CN100425291C - O型***病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用基因克隆技术制备一种畜用***病毒活载体免疫疫苗及其制备方法。本发明的疫苗及其制备方法是携带有可以表达O型***病毒全衣壳蛋白的O型***病毒的结构蛋白基因P1和2A、3C蛋白酶基因，以及真核表达元件形成的目的基因表达盒的疫苗和这种疫苗的制备方法。

Description

O型***病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及采用基因克隆技术制备一种畜用***病毒活载体免疫疫苗及其制备方法，更为确切讲是一种O型***病毒免疫制剂及制备方法。

背景技术

***病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，以下简称为FMDV)是引起偶蹄动物***的病原，该病是一种高度接触性传染病，可引起世界性大流行。对动物生产及其产品国际贸易带来严重影响，因而世界各国都很重视对该病的预防和控制。

***的危害巨大，影响深远，家畜及其产品的国际贸易也因***而分为两大阵营，有疫国家和无疫国家。有疫国家继续蒙受出口限制所带来的巨大经济损失。我国每年要为***的防制耗费数十亿元，所造成的直接和间接损失更是不可估量，有必要加大防治技术的研究力度。

在疫苗研究方面，无疫国家积极研究新型疫苗，以降低应用传统疫苗和疫病传入的风险。有疫国家也在积极开展***新型疫苗的研究，以便在未来***逐步控制和消灭之后，作为一种替代的、安全可靠的疫苗，用于***的预防。

传统的灭活疫苗以细胞培养的全病毒经提纯灭活后作抗原，因而具有良好的免疫原性，免疫动物后产生良好的体液免疫，并伴随有细胞免疫应答，具有良好的保护作用。缺点是，灭活疫苗的热稳定性差，要求低温保存，免疫持续期短，抗病毒谱有限，有造成持续感染的危险性，不能区分注苗动物和自然感染动物，同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性。鉴于灭活疫苗存在的问题，***新型疫苗便成了研究焦点。

中国发明专利申请01111121.6公开了用病毒RNA反转录形成VP1蛋白的全DNA系列，再将VP1基因***植物反应器中，最终形成疫苗。这种通过植物反应器来表达***病毒结构蛋白中的主要免疫区段，对宿主动物具有一定的免疫作用，但这种亚单位疫苗所能展示的抗原表位很有限，而且与自然病毒衣壳的抗原结构差异较大，不足以刺激动物体产生完全的攻毒保护作用。

中国发明专利申请0210370109公开了一种采用***病毒中具有抗原性肽段的DNA与β-半乳糖苷酶基因连接，构成融合基因，表达融合乳糖蛋白，纯化融合蛋白，用其制备多肽疫苗。***的多肽疫苗与病毒亚单位疫苗均具有一个缺点是所能展示的抗原表位有限，而且均为线性的抗原表位，缺少构象表位。而且这类疫苗所刺激产生免疫的反应机制与活病毒载体疫苗有差异。活载体疫苗通过在细胞内表达病毒抗原，作为一种内源性抗原来刺激机体产生***的体液免疫和细胞免疫反应，可以产生完全的免疫保护作用。

在基因克隆技术领域内至今尚无O型***病毒重组腺病毒活载体疫苗研制的报道。

发明内容

本发明的任务是提供一种用O型***病毒为目的基因来源，构建成表达***病毒衣壳蛋白的新型活载体疫苗，以及提供该疫苗的制备方法。

本发明的疫苗是携带有可以表达***病毒全衣壳蛋白的O型***病毒的结构蛋白基因P1和2A、3C蛋白酶基因，以及真核表达元件形成的目的基因表达盒。

在本发明的实施例中其真核表达元件为CMV启动子和SV40的poly(A)序列。

在本发明的实施例中所用O型***病毒的目的基因来自于China99毒株，该毒株属O型***病毒中的泛亚病毒群，1999～2001世界***大流行就是由该群病毒的传播引起的，该毒株的致病性和免疫原性都很强，是传统灭活疫苗的制苗毒株，采用该群病毒的基因序列来构建活载体疫苗，在抗原性方面具有较广泛的代表性。

本发明的制备方法是

(1)采用引物序列为

(2)以O型***病毒基因组重组阳性质粒为目的模板，通过聚合酶链式反应，扩增得到P1-2A和3C蛋白酶基因，

(3)将得到的P1-2A和3C蛋白酶基因克隆到腺病毒穿梭质粒中，形成目的基因表达盒；将此重组穿梭质粒线化后，转化带有腺病毒骨架载体的感受态菌(BJ5183)，得到带有目的基因表达盒的重组腺病毒质粒。

(4)将重组腺病毒质粒酶切线化后，用脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)，得到初代重组腺病毒，

(5)初代重组腺病毒在人胚胎肾细胞上传代扩大培养，制备并纯化得产物。

在实际的工业化制备过程中，初代重组腺病毒的扩大培养可以采用转瓶和微载体悬浮培养法来生产病毒，并采用超滤浓缩纯化病毒。

本发明采用腺病毒作为外源基因的载体。腺病毒种类很多，是一种无囊膜的双股DNA病毒，基因组大小约为30-40kb。由于腺病毒比较安全，经腺病毒感染后的临床症状也比较轻微。以腺病毒为基因治疗载体已经有多年历史，实践证明是无致病、致畸和致癌作用的。另一方面，腺病毒载体疫苗重组病毒载体构建相对容易，且腺病毒的宿主细胞范围较广，可以感染很多类型的***或静止期细胞，进入细胞的效率很高，在细胞培养中可以达到很高的滴度，因此提供了多种给药的途径，如通过肌肉、鼻腔或口服进行免疫。

本发明的疫苗，采用***病毒结构蛋白P1和非结构蛋白2A和3C编码区的重组复制缺陷型重组腺病毒，这种重组腺病毒免疫猪后可以有效的表达和递呈***病毒的全部衣壳抗原成份，刺激猪体产生很好的保护性免疫反应。其次，由于这种免疫制剂不带有***病毒基因组的3D和3AB区段，因而有利于鉴别***疫苗免疫动物与自然感染动物。

发明详述与具体实施方式

本发明通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到China/99株O型***病毒的结构蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因，再应用分子生物学技术将其克隆到腺病毒穿梭质粒(pShuttle-CMV)中，该穿梭质粒带有巨细胞瘤病毒(CMV)极早期启动子和猿猴病毒40(SV40)的POLY(A)尾巴，由此而形成目的基因表达盒。将重组穿梭质粒用限制性内切酶Pme I酶切，然后转化带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的重组大肠杆菌BJ5183感受态菌，通过细菌内同源重组的方法，得到带有目的基因表达盒的重组腺病毒质粒。

将重组腺病毒质粒经限制性内切酶Pac I酶切线化后，用脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)，在HEK293细胞内包装产生高滴度的复制缺陷型重组腺病毒，经过荧光抗体、RT-PCR、PCR等试验证明，这种重组腺病毒可以稳定的携带和表达目的基因。

在HEK293细胞上扩大培养初代病毒，通过分别收集细胞和上清液的方法，大量制备和纯化得到重组腺病毒。用磷酸盐缓冲液溶解细胞沉淀，通过37℃/-70℃反复冻融3次，离心得到含病毒上清液；培养上清液中的病毒通过超滤膜纯化浓缩，用这种方法得到的病毒滴度可达到1～5x10⁹TCID₅₀/ml。

其具体的做法是：

1.引物设计

分别设计两对引物用于扩增P1-2A和3C基因，在引物的两端分别设计了特定的酶切位点，用于片段的连接。引物序列如下：

2.PCR扩增

以发明人实验室保存的O型***病毒China/99株基因组重组质粒为扩增目的基因的模板。用P1K(+)和P1B(-)为引物扩增P1-2A片段。用3CB(+)和3CH(-)为引物扩增3C片段。

反应体系为100μL，即：10×缓冲液10μL，dNTP(2.5mmol/L)8μL，MgCl₂(25mmol/L)6μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL，灭菌水71.5μL，加Biolabs公司高保真Taq酶(10U/μL)0.5μL进行扩增。

离心混匀后置PCR自动扩增仪中，94℃预变性4min，进行如下循环：94℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环后，72℃延伸7min。PCR产物上样5～8μL，在琼脂糖凝胶中进行电泳(80～100V)，扩增产物片段大小若与预期的目的片段大小一致，即可用于后续试验，P1-2A片段大小为2200bp，3C长为750bp。

3.目的DNA片段的纯化回收

先将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳(80V)40min左右。在长波紫外光下观察电泳情况，当目的DNA片段与杂带完全分开后，用清洁手术刀(经火焰消毒)切下含有目的片段的凝胶块(小于300μL)置于1.5mL离心管中。

后续步骤按宝生物公司DNA片段回收试剂盒说明书进行。具体步骤为：

①每100mg琼脂糖凝胶中加入300μL溶胶液，65℃充分溶胶后，加入结合缓冲液150μL，混匀。

②将融化的胶加入离心吸附柱上，3600r/min，离心30s。

③用洗涤液反复洗柱2次，最后一次离心1min。

④将吸附柱放入新的收集管中，加入30μL的洗脱缓冲液，室温作用5min，12000r/min离心1min。

4.目的DNA片段与pGEM-T Easy载体的连接

由于所使用的Taq酶在聚合过程的最后给产物末端加上一个腺嘌呤(A)，而pGEM-T Easy载体的两个末端各有一个突出的胸腺嘧啶(T)，因此既可防止质粒的自身环化，又可形成粘端连接，使得连接效率大为提高。连接体系为10μL，即：2×Bμffer 5μL，T4DNA Ligase 1μL，pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)(10U/μL)1μL，目的DNA 3μL，4℃连接过夜或16℃温育4h以上。

5.感受态细胞的制备(在严格无菌条件下进行)

①吸取大肠杆菌DH5α菌液(保存于-70℃冰箱)5μL至3mL的LB培养基中，37℃220r/min摇振培养16h左右。

②吸取500μL上述菌液至盛有50mL LB(预热)的三角瓶中，37℃培养至对数生长期(大约2.5～3h)。

③培养物转入50mL离心管中，冰浴10～15min。

④4℃4000r/min离心8min。

⑤弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，尽量使培养基控干。

⑥先加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(过滤除菌)重悬沉淀，再加入15mL预冷的CaCl₂溶液，冰浴45min。

⑦4℃4000r/min离心8min；弃上清，倒置离心管控干残液(2min)，用2mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬沉淀，以每管200μL分装于1.5mLEppendorf管中，4℃过夜。

6.感受态细胞的转化

①每管感受态细胞中加入5μL或10μL连接反应物，用枪头轻轻混匀，冰浴45min。

②将离心管小心的转移至42℃水浴中热激90s。

③迅速置于冰浴中冷却3min，然后每管加入预热至37℃的LB培养基800μL，37℃220r/min震荡培养1h使细胞复苏。

④4℃4000r/min离心2min，弃部分上清，留200μL左右重悬沉淀。

⑤在细胞悬液中加入16μL X-gal(50mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)，用枪头轻轻混匀，涂布于预至37℃的LB琼脂平板(含氨苄青霉素60μg/mL)上，37℃过夜培养。

7.挑斑

在超净工作台里用灭菌牙签从平板上挑取单个白色菌落，接种于含3mLLB培养基(含60μg/mL氨苄青霉素)的链瓶中，同时挑一个蓝斑作阴性对照，37℃220r/min摇振培养12～16min。

8.质粒的提取与鉴定

碱裂解法小量提取质粒DNA。操作步骤如下：

①用无菌牙签从LB平板挑取白色单菌落，接种于3mL LB培养液(氨苄青霉素100μg/mL)中，37℃振摇(230r/min)12～16h。

②无菌移取1.5mL菌液置离心管中，12000r/min离心3min，弃上清，倒置控干残留液体。

③每管加入120μL预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0))，用涡旋器振荡悬浮。

④加入240μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH稀释)；1％SDS(用10％SDS稀释))，温和倒置离心管3～4次混匀，然后冰浴放置5min。

⑤加入180μL预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60mL；冰乙酸11.5mL；无离子水28.5mL)，颠倒混和几次，冰浴放置5min。

⑥12000r/min离心8min，将上清转移至另一离心管中，加入500μL Tris饱和酚振荡抽提。

⑦12000r/min离心1min，转移上层水相至一新管中，用Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)振荡抽提。

⑧12000r/min离心1min，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀0.5h以上，12000r/min，离心10min。

⑨沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥。

⑩用30μL含胰RNA酶(20μg/mL)的TE(pH 8.0)溶解，室温放置0.5h，电泳观察。

阳性克隆的鉴定：

①电泳鉴定：将所提取的质粒进行电泳，与阴性质粒(蓝斑)进行比较，选出可能为阳性质粒。

②酶切鉴定：用EcoR I进行酶切。反应体系为20μL体系，即：重组质粒15μL，10×Buffer 2μL，EcoR I 1μL，无菌水2μL，置37℃温箱中，2h后取出，将酶切产物、分子量Marker进行电泳比较。

③PCR鉴定：以酶切和电泳为阳性的质粒10倍稀释后取1μL为模板，加入2μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTP(2.5mmol/L)混合物，0.5μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，0.2μL上游引物(201)、0.2μL下游引物(203)，1.2μLMgCl₂(25mmol/L)，补水至20μL，进行PCR鉴定，用100bp DNA ladder Marker作为参照。

大量增殖鉴定正确的阳性质粒用于以下实验。

9.目的片段与pShuttle-CMV穿梭质粒的连接

分别用限制性内切酶Kpn I和Hind III双酶切pShuttle-CMV穿梭质粒(Stratagene公司产品)，回收大片段；用Kpn I和BamH I双酶切鉴定正确的带P1-2A片段的重组pGEM-T质粒，回收2200bp片段；用BamH I和Hind III双酶切带3C片段的重组pGEM-T质粒，回收750bp片段。用T4DNA连接酶(Biolabs公司产品)体外连接回收的三个片段，连接体系如下：10×Buffer2μL，T4DNA连接酶(400U/μL)1μL，回收片段按由大到小分别为3、5、9μL，4℃连接过夜。

10.带***病毒P1-2AX3C目的基因的重组穿梭质粒的鉴定

取上述连接产物转化DH5α感受态细胞(方法同前)，转化细胞在卡那霉素抗性的培养平板上生长，筛选出卡那抗性的菌落。通过挑斑、提取质粒、PCR和酶切鉴定(方法同前)，鉴定出阳性重组菌。由此构建成功带目的基因表达盒的重组穿梭质粒，提取质粒供以下使用。

11、细菌内同源重组法产生携带目的基因表达盒的重组腺病毒质粒

重组穿梭质粒经限制性内切酶Pme I(Biolabs公司产品)线性化和碱性磷酸酶处理后与腺病毒骨架载体adenoeasy vector(Stratagene公司产品)共转化大肠杆菌BJ5183感受态菌(Stratagene公司产品)。或者先将adenoeasy vector转化BJ5183，制备携带腺病毒骨架载体的Adeno-BJ5183感受态菌，再将Pme I线化的重组穿梭质粒转化Adeno-BJ5183感受态菌。卡那抗性筛选，质粒电泳和Pac I酶切鉴定出重组腺病毒质粒，将鉴定阳性的重组腺病毒质粒转化XL-10感受态菌(Stratagene公司产品)，以大量增殖重组质粒，采用β-ME试剂(Stratagene产品)进行转化，按说明书进行。阳性重组腺病毒质粒命名为pAdcmv-p12x3c，并送宝生物(大连)公司进行测序确证。

测定的序列如下：

ATGGGCAACACTGGAAGCATTATCAACAATTCCTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAACTTGGTGATAACGCTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCCACCCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCTGGCCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTCGCCGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCACTACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTGGAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGACCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAGGGTTGTGCAGGCAGAGCGGTTCTTCAAAACCCACTTGTTCGACTGGGTCACCGGTGACCCGTTCGGACGGTGCTACCTGCTGGAACTCCCAACTGACCACAAAGGTGTCTACGGCAGCCTGACTGACTCTTATGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCAGTGGGAAATCAGTTCAACGGAGGATGTCTGTTGGTGGCCATGGTGCCAGAACTTTGCTCTATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTCACGCTCTTTCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACGGCGCACATCACTGTGCCCTTTGTTGGTGTCAACCGCTACGACCAGTACAAGGTACACAAACCTTGGACCCTCGTGGTTATGGTTGTGGCCCCGCTGACTGTCAACACCGAAGGTGCCCCACAGATCAAGGTCTATGCCAACATCGCCCCTACCAACGTGCACGTTGCGGGTGAGTTCCCTTCTAAGGAAGGGATCTTCCCCGTGGCATGTAGCGACGGTTACGGTGGTCTGGTGACCACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGCCTACGGGAAAGTGTTCAATCCACCTCGCAACATGTTGCCGGGGCGGTTCACCAACTTCCTTGATGTGGCTGAGGCGTGCCCTACGTTTCTGCACTTTGAGGGTGACGTGCCGTACGTGACCACAAAGACGGACTCAGACAGGGTGCTCGCCCAGTTTGACTTGTCTCTGGCAGCAAAGCACATGTCAAACACCTTCCTGGCAGGTCTCGCCCAGTACTACACACAGTACAGCGGCACCATCAACCTGCACTTCATGTTCACAGGACCCACTGACGCGAAAGCGCGTTACATGATTGCATACGCCCCCCCTGGCATGGAGCCGCCCAAAACACCTGAGGCGGCCGCTCACTGCATTCATGCGGAGTGGGACACAGGGTTGAATTCAAAATTCACATTTTCAATCCCTTACCTTTCGGCGGCTGATTCGCGTACACCGCGTCTGACGCTGCGGAGACCACAAATGTACAGGGATGGGTCTGCCTGTTTCAAATTACACACGGGAAGGCTGACGGCGACGCACTGGTCGTTCTAGCTAGCGCCGGTAAGGACTTTGAGCTGCGTCTGCCAGTTGACGCTCGCACGCAGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCCGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGATCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGACGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTGTTGGCCCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGTGCCGTCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCGAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTGAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTCTGACGTCAGGTCAAATCTTTCCAAGTTGGTTGAAACCATCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCGGATCCAGGACCGGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCAAAGAATTTGATTGTCACTGAGAGTGGTGCTCCCCCGACTGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAGCTCATCCTCGACGGGAAGACGGTGGCCATCTGCTGCGCCACCGGAGTGTTTGGTACTGCCTACCTTGTTCCTCGTCATCTTTTCGCAGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGACGGCAGAGCCATGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTGAAAGGACAGGACATGCTCTCAGACGCCGCGCTCATGGTGCTTCACCGTGGGAATCGCGTGCGGGACATCACGAAGCACTTCCGTGATGTGGCAAGAATGAAGAAAGGCACCCCCGTCGTCGGCGTGATCAACAACGCTGATGTTGGGAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCCCTTACCTACAAGGACATTGTAGTGTGCATGGACGGAGACACCATGCCCGGTCTCTTCGCCTACAAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGAGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATCGTCGGCACTCACTCCGCAGGCGGCAATGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCGCACATCGATCCCGAACCACACCACGAGTAG

12、转染HEK293细胞产生重组腺病毒

用小量质粒提取试剂盒(宝生物产品)提取重组腺病毒质粒，取20μg用PacI酶切线化，用70％乙醇过夜沉淀酶切产物，12000r/min，离心10min，无菌操作，去上清，吹干DNA，再用20μL灭菌超纯水溶解沉淀，备用。用脂质体2000转染试剂(Lipofectamine 2000，Invitrogen产品)转染HEK293细胞，转染方法参考转染试剂说明书进行。

具体如下：转染前24小时，将HEK293细胞分到60mm培养皿，待细胞长到约80％满时进行转染。先用无血清的OPTI-MEM培养基(Invitrogen产品)稀释DNA和脂质体，将2μg的DNA和10μL的脂质体分别稀释到50μL的OPTI-MEM中，将二者混匀后，室温作用20min，然后缓慢滴加到生长24小时的细胞单层上，置37℃含5％二氧化碳的恒温培养箱中培养4-8小时。之后，加等量含20％胎牛血清的培养液继续培养。每天观察细胞病变情况。转染后7～10d，离心收集转染细胞，用PBS重悬，37℃/-70℃反复冻融4次，离心，取上清再感染长成单层的293细胞。感染后3～5d收集细胞再传，直到出现明显的细胞病变时进行病毒滴度的测定和表达产物的检测。

重组病毒的鉴定：

(1)间接荧光抗体试验检测目的基因的表达

取转染后24h长满细胞的盖玻片，用丙酮4℃固定30min，置室温干燥后用PBS洗；加兔抗FMDV阳性血清，置湿盒内37℃作用1h；用含0.05％吐温-20的PBST洗4次，然后用PBS洗1次，每次10min；加荧光素标记的羊抗兔IgG，置湿盒内37℃作用1h；同上洗涤后，甘油封片，置荧光显微镜下观察。结果，转染后24h取细胞飞片进行间接荧光抗体染色，转染细胞可见有抗原表达。

(2)RT-PCR检测重组病毒的产生

取第4代病毒感染后24h细胞，用QIAGEN RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，进行RT-PCR检测。结果：RT-PCR扩出了预期大小的片段。说明目的基因在细胞内有转录和表达。

(3)重组病毒稳定性和毒价测定

收取4、6、8和10代病毒上清20μL，加蛋白酶K于56℃作用1h后取2μL为模板进行PCR扩增，以检测重组病毒的稳定性。取第8代病毒液10倍稀释至10^-8，取10^-4～10^-8稀释病毒液各1mL至6孔细胞培养板进行病毒含量进行测定，按常规方法进行。结果：取4、6、8和10代病毒DNA为模板PCR扩增目的基因均扩出预期大小的片段。说明重组病毒在10代以内是稳定的。取第8代病毒进行毒价测定，病毒滴度为10⁹PFU/mL。

(4)重组腺病毒的电镜观察

第8代病毒感染后24h，细胞病变完全，离心收集细胞，加PBS重悬细胞，-70℃/37℃反复冻融3次，离心取上清20μL，磷钨酸负染色，置电子显微镜下观察病毒形态。结果：电镜观察重组病毒直径约为80nm，呈正六边形，大小形状与腺病毒相似。说明所产生的细胞病变是由重组腺病毒所引起。

13、重组腺病毒的大量培养和纯化工艺

将前述得所病毒通过逐级放大，得到产物。可以将HEK293细胞适应于转瓶培养，以每分钟8-9转的转速，细胞贴壁性能良好，细胞形态正常，生长较快。一般在分后2天内长满，以20MOI(感染指数，即感染每个细胞的病毒单位)的病毒量接毒，待病变完全(细胞脱落)后收毒。5000r/min离心20min收集病变细胞和上清，细胞沉淀用PBS缓冲液重悬，反复冻融3次，12000r/min离心10min，收集上清即为病毒液，作进一步纯化；细胞沉淀用初次离心的上清重悬，置4℃过夜浸毒，再离心，弃细胞沉淀，病毒上清留作进一步纯化。将收集的病毒上清液通过300K的PELLICON超滤膜(Millipore公司产品)进一步浓缩和纯化病毒，去除一些小分子蛋白和更换缓冲液。通过浓缩和纯化的病毒可以用于疫苗制备。纯化病毒分装后用于动物免疫。

工业化生产本疫苗时，需要使用转瓶和微载体悬浮培养法来生产病毒。病毒的纯化可采用超滤浓缩纯化。

免疫保护试验

(1)豚鼠免疫实验

试验动物为体重300～400g的豚鼠，共24只，平均分为7组。一组为293细胞对照，每只注射0.5mL 293细胞悬液；二组为Ad5野生型腺病毒免疫组，每只注射0.5mL Ad5野生型腺病毒(约为1～5x10⁸个TCID₅₀)；三组和四组分别为adeno-p12ax3c 1x10⁸和2x10⁸个TCID₅₀病毒量免疫组；免疫途径均为后肢肌肉注射。

于免疫后第25天，用同型豚鼠适应毒攻击，每只10，000豚鼠半数感染剂量(GID₅₀)，后肢脚掌部皮下和皮内分别注射0.1mL，只注射一只脚掌。攻毒后每日两次，观察豚鼠发病情况，并记录。判定标准：原注射部位出现水泡，而其余三足末出现继发性水泡，判为100％保护。

结果如下：攻毒48小时后，1和2组豚鼠开始发病，开始主要为原发部位出现红肿，发热症状，继而出现水泡，72小时后除第3和第4组外，其它两组均出现原发和继发性水泡，3组和4组均有一只豚鼠四个足掌部均末出现水泡，仅略为肿大；除3组有一只豚鼠出现轻微的继发性水泡外(仅一只后足掌部出现，两前足至第10天时仍正常)其余均末出现继发性水泡，且原发部位的水泡面积也明显小于其余各组，到第10天时已基本康复(无红肿和发热症状，水泡结痂，溃疡面基本消退)。结果免疫组豚鼠的免疫保护率分别为83.3％和100％，而对照组全部不保护。由此说明，重组腺病毒对豚鼠具有很好的免疫保护作用。见表1。

表1豚鼠攻毒保护试验结果

组别	1	2	3	4
					原发水泡	6/6	6/6	5/6	5/6
继发水泡	6x6	6x6	1/6	0/6
					保护率	0	0	83.3％	100％

(2)重组腺病毒对猪的免疫保护实验

试验用猪为肃白品种猪，约4～5月龄，体重30～40kg，共8只，购于甘肃省武威地区，均为健康非***疫苗免疫猪，试验前用液相阻断ELISA方法检测***病毒抗体效价均小于4。试验猪随机分为两组，每组4头：A组为攻毒对照组，隔离饲养不免疫；B组为重组腺病毒免疫组，每头猪耳根肌肉接种1x10⁹个TCID₅₀病毒量。

分别于免疫前和免疫后第7、14、21、28天采血5ml，分离血清，用液相阻断ELISA检测特异性抗体。用兰州兽医研究所***病毒抗体液相阻断ELISA试剂盒检测所有猪血清抗体，按照试剂盒操作说明进行。

用O用型制苗毒强毒株每头猪经颈部肌肉注射20个猪感染剂量，进行攻毒，逐天观察病变情况并记录。

结果：

(1)液相阻断ELISA抗体水平见表2。

表2试验猪液相阻断ELISA抗体水平

根据试剂盒的判定标准，抗体水平＜4为阴性，抗体水平≥8判为阳性，抗体水平≥32时具有95％以上的保护力。B组3号和4号猪的抗体水平在第二周时升高，在第三周时抗体水平达到最高，1号猪抗体水平在免疫后第四周方为阳性，说明该猪产生的免疫反应较迟。

(2)猪攻毒保护试验结果见表3。

表3攻毒保护试验结果

注：++++表现出全部的临床症状；+++蹄部不完全发病；++有1个蹄部发病；-表示未发病

A组对照猪在攻毒后第二天全部开始发病，猪体温升高、精神萎靡、食欲不振，蹄痛跛行，在蹄冠和蹄叉部有水泡出现。到第4天发病严重，猪卧地不起蹄壳边缘溃裂，水泡糜烂。该组结果说明攻毒制苗苗种毒是一种强毒株，具有很强的致病作用，达到试验对照的目的。免疫组1号猪在攻毒后第8天，右后蹄出现跛行，蹄缘有水泡出现，在第9天左后蹄也发病，但该猪的症状没有A组的严重，而且病程延迟。免疫组的其余3头猪至11天时仍未出现临床症状。实验说明重组腺病毒对猪具有很好的免疫保护作用，试验保护率可达75％，证明本发明可以成为一种替代***灭活疫苗的新型基因工程重组病毒活载体疫苗。

Claims (4)

1、 O型***病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗，其特征在于疫苗携带有表达***病毒全衣壳蛋白的O型***病毒的结构蛋白基因P 1和2A、3C蛋白酶基因，以及真核表达元件形成目的基因表达盒，所述的真核表达元件为CMV极早期启动子和SV40的POLY(A)尾巴。

2、 根据权利要求1所述的O型***病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗，其特征在于采用O型***病毒毒株China99为目的基因来源。

3、 权利要求1或2所述的O型***病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗的制备方法，其特征在于：

(1)采用引物序列为

(2)以O型***病毒阳性质粒为目的模板，通过聚合酶链式反应进行扩增反应，得到P1-2A和3C蛋白酶基因，

(3)将得到的P1-2A和3C蛋白酶基因克隆到腺病毒穿梭质粒中，形成目的基因表达盒；将此重组穿梭质粒线化后，转化带有腺病毒骨架载体的感受态菌BJ5183，得到带目的基因表达盒的重组腺病毒质粒，

(4)将重组腺病毒质粒酶切线化后，用脂质体转染人胚胎肾细胞HEK293，得到初代重组腺病毒，

(5)初代重组腺病毒在人胚胎肾细胞上传代扩大培养，制备并纯化得产物。

4、 根据权利要求3所述的O型***病毒多基因复制缺陷型腺病毒活载体疫苗的制备方法，其特征在于初代重组腺病毒的扩大培养采用转瓶和微载体悬浮培养法来生产病毒，并采用超滤浓缩纯化病毒。