems，Chapter 27(1987)中，此处引入作为参考。
通常，免疫结合方法包括获得怀疑含有蛋白质或肽(在该情况下为EphB4)的样品，并使所述样品与在有效允许免疫复合体形成的条件下与EphB4免疫反应的第一抗体接触。
免疫结合方法包括用于纯化EphB4蛋白质的方法，因为可用于从患者样品中纯化蛋白质或用于纯化重组表达的蛋白质。它们也包括用于检测或定量组织样品中EphB4的量的方法，其需要检测或定量在结合过程中形成的任何免疫复合体。
所分析的生物样品可以是怀疑含有EphB4的任何样品，如匀浆的瘤形成卵巢组织样品。所选生物样品与抗体在有效并时间足以允许初级免疫复合体形成的条件下接触通常是将抗体组合物加入样品中并将混合物温育足以使抗体与存在的任何EphB4形成免疫复合体，即结合存在的任何EphB4的一段时间。充分洗涤样品-抗体组合物以去除任何非特异性结合的抗体种类，允许初级免疫复合体中仅那些特异性结合的抗体被检测。
通常，免疫复合体形成的检测为本领域所熟知，并可通过应用多种方法来完成。这些方法基于对放射性、荧光、生物或酶标签的检测。当然，可以通过使用二级结合配体，如二级抗体或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列发现额外的优势，如本领域所知。
用于检测的抗EphB4抗体本身可缀合到可检测标记上，其中然后可以简单地检测该标记。然后可以确定组合物中初级免疫复合体的量。
或者，可通过对抗体具有结合亲和力的第二结合配体检测初级免疫复合体内结合的第一抗体。在这些情况下，第二结合配体可连接到可检测标记上。第二结合配体自身通常是抗体，其因此可称为“二级”抗体。使所述初级免疫复合体与标记的二级结合配体或抗体在有效并时间足以允许二级免疫复合体形成的条件下接触。充分洗涤二级免疫复合体以去除任何非特异性结合的经标记的二级抗体或配体，并检测二级免疫复合体中的残留标记。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一类结合测定。在一种类型的ELISA中，用于该申请诊断方法中的抗EphB4抗体固定到显示蛋白质亲和力的所选表面上，如聚苯乙烯微量滴定板的孔中。然后向孔中加入可疑的瘤形成组织样品。结合并洗涤去除非特异性结合免疫复合体后，可检测结合的EphB4。通常通过加入连接可检测标记的另一抗EphB4抗体完成检测。该类型的ELISA是简单的“夹层ELISA”。也可以通过加入第二抗EphB4抗体，然后加入对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体完成检测，所述第三抗体连接到可检测的标记上。
在另一类型的ELISA中，瘤形成卵巢组织样品固定到孔表面上，然后与用于该申请中的抗EphB4抗体接触。结合并洗涤去除非特异性结合的免疫复合体后，可检测结合的EphB4抗体。初始抗EphB4抗体连接到可检测标记上时，可直接检测免疫复合体。或者，可使用对第一抗EphB4抗体具有结合亲和力的第二抗体检测所述免疫复合体，所述第二抗体连接到可检测标记上。
不考虑所用的形式，ELISA具有某些共同特征，如包被、温育或结合、洗涤去除非特异性结合的种类，并检测结合的免疫复合体。
放射免疫测定(RIA)是一种分析技术，其依赖于抗原对抗体分子上抗原结合位点的竞争(亲和力)。从一系列样品收集的数据构建标准曲线，每一样品含有相同已知浓度的标记抗原，和多种已知浓度的未标记抗原。抗原标记有放射性核素示踪物。混合物与抗体接触温育。然后从抗体及结合到其上的抗原中分离游离的抗原。然后，通过合适的检测器，如γ或β辐射检测器确定结合的或游离的标记抗原或两者的百分比。该过程对含有多种已知浓度的未标记抗原的许多样品重复，并将结果绘制为标准曲线图。结合的示踪物抗原的百分比绘制为抗原浓度的函数。通常，随着总抗原浓度升高，结合到抗体上的示踪物抗原的相对量减少。制备了标准图后，其然后用于确定进行分析的样品中抗原的浓度。
在分析中，其中抗原浓度待确定的样品与已知量的示踪物抗原混合。示踪物抗原是已知存在于样品中的同一抗原，但其已经被合适的放射性同位素标记。具有示踪物的样品然后与抗体接触温育。然后在合适的检测器中进行计数，所述检测器对样品中残留的游离抗原计数。也同样对结合抗体或免疫吸附剂的抗原进行计数。然后，从标准曲线确定原始样品中抗原的浓度。
XI.治疗方法
在某些实施方案中，本公开内容提供抑制或降低肿瘤生长的方法和治疗患有癌，例如卵巢癌的个体的方法。这些方法包括向个体施用治疗有效量的上述一种或更多种治疗剂。这些方法特别旨在治疗性和预防性治疗动物，尤其是人。在某些实施方案中，所述癌(例如，卵巢癌)是依赖血管发生的。在其它实施方案中，所述癌(例如，卵巢癌)是不依赖血管发生的。
如此处所述，肿瘤包括个体内的肿瘤、肿瘤异种移植物或体外培养的肿瘤。具体而言，本公开内容的治疗剂用于治疗或预防任何类型(包括上皮、生殖细胞和生殖索间质的)卵巢癌。
在这些方法的某些实施方案中，可一起(同时)或在不同时间(连续)施用一种或更多种治疗剂。此外，治疗剂可与用于治疗癌或抑制血管发生的另一类型的化合物一起施用。
在某些实施方案中，可单独使用本公开内容的主题方法。或者，所述主题方法可与针对增殖疾病(例如，肿瘤)的治疗或预防的其它常规抗癌治疗方法组合使用。例如，这些方法可用于预防性癌预防中、手术后癌复发和转移的预防，并用作其它常规癌治疗的佐剂。本公开内容承认可通过使用主题治疗剂增强常规癌治疗(例如，化学治疗、放射治疗、光疗、免疫治疗和手术)的有效性。
大批常规化合物已经显示具有抗瘤形成活性。这些化合物已经用作化学治疗中的药物试剂，以使实体瘤变小、预防转移和进一步生长，或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性细胞的数量。尽管化学治疗已经有效用于治疗多种类型的恶性肿瘤，但是许多抗瘤形成化合物诱导不想要的副作用。已经显示当两种或更多种不同治疗组合时，所述治疗可协同作用并允许减少每一种治疗的剂量，由此降低更高剂量的每一种化合物引起的有害副作用。在其它情况下，难以治疗的恶性肿瘤可响应于两种或更多种不同治疗的组合治疗。
当本公开内容的治疗剂与另一常规抗瘤形成剂组合同时或顺序施用时，此类治疗剂显示增强抗瘤形成剂的治疗效果或克服对抗瘤形成剂的细胞抵抗力。这允许降低抗瘤形成剂的剂量，由此减少不想要的副作用，或在抗性细胞中恢复抗瘤形成剂的功效。
可用于组合抗肿瘤治疗的药物化合物包括，仅为了说明：氨鲁米特、胺苯吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、碳铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯屈膦酸二钠、秋水仙素、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、己二烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、阿霉素、表柔比星、***、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟***、氟利坦、吉西他滨、染料木黄酮、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、ironotecan、来曲唑、亚叶酸、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、罗氮芥、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巯嘌呤、美司钠、甲氨喋呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、洛可达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥希玛、链脲霉素、苏拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替哌、二氯环戊二烯钛、拓扑替康、司徒曼布、维a酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春烯碱。
可通过它们的作用机制将这些化学治疗抗肿瘤化合物分为例如以下组：抗代谢产物/抗癌剂，如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝***试剂，包括天然产物，如长春花生物碱类(长春碱、长春新碱和长春烯碱)、微管破坏剂如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春碱、洛可达唑、埃坡霉素和诺维本，epidipodophyllotoxins(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA破坏剂(放线菌素、胺苯吖啶、蒽环类、博来霉素、白消安、喜树碱、碳铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、表柔比星、六甲密胺、奥沙利铂、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉酚、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、阿霉素(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其***地引起L-天冬酰胺代谢并去除不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝***烷化剂，如氮芥(氮芥、环磷酰胺和类似物、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥)、氮丙啶和甲基蜜胺类(六甲密胺和塞替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲类(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲霉素)  、trazenes-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝***抗代谢物，如叶酸类似物(氨甲喋呤)；铂配位络合物(顺铂、碳铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(***、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和凝血酶的其它抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活物、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹啶、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抑制分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯)；抗血管生成化合物(TNP-470，染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张肽受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(司徒曼布)；细胞周期抑制剂和分化诱导物(维a酸)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(阿霉素(阿霉素)、胺苯吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、***、氢化可的松、甲基强的松龙、强的松和强的松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导物和胱天蛋白酶激活剂；和染色质破坏剂。
在某些实施方案中，可用于组合抗血管发生治疗的药物化合物包括：(1)“生血管分子”释放的抑制剂，如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)；(2)生血管分子的中和剂，如抗βbFGF抗体；和(3)上皮细胞响应生血管刺激物的抑制剂，包括胶原酶抑制剂、基底膜更新抑制剂、血管生成抑制类固醇、真菌来源的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物，如D-青霉胺和硫代苹果酸金、维生素D3类似物、α干扰素等。对于额外提出的血管发生抑制剂，参阅Blood等，Bioch.Biophys.Acta.，1032：89-118(1990)，Moses等，Science，248：1408-1410(1990)，Ingber等，Lab.Invest.，59：44-51(1988)，和美国专利号5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352和6573256。此外，具有可用于抑制血管发生的多种化合物，例如，阻断VEGF介导的血管发生途径的肽和试剂、内皮抑制素蛋白和衍生物、制管张素的赖氨酸结合片段、黑色素和黑色素促进化合物、纤溶酶原片段(例如，纤溶酶原的Kringles 1-3)、tropoin亚基、玻连蛋白αvβ3的拮抗剂、来自Saposin B的肽、抗生素和类似物(例如，四环素和新霉素)、含双烯孕腈的组合物、包含偶联肽的MetAP-2抑制性核心的化合物、化合物EM-138、查耳酮及其类似物和naaladase抑制剂。参阅，例如，美国专利号6,395,718、6,462,075、6,465,431、6,475,784、6,482,802、6,482,810、6,500,431、6,500,924、6,518,298、6,521,439、6,525,019、6,538,103、6,544,758、6,544,947、6,548,477、6,559,126和6,569,845。
在某些实施方案中，本申请的方法可与卵巢癌的已知治疗组合。在某些实施方案中，所述已知治疗可包括手术、放射治疗和/或化学治疗。在某些实施方案中，用于治疗卵巢癌的化学治疗化合物是铂化学治疗剂，如顺铂或碳铂。本领域普通技术人员将能够确定目前已知用于卵巢癌的治疗方案。
根据组合治疗的性质，可在施用其它治疗的同时和/或之后继续施用本公开内容的治疗剂。可以单次剂量或多次剂量进行治疗剂的施用。在一些情况下，在常规治疗之前至少若干天开始施用治疗剂，而在其它情况下，在施用常规治疗之前或在施用常规治疗时开始施用。
XII.施用方法和药物组合物
在某些实施方案中，用药学上可接受的载体配制本公开内容的主题组合物。这种治疗剂可单独或作为药物制剂(组合物)的成分施用。可配制所述化合物以用于人或兽医学的任何便利方式施用。湿润剂、乳化剂和润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、增甜剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于所述组合物中。
主题试剂的配制包括适合于口腔/鼻、局部、肠胃外、直肠和/或***内施用的那些制剂。所述制剂可方便地以单位剂量形式呈现并可通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量将根据所治疗的宿主、具体施用方式变化。可与载体材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量通常是产生治疗效应的化合物的量。
在某些实施方案中，制备这些制剂或组合物的方法包括组合另一类型的抗肿瘤或抗血管发生治疗剂和载体，和任选地一种或更多种辅助成分。通常，可用液体载体，或细分的固体载体，或者液体载体和细分的固体载体制备所述制剂，然后如果需要使所述产品成型。
用于口服施用的制剂可以是胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用香味主药，通常是蔗糖和***胶或西黄蓍胶)、粉剂、粒剂，或是水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液、或是水包油或油包水液体乳剂，或是酏剂或糖浆剂，或是软锭剂(使用惰性主药，如明胶和甘油，或蔗糖和***胶)和/或是口洗剂等，每一种含有预定量的主题治疗剂作为活性成分。
在用于口服施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、锭剂、粉剂、粒剂等)中，本公开内容的一种或更多种治疗剂可与一种或更多种药学上可接受的载体混和，所述载体如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任一种：(1)填充剂或膨胀剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇，和/或硅酸；(2)粘合剂，如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或***胶；(3)湿润剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐，和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收加速剂，如季胺类化合物；(7)湿润剂，如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和皂土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、硫酸月桂酯钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物也可包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可用作软填充明胶胶囊和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用赋形剂，如乳糖或乳糖，以及高分子量聚乙二醇等。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分，所述液体剂型可含有常用于本领域的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(具体而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混和物。除了惰性稀释剂，口服组合物还可包括佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、增甜剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。
除活性化合物，悬浮液可含有悬浮剂，如乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、维晶纤维素、aluminum metahydroxide、皂土、琼脂-琼脂和西黄蓍胶，及其混合物。
具体而言，本公开内容的方法可向皮肤或粘膜(如宫颈和***上的那些粘膜)局部施用。这为向肿瘤直接递送提供了最大可能性，而且诱导副作用的机会最低。所述局部制剂可进一步包括一种或更多种试剂，其称作有效的皮肤或角质层穿透促进剂。这些的实例是2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲基亚砜和氮酮(azone)。还包括额外的试剂，以制备化妆品可接受的制剂。这些的实例是脂肪、蜡、油、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。还可包括角质层分离剂，如本领域已知的那些分离剂。实例是水杨酸和硫磺。
用于局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。主题试剂可在无菌条件下与药学上可接受的载体、任何防腐剂、缓冲剂或可能需要的推进剂混和。所述软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂除含有主题组合物外，还可含有赋形剂，如动物油和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。
粉剂和喷雾剂除主题治疗剂外，还可含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉剂，或这些物质的混合物。喷雾剂可额外含有惯用推进剂，如氯氟烃和挥发性未取代烃，如丁烷和丙烷。
适合于肠胃外施用的药物组合物可包含一种或更多种治疗剂与一种或更多种药学上可接受无菌等渗水溶液或非水溶液、分散剂、混悬剂或乳剂，或无菌粉剂(其在使用前可重构成无菌可注射溶液或分散液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期受体的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂)的组合。可用于本公开内容的药物组合物中的合适的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适混合物、植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如使用包衣材料，如卵磷脂，通过在分散液情况下维持所需颗粒大小，并通过使用表面活性剂维持合适的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等确保防止微生物的活动。也期望组合物中包括等渗剂，如蔗糖、氯化钠等。此外，通过包括延迟吸附的试剂，如单硬脂酸铝和明胶引起可注射药物形式的延长吸收。
可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯中形成一种或更多种治疗剂的微胶囊基质来制备可注射贮库制剂形式。根据药物与聚合物的比例，和所用特定聚合物的性质，可控制药物释放的比例。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚酐。也可通过将药物包在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备贮库可注射制剂。
***内或直肠施用的制剂可呈现为栓剂，其可通过将本公开内容的一种或更多种化合物与一种或更多种合适的非刺激性赋形剂或载体(其包含，例如，可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯)混合来制备，并且其在室温下为固体，但在体温下为液体，并因此将在直肠或***腔内熔化并释放活性化合物。
用于递送主题核酸化合物的方法为本领域所知(参阅，例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.，2，139；和Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics，编辑Akhtar，1995；Sullivan等，PCT申请号WO 94/02595)。可利用这些方案来递送实际上任何的核酸化合物。核酸化合物可通过多种本领域熟悉的那些方法向细胞施用，所述方法包括，但不限于，脂质体内的胶囊化，通过离子电渗疗法，或通过掺入到其它载体中，如水凝胶、环糊精、生物可降解毫微粒和生物黏附微球体。或者，通过直接注射或通过输注泵局部递送核酸/载体组合。其它递送途径包括，但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience，76，1153-1158)。其它方法包括使用多种运输和载体***，例如通过使用缀合物和生物可降解的聚合物。对于药物递送策略的详细综述，参阅Ho等，1999，Curr.Opin.Mol.Ther.，1，336-343和Jain，Drug Delivery Systems：Technologies and Commercial Opportunities，Decision Resources，1998和Groothuis等，1997，J.Neuro Virol.，3，387-400。核酸递送和施用的更详细描述提供于Sullivan等，上文，Draper等，PCT WO93/23569，Beigelman等，PCT公开号WO99/05094，和Klimuk等，PCT公开号WO99/04819。
在某些实施方案中，本公开内容的核酸用药学上可接受的试剂来配制，所述药学上可接受的试剂允许本公开内容的核酸化合物有效分配到最适合它们想要的活性的物理位置中。这种药学上可接受试剂的非限制性实例包括：PEG、磷脂类、硫代磷酸酯、可促进药物进入多种组织的P-糖蛋白抑制剂(如Pluronic P85)、生物可降解聚合物，如用于移植后持续释放递送的聚(DL-丙交酯-共聚乙交酯)微球体(Emerich，DF等，1999，CellTransplant，8，47-58)，和装载的毫微粒，如由聚丁基氰基丙烯酸酯制成的那些，其可递送药物穿过血脑屏障并可改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。
在其它实施方案中，本公开内容的某些核酸化合物可在细胞中从真核启动子进行表达(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83，399；Scanlon等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.，2，3-15；Dropulic等，1992，J.Virol.，66，1432-41；Weerasinghe等，1991，J.Virol.，65，5531-4；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10802-6；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9；Sarver等，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等，1995，Nucleic AcidsRes.，23，2259；Good等，1997，Gene Therapy，4，45)。本领域的技术人员了解任何核酸可在真核细胞中从适当的DNA/RNA载体进行表达。这些核酸的活性可通过酶核酸从原始转录物释放得以增强(Draper等，PCT WO93/23569，和Sullivan等，PCT WO 94/02595；Ohkawa等，1992，NucleicAcids Symp.Ser.，27，15-6；Taira等，1991，Nucleic Acids Res.，19，5125-30；Ventura等，1993，Nucleic Acids Res.，21，3249-55；Chowrira等，1994，J.Biol.Chem.，269，25856；所有这些参考文献此处以其整体引入作为参考)。Blesch等，2000，Drug News Perspect.，13，269-280；Peterson等，2000，Cent.Nerv.Syst.Dis.，485-508；Peel和Klein，2000，J.Neurosci.Methods，98，95-1 04；Hagihara等，2000，Gene Ther.，7，759-763；和Herrlinger等，2000，Methods Mol.Med.，35，287-312描述了对CNS特异的基因治疗方法。Kaplitt等，美国专利号6,180,613还描述了核酸向神经***细胞的AAV介导的递送。
在本公开内容的另一方面，本公开内容的RNA分子优选从***DNA或RNA载体中的转录单位表达(参阅例如Couture等，1996，TIG.，12，510)。重组载体优选为DNA质粒或病毒载体。可基于，但不限于腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒或α病毒构建核酶表达病毒载体。优选地，能够表达所述核酸化合物的重组载体如上述进行递送，并维持在靶细胞中。或者，可使用病毒载体，其提供核酸化合物的瞬时表达。如需要可重复施用这种载体。一旦表达，所述核酸化合物结合靶mRNA。核酸化合物表达载体的递送可以是全身的，如通过静脉内或肌内施用，通过向从患者外植的靶细胞施用，然后再引入所述患者中，或通过允许引入想要的靶细胞的任何其它方式(对于综述参阅Couture等，1996，TIG.，12，510)。
在一方面，本公开内容涵盖了表达载体，所述表达载体包含编码本公开内容至少一种核酸化合物的核酸序列。所述核酸序列以允许本公开内容的核酸化合物表达的方式有效连接。例如，本公开内容描述了表达载体，其包含：a)转录起始区(例如，真核pol I、II或III起始区)；b)转录终止区(例如，真核pol I、II或III终止区)；c)编码本公开内容的至少一种核酸催化剂的核酸序列；并且其中所述序列以允许所述核酸化合物表达和/或递送的方式有效连接到所述起始区和所述终止区上。所述载体可任选地包括在编码本公开内容的核酸催化剂的序列5′端或3′端上有效连接的蛋白质的可读框(ORF)；和/或内含子(间插序列)。
实施例
现已将本发明进行了一般性描述，通过参考下面的实施例将更易于理解本发明，包含以下实施例的目的仅在于阐明本发明的某些方面和实施方案，且不旨在限制该发明。
实施例1.人卵巢肿瘤样品中EphB4的表达
通过对分离自7个正常卵巢和85个侵入性上皮卵巢癌的切片进行免疫组织化学染色来评估人卵巢样品中EphB4的表达(图1A)。所有正常卵巢在上皮组织表面具有少量或不具有EphB4表达(图1Ab)。在侵入性卵巢癌中，73份(86％)表达EphB4并且在49份(58％)样品中观察到中等或强表达。我们在可用于获得冷冻组织的10份卵巢肿瘤样品的选择组中通过Western印迹来确定EphB4的表达。在Western印迹中10份肿瘤样本中的七份表达EphB4(结果未显示)，验证了染色数据。
实施例2.EphB4的表达与临床病理学特征相关
患有侵入性卵巢癌的患者的人口统计特征概述于图1B中。目前的平均年龄是59.4岁(范围为34-86)。85位患者中的69位(81％)患有晚期(III或IV期)疾病，并且85位患者中的74位(87％)患有高等级(II或III期)疾病。85位患者中的56位(66％)进行了最佳手术细胞减少术(在手术完成后残留疾病＜1cm)。在EphB4的表达和组织学亚类、肿瘤等级或细胞减少的程度之间不存在相关性。
EphB4的过表达与疾病晚期阶段相关。相比于早期卵巢癌中19％的比例，在69％的晚期卵巢癌中检测到了EphB4的高表达(p＜0.001)。相比于不具有EphB4过表达的患者中49％的比例，百分之九十具有EphB4过表达的患者具有腹水(p＜0.001)。使用Kaplan-Meier方法确定具有侵入性卵巢癌和EphB4表达的患者的存活率(图1C)。在单变量分析中，相比于低表达，EphB4过表达与显著更低的存活相关(生存中值7.75年相对于2.58年；p＜0.001)。在使用包括EphB4表达、阶段、级别、腹水、组织学和细胞减少水平在内的Cox比例危险率模型的多重回归分析中，仅有晚期(p＝0.04)和EphB4过表达(p＝0.003)和最适度之下的细胞减少(P＝0.017)是低存活的重要预测因子。
实施例3.EphB4受体在卵巢癌细胞系中高水平表达
为了研究EphB4的生物学作用，我们希望确定卵巢癌细胞系相比于良性卵巢肿瘤细胞系中的EphB4表达水平。Western印迹显示EphB4的确在卵巢癌细胞系Hey、CAOV-3、Hoc-7和OVCAR-3中高度表达，并且在良性卵巢细胞系MCV-50和ML-5中表达最低(图2A)。与其它卵巢细胞系相比，Hoc-7表达高水平的EphB4。在包括良性卵巢细胞系(ML-5)在内的所有卵巢细胞系中EphrinB2以可忽略不计的水平至低表达水平。通过探测β-肌动蛋白的相同印迹来验证每一泳道中装载的等量蛋白质(图2A)。在卵巢癌细胞系中表达的EphB4是有功能的。用3μg/ml EphrinB2/Fc嵌合蛋白(无血清)而非Fc片段单独刺激Hey细胞，导致在十分钟内EphB4的磷酸化，其在60分钟时开始减少(图2B)。并且，向血清饥饿的Hey细胞中添加胎牛血清诱导了高于基线的轻度EphB4磷酸化。
实施例4.孕酮诱导EphB4表达和细胞生长
已知月经激素调节卵巢肿瘤发育和进展(Danforth等，2006)。具体而言，在先前的几个报道中孕酮是生长抑制的(Seeger，2006)。因此我们对孕酮和***是否影响EphB4的表达感兴趣。Hoc-7细胞表达功能性孕酮和***受体。用孕酮处理Hoc-7细胞导致EphB4表达的剂量依赖性降低，然而***对EphB4水平无影响(图2C)。在良性MCV-50细胞中两种激素对EphB4表达均无影响(图2C及数据未显示)。孕酮而非***同样也在Hey细胞中抑制EphB4表达(数据未显示)。用孕酮处理的Hoc-7和Hey细胞在细胞存活上显示剂量依赖性降低。10μM孕酮在Hoc-7细胞中导致细胞存活近50％下降(图2D)。
实施例5.EphB4的抑制导致活力下降
为了测定EphB4在卵巢癌中的生物学功能，我们设计了几种siRNA来敲低(knockdown)EphB4表达并选择在Western印迹中最能抑制EphB4表达的化合物(图3A上图)。EphB4 siRNA也导致Hoc-7细胞中EphB4表达水平相应的剂量依赖性下降(数据未显示)。用在三个碱基上突变了的EphB4 siRNA(EphB4 siRNAΔ)或非特异性GFP siRNA进行转染对EphB4的表达水平无影响(数据未显示)，说明EphB4表达的降低是EphB4siRNA的特异效果。伴随EphB4表达水平的下降，EphB4 siRNA处理而非用突变的EphB4 siRNAΔ处理导致Hey细胞数目上的剂量依赖性下降。在25nM siRNA的剂量下，近90％的细胞数目下降(图3A，下图)。实现50％细胞数目下降的siRNA剂量为4nM。类似地，用25nM EphB4siRNA处理HOC-7细胞导致75％细胞数目下降(数据未显示)。用EphB4 siRNA处理EphB4阴性肿瘤细胞系未影响肿瘤细胞数目(Xia等，2005和数据未显示)。
为了在体内使用，我们生成一组EphB4反义寡核苷酸并选择EphB4水平具有最大降低的AS-10分子用于进一步研究(图3B，上图)。类似地，用10μM AS-10而非乱序ODN处理导致细胞数目下降90％，ED50为4μM(图3B，下图)。
实施例6.EphB4敲低导致程序性细胞死亡和死亡受体胱天蛋白酶途径的激活
我们对确定EphB4敲低后细胞数目下降的原因感兴趣。Hey细胞在用25nM EphB4 siRNA转染并在36小时之后，用于细胞周期分析(图3C)。然而90％的对照细胞和88％的EphB4 siRNAΔ转染的细胞进入G0期并沿着细胞周期前进，仅48％的EphB4 siRNA处理的细胞进入到细胞周期的时期中。
阻止细胞进入细胞周期的G0期与诱导程序性细胞死亡是一致的。为了进一步确认这一点，我们在转染EphB4 siRNA之后48小时通过ELISA在Hey细胞中对细胞质核小体进行定量(图3D)。用25nM EphB4 siRNA转染导致细胞质核小体增加三倍，而用EphB4 siRNAΔ转染无影响。可通过涉及胱天蛋白酶-8的外部膜起源途径或不涉及胱天蛋白酶-8的内部线粒体途径的激活诱导程序性细胞死亡。用25nM EphB4 siRNA转染Hey细胞导致胱天蛋白酶-8 3.2倍的激活，而用EphB4 siRNAΔ转染未观察到这种效果(图3E)。激活或突变的siRNA都不能导致可观察到的胱天蛋白酶-9的激活。EphB4反义寡核苷酸诱导相似的细胞周期模式和胱天蛋白酶-8激活(数据未显示)。因此，由于诱导程序性细胞死亡，Hey细胞中EphB4的敲低主要经外部胱天蛋白酶-8途径导致细胞死亡。
实施例7.EphB4调节细胞迁移和侵入
与良性细胞系相比恶性细胞系中更高水平的EphB4表达揭示更高的EphB4水平通过增加细胞迁移和细胞外基质蛋白质的侵入导致更恶性的行为。因此我们测定EphB4是否参与卵巢细胞系的迁移。在更短的时间周期(9-12h)上进行这些实验，在这些时间未观察到可观测到的细胞死亡。通过用无菌的塑料巴斯德吸管单次刮取使融合的Hey培养物受伤，其留下了具有清晰确定边界的3mm无细胞区域。9小时后评估并定量细胞在EphB4siRNA和EphB4 AS-10的存在下至清晰区域的迁移。对照细胞和EphB4siRNAΔ转染的细胞迅速地迁移以覆盖伤口，导致9小时内几乎完全的创伤愈合，然而，25nM EphB4 siRNA的转染导致细胞迁移的显著抑制并在6小时和9小时的创伤愈合(图4A)。用AS-10观察到细胞迁移类似的减少(数据未显示)。
恶性细胞能够降解细胞外基质和通过组织侵入。为了研究该功能，在外室存在10μg EGF的情况下，将Hey细胞在Boyden双室的内室上包被的基质胶上培养12小时。将迁移至内室下表面的细胞染色并在12小时后显影。在12小时内对照细胞迅速地迁移至膜下表面(图4B)。然而用EphB4siRNAΔ转染对细胞侵入无影响，EphB4 siRNA几乎完全地去除经过基膜的细胞迁移。用AS-10观察到相似的效果(数据未显示)。因此，EphB4赋予卵巢癌细胞迁移并侵入基膜的能力，该能力为侵袭性恶性肿瘤的已知特征。
实施例8.EphB4反义ODN抑制体内肿瘤生长
随后我们在携带人卵巢癌异种移植物的小鼠中研究了全身性反义给药的效果。将2×106个Hey细胞注射到十至十二周龄雌性Balb/C裸鼠的胁腹。在细胞植入后第四天，随机将小鼠分为三组(每组n＝6只小鼠，实验重复两次)并用PBS(载体)、乱序ODN或AS-10按10mg/kg的剂量通过腹膜内注射来处理小鼠。五周后，与载体处理的肿瘤相比，AS-10处理导致超过85％的更小的肿瘤，而乱序ODN处理无效果(图4A)。在整个时间周期内小鼠表现为健康状态，饲喂良好并活跃。处死时三组间的TNF-α和IL-10的血清水平和脾脏重量相近，说明ODNs未诱导炎性细胞因子(数据未显示)。通过H/E评估所获的肿瘤(图4B，上图)，其显示在AS-10处理的肿瘤中大面积的肿瘤坏死。用Ki-67染色进行的免疫组织化学评估显示出与体外发现的程序性细胞死亡诱导相一致的增殖细胞10倍的下降(图4B，第二图)和TUNEL阳性细胞12倍的增加(图4B，第三图)。最后，AS-10处理导致通过CD31免疫染色显示75％更少的肿瘤微血管(图4B，下图)。因此，在小鼠中AS-10的全身性施用抑制Hey肿瘤的生长，伴随肿瘤细胞增殖的抑制、程序性细胞死亡的诱导和肿瘤微血管的减少。
实施例9.MAB265的测序
使用来自Novagen的小鼠Ig引物对通过PCR获得MAB265杂交瘤克隆的可变重链及轻链。可变重链与种系J558.19为98.9％同一。种系序列与可变轻链和N末端序列(SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40)的比对示于图6中。种系序列和可变重链(SEQ ID NO：42)的比对示于图7中。根据Kabat等，1991鉴定CDR。
将小鼠单克隆抗体265重链的CDR区域定义为SEQ ID NO：261(CDR1)、SEQ ID NO：262(CDR2)和SEQ ID NO：263(CDR3)。将小鼠单克隆抗体265的轻链的CDR区域定义为SEQ ID NO：264(CDR1)、SEQ IDNO：265(CDR2)和SEQ ID NO：266(CDR3)。
实施例10.EphB4单克隆抗体对血管发生和肿瘤生长的影响
在小鼠中针对EphB4的胞外域(ECD)产生抗EphB4单克隆抗体。将EphB4ECD(例如见图8)克隆到表达载体(例如pGEX)中产生EphB4ECD融合蛋白(例如GST-ECD)。通过亲和层析纯化表达于大肠杆菌(E.coli)BL21中的EphB4ECD融合蛋白。在GST融合蛋白的情况下，利用凝血酶将GST结构域切掉。利用A蛋白层析从杂交瘤上清液中纯化单克隆抗体。
这些单克隆抗体包括EphB4抗体No.1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138(图8)。抗体作图研究显示了这些抗体的每一抗体的表位结构域(图8)。
进行进一步实验，以分析这些抗体的功能活性，包括它们与其结合配偶体如Ephrin B2竞争的能力、激活EphB4酪氨酸磷酸化的能力、抑制HUAEC中体外血管形成的能力、通过基质胶填料测定抑制体内血管发生的能力、在SCC15肿瘤细胞中刺激程序性细胞死亡或坏死的能力和抑制SCC15异种移植物生长的能力。这些结果概述于下文的表3中。
表3.EphB4抗体活性概述
Figure G20088001509760751
Figure G20088001509760761
Nd＝未测定(未提供数据)
--＝无明显效果
+＝效果明显
A＝程序性细胞死亡
N＝坏死
A，N＝程序性细胞死亡和坏死
实施例11材料和方法
试剂：EphrinB2(P20)抗体购自Santa Cruz Biotech(Santa Cruz，CA)。抗磷酸酪氨酸抗体4G10购自Upstate(Lake Placid，NY)，抗肌动蛋白单克隆抗体购自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)，抗CD31(M20)购自SantaCruz Biotech(Santa Cruz，CA)，抗Ki-67单克隆抗体购自DAKO(Carpentaria，CA)，及抗人Fc购自Jackson Labs(Bar Harbor，ME)。EphrinB2/Fc嵌合蛋白购自R&D systems，Inc.(Minneapolis，MN)。所有反义ODN和siRNA从Qiagen(Valencia，CA)合成。
在Vasgene室内生成针对EphB4胞外域的单克隆抗体(三个不同克隆命名为MAb131、MAb 47和MAb265)。这些抗体已在内部被充分表征并对EphB4受体的细胞外结构域极其敏感和特异。它们不与Eph受体家族的其它成员交叉反应(数据未显示)。MAb265仅在Western印迹中检测到变性的人EphB4；MAb131在组织切片中检测到人EphB4；而MAb47检测到人和小鼠EphB4并且在免疫沉淀实验中非常有效。
细胞培养：ML5和ML10细胞来自人卵巢囊腺瘤并转染有SV40大T抗原以增加其体外存活期。MCV 50细胞来自在培养过程中自发无限增殖化的ML10的亚克隆。HOC-7卵巢癌细胞获自多伦多大学的R Buick博士。OVCAR-3细胞购自ATCC(ATCC#HTB161)。ML5、ML10和MCV50在添加有10％FCS、1mM谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的MEM培养基中培养。HOC-7和OVCAR-3细胞维持在添加有10％FCS、1mM谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素的RPMI培养基中。Hey和CAOV-3细胞在含有10％FCS、1mM谷氨酰胺、1mM MEM丙酮酸钠和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。
EphB4 siRNAs和反义寡脱氧核苷酸：合成EphB4特异的siRNA和硫代磷酸酯修饰的反义或乱序寡脱氧核苷酸(ODN)(Qiagen，Valencia，CA)并检测EphB4表达的特异性抑制。EphB4特异的siRNA对应于序列5’-GGU GAA UGU CAA GAC GCU GUU-3’(SEQ ID NO：1)和3’-UUCCAC UUA CAG UUC UGC GAC-5’(SEQ ID NO：2)。在三个位点上突变特异siRNA以产生siRNAΔ：5’-AGU UAA UAU CAA GAC GCU GUU-3’(SEQ ID NO：3)和3’-UUU CAA UUA UAG UUC UGC GAC-5’(SEQ IDNO：4)，其对EphB4水平无影响并用作对照。将针对GFP的siRNA用作额外的阴性对照。使用的AS-ODN、AS-10横跨1980-1999位核苷酸，具有序列5’-ATG GAG GCC TCG CTC AGA AA-3’(SEQ ID NO：5)。为了否定来自CpG位点的非特异细胞因子介导的效应，在不损失EphB4敲低效应的情况下将11位处的胞嘧啶甲基化(AS-10M)(数据未显示)。还使用在含有CpG位点的随机序列中具有相同核苷酸的乱序ODN(序列5’-AAG GGC TAG GAT AGA CCC TC-3’(SEQ ID NO：6))作为对照。
免疫组织化学：按照Institutional Review Board for the Protection ofHuman Subjects的要求采集所有人类样品。将甲醛固定、石蜡包埋的样品切成5μm切片。用抗原回收缓冲液处理切片(具有DIVA decloaker的改良后柠檬酸盐缓冲液，BioCare Medical，Concord，CA)。室温下过夜应用1％BSA/TBST中浓度为30μg/ml的特异性一级单克隆EphB4抗体MAb131。使用标准技术进行免疫染色(如需要可提供细节)。
所有样品经对患者临床结果未知的董事会认证的病理学家检查。通过评估染色肿瘤细胞的百分比和染色强度来测定EphB4表达。阳性细胞的百分比按如下记分：0分，0-5％；2分，6-50％；3分，＞50％。染色强度按如下记分：1分，低强度；2分，中等强度；3分，高强度。添加表达点和阳性细胞的百分比并分配介于0至6分的总分。将肿瘤分类为四组：阴性(总分＝0)；弱表达(总分＝1-2)；中等表达(总分＝3-4)；及强表达(总分＝5-6)。对于异种移植物染色，将一级抗体与切片4℃过夜温育(CD31 1∶250稀释度，Ki-67 1∶1000)。常规阴性对照包括去除一级和二级抗体和用一级抗体替换正常IgG同位素。当使用小鼠抗人Ki-67抗体时，使用MOM试剂盒(Vector Labs，Burlingame，CA)来封闭对小鼠组织的非特异性结合。通过不知情观测者在五个随机高倍视野中观察对染色阳性的细胞数目计数。
Western印迹：按描述来制备细胞裂解物(Masood等，2003)。通常，将来自总细胞裂解物的10μg蛋白质在4-20％的tris甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，电转移至PVDF膜上并用一级抗体过夜探测。将印迹用RestoreTM Western Blot脱色缓冲液(Pierce，Rockford IL)脱去并用β肌动蛋白重新探测来确认等量上样和蛋白质转移。信号用SuperSignal WestFemto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce)检测，使用Fluro-Smulti-Imager***(Bio-Rad)通过X射线光密度法进行定量。
EphB4的磷酸化分析：使用抗Fc抗体在4℃将重组EphrinB2/Fc或Fc蛋白质聚集1小时。Hey和Hoc-7细胞在60mm盘中生长至100％汇合并用聚集的EphrinB2/Fc或Fc(Bar Harbor，ME)处理不同时长。用含20mM Tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl、1％(v/v)Triton-X100、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM钒酸钠的缓冲液制备裂解物并在4℃ 50,000xg离心60分钟。澄清的蛋白质样品与偶联预包被抗EphB4单克隆抗体(#47)的蛋白质A/G偶联的琼脂糖小珠过夜温育。用抗p-Tyr特异性抗体4G10来探测免疫沉淀(IP)复合体。通过用EphB4特异性单克隆抗体(#265)探测来检测EphB4沉淀效率。
创伤愈合迁移测定：将Hey细胞接种至6孔平板中并培养至汇合。如描述将EphB4反义或乱序ODN(1μM)或siRNA引入孔内用于活力测定。通过用无菌吸头刮擦使细胞单层受到创伤。检查细胞随时间向刮擦区的迁移并用Nikon Coolpix 5000数码照相机进行记录。
细胞迁移测定：使用改良后Boyden室来评估卵巢细胞的趋化性，所述Boyden室含有细胞培养inserts，在24孔板(BD Biosciences)上具有8μm孔径基质胶包被的聚碳酸酯膜。将200μl DMEM/1％FCS中的Hey的细胞悬浮液(2×105细胞/ml)在siRNA引入之后或伴随EphB4 AS-10接种至上层室中。向下层室中加入500μl含有趋化剂EFG(20ng/ml)的DMEM/1％FCS。37℃温育9小时后，用拭子刮去滤器上表面，将滤器固定并用Diff Quick(vWR，West Chester，PA)染色。
细胞活力测定：在200μl培养基中将Hey和Hoc-7细胞以约1×104细胞/孔的密度接种至48孔平板上。用多个浓度(1-10μM)的EphB4 AS-10或乱序ODN在细胞接种后第1天和第3天处理细胞。三天后，更换培养基并加入新鲜ODN。如之前描述通过MTT评估细胞活力(Masood等，2003)。使用2μl LipofectamineTM 2000按照生产商说明书将EphB4 siRNA(10-100nM)引入48孔板至2×104细胞/孔。转染后四小时将细胞返回至生长培养基。在48小时后如描述测定活力(Masood等，2003)。
细胞周期分析：使用LipofectamineTM 2000用多种siRNA(100nM)转染6孔板上Hey细胞的80％汇合培养物不同时间量，将细胞用胰蛋白酶处理、在PBS中洗涤并在4℃下1ml含50μg/ml碘化丙锭、0.1％柠檬酸钠、0.1 Triton X-100和20μg/ml无DNA酶的RNA酶A的低渗溶液中温育1小时。用流式细胞仪在线性模式下分析细胞。结果以在细胞周期不同时期内检测到的元素百分比来表示，所述时期即Sub G0峰(程序性细胞死亡)、G0/G1(无DNA合成)、S(活跃的DNA合成)、G2(前有丝***)和M(有丝***)。
程序性细胞死亡测定：使用检测细胞质核小体的Cell Death DetectionELISA plus试剂盒按照生产商说明书(Roche，Piscataway，NJ)研究程序性细胞死亡。简述之，使用LipofectamineTM 2000用多个浓度(0-100nM)的EphB4 siRNA(472)或GFP siRNA转染24孔板中培养至80％汇合的细胞。16小时后，裂解细胞并将核沉淀，用抗组蛋白生物素和抗DNA POD在链霉抗生素蛋白包被的96孔板中温育。用ABST显色并在酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上在405nm处读取吸光度。使用监测胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9肽底物切割的胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9比色测定试剂盒(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)来测定胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的活性。使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche，Piscataway，NJ)，根据生产商说明书通过TUNEL测定法来检测动物肿瘤的脱石蜡切片中的程序性细胞死亡。
鼠类肿瘤异种移植模型：将Hey细胞培养、通过胰蛋白酶消化收集并在无血清培养基中重悬浮。将2×106个细胞注射到十至十二周龄雌性Balb/C裸鼠的胁腹。一周三次测量肿瘤生长并且估计体积为0.52 Xa X b2，其中a和b为可触及肿瘤的最大和最小长度。在细胞植入后的第四天，计算肿瘤体积以确保大小一致并将动物随机分为三组(每组n＝6只小鼠)。每日通过腹膜内(i.p.)注射剂量为10mg/kg的AS-10或乱序ODN或仅仅载体(无菌生理盐水，pH 7.4)向每一组施用。四周后处死动物并收集肿瘤和正常器官。将一部分肿瘤在***中固定用于石蜡包埋和组织学分析。混合每组中剩余的肿瘤组织和器官并提取蛋白质。所有操作经我们动物实验管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准并按照AnimalWelfare Act规程进行。
统计学分析。使用SPSS(SPSS Inc.，Chicago，IL)用卡方检验来确定不同变量间的差异。用Kaplan-Meier方法生成存活曲线并与log-rank统计学进行比较。Cox比例危险率模型用于多变量分析。使用斯氏t检验来比较肿瘤体积。将p值＜0.05认为是统计学显著的。
引用作为参考
此处提及的所有出版物和专利因此以其整体引入作为参考，就如同每一单个出版物或专利被明确和单独地说明被引用作为参考一样。
尽管已讨论了本发明的具体实施方案，但是上文中的说明书用于说明而非限制。根据该说明书及下文的权利要求，本发明的许多变型对本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明的全部范围应参考权利要求、以及它们的等同范围和说明书、以及此类变型而定。
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序列
GGU GAA UGU CAA GAC GCU GUU-3’(SEQ ID NO：1)
UUC CAC UUA CAG UUC UGC GAC-5’(SEQ ID NO：2)
AGU UAA UAU CAA GAC GCU GUU-3’(SEQ ID NO：3)
UUU CAA UUA UAG UUC UGC GAC-5’(SEQ ID NO：4)
ATG GAG GCC TCG CTC AGA AA-3’(SEQ ID NO：5)
AAG GGC TAG GAT AGA CCC TC-3’(SEQ ID NO：6)
人EphB4(Genbank ID No.NP_004435)(SEQ ID NO：7)
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRT
YEVCDVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVF
YYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSK
AGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVVDAVP
APGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQP
CPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPL
ESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVVVRGLRPDFTYTFE
VTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAVL
DYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHH
SQTQLDESEGWREQLALIAGTAVVGVVLVLVVIVVAVLCLRKQSNGREAEYSDKHGQ
YLIGHGTKVYIDPFTYEDPNEAVREFAKEIDVSYVKIEEVIGAGEFGEVCRGRLKAPGKK
ESCVAIKTLKGGYTERQRREFLSEASIMGQFEHPNIIRLEGVVTNSMPVMILTEFMENGA
LDSFLRLNDGQFTVIQLVGMLRGIASGMRYLAEMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSD
FGLSRFLEENSSDPTYTSSLGGKIPIRWTAPEAIAFRKFTSASDAWSYGIVMWEVMSFGE
RPYWDMSNQDVINAIEQDYRLPPPPDCPTSLHQLMLDCWQKDRNARPRFPQVVSALDK
MIRNPASLKIVARENGGASHPLLDQRQPHYSAFGSVGEWLRAIKMGRYEESFAAAGFG
SFELVSQISAEDLLRIGVTLAGHQKKILASVQHMKSQAKPGTPGGTGGPAPQY
SEQ ID NO：8：
DYYMN
SEQ ID NO：9：
DNNPNNGGTTYNQKF
SEQ ID NO：10：
GKYYGTSYGWYFDV
SEQ ID NO：11：
RISDNIDSYLA
SEQ ID NO：12：
DATVLAD
SEQ ID NO：13：
QVYYSIPWT
SEQ ID NO：14：
DYYIN
SEQ ID NO：15：
KIGPRIGTNYYNENFK
SEQ ID NO：16：
SEDYSGYVSYALDY
SEQ ID NO：17：
SEQ ID NO：18：
GASNRYT
SEQ ID NO：19：
GQTYRYPFT
SEQ ID NO：20：
EVQLVQSGAELKKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAHGKGLEWIGDNNPNNG
GTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELRSLRSEDSAVYYCARGKYYGTSYGWYFDV
WGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：21：
EVQLVQSGAELKKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAHGKGLEWIGDNNPNNG
GTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDSAVYYCARGKYYGTSYGWYFDV
WGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：22：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGKGLEWIGDNNPNNG
GTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGKYYGTSYGWYFDV
WGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：23：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVKQAPGKGLEWIGDNNPNNG
GTNYNQKFKGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGKYYGTSYGWYFDV
WGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：24：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWIGDNNPNNG
GTNYNQKFKGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGKYYGTSYGWYFDVW
GQGTTVTVSS
SEQ ID NO：25：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISDNIDSYLAWFQQKQGKAPKLLVYDATVLADGVP
SRFSGSGSGTQYTLTINSLQSEDAARYYCQVYYSIPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：26：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISDNIDSYLAWFQQKPGKAPKLLVYDATVLADGVP
SRFSGSGSGTDYTLTINSLQAEDAARYYCQVYYSIPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：27：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISDNIDSYLAWFQQKPGKAPKLLVYDATVLADGVP
SRFSGSGSGTDYTLTINSLQAEDAATYYCQVYYSIPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：28：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRISDNIDSYLAWYQQKPGKAPKLLVYDATVLADGVP
SRFSGSGSGTDYTLTINSLQAEDAATYYCQVYYSIPWTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：29：
QVQLVQSGAELKKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQAPGQGLEWIGKIGPRIGTNY
YNENFKGRATLTADISTNTAYMELSSLRSEDSAVYFCARSEDYSGYVSYALDYWGQGT
SVTVSS
SEQ ID NO：30：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQAPGQGLEWIGKIGPRIGTN
YYNENFKGRATLTADISTNTAYMELSSLRSEDTAVYFCARSEDYSGYVSYALDYWGQG
TLVTVSS    
SEQ ID NO：31：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKISCKASGYTFTDYYINWVKQAPGQGLEWIGKIGPRIGTN
YYNENFKGRVTLTADISTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEDYSGYVSYALDYWGQ
GTLVTVS S
SEQ ID NO：32：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWIGKIGPRIGTN
YYNENFKGRVTLTADISTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEDYSGYVSYALDYWGQ
GTLVTVSS
SEQ ID NO：33：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVRQAPGQGLEWIGKIGPRIGTN
YYNENFKGRVTLTADISTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEDYSGYVSYALDYWGQG
TLVTVSS
SEQ ID NO：34：
NIVMTQSPASLSLSPGERVTLSCKASENVDTYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVP
DRFTGSGSATDFTLTISSLQAEDVADYHCGQTYRYPFTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：35：
NIVMTQSPATLSLSPGERVTLSCKASENVDTYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVP
DRFTGSGSATDFTLTISSLQAEDVADYHCGQTYRYPFTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：36：
NIVMTQSPATLSLSPGERVTLSCKASENVDTYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVP
DRFTGSGSATDFTLTISSLQAEDVAVYYCGQTYRYPFTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：37：
NIVMTQSPATLSLSPGERVTLSCKASENVDTYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASNRYTGVP
DRFSGSGSATDFTLTISSLQAEDVAVYYCGQTYRYPFTFGQGTKVEIK
MAB265 VL3 DNA(SEQ ID NO：38)
TTGGTGCAGCATCAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGAGCG
GAGTGGTATAATGTTGCTGACAGAAGTAATCTGCCAGGTCTTCAGCCTGCACACTGC
TGATGGTAAGAGTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCTATGAAGCGATCAGGGACC
CCAGATTCCCTAGTGGATGACAAGTATACCAGAAGTTTAGGAGAATGTCCTGGTTTC
TGCTGGTACCAGGCCAAATAGTTCTTTTGAGTGTTACTATTTAAAAGGCTCTGACTG
GACTTGCAGTTCATAGTGACCTTCTGTCCTACTGAC
ATAGCCAGGGAGGATGGAGACTGTGTCATCACAATGTCTGCACAGGCACCAGATAC
CCAGAGCAGAAGAAACATGAGGACCTGAAACTGTGACTCCATCTTGAAGCCCATGT
CC
MAB265 VL3 AA(SEQ ID NO：39)
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLNSNTQKNYLAWYQQKPGHSPKLLVYLSS
TRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYTTPLTFGAGTKLELKR
MAB265 VL N-末端AA(SEQ ID NO：40)
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMNCKSSQQLLNSNTQKNYLAWYQQKPGHSPKLLVYLS
STRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYTTPLTFGAGTKLELKR
MAB265 VH DNA(SEQ ID NO：41)
CTCAGCAGTCAGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGC
AAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCC
TGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGT
ACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACA
GCCTACATGCAACTCAGCACCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCA
AGAGTCGGGGGATGGTTACTACTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACGCT
MAB265 VH AA(SEQ ID NO：42)
QQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYT
QKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSTLASEDSAVYYCARVGGWLLLAYWGQGTTVT
SEQ ID NO：261：
GYTFTSYWMQ
SEQ ID NO：262：
AIYPGDGDTRYTQKFKG
SEQ ID NO：263：
VGGWLLLAY
SEQ ID NO：264：
KSSQSLLNSNTQKNYLA
SEQ ID NO：265：
LSSTRES
SEQ ID NO：266：
QQHYTTPLT
人EphB4 mRNA(Genbank No：NM_004444)SEQ ID NO：267：
TTCCAGCGCAGCTCAGCCCCTGCCCGGCCCGGCCCGCCCGGCTCCGCGCCGCAGTCT
CCCTCCCTCCCGCTCCGTCCCCGCTCGGGCTCCCACCATCCCCGCCCGCGAGGAGAG
CACTCGGCCCGGCGGCGCGAGCAGAGCCACTCCAGGGAGGGGGGGAGACCGCGAG
CGGCCGGCTCAGCCCCCGCCACCCGGGGCGGGACCCCGAGGCCCCGGAGGGACCCC
AACTCCAGCCACGTCTTGCTGCGCGCCCGCCCGGCGCGGCCACTGCCAGCACGCTC
CGGGCCCGCCGCCCGCGCGCGCGGCACAGACGCGGGGCCACACTTGGCGCCGCCGC
CCGGTGCCCCGCACGCTCGCATGGGCCCGCGCTGAGGGCCCCGACGAGGAGTCCCG
CGCGGAGTATCGGCGTCCACCCGCCCAGGGAGAGTCAGACCTGGGGGGGCGAGGG
CCCCCCAAACTCAGTTCGGATCCTACCCGAGTGAGGCGGCGCCATGGAGCTCCGGG
TGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAA
AATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGG
GAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGT
GTGACGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCA
CGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCT
GTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGA
GAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACA
TCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAG
GCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGG
CTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCT
CTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGT
GCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCG
CCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAG
CCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAA
GTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCC
AGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGC
CGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCC
TCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGA
ATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCT
GCCGGGAGTGCCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTT
GACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCC
TGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCAC
GGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCACCACTGACCGAGAGGTACCTCCTGC
AGTGTCTGACATCCGGGTGACGCGGTCCTCACCCAGCAGCTTGAGCCTGGCCTGGG
CTGTTCCCCGGGCACCCAGTGGGGCTGTGCTGGACTACGAGGTCAAATACCATGAG
AAGGGCGCCGAGGGTCCCAGCAGCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAGAAAACCGGG
CAGAGCTGCGGGGGCTGAAGCGGGGAGCCAGCTACCTGGTGCAGGTACGGGCGCG
CTCTGAGGCCGGCTACGGGCCCTTCGGCCAGGAACATCACAGCCAGACCCAACTGG
ATGAGAGCGAGGGCTGGCGGGAGCAGCTGGCCCTGATTGCGGGCACGGCAGTCGT
GGGTGTGGTCCTGGTCCTGGTGGTCATTGTGGTCGCAGTTCTCTGCCTCAGGAAGCA
GAGCAATGGGAGAGAAGCAGAATATTCGGACAAACACGGACAGTATCTCATCGGA
CATGGTACTAAGGTCTACATCGACCCCTTCACTTATGAAGACCCTAATGAGGCTGTG
AGGGAATTTGCAAAAGAGATCGATGTCTCCTACGTCAAGATTGAAGAGGTGATTGG
TGCAGGTGAGTTTGGCGAGGTGTGCCGGGGGCGGCTCAAGGCCCCAGGGAAGAAG
GAGAGCTGTGTGGCAATCAAGACCCTGAAGGGTGGCTACACGGAGCGGCAGCGGC
GTGAGTTTCTGAGCGAGGCCTCCATCATGGGCCAGTTCGAGCACCCCAATATCATCC
GCCTGGAGGGCGTGGTCACCAACAGCATGCCCGTCATGATTCTCACAGAGTTCATG
GAGAACGGCGCCCTGGACTCCTTCCTGCGGCTAAACGACGGACAGTTCACAGTCAT
CCAGCTCGTGGGCATGCTGCGGGGCATCGCCTCGGGCATGCGGTACCTTGCCGAGA
TGAGCTACGTCCACCGAGACCTGGCTGCTCGCAACATCCTAGTCAACAGCAACCTC
GTCTGCAAAGTGTCTGACTTTGGCCTTTCCCGATTCCTGGAGGAGAACTCTTCCGAT
CCCACCTACACGAGCTCCCTGGGAGGAAAGATTCCCATCCGATGGACTGCCCCGGA
GGCCATTGCCTTCCGGAAGTTCACTTCCGCCAGTGATGCCTGGAGTTACGGGATTGT
GATGTGGGAGGTGATGTCATTTGGGGAGAGGCCGTACTGGGACATGAGCAATCAGG
ACGTGATCAATGCCATTGAACAGGACTACCGGCTGCCCCCGCCCCCAGACTGTCCC
ACCTCCCTCCACCAGCTCATGCTGGACTGTTGGCAGAAAGACCGGAATGCCCGGCC
CCGCTTCCCCCAGGTGGTCAGCGCCCTGGACAAGATGATCCGGAACCCCGCCAGCC
TCAAAATCGTGGCCCGGGAGAATGGCGGGGCCTCACACCCTCTCCTGGACCAGCGG
CAGCCTCACTACTCAGCTTTTGGCTCTGTGGGCGAGTGGCTTCGGGCCATCAAAATG
GGAAGATACGAAGAAAGTTTCGCAGCCGCTGGCTTTGGCTCCTTCGAGCTGGTCAG
CCAGATCTCTGCTGAGGACCTGCTCCGAATCGGAGTCACTCTGGCGGGACACCAGA
AGAAAATCTTGGCCAGTGTCCAGCACATGAAGTCCCAGGCCAAGCCGGGAACCCCG
GGTGGGACAGGAGGACCGGCCCCGCAGTACTGACCTGCAGGAACTCCCCACCCCAG
GGACACCGCCTCCCCATTTTCCGGGGCAGAGTGGGGACTCACAGAGGCCCCCAGCC
CTGTGCCCCGCTGGATTGCACTTTGAGCCCGTGGGGTGAGGAGTTGGCAATTTGGA
GAGACAGGATTTGGGGGTTCTGCCATAATAGGAGGGGAAAATCACCCCCCAGCCAC
CTCGGGGAACTCCAGACCAAGGGTGAGGGCGCCTTTCCCTCAGGACTGGGTGTGAC
CAGAGGAAAAGGAAGTGCCCAACATCTCCCAGCCTCCCCAGGTGCCCCCCTCACCT
TGATGGGTGCGTTCCCGCAGACCAAAGAGAGTGTGACTCCCTTGCCAGCTCCAGAG
TGGGGGGGCTGTCCCAGGGGGCAAGAAGGGGTGTCAGGGCCCAGTGACAAAATCA
TTGGGGTTTGTAGTCCCAACTTGCTGCTGTCACCACCAAACTCAATCATTTTTTTCCC
TTGTAAATGCCCCTCCCCCAGCTGCTGCCTTCATATTGAAGGTTTTTGAGTTTTGTTT
TTGGTCTTAATTTTTCTCCCCGTTCCCTTTTTGTTTCTTCGTTTTGTTTTTCTACCGTCC
TTGTCATAACTTTGTGTTGGAGGGAACCTGTTTCACTATGGCCTCCTTTGCCCAAGTT
GAAACAGGGGCCCATCATCATGTCTGTTTCCAGAACAGTGCCTTGGTCATCCCACAT
CCCCGGACCCCGCCTGGGACCCCCAAGCTGTGTCCTATGAAGGGGTGTGGGGTGAG
GTAGTGAAAAGGGCGGTAGTTGGTGGTGGAACCCAGAAACGGACGCCGGTGCTTG
GAGGGGTTCTTAAATTATATTTAAAAAAGTAACTTTTTGTATAAATAAAAGAAAAT
GGGACGTGTCCCAGCTCCAGGGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Claims (80)

1.治疗卵巢癌的方法，所述方法包括向需要治疗卵巢癌的患者施用有效量的EphB4抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂选自多肽、多肽类似物、拟肽、抗体、核酸、RNAi构建体、核酸类似物和小分子。
3.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂是抗体或其抗原结合片段。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体或抗体片段、双抗体、嵌合的或嵌合抗体或抗体片段、人源化抗体或抗体片段、去免疫化人抗体或抗体片段、完全人类抗体或抗体片段、单链抗体、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab’)2。
5.权利要求4的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
6.权利要求5的方法，其中所述单克隆抗体是人源化抗体。
7.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合位于EphB4细胞外部分中的表位并抑制EphB4活性。
8.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合位于EphB4序列的氨基酸16-198、327-427或428-537内的表位。
9.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中所述重链可变区包含一个或更多个CDR区，所述CDR区具有选自SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263的氨基酸序列。
10.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含一个或更多个CDR区，所述CDR区具有选自SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：265或SEQ ID NO：266的氨基酸序列。
11.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段共价连接到额外的功能部分。
12.权利要求11的方法，其中所述额外的功能部分是可检测标记。
13.权利要求12的方法，其中所述可检测标记选自荧光或生色标记。
14.权利要求12的方法，其中所述可检测标记选自辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
15.权利要求11的方法，其中所述额外的功能部分包含聚乙二醇(PEG)部分。
16.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制EphB4活性。
17.权利要求3的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段刺激EphB4激酶活性。
18.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂是选自以下的可溶性多肽：
(i)包含EphB4蛋白质的胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述EphB4多肽是单体并特异性结合Ephrin B2多肽；和
(ii)包含Ephrin B2蛋白质的胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述可溶性Ephrin B2多肽是单体并以高亲和力结合EphB4多肽。
19.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽包含EphB4蛋白质的球形结构域。
20.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的残基1-522有至少90％同一性的序列。
21.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的残基1-412有至少90％同一性的序列。
22.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽包含与EphB4氨基酸序列的残基1-312有至少90％同一性的序列。
23.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽包含与Ephrin B2氨基酸序列的残基1-225有至少90％同一性的序列。
24.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽是融合蛋白。
25.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽包含一个或更多个经修饰的氨基酸残基。
26.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽抑制Ephrin B2与EphB4之间的相互作用。
27.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽抑制Ephrin B2或EphB4的聚集。
28.权利要求18的方法，其中所述可溶性多肽抑制Ephrin B2或EphB4的磷酸化。
29.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂是核酸化合物。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸化合物长度约15-100个核苷酸，在生理条件下与EphB4核酸序列杂交并降低所述EphB4的表达。
31.权利要求29的方法，其中所述核酸选自：RNAi构建体和反义寡核苷酸。
32.权利要求31的方法，其中所述RNAi构建体选自：dsRNA或siRNA。
33.权利要求32的方法，其中所述siRNA长度为约19-30个核苷酸。
34.权利要求32的方法，其中所述siRNA长度为约21-23个核苷酸。
35.权利要求32的方法，其中所述siRNA序列选自：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
36.权利要求29的方法，其中所述反义寡核苷酸长度为约19-30个核苷酸。
37.权利要求36的方法，其中所述反义寡核苷酸序列由SEQ ID NO：5组成。
38.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂全身施用。
39.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂局部施用。
40.权利要求1的方法，其中所述EphB4抑制剂具有抗癌活性。
41.权利要求40的方法，其中所述抗癌活性选自促进程序性细胞死亡、抑制肿瘤生长、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移、抑制癌细胞转移、抑制血管发生和引起肿瘤细胞死亡。
42.权利要求1的方法，其中用药学上可接受的载体配制所述EphB4抑制剂。
43.权利要求1的方法，其中所述卵巢癌包含表达EphB4的一个或更多个癌细胞。
44.权利要求1的方法，其中所述卵巢癌细胞相比于来自可比较组织的非癌细胞表达更高水平的EphB4。
45.权利要求1的方法，其中所述卵巢癌是转移性的。
46.权利要求1的方法，其中所述卵巢癌是依赖于血管发生的或不依赖于血管发生的。
47.权利要求1的方法，其中所述患者是人。
48.权利要求1的方法，还包括至少一种额外的抗癌化学治疗剂，其与EphB4抑制剂以累加或协同方式抑制卵巢癌细胞。
49.权利要求1的方法，还包括至少一种额外的抗血管发生剂，其与EphB4抑制剂以累加或协同方式抑制血管发生。
50.EphB4抑制剂在制备用于治疗卵巢癌的药物中的用途。
51.治疗患有卵巢癌的患者的方法，其包括：(a)在患者中鉴定具有表达EphB4的许多癌细胞的卵巢癌；和(b)向该患者施用EphB4抑制剂。
52.权利要求51的方法，其中所述EphB4抑制剂选自多肽、多肽类似物、拟肽、抗体、核酸、RNAi构建体、核酸类似物和小分子。
53.在受试者中降低卵巢癌生长速率的方法，其包括施用足以降低所述卵巢癌生长速率量的EphB4抑制剂。
54.权利要求53的方法，其中所述EphB4抑制剂选自多肽、多肽类似物、拟肽、抗体、核酸、RNAi构建体、核酸类似物和小分子。
55.诱导胱天蛋白酶8激活的方法，其包括施用EphB4抑制剂。
56.检测受试者是否患有卵巢癌的方法，其包括：
(a)从所述受试者中获得样品；和
(b)评估样品中EphB4蛋白质和/或mRNA的表达水平；
其中EphB4蛋白质和/或mRNA相对于对照的升高水平表明所述受试者患有卵巢癌。
57.权利要求56的方法，其中所述哺乳动物是人。
58.权利要求56的方法，其中所述卵巢癌是转移性卵巢癌。
59.权利要求56的方法，其中在基于抗体的测定中评估所述EphB4蛋白质的表达水平。
60.权利要求56的方法，其中EphB4蛋白质或mRNA的水平是正常卵巢组织中水平的至少两倍。
61.权利要求56的方法，其中样品选自：组织样品、血液样品和血清样品。
62.对患有卵巢癌的患者进行预后的方法，其包括：
(a)从所述受试者中获得样品；
(b)评估所述样品中EphB4蛋白质和/或mRNA的表达水平；其中EphB4蛋白质和/或mRNA相对于对照的升高水平表明预后不良。
63.权利要求62的方法，其中所述哺乳动物是人。
64.权利要求62的方法，其中所述卵巢癌是转移性卵巢癌。
65.权利要求62的方法，其中EphB4蛋白质或mRNA的水平是正常卵巢组织中水平的至少两倍。
66.权利要求62的方法，其中样品选自：组织样品、血液样品和血清样品。
67.用于诊断卵巢癌的试剂盒，其包含抗EphB4抗体或其抗原结合片段、可检测标记和使用所述试剂盒的说明书。
68.权利要求67的试剂盒，其中所述可检测标记是荧光的或生色的。
69.权利要求67的试剂盒，其中所述试剂盒包含辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
70.包含重链可变区的EphB4抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO：261的CDR1、包含SEQ ID NO：262的CDR2和包含SEQ ID NO：263的CDR3。
71.权利要求70的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
72.权利要求70的抗体，还包含轻链可变区，该轻链可变区包含：包含SEQ ID NO：264的CDR1、包含SEQ ID NO：265的CDR2和包含SEQID NO：266的CDR3。
73.权利要求72的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
74.权利要求70的抗体，其中所述抗体是人源化抗体或其抗体片段。
75.包含轻链可变区的EphB4抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO：264的CDR1、包含SEQ ID NO：265的CDR2和包含SEQ ID NO：266的CDR3。
76.权利要求75的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
77.权利要求75的抗体，还包含重链可变区，该重链可变区包含：包含SEQ ID NO：261的CDR1、包含SEQ ID NO：262的CDR2和包含SEQID NO：263的CDR3。
78.权利要求77的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
79.权利要求75的抗体，其中所述抗体是人源化抗体或其抗体片段。
80.包含轻链可变区的EphB4抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO：11的CDR1、包含SEQ ID NO：12的CDR2和包含SEQ ID NO：13的CDR3。
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