CN111741963A - 一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法 - Google Patents
一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111741963A CN111741963A CN201980013421.9A CN201980013421A CN111741963A CN 111741963 A CN111741963 A CN 111741963A CN 201980013421 A CN201980013421 A CN 201980013421A CN 111741963 A CN111741963 A CN 111741963A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chondroitin sulfate
- molecular weight
- low
- content
- disaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 title claims abstract description 171
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 title claims abstract description 170
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 126
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000018963 Chondroitin Lyases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010026719 Chondroitin Lyases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 3
- -1 chondroitin sulfate disaccharide Chemical class 0.000 claims description 45
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 claims description 44
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 19
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 9
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 6
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 239000010865 sewage Substances 0.000 claims description 4
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 3
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 abstract description 38
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 abstract description 34
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 11
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 9
- 206010060820 Joint injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 abstract 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 241000109497 Acinetobacter sp. c26 Species 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000025157 Oral disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 1
- 229940107200 chondroitin sulfates Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000030194 mouth disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/60—Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
- C07H5/04—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to nitrogen
- C07H5/06—Aminosugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/10—General cosmetic use
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Birds (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法，利用大分子硫酸软骨素为原料，经过硫酸软骨素裂解酶的降解、脱蛋白、过滤除菌及干燥等生产工艺，可得到平均分子量小于1000道尔顿的低分子硫酸软骨素，分子量分布范围窄，硫酸软骨素二糖占比为43～60％，硫酸软骨素四糖占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％，低分子量硫酸软骨素中的寡糖总含量在97％以上，蛋白的含量不超过0.5％；与普通市售的大分子硫酸软骨素相比，该产品在50～100μg/mL浓度内，对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用，修复能力强，修复率在14％～23％之间，可用于治疗关节损伤，是医药产品、保健产品、化妆品、食品等的重要原料。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS，即大分子硫酸软骨素或硫酸软骨素多糖)是一类含有聚阴离子的线性多糖，由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalNAc)以β-1,3糖苷键连接形成二糖单位，二糖单位之间以β-1,4糖苷键连接，并在后续的生物合成过程中在不同的位置引入硫酸基，其广泛存在于各种动物的软骨和***中。
大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化、增强免疫力、抗病毒性肝炎和抗肿瘤等活性，临床中已广泛应用于骨科、眼科、心血管疾病及口腔疾病等医药领域和食品领域。如欧洲风湿病联盟发表的治疗膝骨关节炎的建议中认为CS是一种治疗膝骨关节炎的有效药物；在日本，CS制成口服制剂用于关节止痛，或制成滴眼剂用于泪液补充或角膜保护；美国将CS作为膳食补充剂销售；在澳大利亚，CS大都被制成复合制剂，作为营养保健品销售；2015年版中国药典亦收录了硫酸软骨素钠(CS-Na)、CS-Na片及CS-Na胶囊，类别为降血脂及骨关节疾病治疗药。由此可见，CS是一类生物活性多样、应用广泛的大分子物质，具有很高的开发利用价值。但传统高分子量的CS表观粘度高、结构复杂，不易通过细胞膜，临床应用中主要面临生物利用率低、口服吸收差及疗效不稳定的问题。
天然CS的相对分子质量(Mr)范围一般为50～100kDa，采用不同工艺和不同来源生产得到的CS的Mr范围一般在10～40kDa，低于10kDa时，则称为低分子量硫酸软骨素(Lowmolecular weight chondroitin sulfate，LMWCS)或称为硫酸软骨素寡糖。
LMWCS一般通过CS产品降解来制备，主要有酸水解法、碱水解法和酶法。酸降解反应产物中杂质较多且不易除去，反应过程中硫酸软骨素上的磺酸基团也会不同程度的脱落，且造成环境污染，相比之下，酶解法反应条件温和，污染小易操控，也不会造成磺酸基团的破坏，有利于工业化生产。
现有技术专利文献CN102676613B公开了使用来自牛睾丸的透明质酸酶特异性不高，效率较低，裂解得到了硫酸软骨素二糖、四糖、六糖混合物并分离制备三个单体，但其分子量分别为521、1024、1527，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，如我们工艺中二糖分子量约为379、459和四糖分子量约为838、918，并且该文献未开展所得产物的药效学研究。
专利CN108070627A公开了使用硫酸软骨素AC酶，成本较高，得到了特定结构和分子量的硫酸软骨素D四糖，但其分子量为1078，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，我们工艺中四糖的分子量约为838、918，并且该文献未开展所得产物的药效学研究。
专利CN103602711B公开了使用来自食砜节杆菌发酵后的酶液，效率较低，1000L发酵液只能催化400kg产品，裂解得到的硫酸软骨素二糖，其分子量450～480，二糖含量在97％以上，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，如我们工艺中二糖分子量约为379、459且二糖含量占比为42～58％，并且该文献公开所得产品原料是鸡软骨、猪软骨与牛软骨，而且是特定用于治疗心肌炎。
期刊文献《酶法制备硫酸软骨素寡糖及其抗氧化活性》食品工业科技，2017,13,48～52.公开了使用来自产酶菌株Acinetobacter sp.C26发酵后的硫酸软骨素酶(分子量76kDa)，催化效率低，报道的反应浓度仅为2％，寡糖的比例并未进行分析；裂解得到了硫酸软骨素二糖、四糖，m/Z为342和458的是二糖，m/Z为939的是四糖，与我们的低分子量硫酸软骨素构成及分子量均有所区别，如我们工艺中二糖分子量约为379、459和四糖分子量约为838、918，并且该文献所得产品只进行了抗氧化活性实验，未开展其它药效学研究。
因此国内外对低分子量硫酸软骨素药效学方面的研究不太充分，特别是对主成分为硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖，且二糖和四糖含量控制在一定范围内，平均分子量可稳定地控制在低于1000道尔顿且其分子量分布范围窄的，用于治疗关节损伤的低分子量硫酸软骨素有待进一步研究和确认，从而填补国内外该领域的研究空白。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足之处，提供了一种新的低分子量硫酸软骨素及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明的目的之一是提供了如下的技术方案：一种低分子量硫酸软骨素：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量低于1000道尔顿，其分子量分布范围窄，主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5；R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
进一步的，所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量为590～830Da，进一步优选为677～742Da。
进一步的，所述低分子量硫酸软骨素中硫酸软骨素二糖含量占比为48～55％，硫酸软骨素四糖含量占比为35～40％。
本发明的目的之二是提供了如下技术方案：一种低分子量硫酸软骨素的制备方法，包括：将大分子硫酸软骨素原料经过硫酸软骨素裂解酶的酶解得到平均分子量可稳定地控制在低于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素产物，其分子量分布范围窄，产物主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5；R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
进一步的，所述硫酸软骨素裂解酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到。
进一步的，所涉及的技术方法是利用市售普通大分子硫酸软骨素为生产原料，来源于陆生和海洋动物的软骨组织，所述原料进一步指鸡软骨，猪软骨，牛软骨或鲨鱼骨中的一种或几种混合，更进一步优选为鲨鱼骨。
进一步的，酶解反应的操作条件为，所述硫酸软骨素裂解酶相对每升发酵液的添加量为100～300U/L，大分子硫酸软骨素原料的浓度为100～700g/L，酶解时间为6～10h，酶解温度25～35℃，搅拌转速为100～700rpm，酶解pH为6.5～8.5。
进一步的，所述酶解反应后的水解液利用混合溶剂脱除蛋白，水解液与混合溶剂的体积比为2～5:1，混合溶剂中二氯甲烷和异丙醇的体积比为3～5:1，100～500rpm搅拌10～40min，3000～5000rpm离心10～30min，取上层反应液。
进一步的，所述酶解反应后的水解液还可以通过超滤的方式脱除蛋白得到反应液。
进一步的，所述脱除蛋白后的上层反应液，经过0.22um囊式滤芯过滤除菌，将反应液加入到8～12倍体积量的无水乙醇中，醇沉，真空干燥。
进一步的，所述通过超滤的方式脱除蛋白后的反应液，经过0.22um囊式滤芯过滤除菌后进行喷雾干燥。
进一步的，由鲨鱼骨和鸡软骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨的大分子硫酸软骨素，在50～100μg/mL浓度内对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用，修复率在14％～23％之间。
进一步的，所述低分子量硫酸软骨素具有在制备医药品、化妆品、保健品和食品等领域方面的应用。
本发明相对现有技术，具有以下优势：
1、利用从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到的硫酸软骨素裂解酶催化法酶解，特异性好，酶活更高；可稳定地得到平均分子量小于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素，尤其是平均分子量为590～830Da的低分子量硫酸软骨素，分子量分布范围窄。
2、利用溶剂法或超滤方法脱除蛋白，蛋白的含量不超过0.5％。
3、100L发酵液催化超过400kg大分子硫酸软骨素，生产周期短，效率高，适于工业化放大使用。
4、通过LC-MS分析明确了不同组分寡糖的比例：产品质量稳定，包括硫酸软骨素二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素的寡糖总含量在97％以上，其中产物主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和在87％以上。
5、由鲨鱼骨和鸡软骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨的大分子硫酸软骨素，在50～100μg/mL浓度内，对1mM双氧水损伤的软骨细胞均有更明显的修复作用，修复能力强，修复率在14％～23％之间，可用于治疗关节损伤。其中鲨鱼源的低分子量硫酸软骨素修复效果优于鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源的低分子量硫酸软骨素。在50μg/mL浓度时，由鲨鱼骨、鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源酶解得到的低分子量硫酸软骨素均比鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素，对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用。
附图说明
图1是实施例9中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图2是实施例10中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图3是实施例11中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图4是实施例12中鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的寡糖分布谱图。
图5是实施例14中不同来源的低分子量硫酸软骨素的功效活性检测结果图。
具体实施方式
为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面将结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何方式限制本发明权利要求书请求保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中硫酸软骨素裂解酶来源于本实验室保存的从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到的，其最高酶活可达11976.5U/L，含有998个氨基酸，分子量113KDa，该硫酸软骨素裂解酶的氨基酸序列公开于本公司申请的另外一件发明专利中，其申请日：2019年4月3日，申请号：201910264385.5，公布日：2019年6月21日，公布号：CN109913437A，该专利申请的所有相关内容引入到本专利申请中。
低分子量硫酸软骨素平均分子量的计算公式如下所示：
其中，rt＝rU1+rU2+rU3+rU4+rU5。
其中：ru1：样品溶液中组份一(六糖和八糖)的峰响应值；MW1是样品溶液中组份一的分子量；
ru2：样品溶液中组份二(四糖)的峰响应值；MW2是样品溶液中组份二的分子量；
ru3：样品溶液中组份三(四糖)的峰响应值；MW3是样品溶液中组份三的分子量；
ru4：样品溶液中组份四(二糖)的峰响应值；MW4是样品溶液中组份四的分子量；
ru5：样品溶液中组份五(二糖)的峰响应值；MW5是样品溶液中组份五的分子量；
rt：样品溶液中组份一、组份二、组份三、组份四、组份五的峰响应值之和。
由鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素酶解得到的低分子量硫酸软骨素中二糖(n＝0)、四糖(n＝1)、六糖(n＝2)、八糖(n＝3)的分子量有差异，其中n＝4的十糖和n＝5的十二糖含量非常少，因此在计算寡糖组合物的平均分子量时忽略不计，具体如下表1所示：
表1鲨鱼骨来源的低分子量硫酸软骨素的分子量分布
| # | 二糖(Da) | 四糖(Da) | 六糖(Da) | 八糖(Da) |
| 1 | 379.1和459.1 | 838.2和918.2 | 1155.3 | 1534.5 |
实施例1酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为400rpm，加入800g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至7.0，加入200U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系30℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例2酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为700rpm，加入400g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至6.5，加入300U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系35℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至水解液平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例3酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为100rpm，加入200g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至8.0，加入100U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系25℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至水解液平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例4酶解反应
于5L玻璃烧杯中，加入纯化水2L，控制搅拌转速为500rpm，加入1400g鲨鱼骨硫酸软骨素，待全部溶解后使用氢氧化钠溶液调pH至8.5，加入280U/L的硫酸软骨素裂解酶，保持体系28℃搅拌反应，反应6h检测平均分子量是否低于1000Da，若未反应完全，延长4h反应时间后继续中控。继续反应直至水解液平均分子量低于1000Da判断为合格。
实施例5蛋白脱除
取2L实施例1中反应结束后的水解液，转移到离心机中，在4200rpm离心15min除去菌体，取上清，加入有机溶剂0.4L(二氯甲烷和异丙醇的体积比＝5:1)，脱除蛋白，在100rpm搅拌40min，在4200rpm继续离心15min，取出后倒出上层反应液。
实施例6蛋白脱除
取2.1L实施例2中反应结束后的水解液，转移到离心机中，在4200rpm离心15min除去菌体，取上清，加入有机溶剂0.7L(二氯甲烷和异丙醇的体积比＝4:1)，脱除蛋白，在500rpm搅拌10min，在3000rpm继续离心30min，取出后倒出上层反应液。
实施例7蛋白脱除
取2L实施例3中反应结束后的水解液，转移到离心机中，在4200rpm离心15min除去菌体，取上清，加入有机溶剂1L(二氯甲烷和异丙醇的体积比＝3:1)，脱除蛋白，在300rpm搅拌30min，在5000rpm继续离心10min，取出后倒出上层反应液。
实施例8蛋白脱除
取2.3L实施例4中反应结束后的水解液，通过超滤***，在低温条件下，采用截留分子量5-8万的膜包进行超滤，使蛋白去除得到超滤后反应液。
实施例9醇沉干燥
将2L实施例5得到的上层反应液经0.22um囊式滤芯过滤除菌至洁净区中，然后滴加到20L无水乙醇中，搅拌0.5h，静置2h，固体完全沉淀，抽去上清，离心过滤收集固体，固体于真空干燥箱中45℃真空干燥24h，至干燥失重不超过10％，得到650g低分子量硫酸软骨素产品，收率为81.3％(即650g低分子量硫酸软骨素与800g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.3％，用液质联用仪测定其分子量分布如图1所示，出峰时间为5.879min的组分一主要为六糖和八糖的组合物，含量为9.51％；出峰时间为8.632min组分二为四糖，含量为33.83％；出峰时间为8.966min的组分三也为四糖，含量为5.07％；出峰时间为9.846min的组分四为二糖，含量为47.08％；出峰时间为10.786min的组分五也为二糖，含量为2.03％；出峰时间为12.506min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为97.52％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为88.01％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为704.3～741.2Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例10醇沉干燥
将2L实施例6得到的上层反应液经0.22um囊式滤芯过滤除菌至洁净区中，然后滴加到16L无水乙醇中，搅拌0.5h，静置2h，固体完全沉淀，抽去上清，离心过滤收集固体，固体于真空干燥箱中50℃真空干燥24h，至干燥失重不超过10％，得到320g低分子量硫酸软骨素产品，收率为80.0％(即320g低分子量硫酸软骨素与400g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.4％，用液质联用仪测定其分子量分布如图2所示，出峰时间为5.878min的组分一为六糖和八糖，含量为9.50％；出峰时间为8.625min的组分二为四糖，含量为33.90％；出峰时间为8.958min的组分三也为四糖，含量为5.08％；出峰时间为9.838min的组分四为二糖，含量为46.86％；出峰时间为10.785min的组分五也为二糖，含量为2.13％；出峰时间为12.505min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为97.47％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为87.97％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为704.7～741.6Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例11醇沉干燥
将2L实施例7得到的上层反应液经0.22um囊式滤芯过滤除菌至洁净区中，然后滴加到24L无水乙醇中，搅拌0.5h，静置2h，固体完全沉淀，抽去上清，离心过滤收集固体，固体于真空干燥箱中40℃真空干燥24h，至干燥失重不超过10％，得到150g低分子量硫酸软骨素产品，收率为75.0％(即150g低分子量硫酸软骨素与200g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.4％，用液质联用仪测定其分子量分布如图3所示，出峰时间为5.879min的组分一为六糖和八糖，含量为8.62％；出峰时间为8.632min的组分二为四糖，含量为30.79％；出峰时间为8.966min的组分三也为四糖，含量为4.41％；出峰时间为9.872min的组分四为二糖，含量为52.49％；出峰时间为10.786min的组分五也为二糖，含量为2.02％；出峰时间为12.512min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为98.32％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为89.70％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为679.2～712.5Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例12喷雾干燥
将2L实施例8得到的反应液经0.22um囊式滤芯过滤除菌后进行喷雾干燥，喷雾干燥参数为：进风温度为120℃，出风温度为60℃，流速为100rpm。得到1200g低分子量硫酸软骨素产品，收率为85.7％(即1200g低分子量硫酸软骨素与1400g鲨鱼骨硫酸软骨素原料的比值)，用考马斯亮蓝法检测蛋白含量为0.5％，用液质联用仪测定其分子量分布如图4所示，出峰时间为5.876min的组分一为六糖和八糖，含量为8.50％；出峰时间为8.636min的组分二为四糖，含量为30.59％；出峰时间为8.963min的组分三也为四糖，含量为4.43％；出峰时间为9.870min的组分四为二糖，含量为52.69％；出峰时间为10.783min的组分五也为二糖，含量为2.14％；出峰时间为12.510min的组分六为盐峰；因此包括二糖、四糖、六糖和八糖的低分子量硫酸软骨素总含量为98.35％，主要以二糖和四糖为主，其中二糖和四糖含量之和为89.85％；由鲨鱼骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素的平均分子量为677.4～710.2Da，具体计算过程如下：
假定组分一中全部为六糖，则
假定组分一中全部为八糖，则
实施例13
分别使用牛软骨、猪软骨、鸡软骨以及鸡软骨和鲨鱼骨的混骨按照实施例1的酶解反应、实施例5的蛋白脱除工艺以及实施例9的醇沉干燥工艺，得到另外四种不同来源的低分子量硫酸软骨素。
实施例14功效活性检测
采用细胞活性测定CCK法，考察不同来源的低分子量硫酸软骨素和大分子硫酸软骨素，对损伤的软骨细胞的修复作用，其功效活性检测结果如图5所示，结果表明由鲨鱼骨或鸡骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素(硫酸软骨素多糖)，在50～100μg/mL浓度内对1mM双氧水损伤的软骨细胞均有更明显的修复作用，修复能力在14％～23％之间，可用于治疗关节损伤。其中鲨鱼源的低分子量硫酸软骨素修复效果优于鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源的低分子量硫酸软骨素。在50μg/mL浓度时，由鲨鱼骨、鸡软骨、猪软骨、牛软骨和混骨来源酶解得到的低分子量硫酸软骨素均比鲨鱼骨来源的大分子硫酸软骨素，对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用。
Claims (14)
1.一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量低于1000道尔顿，其分子量分布范围窄，主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5，R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
2.根据权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素的平均分子量为590～830Da，进一步优选为677～742Da。
3.根据权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素中硫酸软骨素二糖含量占比为48～55％，硫酸软骨素四糖含量占比为35～40％。
4.一种权利要求1～3任一项所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：将大分子硫酸软骨素原料经过硫酸软骨素裂解酶的酶解得到平均分子量可稳定地控制在低于1000道尔顿的低分子量硫酸软骨素产物，其分子量分布范围窄，产物主要以硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖为主，硫酸软骨素二糖含量占比为43～60％，硫酸软骨素四糖含量占比为30～45％，硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素四糖含量之和大于87％；所述低分子量硫酸软骨素的结构通式如下式I所示：
式I：n＝0～5；R1,R2,R3＝-H或-SO3Na。
5.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素裂解酶从海岸边、河边、农贸市场、屠宰厂和食堂处的土样、污水或淤泥中筛选、鉴定，并用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌优化表达得到。
6.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述大分子硫酸软骨素原料来源于陆生和海洋动物的软骨组织，包括鸡软骨，猪软骨，牛软骨或鲨鱼骨中的一种或几种混合。
7.根据权利要求6所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述大分子硫酸软骨素原料来源于鲨鱼骨。
8.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：酶解反应的操作条件为，所述硫酸软骨素裂解酶相对每升发酵液的添加量为100～300U/L，大分子硫酸软骨素原料的浓度为100～700g/L，酶解时间为6～10h，酶解温度为25～35℃，搅拌转速为100～700rpm，酶解pH为6.5～8.5。
9.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：酶解反应后的水解液通过混合溶剂脱除蛋白，水解液与混合溶剂的体积比为2～5:1，混合溶剂中二氯甲烷和异丙醇的体积比为3～5:1，100～500rpm搅拌10～40min，3000～5000rpm离心10～30min，取上层反应液。
10.根据权利要求4所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：酶解反应后的水解液通过超滤的方式脱除蛋白得到反应液。
11.根据权利要求9所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：将脱除蛋白后的上层反应液，经过0.22um囊式滤芯过滤除菌，然后将反应液加入到8～12倍体积量的无水乙醇中，醇沉，真空干燥。
12.据权利要求10所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：将脱除蛋白后的反应液，经过0.22um囊式滤芯过滤除菌后进行喷雾干燥。
13.根据权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：由鲨鱼骨和鸡软骨中的一种或其混合骨酶解得到的低分子量硫酸软骨素相对鲨鱼骨的大分子硫酸软骨素，在50～100μg/mL浓度内对1mM双氧水损伤的软骨细胞有更明显的修复作用，修复率在14％～23％之间。
14.根据权利要求1～3任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述低分子量硫酸软骨素具有在制备医药品、化妆品、保健品和食品领域方面的应用。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2019/115120 WO2021081999A1 (zh) | 2019-11-01 | 2019-11-01 | 一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111741963A true CN111741963A (zh) | 2020-10-02 |
Family
ID=72646045
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980013421.9A Withdrawn CN111741963A (zh) | 2019-11-01 | 2019-11-01 | 一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111741963A (zh) |
| WO (1) | WO2021081999A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021083384A1 (zh) * | 2019-11-01 | 2021-05-06 | 南京信朗企业管理咨询有限公司 | 低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其用途 |
| CN113603732A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-11-05 | 江南大学 | 一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法 |
| CN114480182A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-05-13 | 中国农业大学 | 一种假节杆菌pl-410及其在产软骨素裂解酶中的应用 |
| CN114533654A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-27 | 南京乐韬生物科技有限公司 | 一种低分子硫酸软骨素复合水凝胶及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3278629B2 (ja) * | 1999-03-19 | 2002-04-30 | 北海道 | コンドロイチン硫酸の分離精製方法 |
| KR100706294B1 (ko) * | 2005-03-18 | 2007-04-11 | 한국식품연구원 | 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법 |
| CN102676613B (zh) * | 2012-05-22 | 2013-08-07 | 江南大学 | 一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法 |
| CN103602711B (zh) * | 2013-11-08 | 2016-05-18 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种治疗心肌炎的低分子硫酸软骨素的制备方法 |
| CN103623006A (zh) * | 2013-11-26 | 2014-03-12 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种预防和治疗骨关节炎的鱼类软骨提取物的生产方法 |
| CN108070627A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-05-25 | 滨州医学院 | 一种硫酸软骨素d四糖的制备方法 |
| CN109913437B (zh) * | 2019-04-03 | 2021-04-09 | 南京汉欣医药科技有限公司 | 一种硫酸软骨素酶的筛选，鉴定及优化表达 |
-
2019
- 2019-11-01 CN CN201980013421.9A patent/CN111741963A/zh not_active Withdrawn
- 2019-11-01 WO PCT/CN2019/115120 patent/WO2021081999A1/zh active Application Filing
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021083384A1 (zh) * | 2019-11-01 | 2021-05-06 | 南京信朗企业管理咨询有限公司 | 低分子量硫酸软骨素、包含其的组合物、其制备方法以及其用途 |
| CN113603732A (zh) * | 2021-08-25 | 2021-11-05 | 江南大学 | 一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法 |
| WO2023025189A1 (zh) * | 2021-08-25 | 2023-03-02 | 江南大学 | 一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法 |
| CN113603732B (zh) * | 2021-08-25 | 2024-02-13 | 江南大学 | 一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法 |
| CN114533654A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-27 | 南京乐韬生物科技有限公司 | 一种低分子硫酸软骨素复合水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN114533654B (zh) * | 2021-12-29 | 2023-11-21 | 南京乐韬生物科技有限公司 | 一种低分子硫酸软骨素复合水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN114480182A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-05-13 | 中国农业大学 | 一种假节杆菌pl-410及其在产软骨素裂解酶中的应用 |
| CN114480182B (zh) * | 2022-01-10 | 2023-10-31 | 中国农业大学 | 一种假节杆菌pl-410及其在产软骨素裂解酶中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021081999A1 (zh) | 2021-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | Microbial catabolism of Porphyra haitanensis polysaccharides by human gut microbiota | |
| CN111741963A (zh) | 一种低分子量硫酸软骨素及其制备方法 | |
| WO2021120521A1 (zh) | 一种超低分子量透明质酸及其制备方法 | |
| CN101512006B (zh) | 用于纯化高分子量透明质酸的有效方法 | |
| Shi et al. | Chondroitin sulfate: Extraction, purification, microbial and chemical synthesis | |
| JP4420470B2 (ja) | あわび多糖類抽出方法 | |
| WO2007126727A2 (en) | WATER SOLUBLE β-GLUCAN, GLUCOSAMINE, AND N-ACETYLGLUCOSAMINE COMPOSITIONS AND METHODS FOR MAKING THE SAME | |
| WO2007123622A1 (en) | Glucosamine and n-acetylglucosamine compositions and methods of making the same from fungal biomass | |
| Ariestanti et al. | Optimization on production of konjac oligo‐glucomannan and their effect on the gut microbiota | |
| WO2013053071A1 (zh) | 酶解半纤维素制备高纯度甘露低聚糖的生产方法 | |
| CN111285939A (zh) | 一种具有抗氧化和调节肠道菌群功效的海蒿子多糖及其制备方法与应用 | |
| CN102373256A (zh) | 酶解半纤维素制备高纯度甘露低聚糖的生产方法 | |
| CN108359026B (zh) | 一种水不溶性木聚糖的制备方法及其用途 | |
| AU2017385354A1 (en) | Method of degrading polysaccharide using ozone | |
| WO2021196572A1 (zh) | 富含岩藻糖的胞外多糖及其制备方法和应用 | |
| CN101168570B (zh) | 海带硫酸多糖的降解方法 | |
| CN111808215B (zh) | 一种复合酶水解法从蛋壳膜中制备生物活性物质的方法 | |
| NL2021875B1 (en) | Production of biomedical compounds by enrichment cultures of microorganisms | |
| de Souza et al. | Concepts and trends for extraction and application of microalgae carbohydrates | |
| CN115161361A (zh) | 酶分子机器技术制备无支链的直链半乳聚糖的方法及应用 | |
| CN107163163A (zh) | 一种硫酸软骨素产品的加工方法 | |
| CN112961891A (zh) | 利用双相酶促反应制备淫羊藿苷的方法 | |
| CN113563488A (zh) | 一种医药级小分子海洋生物多糖的制备方法 | |
| KR20100138440A (ko) | 푸코이단 분해 효소 및 이의 제조방법 | |
| KR20010018802A (ko) | 유기산을 이용한 한천 올리고당의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20201002 |