KR101632262B1

KR101632262B1 - DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물

Info

Publication number: KR101632262B1
Application number: KR1020130137079A
Authority: KR
Inventors: 이제현; 홍순광; 홍선주; 이문희
Original assignee: 다인바이오 주식회사
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2013-11-12
Publication date: 2016-06-21
Also published as: JP2016505521A; JP6088657B2; KR20140061272A; CN104780943A; CN104780943B; KR101632262B9

Abstract

본 발명은 DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유함으로써 비만 또는 당뇨의 예방, 치료, 개선 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응산물이 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 나타내기 때문에, 본 발명의 조성물을 투여하거나 섭취하면 효과적으로 비만 및 당뇨를 예방, 치료 및 개선할 수 있다.

Description

DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물{Agar-derived neoagarooligosaccharide complex for the prevention and treatment of obesity and/or diabetes comprising enzyme reaction products of beta agarase DagA and agar}

본 발명은 DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유함으로써 비만 또는 당뇨의 예방, 치료, 개선 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

한천(Agar)은 오래 전부터 식품첨가물, 의약품, 화장품, 가축사료 및 공업원료 등으로 널리 이용되고 있는 대표적인 해조류 유래 다당류로, 국내의 경우 해마다 그 생산량이 약 3,600톤에 이르고 있는 비교적 풍부한 수산자원의 하나이다. 그러나 실제 이용 면에서는 전체생산량의 일부만이 단순가공 처리되어 값싼 원료로 사용될 뿐이며, 그 나머지는 대부분 방치되고 있어 부존자원량에 비해 부가가치가 매우 낮은 실정이다. 따라서 풍부한 국내 한천의 새로운 용도개발과 부가가치 향상에 관한 연구가 크게 요구되고 있는 실정이다.

한천은 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)으로 구성되어있는데, 아가로스는 갈락토스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose가 β-1, 4 형태로 결합한 단위체인 아가로비오스(agarobiose)가 반복되어 α-1, 3 결합으로 연결된 직쇄구조로 되어있고 겔(gel)화력이 강한 반면, 아가로펙틴은 아가로스와 마찬가지로 아가로비오스 단위로 되어 있으나 황산기 등의 산성기를 함유하며 겔화력이 약하다.

이중 아가로스는 β-1, 4 결합에 작용하는 베타-아가레즈(β-agarase)에 의해서 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로비오스(neoagarobiose)로 분해되고 계속해서 α-1, 3 결합에 작용하는 알파-아가레즈(α-agarase)에 의해서 갈락토스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose로 최종 분해된다.

한편, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) A3(2)는 한천을 분해하는 세포외(세포밖으로 분비되는) 아가레즈를 생산한다고 알려져 있으며(Stanier et al., 1942, J. Bacteriol.; Hodgson and Chater, 1981, J. Gen. Microbiol.), 이 아가레즈는 dagA 유전자에 의해서 코드되어 있다. 방선균에서는 dagA 유전자가 그 기능이 유일하게 알려진 베타-아가레즈(β-agarase) 유전자로서 방선균에서의 아가레즈 생산 연구에 있어서 중요한 위치를 갖는다. 특히 스트렙토마이세스 시리칼라는 방선균의 분자생물학적 연구에 가장 널리 사용되는 균주로서 2002년 영국의 Sanger centre에서 염색체 DNA의 서열이 분석되어 공개되어 있다(Bentley et al.,2002, Nature).

본 발명자는 풍부한 수산자원인 한천을 보다 유용하게 활용할 수 있는 방법을 개발하고자 하였고, 한천이 다당류이므로 당분해효소를 적절히 활용하면 한천의 분해과정에서 생리활성효과를 나타내는 다양한 당 유래 화합물이 생성될 수 있다는 가능성에 주목하게 되었다. 그리고 방선균은 항생제 등 유용한 생리활성물질을 생산하는 미생물이며, 이 생리활성물질에는 당과 관련된 다양한 화합물이 포함되기 때문에, 방선균 중에는 한천을 분해하거나 변형시켜 유용한 당 화합물로 전환시킬 수 있는 효소를 보유한 균주가 있을 것이라 생각하였다. 따라서 이러한 방선균으로부터 유용한 효소를 탐색하고 이를 한천의 효소반응에 적용하여 유용한 생리활성 물질의 생산을 시도하였다.

한천과 같은 고분자 다당류는 효소반응을 통해 상대적으로 크기가 작은 올리고당이 생성될 수 있다. 이러한 올리고당 중에는 생체의 대사에 사용되는 올리고당과 분자적 형태는 유사하지만 관련 효소가 분해할 수 없기 때문에 결과적으로 당분해 효소의 활성을 저해할 수 있는 것들이 존재한다. 본 발명자는 이 점에 주목하여, 한천의 효소반응산물에 대한 당분해 효소 활성의 저해능을 확인함으로써 비만이나 당뇨에 효과적인 물질을 개발하고자 하였다.

이의 결과, 방선균인 스트렙토마이세스 시리칼라의 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응을 통해 수득한 반응산물이 비만 또는 당뇨의 예방, 치료, 개선에 우수한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0093120호

Stanier RY. 1942. Agar decomposing strains of the Actinomyces coelicolor species group. J. Bacteriol. 44:555-570. Hodgson, D. A., and K. F. Chater. 1981. A chromosomal locus controlling extracellular agarase production by Streptomyces coelicolor A3(2) and its inactivation by chromosomal integration of plasmid SCP1. J. Gen. Microbiol. 124:339-348. Bentley SD, et al. 2002. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417:141-147.

따라서 본 발명의 주된 목적은 한천을 기질로 하는 효소반응을 통해 생산되는 유용한 생리활성 물질, 그 중에서도 특히 지방세포 분화 및 당 대사를 조절함으로써 비만 또는 당뇨에 우수한 효과를 나타내는 생리활성 물질을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 반응산물을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료를 제공한다.

본 발명에서 상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스(agarose) 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것이 바람직하다. 이때 1unit은 0.2%(w/v)로 아가로스를 녹인 50mM 인산용액(pH 7)과 40℃에서 5분간 반응(반응액 4㎖)한 후 반응액과 동량의 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ / 1ℓ 증류수)을 넣고 10분간 끓인 다음 식혀 흡광도(Å540㎚)을 측정하였을 때, 흡광도(Å540㎚) 0.001을 생성하는 양을 의미한다.

본 발명에서 상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 네오아가로올리고당 혼합물을 유효성분으로 함유하며, 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 또는 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료를 제공한다.

본 발명에서 상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 10중량% 이하의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA는 서열번호 2의 31 ~ 309번 사이의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미하며, 스트렙토마이세스 시리칼라로부터 생산되거나 이종균주로부터 생산된 단백질을 포함한다. 또한, 기능이 전혀 다른 것으로 변경되거나 아가레즈 활성을 잃지 않는 범위 내에서 통상적인 유전자 재조합 방법 즉, 정제를 유리하게 하기 위해 표지 아미노산을 포함시키거나 이종 발현을 위해 아미노산 서열을 변경하는 등의 방법에 따라 재조합된 단백질을 포함한다.

DagA는 본래 스트렙토마이세스 시리칼라가 생산하는 베타-아가레즈로 유전자로부터 번역될 때 서열번호 2의 309개 아미노산을 갖고 분자량이 약 35kDa인 상태로 생산되며, N-말단 30개의 아미노산 시그널 펩티드가 잘려져서 완성된 세포외형 단백질(약 32kDa)의 상태로 분비된다.

스트렙토마이세스 시리칼라의 dagA 유전자가 이 DagA를 암호화하며, dagA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다. 서열번호 1은 스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 게놈에 존재하는 유전자의 염기서열로 NCBI(미국 국립생물정보센터) 데이터베이스 상에 “SCO3471”로 명명되어 있다. In vitro 실험을 통해 확인된 바에 따르면, dagA 유전자의 전사는 RNA 중합효소의 적어도 다른 3가지의 완전효소(holoenzyme)에 의해 인지되는 4 또는 5가지의 다른 프로모터(promoter)에 의해 조절된다. dagA 유전자의 전사단계 분석을 통해, 전사가 암호화 서열의 상부 32, 77, 125 및 220번째 염기에서 개시되는 것으로 나타났다.

본래 DagA의 생산 균주인 스트렙토마이세스 시리칼라의 배양을 통해 본 발명의 DagA를 생산할 수 있으나, 생산효율을 높이기 위해 이종균주인 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans)의 발현 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 dagA 유전자를 방선균용 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 다음 이 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스를 형질전환하고, 이 형질전환체를 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 이 경우 재조합 벡터는 dagA 유전자가 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성하는 것이 바람직하다.

방선균 유래 프로모터에는 sgtR 프로모터(sgtRp), ermE 프로모터(ermEp), tipA 프로모터(tipAp) 등 다양한 프로모터가 존재하므로 재조합 벡터를 제조할 때 이들을 선택하여 사용할 수 있다. 이들 프로모터에 의해 전사가 조절될 수 있도록 구성된 여러 종류의 벡터들이 개발되어 있어, 이 벡터에 SCO3471를 클로닝하면 방선균 유래 프로모터에 의해 전사가 조절되는 구조의 재조합 벡터를 제조할 수 있다.

형질전환체는 숙주균주를 재조합 벡터로 형질전환시켜 제조할 수 있는데, 숙주균주에 따라 형질전환을 위한 방법이 다양하게 존재하므로, 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 리비던스를 숙주균주로 사용하는 경우 PEG(polyethylene glycol)를 매개로한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.

형질전환체 등과 같은 DagA 생산균주를 액체배지에서 배양하면 DagA를 생산할 수 있으며, 배양액을 수득하여 한외여과법과 같은 통상의 단백질 정제 방법을 이용하면 고순도의 DagA를 생산할 수 있다. 이때 액체배지에 아가(agar) 또는 아가로스(agarose)를 포함시키면 보다 효율적으로 DagA를 생산할 수 있다.

본 발명에 따르면, 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응을 통해 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로비오스가 생성되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에서 효소반응산물은 이들 각각이 될 수 있으며, 이들이 혼합된 상태가 될 수 있다. 하지만, 본 발명에서 확인된 이들 세 가지 반응산물 이외에도 다른 반응산물이 생성될 수 있으므로, 반드시 이들 세 가지 반응산물로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응 이후 한외여과를 통해 수득한 반응산물(네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로비오스가 모두 포함된 형태이며, 이들 이외의 반응산물이 포함되어 있을 수 있음) 뿐만 아니라 각각의 네오아가로헥사오스, 네오아가로테트라오스, 네오아가로비오스 또한 비만 및 당뇨의 예방 및 치료 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

본 발명의 조성물은 의약품 및 식품 등의 용도로 사용할 수 있다.

식품의약품안전처(MFDS)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있으며, 통상적인 방법으로 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시킬 수 있다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조할 수 있다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 10 내지 200㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

상기 유효량을 기준으로, 본 발명은 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응산물 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 함유하는 식품을 제공한다. 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수의 식품에 포함하여 사용할 수 있다. 각 식품의 조리 방법이나 생산 방법은 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명한 사항으로 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 상술한 약제학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있다.

상기 유효량을 기준으로, 본 발명은 한천 또는 아가로스와 DagA의 효소반응산물 그 자체 또는 사료로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 함유하는 사료를 제공한다. 급이 대상의 기본식이소재에 본 발명의 조성물을 포함하여 사용할 수 있다. 특히, 운동이 부족하여 비만이 걱정되는 개, 고양이 등의 애완동물이나 경주마의 사료로 사용하면 효과적일 것이다.

본 발명에 따르면, 스트렙토마이세스 시리칼라 DagA와 한천 또는 아가로스의 효소반응산물이 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 나타내기 때문에, 본 발명의 조성물을 투여하거나 섭취하면 효과적으로 비만 및 당뇨를 예방, 치료 및 개선할 수 있다.

도 1은 pUWL201pw 벡터의 지도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 벡터의 지도이다.
도 3은 본 발명의 효소반응산물을 HPLC-ELSD 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 효소반응산물(이하, 'NAO'라 한다) 또는 이를 정제하여 수득한 네오아가로헥사오스(이하, 'DP6'라 한다), 네오아가로테트라오스(이하, 'DP4'라 한다), 네오아가로비오스(이하, 'DP2'라 한다)의 알파-아밀라아제 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 NAO 또는 DP6, DP4, DP2의 알파-글루코시다아제 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 정상식이(이하, 'ND'라 한다), 고지방식이(이하, 'HFD'라 한다), 0.25%(w/w) 본 발명의 효소반응산물이 포함된 고지방식이(이하, 'HFD-NAO 0.25%'라 한다) 또는 0.5%(w/w) 본 발명의 효소반응산물이 포함된 고지방식이(이하, 'HFD-NAO 0.5%'라 한다)를 섭취시킨 실험동물의 일자별 체중증가량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 간 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 촬영한 사진이다. A는 ND, B는 HFD, C는 HFD-NAO 0.25%, D는 HFD-NAO 0.5% 실험군의 조직을 나타낸다.
도 8은 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 간 지방변성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 부고환지방조직 세포의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 10은 ND, HFD, HFD-NAO 0.25% 또는 HFD-NAO 0.5%를 섭취시킨 실험동물의 부고환지방조직을 H&E 염색하여 현미경으로 촬영한 사진(A ~ D)과 경구 당 부하시험 결과를 나타낸 그래프(E)이다. A는 ND, B는 HFD, C는 HFD-NAO 0.25%, D는 HFD-NAO 0.5% 실험군의 조직을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. DagA 생산

스트렙토마이세스 시리칼라 A3(2)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 아래의 Asm-F 및 Asm-R 프라이머를 사용한 PCR을 통해 dagA 유전자 단편(DagA의 시그널 펩타이드 및 완성형 펩타이드가 암호화된 947bp 단편, 서열번호 1에 프라이머의 일부 서열이 포함된 상태)을 증폭하였고, 단편의 제한효소 부위(NdeI/BamHI)를 이용하여 pUWL201pw 벡터(도 1 참조)에 dagA 유전자를 클로닝하여 dagA 유전자의 전사가 ermE 프로모터에 의해 조절되도록 재조합 벡터(도 2 참조)를 제조하였다.

Asm-F 프라이머 : 5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI) (서열번호 3)

Asm-R 프라이머 : 5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3′(BamHI) (서열번호 4)

이 재조합 벡터로 스트렙토마이세스 리비던스(Streptomyces lividans) TK24를 형질전환하여 수득한 형질전환균주를 DagA의 생산을 위해 사용하였다.

이 균주를 0.3%(w/v)의 아가(agar)가 포함된 R2YE 액체배지에 접종하여 28℃에서 48 내지 72시간 120rpm으로 진탕배양하였다. 전배양 과정을 거친 다음 본배양을 실시하였으며, 각 배양시간은 2.5일로 하였다.

본배양을 통해 수득한 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 상층액을 한외여과막(5kDa cut-off membrane)으로 여과하여 여과막을 통과하지 못한 단백질을 분리 및 정제하였다. 수득한 농축액(효소액)은 동결건조하여 보관하면서 사용하였다.

실시예 2. DagA의 아가레즈 활성 측정

환원당량 검정방법(DNS method)으로 상기 실시예 1의 DagA에 대한 아가레즈 활성을 측정하였다. 실시예 1에서 수득한 효소액 100㎕에 0.2%(w/v)로 아가로스를 녹인 50mM 인산용액(pH 7) 3.9㎖를 섞어 40℃에서 5분간 반응시킨 후 DNS 시약(dinitrosalicylic acid 6.5g, 2M NaOH 325㎖, glycerol 45㎖ / 1ℓ 증류수) 4㎖를 넣고 10분간 끓인 다음 식혀 흡광도(Å540㎚)을 측정하였다. 효소 1U은 5분 반응 후에 흡광도(Å540㎚) 0.001을 생성하는 활성으로 정의하였다.

실시예 3. DagA 효소반응산물

3-1. DagA를 이용한 한천 또는 아가로스의 분해

0.5 내지 5%(w/v) 한천 또는 아가로스를 녹인 20mM Tris-HCl 용액 1ℓ를 제조하여 100℃에서 약 10분간 가열하여 충분히 녹인 다음 40℃로 온도를 떨어뜨리고 DagA 효소 2,000 내지 50,000U을 처리하여 24시간 효소반응을 실시하였다.

3-2. DagA 효소반응산물의 전처리

효소반응산물에서 미분해된 아가로스를 제거하기 위해 원심분리하여 상등액을 회수한 다음 TLC(thin layer chromatography)를 이용하여 효소반응 생성물을 확인하였다. 회수한 상등액을 5KDa cut-off membrane으로 한외여과방법을 통해 부분 정제하였다.

실시예 4. HPLC-ELSD 분석을 통한 DagA 효소반응산물의 조성 확인

HPLC-ELSD 분석을 통해 상기 실시예 4에서 수득한 효소반응산물의 조성을 확인하였다. NH₂ P-50 4E multimode column(250 x 4.6mm)을 사용하였으며 이동상으로 아세토니트릴(acetonitrile)과 물의 혼합용액(acetonitrile : water = 65 : 35)을 사용하였다.

이의 결과, 도 3에서와 같이 반응산물 중 네오아가로비오스(neoagarobiose, 이하 'DP2'라 한다), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose, 이하 'DP4'라 한다) 및 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose, 이하 'DP6'라 한다)의 합으로 이루어진 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides)의 총량이 65±20%(중량)를 차지하는 것으로 나타났고, 이 네오아가로올리고당의 총량을 기준으로 DP2, DP4, DP6가 각각 0 ~ 10%, 50 ~ 70%, 30 ~ 50%(중량)를 차지하는 것으로 나타났다.

실시예 5. 겔여과 크로마토그래피를 이용한 DagA 효소반응산물의 정제

BioGel P-2 gel(Biorad, Cat. No.: 150-4115)을 이용하여 겔여과 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)를 통해 DP6, DP4, DP2를 순수하게 정제하여 정제한 산물들은 TLC와 HPLC를 통해 순도를 확인하였다.

실시예 6. DagA 효소반응산물의 항비만 및 항당뇨 효능 확인 시험

6-1. 알파-아밀라아제(α-amylase) 저해 활성

상기 실시예 5에서 정제를 통해 수득한 DP2, DP4, DP6 및 실시예 3에서 수득한 효소반응산물(이하 'NAO'라 한다)을 시료로 사용하였다.

제2형 당뇨병 치료제로 널리 알려져 있는 아카보스(acarbose)는 알파-아밀라아제 및 알파-글루코시다아제의 활성을 억제하여 당 흡수를 지연시키는 기작으로 항당뇨 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 따라서 네오아가로올리고당의 당뇨관련성을 확인하기 위해 아카보스와 유사한 효소활성 억제 기능이 있는지를 조사하였다.

알파-아밀라아제 용액과 각 시료를 섞고 기질로서 전분 청색 시약(starch azure solution)을 넣어 10분간 반응시킨 다음 분해되어 나타나는 청색의 농도를 흡광도(Å595㎚)로 측정하여 효소활성을 분석하였다.

이의 결과, 도 4에서와 같이 각 시료가 알파-아밀라아제 저해 활성을 갖는 것으로 나타났으나, 아카보스(양성 대조군)에 비해서는 저해활성이 낮은 것으로 나타났다.

6-2. 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성

DP2, DP4, DP6 및 NAO를 시료로 사용하였다.

알파-글루코시다아제 용액과 각 시료를 섞고, 기질로서 p-NPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside) 용액을 넣어 10분간 반응시킨 다음 분해되어 생성된 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 농도를 흡광도(Å405nm)로 측정하여 효소활성을 분석하였다.

이의 결과, 도 5에서와 같이 제2형 당뇨병 치료제인 아카보스(양성 대조군) 만큼 높은 저해활성은 아니지만 DP2, DP4, DP6 및 NAO 모두 저해활성이 있음을 확인하였다.

6-3. 비만 유발쥐에서의 항비만 및 항당뇨 효과 확인

실험동물(마우스)에 고지방사료를 급여하면 과다한 내장 지방 증가, 고혈당, 이상 지질증, 고인슐린혈증 및 간 조직에 지방 변성이 발생하여 비만 환자에 나타나는 특징을 잘 반영하는 비만 동물모델을 수립할 수 있다.

이에 따라 순화기간이 종료된 4주령의 C57bl/6 마우스를 체중에 따라 난괴법에 의하여 정상군(Normal diet, ND), 고지방대조군(High fat diet, HFD), 고지방-0.25% NAO 혼합군(HFD-NAO 0.25%), 고지방-0.5% NAO 혼합군(HFD-NAO 0.5%)의 4개 군으로 분리한 다음 각각에 대한 시료를 고지방식이와 함께 9주간 공급하였고, 실험동물의 혈액생화학적 검사, 조직학적 검사, 포도당 내성 검사를 통하여 NAO의 항비만 및 항당뇨 효과를 확인하였다.

9주간 실험식이를 급여한 실험동물의 체중증가량과 식이섭취량은 도 6 및 표 1과 같다. 체중은 고지방식이 공급 1주 이후부터 통계적 유의차가 나타나 실험종료 시점인 9주째에는 대조군인 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND)에 비하여 29.5% 증가해 고지방식이로 인한 마우스의 비만 유도를 관찰할 수 있었다. NAO를 0.5%로 첨가한 식이군의 체중은 고지방식이군에 비하여 유의적으로 낮았으며, 체중증가량에 있어서도 정상군보다 적은 체중증가량을 보였다. 반면에, NAO를 0.25%로 첨가한 식이군에서는 고지방식이군과 유의적인 차이를 보이지 않았다.

	급여전 체중 (g)	급여완료후 체중 (g)	체중증가량 (g/10 wks)	식이섭취량 (g/day)	사료효율¹⁾
ND	21.13±0.27	29.35±0.27	8.22±0.19	4.15±0.09	2.02±0.07
HFD	21.30±0.30	37.78±1.04^†	16.48±0.85	2.74±0.05^†	6.40±0.51^†
HFD-NAO 0.25%	21.00±0.25	37.59±0.63	16.59±0.58^†	2.56±0.10	6.45±0.36
HFD-NAO 0.5%	20.89±0.27	34.37±0.97^*	13.48±0.94^*	2.77±0.01	4.82±0.36^*

¹⁾ 사료효율 : 체중증가량/식이섭취량

결과값 : 평균±표준편차, T-검정(n=6~10)에 의해 p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.

^† 정상식이군에 대한 p<0.05, ^* 고지방식이군에 대한 p<0.05

9주간 실험식이를 급여한 실험동물로부터 간조직 및 부고환지방조직을 채취하여 현미경으로 관찰하였으며, 간 조직의 H&E 염색(staining) 결과는 도 7과 같다.

간조직의 경우, Kleiner DE et. al.(2005)의 간 지방변성(steatosis) 정도 비교 방법에 따라 지방변성 정도를 구분하였으며, 이의 결과는 도 8과 같다. 고지방식이 섭취에 따른 간조직 내 지방축적이 정상식이군에 비하여 현격하게 높은 것으로 나타나 소수포성 지방변성(micro-vescularsteotosis)과 대수포성 지방변성 (macro-vescularsteotosis) 형태를 나타내었다(grade 1.75±0.41). 이에 반하여 NAO 첨가 식이군에서는 0.25%군(grade 0.75±0.16)과 0.5%(grade 0.37±0.18)군 모두에서 지방공포의 수와 크기가 정상 수준으로 감소한 것으로 나타나, NAO에 의해 간조직내 지방침착이 억제됨을 확인하였다.

부고환주위 지방조직의 H&E 염색 결과, 도 9 및 10과 같이 HFD(10.74±1.44)가 ND(4.65±0.54)에 비하여 부고환지방 조직에서 지방세포의 크기가 현저히 증가하였으나, NAO를 첨가한 식이군에서는 0.25%군(6.74±0.38)과 0.5%(6.95±0.82)군 모두에서 고지방식이군에 비해 지방세포의 크기가 감소하였다. 따라서 NAO는 간 및 지방조직 내 지방축적을 억제시키는 것으로 사료된다.

고지방식이 및 NAO가 지질대사에 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 내 지질함량을 조사하여 표 2에 나타내었다. 혈청 총콜레스테롤 함량은 ND군의 경우 140.1±5.2mg/dL이었고, 이에 비해 HFD군에서는 182.0±8.2mg/dL로 증가하였다. 반면에 NAO를 첨가한 식이군은 0.25%군에서 173.0±4.3mg/dL로 감소하는 경향을 나타내었으며 0.5%군에서는 159.6±5.6mg/dL로 유의성 있게 감소하였다. 혈청 중성지방의 경우, ND군의 경우 48.7±3.2mg/dL인 반면 HFD군에서는 64.8±4.0mg/dL로 증가하였다. NAO를 첨가한 식이군은 0.25%군에서 56.7±4.4mg/dL로 감소하는 경향을 나타내었으며 0.5%군에서는 47.3±2.9mg/dL로 유의성 있게 감소하였다. 또한 혈중 FFA(Free fatty acid)도 고지방식이군에서는 정상보다 높은 수치를 나타냈으나 NAO를 첨가한 식이군에서는 정상과 비슷한 수준의 수치를 나타내었다. 혈중 FFA농도와 TG의 농도는 간조직의 지방침작과 인슐린저항성과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다. 따라서 NAO가 혈중 FFA와 TG를 조절함으로서 제 2형 당뇨의 주된 원인중 하나인 인슐린 저항성을 개선하는 효과가 있는 것으로 판단된다.

	T-CHO (mg/dL)	TG (mg/dL)	FFA (mEq/L)
ND	140.1±5.2	48.7±3.2	1.28±0.07
HFD	182.0±8.2^†	64.8±4.0^†	1.52±0.11^†
HFD-NAO 0.25%	173.0±4.3	56.7±4.4	1.30±0.05^*
HFD-NAO 0.5%	159.6±5.6^*	47.3±2.9^*	1.22±0.06^*

결과값 : 평균±표준편차, T-검정(n=8)에 의해 p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.

^† 정상식이군에 대한 p<0.05, ^* 고지방식이군에 대한 p<0.05

NAO의 당뇨개선 효과 및 인슐린 저항성 개선 효과를 확인하기 위하여 Oral GTT와 인슐린저항성과 관련한 생화학적 분석을 수행하여 결과를 도 10(E)와 표 3에 나타내었다. NAO를 9주간 섭취시킨 후 포도당(glucose)을 경구 투여하고 혈당을 측정한 결과 고지방식이군은 혈당 투여 후 30분과 60분 시점에 정상군보다 높은 혈당수치를 나타내어 인슐린 저항성이 유발됐음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 NAO를 첨가한 식이군에서는 30분과 60분 시점에 고지방식이군 보다 유의성 있게 낮은 혈당 수치를 나타내었으며 AUC(Area under curve)를 계산하여 비교한 결과에서도 NAO를 첨가한 식이군에서 유의성이 있게 낮게 나타났다. 이는 고지방식이를 통해 유발된 인슐린저항성이 NAO를 같이 섭취함으로서 정상과 비슷한 수준으로 회복됨을 시사하고 있다. 또한 표 3에 나타낸 바와 같이 혈중 인슐린과 혈당 측정결과, NAO를 첨가한 식이군에서 HFD보다 낮은 수치를 나타내었고, 혈중 아디포넥틴은 NAO를 첨가한 식이군에서 HFD보다 높은 수치를 나타내었다. 아디포넥틴 수치는 인슐린저항성과도 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있는데, 인슐린저항성이 있는 사람의 아디포넥틴 수치가 떨어져 있고 이들의 인슐린저항성이 개선되면 아디포넥틴 수치도 올라간다고 하였다. 표 3에서 나타난 바와 같이 HFD군의 아디포넥틴 농도는 정상군과 큰 차이를 보이지 않았는데, HFD군에서 비만에 의한 인슐린저항성 및 당뇨가 충분히 진전되지 않은 것으로 보인다. 그렇지만, NAO를 첨가한 식이군에서 아디포넥틴의 수치가 정상군에 비해 증가하는 것으로 나타나, NAO가 인슐린 저항성 개선에 중요한 기능을 할 수 있음을 시사하였다. 본 실시예에서는 HFD에서 당뇨병으로까지는 진전이 되지 않았으나 당뇨관련 지표들이 악화되는 경향을 보였으며, 이는 NAO를 섭취함으로써 상당부분 정상화됨을 확인할 수 있었다. 또한, OGTT 검정 결과에서는 NAO를 섭취한 식이군에서 확실한 당뇨개선 효과를 보여 항당뇨 기능성 소재로서 NAO의 가능성을 입증하였다.

	Insulin (ng/㎖)	Glucose (㎎/㎗)	Adiponectin (㎍/㎖)
ND	0.72±0.12	115.4±7.3	47.29±5.66
HFD	1.35±0.14^†	153.3±7.3^†	48.38±10.95
HFD-NAO 0.25%	0.92±0.13^*	159.4±4.0	55.35±4.09
HFD-NAO 0.5%	0.94±0.14	156.8±19.6	58.91±11.45

^† 정상식이군에 대한 p<0.05, ^* 고지방식이군에 대한 p<0.05

<110> DyneBio Inc. <120> Agar-derived neoagarooligosaccharide complex for the prevention and treatment of obesity and/or diabetes comprising enzyme reaction products of beta agarase DagA and agar <130> PA131112-C01 <150> 10-2012-0128087 <151> 2012-11-13 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 930 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor A3(2) <400> 1 gtggtcaacc gacgtgatct catcaagtgg agtgccgtcg cactcggagc gggtgcgggg 60 ctcgcgggtc ccgcacccgc cgctcatgcc gcagacctcg aatgggaaca gtaccccgtg 120 ccggccgccc ctggcggaaa caggtcctgg cagcttctcc ccagccattc ggacgacttc 180 aactacaccg gcaagcctca aaccttcagg ggcagatggc tggaccagca caaggatggc 240 tggtcgggcc cggccaacag cctctacagt gcgcgccatt cctgggtggc tgacggaaat 300 ctcatcgtcg agggccgcag ggcgccggac gggagggtct actgcggcta cgtgacctcc 360 cgcaccccag tcgagtaccc tctctatacc gaagtactca tgcgtgtgag cgggctgaag 420 ctctcatcga atttctggct cctgagcaga gacgacgtca acgagattga cgtgatcgaa 480 tgctacggca acgagtcatt gcacggaaag cacatgaaca ccgcctacca catattccag 540 cggaacccct tcactgaact ggcgagaagc cagaaggggt atttcgcaga tgggagctac 600 gggtacaatg gtgagactgg gcaggtgttt ggggacggcg ccgggcaacc tcttcttcgg 660 aatggattcc accgctacgg cgtgcactgg ataagcgcca ccgaattcga tttctacttc 720 aacggcaggt tggtgcgccg gctgaaccgg tcgaacgacc tcagggaccc ccggagccgg 780 ttcttcgacc agccaatgca tctgatcctc aacaccgaga gtcatcagtg gcgcgtcgac 840 cgaggtatcg aacccacgga cgcggaactc gcagacccca gcatcaacaa catctactac 900 cgctgggtca ggacgtatca ggccgtgtag 930 <210> 2 <211> 309 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor A3(2) <400> 2 Met Val Asn Arg Arg Asp Leu Ile Lys Trp Ser Ala Val Ala Leu Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Leu Ala Gly Pro Ala Pro Ala Ala His Ala Ala Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Glu Gln Tyr Pro Val Pro Ala Ala Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Ser Trp Gln Leu Leu Pro Ser His Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Thr Gly 50 55 60 Lys Pro Gln Thr Phe Arg Gly Arg Trp Leu Asp Gln His Lys Asp Gly 65 70 75 80 Trp Ser Gly Pro Ala Asn Ser Leu Tyr Ser Ala Arg His Ser Trp Val 85 90 95 Ala Asp Gly Asn Leu Ile Val Glu Gly Arg Arg Ala Pro Asp Gly Arg 100 105 110 Val Tyr Cys Gly Tyr Val Thr Ser Arg Thr Pro Val Glu Tyr Pro Leu 115 120 125 Tyr Thr Glu Val Leu Met Arg Val Ser Gly Leu Lys Leu Ser Ser Asn 130 135 140 Phe Trp Leu Leu Ser Arg Asp Asp Val Asn Glu Ile Asp Val Ile Glu 145 150 155 160 Cys Tyr Gly Asn Glu Ser Leu His Gly Lys His Met Asn Thr Ala Tyr 165 170 175 His Ile Phe Gln Arg Asn Pro Phe Thr Glu Leu Ala Arg Ser Gln Lys 180 185 190 Gly Tyr Phe Ala Asp Gly Ser Tyr Gly Tyr Asn Gly Glu Thr Gly Gln 195 200 205 Val Phe Gly Asp Gly Ala Gly Gln Pro Leu Leu Arg Asn Gly Phe His 210 215 220 Arg Tyr Gly Val His Trp Ile Ser Ala Thr Glu Phe Asp Phe Tyr Phe 225 230 235 240 Asn Gly Arg Leu Val Arg Arg Leu Asn Arg Ser Asn Asp Leu Arg Asp 245 250 255 Pro Arg Ser Arg Phe Phe Asp Gln Pro Met His Leu Ile Leu Asn Thr 260 265 270 Glu Ser His Gln Trp Arg Val Asp Arg Gly Ile Glu Pro Thr Asp Ala 275 280 285 Glu Leu Ala Asp Pro Ser Ile Asn Asn Ile Tyr Tyr Arg Trp Val Arg 290 295 300 Thr Tyr Gln Ala Val 305 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer(Asm-F) <400> 3 gacatatggt ggtcaaccga cgtgatc 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer(Asm-R) <400> 4 ggtggatccc tacacggcct gatacg 26

Claims

스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
상기 반응산물은 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고,
상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 0 내지 10중량%의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 식품으로서,
상기 반응산물은 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고,
상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 0 내지 10중량%의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
제 5항에 있어서,
상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
제 5항에 있어서,
상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
제 5항에 있어서,
상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 기능성 식품.
스트렙토마이세스 시리칼라(Streptomyces coelicolor) DagA와 한천 또는 아가로스(agarose)의 효소반응으로 수득한 반응산물을 유효성분으로 함유하는 사료로서,
상기 반응산물은 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하고,
상기 네오아가로올리고당 혼합물은 네오아가로올리고당 혼합물 총중량을 기준으로 0 내지 10중량%의 네오아가로비오스(neoagarobiose), 50 내지 70중량%의 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose) 및 30 내지 50중량%의 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose)를 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
제 9항에 있어서,
상기 효소반응은 35 내지 45℃의 온도 및 pH 6 내지 8에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
제 9항에 있어서,
상기 효소반응은 0.5 내지 5%(w/v)의 한천 또는 아가로스 용액에 20 내지 100unit/㎖의 농도로 DagA를 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
제 9항에 있어서,
상기 반응산물은 반응산물 총중량을 기준으로 45 내지 85중량%의 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide) 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병의 예방 및 개선용 사료.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제