CN105087504A - 肠道病毒71型5’utr嵌合病毒及其拯救方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Human？enterovirus？71？5’UTR？chimeric？virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC？NO.V201524。非编码区的研究一直存在一个瓶颈问题，就是它无法像编码区的研究一样，可以通过构建表达载体进而表达出相应的蛋白进行研究。反向遗传技术为非编码区的研究提供了新的思路，我们构建的EV71的5’UTR区的嵌合毒株为研究EV71的5’UTR区在致病机制中的作用提供了研究平台。

Description

肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒及其拯救方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒及其拯救方法和应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期发现的手足口病的病原体主要为CoxA16型，手足口病与EV71感染有关的报道开始于20世纪70年代初，1972年EV71首次在美国确认。此后EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情进展较快，导致死亡。重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65％以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。

手足口病的相关科研工作起步较晚，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为主要流行区域，但对EV71的基础研究投入不够，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物，对EV71进行有效的预防和控制。由于肠道病毒71型属于小RNA病毒科，所以其基因组的人工操作较难，这给疫苗的制备增加了难度。

因此目前对EV71的疫苗研究仍主要聚焦在传统的灭活疫苗上，而此类疫苗的免疫效果一般较低；虽然能够诱导产生包括中和抗体在内的免疫反应，但不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应；诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种；需要使用佐剂，制剂中存在灭活剂，灭活剂对病毒抗原有影响；由于诱导的免疫反应水平较低，以及各个抗原成分之间的疫苗应答不平衡，可能诱发疾病；一般不能通过自然途径接种，不易产生局部免疫反应。由于以上问题的存在，亟需研发新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫应答，又能避免感染性。此类疫苗的研制，需要对病毒基因组中各基因编码区域的功能进行深入研究和了解，这种深入了解还有助于筛选抗病毒药物的靶点研究。

反向遗传学方法研究RNA病毒，是在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的拯救病毒表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但迄今还没有合适的病毒作为疫苗研究的工具。

现有技术中没有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技术偏见EV71的反向遗传学研究是无法实现的，此外由于EV71拯救病毒是一种新的病毒，所以在研究拯救方法时就存在很大的不可预期性，如何克服这种不可预期性是现有技术中无法做到的。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒及其拯救方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Humanenterovirus715’UTRchimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201524。

本发明病毒的形态特征描述：

该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的四种结构蛋白VP1～VP4构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。

一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒的构建方法(模式图见图1)，步骤如下：

(1)以SDLY1(GenBank，HM188481.1)全长cDNA为PCR模板，引物5’UTR1F(序列见表1，SEQIDNo.1)为上游引物，引物5’UTR1R(序列见表1，SEQIDNo.2)为下游引物扩增SDLY1株的5’UTR；

(2)以SDLY107(GenBank，JX244186.1)全长cDNA为PCR模板，引物VP4107F(序列见表1，SEQIDNo.3)为上游引物，引物VP4107R(序列见表1，SEQIDNo.4)为下游引物扩增SDLY107的VP4；

(3)采用融合PCR方法，以5’UTR1F(SEQIDNo.1)为上游引物，VP4107R(SEQIDNo.4)为下游引物将两个片段连接起来；

(4)步骤(3)得到得融合片段以及pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒(质粒pcDNA3.1(+)为本研究室保存，pcDNA3.1(+)-SDLY107构建见下图)进行HindIII和BsiWI双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)；

(5)将步骤(4)得到的pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)进行质粒扩增、体外转录以及RNA转染。

所述步骤(4)中酶切的具体步骤如下：HindIII与BsiWIFastDigestenzyme各2.5μL，DNA10μg，10×FastDigestGreenBuffer5μL，水补齐至50μl，37℃酶切3-4h。

所述步骤(5)中具体为：RD细胞转染重组RNA后，37℃二氧化碳培养箱中培养以期病毒的拯救，通过每日观察细胞病变发现拯救病毒颗粒的出现，当CPE达到90％病变时，冻融一次(避免多次冻融)收获上清即为第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接种细胞培养板中(优选取500μl接种24孔细胞培养板中)，放入37℃二氧化碳培养箱中继续培养，培养3天后或出现明显的CPE时同样冻融一次(避免多次冻融)，10,000g离心5min收获上清，即为低二代拯救病毒；继续上述步骤接种二代病毒，约36h后出现病变，72h后病变达到90％，冻融三次收获病毒。反复操作传代3次以上直至细胞病变稳定即为拯救成功的病毒。

pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒构建过程如下：

利用SDLY107株全基因组序列中固有的酶切位点(BsiWI,Bsp1407I),分三段扩增EV71全长基因组。构建见图2

(1)根据SDLY107株全长cDNA作为扩增模板，以ORF107F为上游引物(序列见表1，SEQIDNo.5)，以ORF107R为下游引物(序列见表1，SEQIDNo.6)扩增EV71的大部开放阅读框(BsiWI—Bsp1407I)。将扩增片段ORF(BsiWI-Bsp1407I)与pcDNA3.1(+)质粒进行HindIII与XbaI双酶切。酶切片段回收后，进行T4连接获得pcDNA3.1(+)-ORF(BsiWI-Bsp1407I)。

(2)以SDLY107株全长cDNA为扩增模板，5＇UTR107F(含有T7启动子)为上游引物(序列见表1，SEQIDNo.7)，VP4107R为下游引物(序列见表1，SEQIDNo.4)扩增EV71的5′端(5′UTR-BsiWI)。将扩增片段5′UTR-BsiWI以及载体pcDNA3.1(+)-ORF(BsiWI-Bsp1407I)进行HindIII以及BsiWI酶切。酶切片段回收后，进行T4连接获得pcDNA3.1(+)-5′UTR-ORF(BsiWI-Bsp1407I)。

(3)以3＇UTRBsp1407IF为上游引物(序列见表1，SEQIDNo.8)，3＇UTR52TR为下游引物(序列见表1，SEQIDNo.9)扩增EV71的3′端(Bsp1407I-3′UTR)。将扩增片段Bsp1407I-3′UTR以及载体pcDNA3.1(+)-5′UTR-ORF(BsiWI-Bsp1407I)进行Bsp1407I以及XbaI酶切。酶切片段回收后，进行T4连接获得全长EV71克隆pcDNA3.1(+)-SDLY107。

表1：引物序列

上述肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒在制备疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

非编码区的研究一直存在一个瓶颈问题，就是它无法像编码区的研究一样，可以通过构建表达载体进而表达出相应的蛋白进行研究。反向遗传技术为非编码区的研究提供了新的思路，我们构建的EV71的5’UTR区的嵌合毒株为研究EV71的5’UTR区在致病机制中的作用提供了研究平台。

附图说明

一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Humanenterovirus715’UTRchimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期：2015年6月24，保藏编号：CCTCCNO.V201524。

图1重组病毒构建模式图；

图2EV71全长克隆pcDNA3.1(+)-SDLY107构建模式示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞与病毒

所用细胞为人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcomacells，RD)。RD细胞生长至对数生长期时接种病毒，待细胞病变至80％左右时，-40℃和室温之间反复冻融三次后4℃10,000g离心10分钟收获，储存于-80℃冰箱中。

1.1.2实验试剂

所用主要试剂为病毒RNA提取试剂盒(OMEGA,中国)、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(OMEGA,中国)；逆转录试剂盒(TOYOBO,日本)；体外转录试剂盒(Promega,美国)；高效保真酶PrimeSTARGXLDNAPolymerase、pMD19-T(TaKaRa,中国)；限制性内切酶、转染试剂(Thermo,美国)；细胞培养基、血清(HyClone,美国)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；测序由上海博尚生物技术公司完成。

1.2实验方法

1.2.1扩增EV71SDLY107与SDLY1株病毒的cDNA

使用OMEGA公司的ViralRNAkit试剂盒提取SDLY107与SDLY1株病毒的RNA，使用TOYOBO公司的ReverTraAceqPCRKit逆转录生成cDNA。

1.2.2引物设计与RCR扩增

病毒株SDLY107和SDLY1为本课题组分离自山东的手足口病患儿，SDLY107为死亡患儿分离株，经鉴定为强毒株(细胞病变快而强，动物病理特征明显)，SDLY1分离自轻症患儿，经鉴定为弱毒株，毒株均已经进行全序列分析。

PCR扩增VP4(107)-5’UTR(1)

引物见表1。使用引物5’UTR1F，(SEQIDNo.1)、5’UTR1R(SEQIDNo.2)，以SDLY1株cDNA为模板，扩增5’UTR非编码区；使用引物VP4107F(SEQIDNo.3)、VP4107R(SEQIDNo.4)，以SDLY107株cDNA为模板，扩增107病毒的VP4编码区；使用引物5’UTR1F(SEQIDNo.1)、VP4107R(SEQIDNo.4)，以扩增获得的SDLY1株5’UTR与SDLY107株VP4为模板进行重叠PCR，获得重组PCR产物5’UTR(1)-VP4(107)。

1.2.3pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)的构建

将pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒以及上述融合片段5’UTR(1)-VP4(107)进行HindIII和BsiWI双酶切：HindIII与BsiWIFastDigestenzyme各2.5μl，DNA10μg，10×FastDigestGreenBuffer5μl，水补齐至50μl，37℃酶切4h。酶切片段回收后，进行T4连接获得重组病毒质粒pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)。

1.2.4重组107(1-5’UTR)全长的获得及体外转录

使用XbaⅠ和HindⅢ对pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)进行双酶切，使其线性化，并回收107(1-5’UTR)。使用Promega公司生产的RiboMAXⅢLargeScaleRNAProductionSystems—T7试剂盒进行体外转录，并使用OMEGA公司的RNA提取试剂盒对RNA进行提取。

1.2.5转染与拯救病毒

按照转染试剂ThermoScientificTurboFect使用方法，将1μg的107(1-5’UTR)全长RNA转染入刚铺满单层的RD细胞，约72h小时后收获细胞，置-40℃和室温冻融一次后(避免反复冻融)，接种至刚铺满单层的RD细胞，每孔200μl。再次培养72h后收获细胞并冻融一次，接种至刚铺满单层的RD细胞。全程观察细胞病变情况，并设置阴性及SDLY107、SDLY1株作为对照。

1.2.6重组病毒的鉴定

提取拯救病毒SDLY107(1-5’UTR)的RNA，逆转录生成cDNA，PCR扩增5’UTR非编码区后回收，送上海博尚生物技术公司测序进行鉴定。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (6)

1.一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，Humanenterovirus715’UTRchimericvirus，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201524。

2.如权利要求1所述的肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒的拯救方法，其特征是，步骤如下：

(1)以SDLY1全长cDNA为模板，5’UTR1F为上游引物，5’UTR1R为下游引物扩增SDLY1株的5’UTR；

(2)以SDLY107全长cDNA为模板，VP4107F为上游引物，VP4107R为下游引物扩增SDLY107的VP4；

(3)以5’UTR1F为上游引物，VP4107R为下游引物将步骤(1)和步骤(2)得到的两个片段连接起来；

(4)将步骤(3)得到的融合片段以及pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒进行HindIII和BsiWI双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)；

(5)将步骤(4)得到的pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)进行质粒扩增、体外转录以及RNA转染，传代培养至细胞病变稳定即为拯救成功的病毒。

3.如权利要求2所述的的拯救方法，其特征是，所述步骤(4)中酶切的具体步骤如下：HindIII与BsiWIFastDigestenzyme各2.5μL，DNA10μg，10×FastDigestGreenBuffer5μL，水补齐至50μl，37℃酶切3-4h。

4.如权利要求2所述的的拯救方法，其特征是，所述步骤(5)中传代培养具体为：RD细胞转染重组RNA后，37℃二氧化碳培养箱中培养以期病毒的拯救，当CPE达到90％病变时，冻融一次收获上清即为第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接种细胞培养板中(优选取500μl接种24孔细胞培养板中)，放入37℃二氧化碳培养箱中继续培养，培养至出现明显的CPE时冻融一次，10,000g离心5min收获上清，即为低二代拯救病毒；继续上述步骤接种二代病毒，冻融三次收获病毒，反复操作传代3次以上直至细胞病变稳定即为拯救成功的病毒。

5.如权利要求1所述的肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒在制备疫苗中的应用。

6.如权利要求1所述的肠道病毒71型3CD嵌合病毒在制备抗病毒药物中的应用。