CN105925594A

CN105925594A - 生淀粉糖化酶及其制备方法与其在生淀粉水解和生料同步糖化发酵产酒精中的应用

Info

Publication number: CN105925594A
Application number: CN201610412418.2A
Authority: CN
Inventors: 冯家勋; 徐强胜; 闫语丝
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2016-09-07

Abstract

本发明公开了一种生淀粉糖化酶的制备方法及其在生淀粉水解和生料同步糖化发酵生产酒精中的应用。本发明提供一种经过密码子优化后的生淀粉糖化酶基因，其核苷酸序列为如下A1)‑A5)中任一所示：A1)序列表中序列3；A2)序列表中序列3的第1‑1878位核苷酸；A3)序列表中序列3的第19‑1878位核苷酸所示的DNA分子；A4)序列表中序列3的第19‑1857位核苷酸所示的DNA分子；A5)与A1)或A2)或A3)或A4)所限定的序列至少具有98％的同一性，且编码序列表序列4所示蛋白质的序列。实验证明，本发明所提供的生淀粉糖化酶基因能够在异源表达***中高效表达获得一种生淀粉糖化酶rPoGA15A，该酶与α‑淀粉酶协同作用可以快速高效水解生淀粉和实现生淀粉同步糖化发酵生产酒精。

Description

生淀粉糖化酶及其制备方法与其在生淀粉水解和生料同步糖化发酵产酒精中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种生淀粉糖化酶的制备方法，尤其涉及生淀粉糖化酶rPoGA15A的制备方法及其生淀粉糖化酶rPoGA15A在生淀粉水解和生料同步糖化发酵生产酒精中的应用。

背景技术

植物通过光合作用合成的淀粉是自然界植物中的最主要的贮藏性碳水化合物之一，淀粉在植物的种子(如水稻、小麦、玉米、高粱等)及根茎(如木薯、马铃薯等)中含量较高，其产量仅次于纤维素。

淀粉是葡萄糖分子的聚合物，包括α-1,4-糖苷键连接的一条直链，以及α-1,6-糖苷键构成位置随机且数量不定的分枝点，在分枝点可连接长度不同的直链。淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉两类，前者的葡萄糖分子以α-1,4糖苷键形式连接，而后者的葡萄糖分子以α-1,4和α-1,6糖苷键连接(Vamadevan V,Bertoft E.Structure-function relationshipsof starch components.Starch/2015,67:55-68)。在食品加工工业中，淀粉可被用作原料通过水解生产葡萄糖、果糖及果葡糖浆(Glucose-fructose syrup)等(WaterschootJ,Gomand SV,Fierens E,Delcour JA.Production,structure,physicochemical andfunctional properties of maize,cassava,wheat,potato and rice starches.Starch/2015,67:14-29)；此外，在发酵工业中，淀粉还可以被作为重要的原料用于发酵生产酒精(Favaro L,Viktor MJ,Rose SH,Viljoen-Bloom M,van Zyl WH,BasagliaM,Cagnin L,Casella S.Consolidated bioprocessing of starchy substrates into ethanolby industrial Saccharomyces cerevisiae strains secreting fungal amylases.Biotechnology and Bioengineering,2015,112:1751-1760)。

在目前的淀粉水解工艺中，主要采用两步法对淀粉水解产生葡萄糖，包括淀粉的高温液化和高温糖化两个步骤，这两步中分别使用的关键酶主要有α-淀粉酶和糖化酶。在第一步高温液化过程中，首先将淀粉在高温下加热糊化，之后加入来源于细菌的耐热型的α-淀粉酶，在pH 6.0–6.5及95–105℃高温条件下快速液化成糊精及小分子寡糖；在第二步高温糖化过程中，将水解糊化液冷却至60–65℃左右，调节pH至4.0–4.5后，向其中加入来源于黑曲霉的糖化酶，再将糊精和小分子寡糖进一步水解成葡萄糖(Sánchez OJ,Cardona CA.Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks.Bioresource Technology,2008,99:5270-5295)。

淀粉在糊化、液化和水解糖化的过程中需要高温蒸煮及连续加热，消耗了大量能量，也增加了设备的投入，大大提高了生产成本。同时，糖化酶和α-淀粉酶最适作用pH也不相同，需要反复调节pH，浪费了试剂的同时也给环境造成了污染(JF,Bressler DC,vanRensburg E.Engineering Saccharomyces cerevisiae for direct conversion of raw,uncooked or granular starch to ethanol.Critical Reviews in Biotechnology,2015,35:369-391)。不管是淀粉水解生产果葡糖浆或者以淀粉为原料进行发酵生产酒精，首先都需要将淀粉水解成葡萄糖分子，而当前淀粉水解所使用的工业淀粉酶都不能将生淀粉有效地水解，开发在较低温度下能直接将未经蒸煮的生淀粉水解糖化的生淀粉酶意义重大(Wang P,Singh V,Xue H,Johnston DB,Rausch KD,Tumbleson ME.Comparison of raw starchhydrolyzing enzyme with conventional liquefaction and saccharification enzymes indry-grind corn processing.Cereal Chemistry,2007,84:10-14；Cinell i BA,Casti lhoLR,Freire DMG,Castro AM.A brief review on the emerging technology of ethanolproduction by cold hydrolysis of raw starch.Fuel,2015,150:721-729)。将生淀粉酶应用于以淀粉原料的酒精生产中可以减少占所生产出的酒精的燃烧值的10-20％的能量消耗(Robertson GH,Wong DWS,Lee CC,Wagschal K,Smith,MR,Orts WJ.Native or raw starchdigestion:a key step in energy efficient biorefining of grain.Journal of Agricultureand Food Chemistry,2006,54:353-365；JF,Bressler DC,van Rensburg E.Engineering Saccharomyces cerevisiae for direct conversion of raw,uncooked orgranular starch to ethanol.Critical Reviews in Biotechnology,2015,35:369-391)。

生淀粉酶是指具有能将未经蒸煮的生淀粉直接水解的酶类，主要包括α-生淀粉酶、β-生淀粉酶和生淀粉糖化酶(Raw starch-digesting glucoamylase,RSDG)等。生淀粉酶广泛存在于动物、植物、微生物中，微生物中主要有黑曲霉、米曲霉、青霉、芽孢杆菌和海洋酵母等产生生淀粉酶(Sun H,Zhao P,Ge X,Xia Y,Hao Z,Liu J,Peng M.Recent advancesin microbial raw starch degrading enzymes.Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,160:988-1003)。其中，生淀粉糖化酶能直接将生淀粉水解成葡萄糖，可以改变传统淀粉水解加工工艺，直接将糊化、液化及糖化多步合并为一步进行，具有较好的开发和应用前景(Sun HY,Ge XY,Zhang WG.Production of a novel raw-starch-digesting glucoamylaseby Penicillium sp.X-1under solid state fermentation and its use in direct hydrolysisof raw starch.World Journal of Microbiology and Biotechnology,2007,23:603-613；Lin HJ,Xian L,Zhang QJ,Luo XM,Xu QS,Yang Q,Duan CJ,Liu JL,Tang JL,Feng JX.Production of raw cassava starch-degrading enzyme by Penicillium and its use inconversion of raw cassava flour to ethanol.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2011,38:733-742)。目前，报道的生淀粉糖化酶的活力都不高，而且对水解生淀粉的种类具有偏好性(Li HF,Chi ZM,Wang XH,Duan XH,Ma LY,Gao LM.Purificationand characterization of extracellular amylase from the marine yeast Aureobasidiumpullulans N13d and its raw potato starch digestion.Enzyme and Microbial Technology,2007,40:1006-1012；Sun H,Zhao P,Ge X,Xia Y,Hao Z,Liu J,Peng M.Recent advancesin microbial raw starch degrading enzymes.Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,160:988-1003)，使生产应用成本增加，因而开发生淀粉底物范围广、水解活性高的优良生淀粉糖化酶很有必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高生淀粉糖化酶基因在酵母细胞中的表达量，从而使其工业化大规模生产成为可能，同时还提供一种生淀粉糖化酶。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种经过基因改造的生淀粉糖化酶基因。

所述经过改造的生淀粉糖化酶基因，具体可为如下A1)-A5)中任一DNA分子：

A1)序列表中序列3所示的DNA分子；

A2)序列表中序列3的第1-1878位核苷酸所示的DNA分子；

A3)序列表中序列3的第19-1878位核苷酸所示的DNA分子；

A4)序列表中序列3的第19-1857位核苷酸所示的DNA分子；

A5)与A1)或A2)或A3)或A4)所限定的DNA分子至少具有98％的同一性，且编码序列表序列4所示蛋白质的DNA分子。

其中，序列3共由1886个核苷酸组成，其中第1-1878位核苷酸所示的DNA分子编码序列表中序列4所示的重组生淀粉糖化酶rPoGA15A。序列3的第19-1878位核苷酸所示的DNA分子编码序列表中序列4的第7-625位氨基酸残基所示的蛋白质。序列3的第19-1857位核苷酸所示的DNA分子编码序列4的第7-619位氨基酸残基所示的蛋白质或序列表中序列2的第23-635位氨基酸残基所示的蛋白质。

这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQID No.2所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

为了解决上述技术问题，本发明还提供一种蛋白质。

所述蛋白质为如下为a)或b)或c)或d)或e)或f)：

a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由序列表中序列4第7-625位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d)由序列表中序列2第23-635位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

e)在a)或b)或c)或d)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

f)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。

其中，序列表中序列4所示的蛋白质由625个氨基酸残基组成；序列表中序列2所示的蛋白质由635个氨基酸组成。

上述e)中的蛋白标签的如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述f)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述f)中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述f)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白质是通过将生淀粉糖化酶基因在生物细胞中进行表达得到的。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种；

B1)编码上述蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞系、含有B2)所述表达盒的重组细胞系、或含有B3)所述重组载体的重组细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述蛋白质编码基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述的含有编码上述蛋白质的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pPIC9k的多克隆位点***序列表中序列3第19-1878位所示的DNA分子得到的重组表达载体。所述的重组微生物可为酵母、细菌、藻和真菌。酵母可为毕赤酵母GS115，细菌可为大肠杆菌(E.coli)DH5α。所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入毕赤酵母GS115得到的重组菌，命名为Pp9kPoGA15A-1。所述的转基因细胞系不包括动物植物的繁殖材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种生淀粉糖化酶的制备方法。

本发明所提供的生淀粉糖化酶的制备方法包括将上述生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到生淀粉糖化酶的步骤；所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞；所述生淀粉糖化酶的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

具体方法为：所述将生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达包括将生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到表达所述生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质的编码基因的重组酵母，培养所述重组酵母，表达得到生淀粉糖化酶；所述表达为诱导表达。

上述方法中，所述诱导表达的条件为在28℃培养96小时，并每隔12小时向培养基中加入甲醇，使甲醇的体积浓度为1％。

上述方法中，所述诱导表达采用的培养基的成分如下：每升所述发酵培养基由10g酵母浸出物、20g蛋白胨、100mL 1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、100mL 10×YNB(13.4％酵母氮源碱，含硫酸铵不含氨基酸)、2ml 500×生物素(0.02％)、10ml甲醇和水组成。

所述诱导表达培养基的pH值具体为pH 6.0。

上述方法中，所述诱导表达为将上述的Pp9kPoGA15A-1菌株接种至所述发酵培养基中培养。

上述方法中，所述诱导表达结束后还要收集诱导表达产物。

上述方法中，在所述收集诱导表达产物后还包括如下步骤：将所述诱导表达产物离心，收集上清液，得到生淀粉糖化酶的酶液；上述离心具体为12000rpm，离心5min，离心半径为7.0cm。

本发明的又一个目的是提供了上述生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料或上述方法在制备生淀粉糖化酶或生淀粉糖化酶制剂中的应用。

本发明的再一个目的是提供了上述生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料或上述方法在制备用于水解生淀粉的产品中的应用。

本发明的再一个目的是提供了上述生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料或上述方法在生淀粉水解加工中的应用。

本发明的再一个目的是提供了上述生淀粉糖化酶基因或上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料或上述方法在生料同步糖化发酵产酒精中的应用。

本发明的再一个目的是提供了上述蛋白质在作为生淀粉糖化酶中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种水解生淀粉的方法。

本发明提供的水解生淀粉的方法包括在生淀粉中加入上述蛋白质和α-淀粉酶的步骤。

上述方法中，以0.05U酶/mg生淀粉的酶量加入上述蛋白质，并同时按0.05U酶/mg生淀粉的酶量添加α-淀粉酶。

上述方法是在pH 4.5、40℃条件下进行的。

上述方法中，所述生淀粉为玉米淀粉或木薯淀粉。

本发明的再一个目的是提供一种生料同步糖化发酵生产酒精的方法。

本发明提供的生料同步糖化发酵生产酒精的方法包括在生淀粉中加入上述蛋白质和α-淀粉酶的步骤。

上述方法中，还需要加入尿素、酿酒酵母和灭菌水。

上述方法是在pH 4.0、40℃条件下静置发酵得到酒精的。

上述方法中，所述生淀粉为玉米淀粉或木薯淀粉。

本发明的再一个目的是提供上述蛋白质和α-淀粉酶在水解生淀粉或生料同步糖化发酵生产酒精中的应用。

上述应用中，所述蛋白质和α-淀粉酶的用量比为1∶1。

上述应用中，所述蛋白质按照0.05U酶/mg生淀粉的酶量加入；所述α-淀粉酶按0.05U酶/mg生淀粉的酶量添加。

本发明通过基因工程方法合成了可在异源表达***中实现高效表达的生淀粉糖化酶的DNA分子(cPoGA15A-1)，并利用该DNA分子制备得到了具有高降解活性的生淀粉糖化酶rPoGA15A。实验证明：生淀粉糖化酶rPoGA15A水解生淀粉种类广泛，pH耐受性好，其与α-淀粉酶协同作用可以快速高效水解生淀粉；将其应用在生淀粉同步糖化发酵生产酒精中发酵速度快，发酵率高。可见，生淀粉糖化酶rPoGA15A及其基因在生淀粉的水解加工和生料同步糖化发酵生产酒精中具有应用潜力。

附图说明

图1为纯化的青霉GXU20生淀粉酶的电泳结果。

其中，A为纯化的青霉GXU20生淀粉酶在SDS-PAGE胶上的电泳结果；B为纯化的青霉GXU20生淀粉酶在Native-PAGE胶上的电泳结果；A中，1为蛋白质分子量标准物，2为纯化的青霉GXU20生淀粉酶；B中，1为纯化的青霉GXU20生淀粉酶，2为KI/I₂显色后的活性条带。

图2为不同时间点生淀粉糖化酶PoGA15A水解木薯生淀粉的产物的HPLC图谱。

图3为不同时间点生淀粉糖化酶PoGA15A水解木薯生淀粉颗粒的扫描电镜图。

其中，A为未水解的木薯淀粉颗粒；B为水解0.5h的木薯淀粉颗粒；C为水解2h的木薯淀粉颗粒；D为水解4h的木薯淀粉颗粒；E为水解8h的木薯淀粉颗粒。

图4为生淀粉糖化酶PoGA15A的pH和温度特征曲线。

其中，A为不同的pH值对生淀粉糖化酶PoGA15A酶活性的影响；B为不同的温度对生淀粉糖化酶PoGA15A酶活性的影响；C为不同的pH值对生淀粉糖化酶PoGA15A酶活性稳定性的影响；D为不同的温度对生淀粉糖化酶PoGA15A酶活性稳定性的影响。

图5青霉GXU20中生淀粉糖化酶基因cPoGA15A的PCR产物的电泳结果。

其中，M为1kb DNA ladder(片段从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb，1.0kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb)；1为生淀粉糖化酶基因cPoGA15A。

图6为重组质粒的p9kPoGA15A-1双酶切电泳图谱。

其中，M为1kb DNA ladder(片段从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb，1.0kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb)；1为双酶切后的pPIC9k空载质粒；2为生淀粉糖化酶基因PoGA15A-1；3为双酶切的重组质粒p9kPoGA15A-1。

图7为重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的电泳结果。其中，1为蛋白质标准物；2为重组生淀粉糖化酶rPoGA15A；3为实施例1获得的天然的生淀粉糖化酶PoGA15A。

图8为重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同来源的生淀粉的水解效果。

图9为不同重组生淀粉糖化酶rPoGA15A酶用量对生淀粉水解率的影响。

图10为重组生淀粉糖化酶rPoGA15A与α-淀粉酶协同作用对不同浓度的玉米生淀粉的水解效果。

图11为重组生淀粉糖化酶rPoGA15A与α-淀粉酶协同作用对不同浓度的木薯生淀粉的水解效果。

图12为重组生淀粉糖化酶和α-淀粉酶协同作用进行的玉米淀粉生料同步糖化发酵产酒精曲线。

图13为重组生淀粉糖化酶和α-淀粉酶协同作用进行的木薯淀粉生料同步糖化发酵产酒精曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

产酶培养基配方：称取3g KH₂PO₄、0.2g MgSO₄·7H₂O、0.0255g FeSO₄·7H₂O、0.13gCaCl₂、35g麦麸和25g豆饼粉，定容至1000mL，pH调至5.5。分装150mL至500mL三角瓶中，121℃条件下湿热灭菌20min。

pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制：将9.1mL的0.2M Na₂HPO₄水溶液和10.9mL的0.1M柠檬酸水溶液混合。

BMMY培养基：称取10g酵母浸出物和20g蛋白胨，溶于700ml蒸馏水中高压灭菌20min，冷却后加入100mL灭菌的1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)和100mL无菌的10×YNB(13.4％酵母氮源碱，含硫酸铵，不含氨基酸)，加入2ml 500×生物素(0.02％)，和10ml甲醇，用无菌蒸馏水补足体积至1000mL。

下述实施例中，如无特别说明，生淀粉糖化酶的酶活力测定都采用3,5-二硝基水杨酸法(3,5-dinitrosalicylate,DNS)测定水解产生的还原糖(Miller GL.Use ofdinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar.AnalyticalChemistry,1959,31:426-428)，具体步骤如下：

1、称取葡萄糖溶于无菌去离子水中，配制成浓度为1mg/ml的葡萄糖母液，将其稀释成一系列不同浓度的葡萄糖标准溶液(0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL)；向配制好的500μL的葡萄糖标准液中加入1000μL的DNS溶液，沸水浴中放置5min显色，冷却至室温(25℃)，吸取200μL反应液至96微孔酶标板上，酶标仪540nm处测定吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。标准曲线的函数式为：y＝2.9834x-0.0124(R²＝0.9994)，其中y为光吸收值，x为葡萄糖浓度。

2、取450μL含有1％木薯生淀粉、pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入到2mL EP管中，置于40℃水浴锅预热5min，加入50μL适当稀释的生淀粉糖化酶酶液，40℃条件下反应30min，并不间断振荡EP管，反应结束后立即加入1000mL DNS溶液，置于沸水浴中5min，冷却至室温后，12000rpm离心5min，吸取200μL上清液于540nm处测定吸光值。依据葡萄糖标准曲线计算出酶活力大小。

生淀粉糖化酶酶活力的定义：在40℃，pH 4.5条件下，水解生淀粉一分钟产生1μmol还原糖(相当于等量的葡萄糖)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。

pPIC9k载体为invitrogen公司产品，其产品编码为V17520。

毕赤酵母GS115为invitrogen公司产品，其产品编码为C18100。

实施例1、青霉GXU20产生的生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质的测定

一、青霉GXU20产生的生淀粉酶的分离纯化

按照授权公告号为101955887B的中国发明专利实施例2的方法利用产酶培养基对青霉GXU20进行发酵培养，得到青霉GXU20粗酶液。其中，青霉GXU20是授权公告号为101955887B的中国发明专利中授权的生物材料。

1、乙醇分级沉淀

采用两步法进行乙醇沉淀。向500mL三角瓶中加入适量经旋转蒸发仪浓缩后的青霉GXU20粗酶液，置于冰上并用磁力搅拌器缓慢搅动粗酶液，将预冷的无水乙醇缓慢加入粗酶液中，加入的乙醇体积为粗酶液体积的0.5倍，继续缓慢搅拌60min，使杂蛋白充分沉淀，12000rpm、4℃离心20min；取离心后的上清液继续加入无水乙醇，至乙醇终体积倍数为2.0，连续搅拌60min后放置于4℃冰箱内过夜。取出沉淀后的溶液，12000rpm、4℃离心20min，弃去上清液，吸水纸吸去沉淀表面残留的液体，用pH 7.0、50mM、含1.5M硫酸铵的磷酸缓冲液复溶，12000rpm、4℃再次离心20min，弃去不容物，取出上清液，并用0.45μm EMDMillipore Millex(美国Millipore公司)针头过滤器过滤即制备成蛋白质上样缓冲液。

2、Hiprep 16/10phenyl疏水层析

将所有层析用的溶液及缓冲液用0.5μm Millipore滤膜过滤，除去溶液中的不溶杂质，以避免堵塞层析柱。

(1)按照仪器操作说明书打开AKTA蛋白质纯化仪(瑞典Amersham公司)，先用超纯水清洗整个仪器管路***，接上20mL柱体积Hiprep 16/10phenyl层析柱(美国GE HealthcareLife Science公司)，设定保护报警压力值为0.15MPa，用5mL/min流速的起始缓冲液(含1.5M(NH₄)₂SO₄的50mM、pH 7.0的磷酸缓冲液)冲洗平衡层析柱和进样口。

(2)平衡完毕后，以2mL/min流速注入蛋白上样缓冲液。上样结束后，用起始缓冲液洗涤没有结合到层析柱上的蛋白，直至流出液在280nm波长处没有吸光值。

(3)以4mL/min流速的洗脱液(50mM、pH 7.0的磷酸缓冲液)洗脱结合到层析柱上的蛋白，洗脱体积为20倍柱体积，线性洗脱硫酸铵浓度为1.5–0M。自动收集器每管收集5mL。

(4)实验结束后用0.5M氢氧化钠溶液清洗层析柱上未被洗脱的蛋白质及色素，保证柱子的蛋白结合能力不降低，并用20％(V/V)乙醇溶液保存层析柱。检测每个组分的酶活力，SDS-PAGE检测有活性组分的蛋白质纯度。

3、Source 15S 4.6/100PE阳离子交换层析

(1)将疏水层析检测有酶活力的组分合并，用10,000Da分子截留量Amicon Ultra-15(美国Millipore公司)超滤离心管12000rpm、4℃离心浓缩，向浓缩液中加入适量的pH 4.0、25mM醋酸-醋酸钠缓冲液，12000rpm、4℃离心三次。

(2)先用超纯水清洗蛋白质纯化仪的管路***，接上1.7mL柱体积Source 15S 4.6/100PE(美国GE Healthcare Life Science公司)层析柱，设定保护报警压力值为4.0Mpa。

(3)用1mL/min流速的起始缓冲液(pH 4.0、25mM醋酸-醋酸钠缓冲液)冲洗平衡层析柱和进样口。平衡完毕后，以0.4mL/min流速进样。上样结束后，用起始缓冲液洗涤没有结合到层析柱上的蛋白，直至流出液在280nm处没有吸光值。

(4)用1mL/min流速的洗脱缓冲液(含1M NaCl的pH 4.0、25mM醋酸-醋酸钠缓冲液)洗脱结合到层析柱上的蛋白，洗脱体积为20倍柱体积，线性洗脱NaCl浓度为0–1M。自动收集器每管收集1mL。

(5)检测每个组分的酶活力，SDS-PAGE检测有活性组分的蛋白质纯度。Native-PAGE检验生淀粉酶的活性。

经乙醇分级沉淀、疏水层析及阳离子交换层析对青霉GXU20产生的粗酶液进行分离纯化后，在SDS-PAGE胶上出现一条单一蛋白质条带，达到了电泳纯级别，结果见图1中A，根据蛋白质分子迁移率的计算表明该蛋白质的分子量为75.4kDa。对纯化的蛋白进行Native-PAGE检测，结果见图1中B，在活性胶唯一蛋白条带对应的同一位置出现了明显的淀粉水解的透明条带，表明纯化的蛋白质有水解淀粉的能力，为淀粉酶。

乙醇分级沉淀对生淀粉酶是一种较好的蛋白质粗分离的方法，它能将大量的杂质蛋白有效地与生淀粉酶分离，并实现了53.51％的生淀粉酶的回收率。再经疏水层析和阳离子交换层析两步色谱柱纯化后，目的蛋白的比活力和纯化倍数逐渐升高，生淀粉酶的最终纯化比活力达到10.91U/mg，纯化倍数达到60.95倍，产率为11.61％，生淀粉酶的分离纯化结果见表1。

表1青霉GXU20生淀粉酶的分离纯化表

二、纯化的生淀粉酶水解木薯生淀粉的产物的HPLC检测

1、取步骤一中获得的酶液300μL加入到1.5mL含2％木薯生淀粉的pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，充分混合后，40℃条件下反应并不间断振荡反应液。分别在0.5h、2h、4h、8h时间点取样，每次取样体积为300μL，10000rpm离心10min，取出上清液，用0.22μm针孔滤膜过滤。将滤液在沸水浴中煮沸5min，使酶充分失活。

2、取水解液进行高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)检测，使用的HPLC型号为岛津公司的LC-10AT型，串联了示差检测器。按照仪器说明书打开仪器，将7.8×300mm糖柱(BensonPolymeric公司)连接到HPLC***中，柱温设定为80℃，以超纯水作为流动相，流速为1mL/min，手动进样体积为20μL，检测时间20min。标准样品分别为：麦芽三糖，麦芽糖，葡萄糖。

检测结果见图2，反应30min后，在HPLC图谱中13.5min位置出现了唯一的葡萄糖峰，随着作用时间的增加，生成葡萄糖的量也随之逐渐升高，并且整个水解过程除了葡萄糖之外没有其他的糖类(如麦芽糖和麦芽三糖等糖类)生成，表明该生淀粉酶为糖化酶，将之命名为生淀粉糖化酶PoGA15A。

三、生淀粉糖化酶降解木薯淀粉颗粒的扫描电镜观察

取步骤一得到的酶液300μL加入到1.5mL含2％木薯生淀粉的pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，充分混合后，40℃条件下反应并不间断振荡反应液。分别于水解0.5h、2h、4h、8h时间点取样，每个时间点取样体积为300μL，10000rpm离心10min，向离心后的沉淀物中加入无水乙醇。10000rpm离心10min，重复两次。将洗涤过的淀粉颗粒置于35℃烘箱中晾干。将淀粉颗粒均匀的分散吸附至扫描电镜载样器平板上，并向其表面喷金后，在20kV电压条件下进行扫描电镜观察，使用的扫描电镜型号为日本日立SU8020。

观察木薯淀粉颗粒的变化情况，结果见图3。未经酶处理的淀粉颗粒表面光滑平整，似圆球状(图3中A)；经过酶降解的淀粉颗粒表面会***糙，在淀粉颗粒表面只形成一个较大的孔洞，并且孔洞大小会随着作用时间的增加而不断变大(图3中B–E)，直至整个淀粉颗粒被降解成一个似半球形状的中空壳(图3中E)。降解2小时后，可以明显观察到木薯淀粉颗粒内部的淀粉层(图3中C)，生淀粉糖化酶从水解起始形成的穿透孔逐渐进入到淀粉颗粒内部，不断从内部水解淀粉颗粒，直至整个淀粉颗粒被完全瓦解。

四、pH和温度对生淀粉糖化酶PoGA15A的酶活力的影响

1、最适作用pH

在37℃条件下，测定步骤一获得的生淀粉糖化酶在pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0范围内的酶活力。pH 3.0-7.0使用的缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。将酶活力最高的pH点的酶活力作为100％，其它点的酶活与最高酶活之间的百分比为生淀粉糖化酶在该pH条件下的相对酶活(％)。

结果见图4中A，pH 3.0时，生淀粉糖化酶的酶活力为最高酶活力的69％，随着pH值的升高，酶活力也逐渐随之提高，pH 3.5-5.5范围内酶活力较高，达到85％以上，并在pH 4.5条件下达到最高值，因此，该酶的最适pH为pH 4.5。pH大于5.5之后，酶活力逐渐下降。

2、最适作用温度

在最适pH条件下，测定酶的最适作用温度。将酶液与含1％木薯生淀粉、pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液混合，分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃下反应30min，DNS法检测酶活力。以酶活力最高的温度点的酶活力作为100％，其它点的酶活与最高酶活之间的百分比为淀粉酶在该温度条件下的相对酶活(％)。

测定结果见图4中B，生淀粉糖化酶活力从30℃开始逐渐升高，65℃时，酶活力达到最大，表明该酶的最适作用温度为65℃；70℃以上酶活力开始迅速下降，80℃下降到20％左右。

3、pH耐受性

取50μL适当稀释的步骤一获得的酶液与450μL的一系列pH缓冲液(2.0–11.0)混合，每个pH点之间设置的差值为0.5。将混合液放置于4℃冰箱中24h后，检测残留的生淀粉酶活力。测定未作pH处理前的原始酶活力，将其定义为100％，处理后的残留酶活力与原始酶活力的百分比即为该pH点下的酶活力(％)。使用的缓冲液为：0.1M柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 2.0-7.0)、磷酸盐缓冲液(pH 7.0-8.0)、Tris-HCl(pH 8.0-9.0)、Glycine-NaOH(pH 9.0-11.0)。

结果见图4中C，纯化的生淀粉糖化酶在pH 2.0–10.5范围内的稳定性非常好，在较低的酸性pH 2.0–5.0范围内，生淀粉糖化酶很稳定，酶活力几乎没有丧失，随着pH的逐渐升高，酶活力略有下降，但基本上保持在90％左右，当pH值大于10.5时，酶活力开始显著下降。

4、温度耐受性

将实施例1获得的酶液与pH 4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液混合，放置于不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)的水浴锅中保温60min，之后测定残余酶活力。检测未作温度处理前的原始酶活力，将其定义为100％，处理后的残留酶活力与原始酶活力的百分比即为该温度点下的相对酶活力(％)。

结果见图4中D，在30–50℃范围内，生淀粉糖化酶的温度耐受性好，55℃时，保留的酶活力约为85％。当温度升高大于55℃时，酶活力迅速降低。

五、金属离子、表面活性剂、螯合剂对生淀粉糖化酶活力的影响

分别配制浓度为100mM含各种金属离子、表面活性剂、螯合剂的溶液母液，分别向含有1％木薯生淀粉、pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入上述溶液并充分混匀，使各种添加物终浓度为10mM，40℃条件下测定酶活。测定无上述添加物时的原始酶活力，并将其定义为100％，添加各化学试剂处理后的酶活力与原始酶活力的百分比即为该添加物下的相对酶活力(％)。

测定结果见表2，Mn²⁺和Fe²⁺对生淀粉糖化酶有促进作用，Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Li⁺、Co²⁺、Zn²⁺等离子对酶的活力影响不大，Ag⁺重金属离子能够显著抑制酶活力，Cu²⁺也对酶活有抑制作用。变性剂SDS对酶具有显著的抑制作用，金属螯合剂EDTA和表面活性剂Tween 80、TritonX-100对酶活力没有影响。此外，Ca²⁺对酶活没有影响，表明该酶是钙不依赖型糖化酶。

表2金属离子及化学试剂对生淀粉糖化酶活力的影响

六、生淀粉糖化酶的底物特异性

分别配制含1％不同生淀粉及可溶性淀粉的pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，测定的生淀粉包括：大米、玉米、木薯、马铃薯、红薯、荞麦。40℃条件下测定酶活力，将用木薯生淀粉测得的酶活力定义为100％，其它淀粉的酶活力与木薯生淀粉的酶活力之间的百分比为生淀粉糖化酶对该生淀粉的相对酶活(％)。

表3生淀粉糖化酶PoGA15A对不同淀粉的底物特异性

测定结果见表3，生淀粉糖化酶PoGA15A对所有测定的淀粉均有降解能力。在生淀粉中，对大米生淀粉的比活力最高，约为木薯生淀粉的活力的211％；对玉米生淀粉的活力与大米生淀粉相近，对木薯生淀粉、马铃薯生淀粉、荞麦生淀粉的活力逐渐下降，对甘薯生淀粉的活力最低。在所测定的淀粉底物中，生淀粉糖化酶对可溶性淀粉的活力最高，分别是大米生淀粉和木薯生淀粉的酶活力的334％和706％。

七、生淀粉糖化酶的吸附特性

取步骤一获得的纯酶液分别加入到含有1％、5％、10％生淀粉的pH 4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中充分混匀，放入40℃水浴锅中保温30min，期间不时地振荡EP管。吸附完成后，8000×g离心5min，取出上清液测定酶活力，同时测定相同条件下无生淀粉吸附底物的对照的酶活力。生淀粉糖化酶吸附率的计算根据以下公式：吸附率(％)＝(A–B)×100/A，其中A代表无生淀粉吸附底物的对照的酶活力，B代表吸附作用之后上清液中残留的酶活力( N,Ruiz J,López-Santín J,Z.Production and properties of the highlyefficient raw starch digestingα-amylase from a Bacillus licheniformis ATCC 9945a.Biochemical Engineering Journal,2011,53:203-209.)。

结果见表4，生淀粉糖化酶PoGA15A对测定的4种生淀粉都有吸附能力，对大米生淀粉的吸附率最高，对玉米、木薯生淀粉次之，对马铃薯生淀粉吸附力最低，这与该酶对上述四种生淀粉的比活力大小的顺序相一致，表明生淀粉糖化酶对生淀粉的水解能力与吸附特性有很强的正相关性。随着生淀粉浓度的升高，吸附率也随之升高，当生淀粉浓度升高至10％时，吸附率有微弱的下降。

表4生淀粉糖化酶PoGA15A对不同生淀粉底物的吸附特性

实施例2、生淀粉糖化酶基因的克隆、表达及鉴定

一、生淀粉糖化酶编码基因的克隆

1、生淀粉糖化酶PoGA15A的质谱分析

将实施例1获得的生淀粉糖化酶PoGA15A进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后脱色干净，双手带上干净的PE手套，用乙醇擦拭消毒后的手术刀将目的蛋白条带轻轻切割取出(尽量将目的条带边缘多余的蛋白胶切掉，以便后续的胰蛋白酶水解)，放入EP管中，37℃条件下胰蛋白酶水解过夜后，进行离子轨道肼质谱(LTQ-Orbitrap LC/MS/MS)检测。

获得了三条与来源于Penicillium marneffei和草酸青霉的糖化酶高度匹配的内部氨基酸多肽序列(结果见表5)。表中的多肽序列在NCBI网站用BLASTP比对分析，分别与来源于P.marneffei ATCC 18224的糖化酶(XP_002149243)和草酸青霉114-2的糖化酶(EPS34453)同源，序列同一性均为100％。

表5采用LC/MS/MS质谱分析经胰蛋白酶水解的生淀粉糖化酶PoGA15A产生的肽段匹配上的多肽序列

2、青霉GXU20转录组序列的测定

将1mL的青霉GXU20孢子悬液(浓度为1×10⁸个孢子/mL)接种到500mL三角瓶中含有的150mL产酶培养基中，28℃、180rpm培养4天。用灭菌后的纱布过滤后收集菌丝体，从菌丝体中提取总RNA，进行转录组测序，具体步骤如下：

(1)取出菌丝体，并用DEPC灭菌水将菌丝体清洗3次，再用灭过菌的滤纸将菌丝体的水分吸干。

(2)使用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取总RNA，具体方法步骤参见试剂盒说明书进行。

(3)用凝胶电泳及Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)检测提取的总RNA浓度和纯度。

(4)将提取的总RNA反转录，合成cDNA文库。

(5)将扩增纯化后的cDNA用Illumina^TM2000测序仪进行序列测定，

(6)对下机的原始数据进行过滤，去除接头(adapters)污染的reads和一部分低质量的reads，对数据作进一步的分析。

(7)由于没有参考的基因组序列，故采用de novo方法对转录组序列进行拼接组装。

(8)通过Blast2GO软件和SwissProt及NCBI非冗余蛋白质数据库对转录本进行功能注释。

对转录组进行拼接，共获得11359个unigene。对功能注释的转录本进行分析，共发现3个编码α-淀粉酶的基因，2个编码糖化酶的基因。将获得的生淀粉糖化酶PoGA15A的三条内部多肽序列与青霉GXU20的转录组测序得到的基因功能注释的多肽序列库进行比对，发现三条多肽序列均与同一基因功能注释为糖化酶的多肽序列的同一性为100％，因而确定了编码生淀粉糖化酶PoGA15A的全长cDNA序列。

3、生淀粉糖化酶PoGA15A的编码基因的克隆

收集青霉GXU20的菌丝体，研磨菌丝体，提取总RNA，将符合要求的总RNA反转录成cDNA，根据转录组获得的生淀粉糖化酶的基因序列设计引物(上游引物：5’ATGTCTCGACTTCTCTACGCAC 3’)，下游引物：(5’TTAGCGCCAGGTGTCGTTCT 3’)，PCR扩增出一条约为1.9kb大小的DNA序列，结果见图5。经序列测定，该序列长度为1908bp，序列比对分析发现克隆得到的基因序列与转录组获得的基因序列完全相同，该基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，命名其为cPoGA15A。序列表中序列1所示的DNA自5’端的第1-1908位核苷酸为cDNA基因cPoGA15A的开放阅读框(open reading frame,ORF)，由1908个核苷酸组成，自5’端的第1-3位核苷酸为cDNA基因cPoGA15A的起始密码子ATG，自5’端的第1906-1908位核苷酸为cDNA基因cPoGA15A的终止密码子TAA，自5’端的第1-57位核苷酸编码信号肽。

生淀粉糖化酶PoGA15A的基因编码一个含有635个氨基酸的蛋白质PoGA15A，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，其中自N端的第1-19位氨基酸为信号肽。

二、生淀粉糖化酶基因在毕赤酵母中的表达

1、生淀粉糖化酶基因表达载体的构建

为了使生淀粉糖化酶PoGA15A的基因在毕赤酵母中能实现高效表达，对生淀粉糖化酶PoGA15A的编码基因进行优化改造，获得用于毕赤酵母表达的DNA分子，将其命名为cPoGA15A-1，其核苷酸序列如序列表中序列3第13-1886位所示，编码序列表中序列4第5-625位氨基酸残基所示的蛋白质。

将上述生淀粉糖化酶基因cPoGA15A-1与pPIC9k载体用AvrⅡ和NotⅠ酶切后连接，转化DH5α感受态细胞，通过含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板筛选带有目的基因片段的转化子，提取重组质粒。对质粒进行AvrⅡ和NotⅠ双酶切鉴定(图6)。将双酶切鉴定正确的阳性克隆再次进行测序鉴定。将测序结果表明序列表中序列3的第19-1878位所示的DNA分子***到pPIC9k载体多克隆位点AvrⅡ和NotⅠ之间，保持pPIC9k载体其它序列不变的重组质粒命名为p9kPoGA15A-1。p9kPoGA15A-1含有编码序列表中序列4所示的蛋白质的编码基因，将该基因命名为cPoGA15A-2，其核苷酸序列如序列表中序列3第1-1878位所示。

2、生淀粉糖化酶基因的诱导表达

利用SalⅠ限制性内切酶对所获得的生淀粉糖化酶重组质粒p9kPoGA15A-1进行线性化，然后通过电转化方法将线性化后的重组质粒导入到毕赤酵母GS115感受态细胞内，分别涂布于G418浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的MD平板上，用通用引物5’AOX(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)和3’AOX(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)进行菌体PCR，验证重组转化子的正确性，将正确整合有p9kPoGA15A-1质粒的重组毕赤酵母菌株命名为Pp9kPoGA15A-1。挑取重组菌Pp9kPoGA15A-1进行扩大培养，扩大培养后接入BMMY诱导培养基中进行生淀粉糖化酶基因的诱导表达，每隔12h添加甲醇，使甲醇的终浓度为1％。将诱导后的表达上清液离心，测定酶活力，并用镍柱纯化重组表达蛋白，SDS-PAGE检测重组蛋白质。电泳结果表明，重组菌p9kPoGA15A-1诱导表达的生淀粉糖化酶与实施例1获得的天然生淀粉糖化酶PoGA15A分子量相似并被纯化(图7)。表明生淀粉糖化酶基因cPoGA15A-1在毕赤酵母中得到了表达，将重组表达的生淀粉糖化酶命名为rPoGA15A，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

三、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A酶学特性的鉴定

1、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A水解生淀粉的产物分析

向含2％木薯生淀粉的pH 4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中加入纯化的重组生淀粉糖化酶，40℃条件下水解4h，HPLC法检测上清液中的水解产物的成分，检测结果显示，反应4h后，在HPLC图谱中13.87min位置出现了唯一的葡萄糖色谱峰，证实所克隆表达的酶是糖化酶。

2、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的酶学特性的测定方法与实施例1中的天然酶PoGA15A特性的测定方法相同。经测定重组生淀粉糖化酶rPoGA15A的酶学特性与实施例1获得的天然生淀粉糖化酶PoGA15A性质相似，酶学性质见表6，结果表明生淀粉糖化酶在毕赤酵母表达***中得到了正确的表达。

表6重组生淀粉糖化酶与天然生淀粉糖化酶的酶学特性比较

实施例3、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在生淀粉的水解和生料同步糖化发酵产酒精中的应用

一、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对生淀粉高效快速的水解

1、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A对不同种类生淀粉的水解

总淀粉含量的测定：分别称取1g Co⁶⁰辐照灭菌的大米、玉米、木薯、马铃薯生淀粉放入指型瓶中，分别加入10mL的2M浓盐酸溶液，放置于沸水浴中20min，用2M的氢氧化钠溶液中和至pH 7.0左右，100mL容量瓶定容，DNS法测定上清液中葡萄糖含量，转化成对应的淀粉量，计算总淀粉的含量(Moon SK,Kim SW,Choi GW.Simultaneous saccharificationand continuous fermentation of sludge-containing mash for bioethanol production bySaccharomyces cerevisiae CHFY0321.Journal of Biotechnology,2012,157:584-589)。

纯化的重组生淀粉糖化酶对不同生淀粉的水解作用：分别配制含10g/L大米、玉米、木薯、马铃薯生淀粉的pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，分别吸取600μL的上述生淀粉缓冲液至2mL EP管中，按0.2U酶/mg生淀粉的酶用量加入实施例3获得的纯化后的重组生淀粉糖化酶，40℃振荡水浴锅中反应，分别于12h、24h、36h、48h、60h，72h取样，DNS法测定上清中的还原糖含量，计算水解率百分比，计算公式为：R_h＝(A₁/A₀)×0.9×100，其中R_h代表生淀粉的水解百分比；A₁代表重组生淀粉糖化酶水解淀粉后，上清液中还原糖的含量；A₀代表水解反应前，总淀粉的含量(Shafiei M,Ziaee A,Amoozegar MA.Purification and biochemical characterization of a novel SDS and surfactant stable,raw starch digesting,and halophilicα-amylase from a moderately halophilicbacterium,Nesterenkonia sp.strain F.Process Biochemistry,2010,45:694-699)。

水解结果见图8，生淀粉糖化酶rPoGA15A对大米和玉米生淀粉的水解效果较好，对木薯和马铃薯生淀粉水解效果次之，水解72h后对大米、玉米、木薯及马铃薯生淀粉的水解率依次为86.5％、71.9％、30.9％、14.8％。

2、重组生淀粉糖化酶添加量对生淀粉水解率的影响

以玉米生淀粉为水解底物，配制pH 4.5、150g/L的玉米生淀粉缓冲液，分别按0.05、0.1、0.2、0.5U生淀粉糖化酶/mg生淀粉4个设定的使用酶量，向反应体系中加入生淀粉糖化酶，置于40℃振荡水浴锅中，反应72h后取样，沸水浴中保温5min，DNS法测定上清液中还原糖的量，计算玉米生淀粉的水解率。

水解结果见图9，0.05、0.1、0.2、0.5U/mg生淀粉的酶添加量下，72h后的水解率分别为65.5％、66.5％，67.0％，70.6％，表明不同酶添加量对150g/L浓度玉米淀粉的水解率影响不大，可以选择0.05U/mg生淀粉的酶添加量进行生淀粉的水解和生料同步糖化发酵产酒精。

3、重组生淀粉糖化酶与α-淀粉酶协同水解不同浓度的玉米生淀粉

分别配制含50g/L、100g/L、150g/L玉米生淀粉的pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，向不同浓度的玉米生淀粉缓冲液中分别以0.05U酶/mg生淀粉的酶量加入生淀粉糖化酶rPoGA15A，并同时按0.05U酶/mg生淀粉的酶量添加α-淀粉酶，40℃振荡水浴锅中反应，每隔一定时间，在无菌超净台中取样，DNS法测定上清液中的还原糖含量，计算水解百分比。

结果见图10，生淀粉糖化酶rPoGA15A与α-淀粉酶协同对玉米生淀粉水解非常迅速，2h后，对50g/L、100g/L、150g/L浓度的生淀粉水解率分别为84.6％、78.3％、77.9％。6h后，50g/L浓度的淀粉已被完全降解，12h后，100g/L和150g/L浓度的淀粉也基本被完全水解，表明生淀粉糖化酶rPoGA15A与α-淀粉酶协同对玉米生淀粉的水解速度快、效果好。

4、重组生淀粉糖化酶与α-淀粉酶协同水解不同浓度的木薯生淀粉

分别配制浓度为50g/L、100g/L、150g/L木薯生淀粉的pH 4.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，向不同浓度的木薯生淀粉缓冲液中以0.05U酶/mg生淀粉的酶量加入生淀粉糖化酶rPoGA15A，并同时按0.05U酶/mg生淀粉的酶量添加α-淀粉酶，40℃振荡水浴锅中反应，每隔一定时间取样，DNS法测定上清液中的还原糖含量，计算水解百分比。

水解结果见图11，水解24h后，对50g/L、100g/L、150g/L浓度的生淀粉水解率分别为88.4％、87.8％、74.9％；48h后，50g/L和100g/L浓度的淀粉已几乎被完全降解，水解72h后，150g/L浓度的淀粉也基本被水解完全。结果表明生淀粉糖化酶rPoGA15A与α-淀粉酶协同显著提高了对木薯生淀粉的水解速度和水解率，可实现对木薯生淀粉的100％水解。

生淀粉糖化酶对玉米和木薯生淀粉的水解效果好，在淀粉加工工业中具有应用前景。

二、重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在生料同步糖化发酵产酒精中的应用

1、重组生淀粉糖化酶在玉米生淀粉的同步糖化发酵产酒精中的应用

在超净台内，按照表7的使用剂量，分别将辐照灭菌后的玉米生淀粉、生淀粉糖化酶(按0.05U生淀粉酶/mg生淀粉的酶用量加入)、α-淀粉酶(与生淀粉糖化酶的酶用量相同)、6％尿素、酿酒酵母、灭菌水，加入到50mL的三角瓶，充分混匀，用pH计调节pH值至4.0，用六层纱布将瓶口封紧，放入40℃恒温培养箱中，静置发酵，在发酵试验进行12h后，向三角瓶口加盖一层塑料薄膜。每隔12h取样，12000rpm离心5min，HPLC法测定上清液中未被发酵的糖和生成的酒精含量(Tanimura A,Kikukawa M,Yamaguchi S,Kishino S,OgawaJ,Shima J.Direct ethanol production from starch using a natural isolate,Scheffersomyces shehatae:Toward consolidated bioprocessing.Scientific Reports,2015,5:9593)。残留的淀粉含量的测定与总淀粉含量的测定方法相同，计算玉米生淀粉的酒精发酵效率。

表7玉米生淀粉同步糖化发酵产酒精的反应体系

发酵结果见图12。发酵12h后，玉米生淀粉被迅速水解，发酵液中的葡萄糖含量明显升高，酒精也快速地生成，水解和发酵同时进行；随着发酵时间的增加，发酵液中的葡萄糖含量逐渐下降，酒精快速生成，发酵48h后，乙醇产量为61.0g/L，发酵率为95.1％，残余葡萄糖和残余淀粉含量均低于0.2％，淀粉糖化发酵产酒精进行的非常完全、彻底。48h后发酵已经结束。

2、重组rPoGA15A在木薯生淀粉的同步糖化发酵产酒精中的应用

在超净台中，分别将辐照灭菌后的木薯生淀粉、重组生淀粉糖化酶(按0.05U生淀粉糖化酶/mg生淀粉的酶用量加入)、工业α-淀粉酶(按0.05U生淀粉酶/mg生淀粉的酶用量加入)、6％尿素、酿酒酵母、灭菌水，加入到50mL的三角瓶，充分混匀，反应体系中各成分的添加剂量与表7相同。发酵条件和发酵产物的测定及计算方法与玉米生淀粉同步糖化发酵产酒精相同。

发酵结果见图13，发酵12h后，发酵液中的木薯生淀粉含量快速下降，而发酵液中葡萄糖的浓度一直处于很低的水平(小于0.15％(w/v))，酒精含量迅速上升，表明木薯生淀粉糖化后的葡萄糖很快被酵母利用，发酵产生酒精，水解和发酵同步进行，两者速度比较协调。发酵36h后，酒精产量和发酵率分别达到57.0g/L和93.5％，发酵液中残余葡萄糖和残余淀粉含量很低(均小于0.3％)，达到了淀粉生产酒精工业中发酵结束后残糖量的检测要求，36h之后发酵完成。

玉米和木薯淀粉生料同步糖化发酵生产酒精进行的非常快速、有效、完全，表明重组生淀粉糖化酶rPoGA15A在生料同步糖化发酵酒精工业中具有较好的应用潜力。

Claims

1.DNA分子，为如下A1)-A5)中任一DNA分子：

A1)序列表中序列3所示的DNA分子；

A2)序列表中序列3的第1-1878位核苷酸所示的DNA分子；

A3)序列表中序列3的第19-1878位核苷酸所示的DNA分子；

A4)序列表中序列3的第19-1857位核苷酸所示的DNA分子；

A5)与A1)或A2)或A3)或A3)所限定的DNA分子至少具有98％的同一性，且序列表序列4所示蛋白质的DNA分子。

2.蛋白质为如下为a)或b)或c)或d)或e)或f)：

a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由序列表中序列4第7-625所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质是通过将权利要求1所述的DNA分子在生物细胞中进行表达得到的。

4.与权利要求2所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种；

B1)编码权利要求2所述的蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

5.一种制备生淀粉糖化酶的方法，包括将编码权利要求2所述的蛋白质的DNA分子在生物细胞中进行表达得到生淀粉糖化酶的步骤；

或，一种制备生淀粉糖化酶的方法，包括权利要求1所述的DNA分子在生物细胞中进行表达得到生淀粉糖化酶的步骤。

6.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2或3所述的蛋白质或权利要求4所述的生物材料或权利要求5所述的方法在如下C1)-C4)任一中的应用：

C1)制备生淀粉糖化酶或生淀粉糖化酶制剂；

C2)制备用于水解生淀粉的产品；

C3)生淀粉水解加工；

C4)生料同步糖化发酵酒精。

7.权利要求2或3所述的蛋白质在作为生淀粉糖化酶中的应用。

8.一种水解生淀粉的方法，包括在生淀粉中加入权利要求2或3所述的蛋白质和α-淀粉酶的步骤。

9.一种生料同步糖化发酵生产酒精的方法，包括在生淀粉中加入权利要求2或3所述的蛋白和α-淀粉酶的步骤。

10.权利要求2或3所述的蛋白质和α-淀粉酶在水解淀粉或生料同步糖化发酵生产酒精中的应用。