CN105106075B - 一种具有营养和保湿功效的组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种具有营养和保湿功效的组合物及其制备方法与应用。本发明先通过超声作用壳聚糖，再使用溶菌酶和纤维素酶进行第一步的酶解，接着使用壳聚糖酶和果胶酶进行第二步的酶解；酶解反应结束后，将酶解液进行灭活、脱色、固液分离，取液体，得到低聚葡萄糖胺水溶液；将甜菜根提取液、低聚葡萄糖胺水溶液、甲基异噻唑啉酮和苯氧乙醇混匀，得到具有营养和保湿功效的组合物。该具有营养和保湿功效的组合物在营养皮肤方面表现显著，对皮肤真皮层中影响皮肤衰老的成纤维细胞具有显著的促进增长的能力。将其用于制备得到的日用化妆品市场潜力大。

Description

一种具有营养和保湿功效的组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于日用化学品技术领域，具体涉及一种具有营养和保湿功效的组合物及其制备方法与应用。
背景技术
素有“人体第六生命要素”、“软黄金”之美誉的甲壳素(几丁质，Chitin)广泛存在于海产品和丝状菌类中。但由于其不溶于水，在开发应用上受到了很大的限制。而低聚葡萄糖胺(又称壳寡糖、甲壳低聚糖)由甲壳质脱乙酰化的产物壳聚糖降解获得，是由2～20个葡萄糖胺通过β-1-4糖苷键连接而成的低聚糖是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，其水溶性好，易被动物体吸收。
降解壳聚糖制备低分子量聚葡萄糖胺的主要方法有：化学降解法、物理降解法、酶解法，以及复合降解法。专利CN201010004264.6以米格列醇中间体作为原料采用化学合成法制备N-羟乙基葡萄糖胺；专利CN201310065854.3采用N-乙酰葡萄糖胺异构酶生产N-乙酰甘露糖胺；专利CN200910117918.3采用微生物化制备葡萄糖胺。化学降解法简便宜行，但降解产物相对分子质量较难控制，很难得到所需的活性葡萄糖胺；化学合成法合成具有活性的低聚葡萄糖胺得率相对较高，但是存在中间副产物的残留。酶法降解制备低聚壳聚糖近期受到了极大关注，但由于专一性酶价格昂贵、难以商业化，寻找其它降解效果好，价格低廉的非专一性酶，并通过物理、化学方法与酶法相结合探索出能够高效、安全生产低聚葡萄糖胺的复合降解法已经成为解决问题的突破口。
低聚葡萄糖胺几乎分布于人体所有组织，参与构造人体组织和细胞膜，特别是合成那些关节软骨以及滑液分子的中间物，体外研究表明低聚葡萄糖胺在临床上具有抗骨关节炎作用(复方盐酸氨基葡萄糖治疗骨关节炎的多中心随机双盲试验)、抗肿瘤作用(D-氨基葡萄糖盐酸盐体外抗肿瘤及其免疫调节作用)、有抗氧化、肝保护作用(氨基葡萄糖对CCl4所致小鼠肝损伤的改善作用)，低聚葡萄糖胺在临床上早有应用，但其在化妆品中的研究鲜见。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种制备低聚葡萄糖胺的方法。
本发明的另一目的在于提供一种兼具营养和保湿功效的组合物及其制备方法，其组分包含低聚葡萄糖胺。
本发明的再一目的在于提供所述具有营养和保湿功效的组合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有营养和保湿功效的组合物的制备方法，包括如下步骤：
(I)将壳聚糖溶解在0.2mol/L、pH值3～5.5的醋酸缓冲液中，超声；然后加入复合酶A，在40～55℃下反应4～8h；再加入复合酶B，在60～70℃下反应6～12h；酶解反应全程保持搅拌状态，酶解反应结束后，将酶解液进行灭活、脱色、固液分离，取液体，得到低聚葡萄糖胺水溶液；复合酶A由溶菌酶与纤维素酶按质量比1:1混合得到；复合酶B由壳聚糖酶和果胶酶按质量比1:1混合得到；
(II)在50质量份甜菜根提取液中加入50质量份步骤(I)获得的低聚葡萄糖胺水溶液中，接着加入0.1～0.15质量份甲基异噻唑啉酮和0.6～1质量份苯氧乙醇，搅拌均匀，得到具有营养和保湿功效的组合物。
步骤(I)中所述壳聚糖为市售化妆品级或医药级商品，优选来自雪蟹壳加工得到，脱乙酰度≥90.0％，相对分子质量(Mr)为(8～20)×104。
步骤(I)中所述的醋酸缓冲液的质量用量优选为相当于所述壳聚糖质量的100～200倍。
步骤(I)中所述的超声的条件优选为80～120KHz超声15～45min。
步骤(I)中所述的复合酶A的用量优选为相当于所述壳聚糖质量的0.5～10％。
步骤(I)中所述的复合酶B的用量优选为相当于所述壳聚糖质量的0.02～2％。
所述的溶菌酶来源于美国Sigma-Aldrich公司，类似于鸡蛋清溶菌酶，酶活力单位≥30,000U/ml，通过裂解β-1,4糖苷键催化一系列的壳聚糖水解反应。
所述的纤维素酶来源于美国Sigma-Aldrich公司，从绿色木霉中提取纯化，酶活力单位≥50U/mg，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，其结构与壳聚糖在糖苷键的连接上有相似之处，降解效果较为显著。
所述的壳聚糖酶亦称几丁质酶，来源自美国Sigma-Aldrich公司，酶活力单位≥200U/g。
所述的果胶酶来源自丹麦诺维信公司，酶活力单位为30万U/g。
步骤(I)中所述的搅拌的转速优选为150～250rpm。
步骤(I)中所述的灭活步骤优选为95～100℃加热反应5～10min。
步骤(I)中所述的脱色步骤中脱色剂优选为活性炭或硅藻土，其添加量相当于所述壳聚糖质量的1～2倍，脱色温度为45～55℃，脱色时间为1～2h。
步骤(I)中所述的固液分离优选为通过离心方法实现。
所述的离心的转速优选为3000～5000rpm。
步骤(I)中所述的低聚葡萄糖胺的分子量经凝胶渗透色谱(GPC)分析，其分子量分布为：2～8％的分子量不大于200(含端点值200)，20～35％的分子量为大于200且不大于500(含端点值500)，30～50％的分子量为500～2000，余下的分子量不小于2000(含端点值2000)。
步骤(I)中所述的低聚葡萄糖胺的色泽采用铂-钴比色法测定，其色度为50～100。
步骤(II)中所述的甜菜根提取液为市售化妆品级产品商品，其中甜菜碱的含量≥5％。
步骤(II)中所述的甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇为市售化妆品级产品商品。
步骤(II)中所述的搅拌的条件优选为200～300rpm搅拌10～15min。
一种具有营养和保湿功效的组合物，通过上述制备方法得到。
所述的有营养和保湿功效的组合物适合用于制备日用化妆品。
所述的具有营养和保湿功效的组合物的应用，可以直接加入化妆品配方中，如水剂、乳剂、膏剂等剂型，添加温度为45～55℃。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)通过超声波法与酶解法联合处理制备低聚葡萄糖胺，工艺过程简单、成本低廉，产品的水溶性好，色泽浅；经过连续的中试试验和规模生产检验，能实现年产500吨生产能力；
(2)所获得的低聚葡萄糖胺分子量分布较宽，大部分集中于200～2000道尔顿，在人体皮肤表面易于被吸收；高于2000道尔顿的大分子低聚葡萄糖胺在表皮成膜，起到保湿及皮肤屏障的作用；
(3)甜菜根提取液含有天然甜菜碱，是一种小分子的氨基酸，能够提高低聚葡萄糖胺在皮肤表面的渗透，并且天然甜菜碱本身也具有较好的保湿作用；
(4)本发明提供的具有营养和保湿功效的组合物其在营养皮肤方面表现显著，对皮肤真皮层中影响皮肤衰老的成纤维细胞具有显著的促进增长的能力。
附图说明
图1是本发明具有营养和保湿功效的组合物与EGF分别对成纤维细胞活性的影响检测结果图。
图2是实施例1～3制备的组合物的保湿度测试结果图。
图3是组合物1和透明质酸的保湿度比较结果图。
图4是组合物1和对比组合物1～3的保湿度比较结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(I)将2质量份壳聚糖(脱乙酰度为92.0％，分子量8×104)溶解在200质量份0.2mol/L、pH 3的醋酸缓冲液中，80KHz超声波超声15min，然后加入0.005质量份溶菌酶(Sigma-Aldrich，下同)、0.005质量份纤维素酶(Sigma-Aldrich，下同)，在40℃下反应4h；接着加入0.0025质量份壳聚糖酶(Sigma-Aldrich，下同)和0.0025质量份果胶酶(丹麦诺维信，下同)，在60℃下反应6h。酶解反应全程保持150rpm的搅拌状态，酶解反应结束后，将酶解液在95℃加热反应5min灭活，接着降温至45℃，加入2质量份活性炭，脱色时间为1h，滤去活性炭。最后以转速3000rpm离心，取上层清液，得到约150质量份低聚葡萄糖胺水溶液，色度为50。
(II)室温下，将50质量份甜菜根提取液加入50质量份步骤(I)获得的低聚葡萄糖胺水溶液中，加入0.1质量份甲基异噻唑啉酮、0.6质量份苯氧乙醇，以200rpm搅拌10min，得到一种具有营养和保湿功效的组合物1。
以实施例1生产工艺得到的低聚葡萄糖胺水溶液采用凝胶渗透色谱(GPC)对其分子量分布及其相对含量进行测定，实验结果见表1。
表1 本发明生产的低聚葡萄糖胺的分子量分布结果
实施例2
(I)将2质量份壳聚糖(脱乙酰度为91.5％，分子量12×104)溶解在400质量份0.2mol/L、pH为5.5的醋酸缓冲液中，120KHz超声波超声45min，然后加入0.1质量份溶菌酶、0.1质量份纤维素酶，在55℃下反应8h；接着加入0.05质量份壳聚糖酶和0.05质量份果胶酶，在70℃下反应12h。酶解反应全程保持250rpm的搅拌，酶解反应结束后，将酶解液在100℃加热反应10min灭活，接着降温至55℃，加入4质量份活性炭，脱色时间为2h，滤去活性炭。最后以转速5000rpm离心，取上层清液，得到350质量份低聚葡萄糖胺水溶液，色度为100。
(II)室温下，将50质量份甜菜根提取液加入50质量份步骤(I)获得的低聚葡萄糖胺水溶液中，加入0.15质量份甲基异噻唑啉酮、1质量份苯氧乙醇，以300rpm搅拌15min，得到一种具有营养和保湿功效的组合物2。
以实施例2的生产工艺生产的低聚葡萄糖胺水溶液采用凝胶渗透色谱(GPC)对其分子量分布及其相对含量进行测定，实验结果见表2。
表2 本发明生产的低聚葡萄糖胺的分子量分布结果
实施例3
(I)将2质量份壳聚糖(脱乙酰度为92.7％，分子量20×104)溶解在300质量份0.2mol/L、pH为4.5的醋酸缓冲液中，100KHz超声波超声30min，然后加入0.05质量份溶菌酶、0.05质量份纤维素酶，在50℃下反应6h；接着加入0.0025质量份壳聚糖酶和0.0025质量份果胶酶，在65℃下反应8h。酶解反应全程保持200rpm的搅拌，酶解反应结束后，将酶解液在98℃加热反应8min灭活，接着降温至50℃，加入3质量份活性炭，脱色时间为1.5h，滤去活性炭。最后以转速4500rpm离心，取上层清液，得到得到250质量份低聚葡萄糖胺水溶液，色度为80。
(II)室温下，将50质量份甜菜根提取液加入50质量份步骤(I)获得的低聚葡萄糖胺水溶液中，加入0.12质量份甲基异噻唑啉酮、0.8质量份苯氧乙醇，以250rpm搅拌13min，得到一种具有营养和保湿功效的组合物3。
以实施例3的生产工艺生产的低聚葡萄糖胺水溶液采用凝胶渗透色谱(GPC)对其分子量分布及其相对含量进行测定，实验结果见表3。
表3 本发明生产的低聚葡萄糖胺的分子量分布结果
对比例1
与实施例1步骤(I)基本相同，区别仅在于略去超声步骤，获得的低聚葡萄糖胺的分子量分布如下：
表4 本发明生产的低聚葡萄糖胺的分子量分布结果
从对比例1中可以看出，超声过程具有一定的作用，超声所产生的强烈空化作用使得壳聚糖分子链段打开，部分链段断开，使得壳聚糖降解。但是由于壳聚糖本身较为稳定，超声并不足以使其完全降解至低聚葡萄糖胺。
以对比例1获得的低聚葡萄糖胺按实施例1步骤(II)，获得对比组合物1。
对比例2
与实施例2步骤(I)基本相同，区别仅在于略去复合酶A降解步骤，即不添加0.1质量份溶菌酶、0.1质量份纤维素酶以及不进行55℃下反应8h。获得的低聚葡萄糖胺的分子量分布如下：
表5本发明生产的低聚葡萄糖胺的分子量分布结果
从对比例2中可以看出，不进行由溶菌酶和纤维素酶组成的复合酶A的降解过程，所获得的低聚葡萄糖胺的分子量明显较大。
以对比例2获得的低聚葡萄糖胺按实施例2步骤(II)，获得对比组合物2。
对比例3
与实施例3步骤(I)基本相同，区别仅在于将复合酶A和复合酶B的酶解过程调换顺序，其他工艺参数相同，所获得的低聚葡萄糖胺的分子量分布如下：
表6 本发明生产的低聚葡萄糖胺的分子量分布结果
从对比例3中可以看出，调换复合酶A和复合酶B的酶解过程，获得的低聚葡萄糖胺分子量有所提高，这是由酶的选择性所决定的，溶菌酶和纤维素酶适合降解较大分子量的壳聚糖，而壳聚糖酶和果胶酶对经过降解的壳聚糖效果更显著。
以对比例3，获得对比组合物3。
功能性评价：
1.采用CCK-8细胞活性检测法检测实施例1中得到的营养保湿组合物1对人成纤维细胞增殖活性影响，以促表皮生长因子(EGF 5000IU)作为阳性对照组；
方法：制备单细胞(成人真皮纤维原细胞HDF-a 2320，上海斯信生物科技有限公司)，悬液，以1×104个/ml的浓度接种于96孔培养板中，37℃孵育12h，每孔加入不同浓度(0.01％、0.02％、0.05％、1％(v/v))的营养保湿组合物，阳性对照组设置4组，每孔添加浓度(0.01％、0.02％、0.05％、1％(v/v))与营养保湿组合物一样，另设1组常规培养对照组，每组6个平行样，加样品后继续孵育24h，后加入CCK-8 15μl的继续培养3h，450nm波长测定吸光值，细胞活性结果见图1。
从图1可以看出，0.01％～1％浓度的营养保湿组合物1具有促进成纤维细胞增长的作用，其增值能力比EGF稍弱，具有明显的增值效果。
2.保湿度测试
分别测定实施例1～3制备的组合物1～3、对比组合物1～3、透明质酸(130～150万分子量)水溶液的保湿作用，分别配制成1％(v/v)的水溶液，使用德国CK公司的多功能皮肤测试仪MPA10，连接Corneometer CM825水份测试探头，按照QB/T 4256-2011《化妆品保湿功效评价指南》测定保湿度。
组合物1～3相互之间对比，其保湿能力非常接近，如图2所示。
以1％组合物1与1％透明质酸做对比，如图3所示，结果表明：1％组合物1的保湿能力接近1％透明质酸的保湿度，且2h之后的持续保湿效果能力强于透明质酸。
以1％组合物1与1％的对比组合物1～3做对比，如图4所示，结果表明，尽管对比组合物1～3在初始的保湿能力强于1％组合物1，但是在1h后的保湿能力不如1％组合物1；可能原因是：对比组合物1～3中低聚葡萄糖胺的分子量较大，初始成膜能力较强，但后期其从空气中吸收水分的能力比含有更小分子低聚葡萄糖胺的组合物1弱。
应用测试
用上述实施例3中得到的营养保湿组合物应用在精华液中，配方如下，见表7：
表7 护肤精华液配方(％)
制备工艺：搅拌下将A相中物料依次冷水中，搅拌升温至82～85℃，至物料全部溶解，保温15～30min；降温至60～65℃，依次加入分别预先混合好的C相和D相，降温至40～45℃，加入B相，得到护肤精华液。
从外观上看，均匀一致。选用30～45岁女性100人擦拭上述护肤精华液于皮肤上，调查报告表明，90％的人数选择不油腻，保湿效果维持时间长达4h。且85％的人表述每日早晚使用两次，使用1个月后皮肤细纹变淡或消失。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种具有营养和保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(I)将壳聚糖溶解在0.2mol/L、pH值3～5.5的醋酸缓冲液中，超声；然后加入复合酶A，在40～55℃下反应4～8h；再加入复合酶B，在60～70℃下反应6～12h；酶解反应全程保持搅拌状态，酶解反应结束后，将酶解液进行灭活、脱色、固液分离，取液体，得到低聚葡萄糖胺水溶液；复合酶A由溶菌酶与纤维素酶按质量比1:1混合得到；复合酶B由壳聚糖酶和果胶酶按质量比1:1混合得到；
(II)在50质量份甜菜根提取液中加入50质量份步骤(I)获得的低聚葡萄糖胺水溶液中，接着加入0.1～0.15质量份甲基异噻唑啉酮和0.6～1质量份苯氧乙醇，搅拌均匀，得到具有营养和保湿功效的组合物；
步骤(I)中所述的低聚葡萄糖胺的分子量经凝胶渗透色谱分析，其分子量分布为：2～8％的分子量不大于200，20～35％的分子量为大于200且不大于500，30～50％的分子量为大于500且小于2000，余下的分子量不小于2000。
2.根据权利要求1所述具有营养和保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：步骤(I)中所述的复合酶A的用量相当于所述壳聚糖质量的0.5～10％。
3.根据权利要求1所述具有营养和保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：步骤(I)中所述的复合酶B的用量相当于所述壳聚糖质量的0.02～2％。
4.根据权利要求1所述具有营养和保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：
步骤(I)中所述壳聚糖为脱乙酰度≥90.0％，相对分子质量为(8～20)×104的壳聚糖；
所述的溶菌酶的酶活力单位≥30,000U/ml；
所述的纤维素酶的酶活力单位≥50U/mg；
所述的壳聚糖酶的酶活力单位≥200U/g；
所述的果胶酶的酶活力单位为30万U/g。
5.根据权利要求1所述具有营养和保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：
步骤(I)中所述的醋酸缓冲液的质量用量为相当于所述壳聚糖质量的100～200倍；
步骤(I)中所述的超声的条件为80～120K Hz超声15～45min；
步骤(I)中所述的搅拌的转速为150～250rpm；
步骤(I)中所述的灭活步骤优选为95～100℃加热反应5～10min；
步骤(I)中所述的脱色步骤中脱色剂为活性炭或硅藻土；
步骤(I)中所述的固液分离优选为通过离心方法实现；
步骤(II)中所述的搅拌的条件为200～300rpm搅拌10～15min。
6.一种具有营养和保湿功效的组合物，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的制备方法得到。
7.权利要求6所述的具有营养和保湿功效的组合物的应用，其特征在于：所述的具有营养和保湿功效的组合物用于制备日用化妆品。
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酶法降解壳聚糖工艺研究;涂绍勇等;《化学与生物工程》;20091231;第26卷(第12期);第63-65页

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