CN105062970A - 一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂及诱导分化完全培养基 - Google Patents
一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂及诱导分化完全培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种诱导剂及诱导培养基。一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂，包含白藜芦醇、淫羊藿苷、氢化可的松、VEGF，IGF-I、EPO。一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，组成成分为：每1000ml所述诱导培养基中含有白藜芦醇30～50μmol、淫羊藿苷5～10μmol、氢化可的松5～10nmol、VEGF？10～20μg、IGF-I？5～10μg、EPO？2～5μg，余量为人间充质干细胞无血清完全培养基。本发明的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，采用中药成分白藜芦醇、淫羊藿苷联合氢化可的松及生长因子VEGF、IGF-I、EPO协同诱导间充质干细胞分化定向分化为神经细胞，所选用的诱导成分均无毒，诱导效率高，诱导时间短，诱导获得神经细胞活性好，细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种诱导剂及诱导分化培养基。
背景技术
自1995年首次报道间充质干细胞(MSC)应用于临床试验以来，现在培养的MSC已被广泛的用于临床试验研究，包括移植物抗宿主病（GVHD），充血性心衰，急性心梗，2型糖尿病，脊髓损伤，软骨和骨损伤、克罗恩病等等。另一方面，随着不断发现新的间充质干细胞来源，如脂肪、羊水、胎盘、脐带、脐血等，拓展了间充质干细胞的来源途径，为基于间充质干细胞的各种治疗手段提供了更多更好的种子细胞来源。国外干细胞药物领域的市场化大门已经打开，已有4个干细胞药物获批上市，包括韩国批准的3个：急性心肌梗死治疗药物Hearticellgram-AMI、关节软骨缺损治疗药物CartiStem、治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘的自体干细胞药物Cuepistem，以及加拿大批准的治疗儿童移植物抗宿主病的非处方间充质干细胞药物Prochymal。之后新西兰医疗管理局和瑞士医药管理局也批准了Prochymal在这2个国家的上市销售权。但是目前，中国尚未批准任何干细胞药物或产品上市，中国在2004年、2005年以及2006年共批准了三个干细胞药物进入临床试验阶段。根据中国SFDA网站的查询信息，这三个药物分别是“骨髓原始间充质干细胞”、“自体骨髓间充质干细胞注射液”、“间充质干细胞心梗注射液”。除此之外，尚未开始受理审批其它任何干细胞项目。因此，需要加快国内干细胞基础与临床研究，力争赶超欧美。神经***损伤和神经退行性病变如帕金森氏病、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病等，一直是困扰人类健康的难题，而细胞移植是治愈此类疾病的希望。目前用于移植治疗中枢神经***损伤的主要是胚胎干细胞和神经干细胞，但由于供体来源难，伦理学异议、免疫排斥反应以及移植细胞存活困难等问题，发展空间有限。
间充质干细胞来源广泛、取材容易，便于自体移植，具有强大的增殖能力，在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能，在特定条件诱导下可以分化为成骨、软骨、肌腱、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等，是一种理想的组织工程种子细胞。间充质干细胞已经成为干细胞研究的热点，经诱导后分化为神经细胞，可用于神经***疾病和损伤的修复。
干细胞的分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达，从而控制细胞表型和蛋白质的特异性分布。间充质干细胞分化为特定细胞类型主要取决于基因的激活，而细胞外微环境中各种因子类型和浓度则是基因激活的重要因素。间充质干细胞向神经细胞的诱导分化至少具有两方面的意义：一方面，揭示细胞的基因机制具有可塑性，外环境的变化能够激发出细胞的多能性，从而超越起源胚层的固有限制，分化为携带本胚层/其它胚层标志物的细胞。另一方面，作为产生移植用神经细胞的新途径，为临床移植治疗神经***损伤提供机会。
目前文献报道的运用间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的研究报道非常多，主要有：（1）传统的化学诱导剂（抗氧化剂）法如：β-ME（β-巯基乙醇）、DMSO（二甲基亚砜）、BHA（丁基羟基茴香醚）联合诱导等；（2）生长因子诱导法如：神经生长因子NGF，表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF、维甲酸（RA）单独或者联合诱导等；（3）生长因子与化学诱导剂联合；（4）共培养或用接近生理状态的条件培养基；（5）基因转染；（6）中药丹参、黄芩苷等。
传统的化学诱导剂法虽然可以高效、快速地将间充质干细胞分化为神经细胞，但细胞死亡率较高（化学诱导剂具有一定毒性，BHA、DMSO等可使细胞突变，用于细胞移植存在致瘤性的危险）；生长因子诱导方法虽然诱导后细胞存活率高，但诱导时间长、诱导效率低。基因转染诱导因为基因改变存在罹患癌症的潜在风险。
发明内容
本发明的目的是针对现有的诱导剂及诱导方法存在的缺陷，提供一种安全无毒、诱导效率高，诱导时间短的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂和诱导分化完全培养基。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂，包含白藜芦醇、淫羊藿苷、氢化可的松、VEGF，IGF-I、EPO。
一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，其组成成分为：每1000ml所述诱导培养基中含有白藜芦醇30～50μmol、淫羊藿苷5～10μmol、氢化可的松5～10nmol、VEGF10～20μg、IGF-I5～10μg、EPO2～5μg，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
所述的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，其组成成分为：每1000ml所述诱导分化完全培养基中含有白藜芦醇40μmol、淫羊藿苷8μmol、氢化可的松8nmol、VEGF15μg、IGF-I7μg、EPO4μg，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
所述的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，将上述组分按配比混匀后过滤除菌即可。
本发明的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂及诱导分化完全培养基，采用中药成分白藜芦醇、淫羊藿苷联合氢化可的松及生长因子VEGF、IGF-I、EPO协同诱导间充质干细胞分化为神经细胞，所选用的诱导成分均无毒，诱导效率高，诱导时间短，诱导获得细胞活性好，细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。
附图说明
图1是人脂肪来源间充质干细胞形态图（×100）；
图2是采用本发明的培养基诱导后出现的神经细胞形态图（×200）；
图3是采用本发明的培养基诱导后NeuN阳性表达细胞免疫细胞化学染色结果图（×400）；
图4是采用本发明的培养基诱导后β-TubulinⅢ阳性表达细胞免疫细胞化学染色结果图（×400）；
图5采用本发明的培养基诱导后GFAP阳性表达细胞免疫细胞化学染色结果图（×400）；
图6是采用本发明的培养基诱导后β-TubulinⅢ阳性表达细胞免疫荧光染色结果图（×200）；图中：a示β-TubulinⅢ阳性细胞，呈红色荧光；b示Hoechst33258复染的胞核，呈蓝色荧光；c为a与b的合成。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。
实施例1一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂，包含白藜芦醇、淫羊藿苷、氢化可的松、血管内皮生长因子(VEGF)，***-I（IGF-I）、***（EPO）。
实施例2本实施例的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清完全培养基为基质（LONZA，货号00190632），使各组分含量如下列定容至1000ml：白藜芦醇（Sigma,R5010-100MG）36g、淫羊藿苷（上海微晶生物,489-32-7,20mg）7μmol、氢化可的松（Sigma,H3160）6nmol、VEGF（PeproTech，96-100-20-2）10μg、IGF-I（PeproTech，96-100-11-20）6μg、EPO（PeproTech，CYT-201）3μg。
实施例3本实施例的将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，将下列原料按其各自特性进行溶解，以人间充质干细胞无血清培养基为基质（LONZA，货号00190632），使各组分含量如下列定容至1000ml：白藜芦醇（Sigma,R5010-100MG）40g、淫羊藿苷（上海微晶生物,489-32-7,20mg）8μmol、氢化可的松（Sigma,H3160）8nmol、VEGF（PeproTech，96-100-20-2）15μg、IGF-I（PeproTech，96-100-11-20）7μg、EPO（PeproTech，CYT-201）4μg。
实施例4采用实施例3制备的诱导培养基，对人脂肪来源间充质干细胞（AD-MSC）进行神经细胞诱导分化实验，步骤如下：
一、人脂肪间充质干细胞制备：
1、接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
2、分装脂肪组织，每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。10ml移液管，去吸头，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。
3、洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。
4、胶原酶I消化：加入等量新配制的预热（提前半小时于37℃的气浴摇床预热）的胶原酶I溶液（0.1%胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37℃预热），封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到看起来较为平滑。
5、分离基质血管组分（SVF）：将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。
6、净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。
7、细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。
8、原代细胞培养：平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。培养基：人间充质干细胞无血清完全培养基（LONZA，00190632）。
9、换液：原代培养第24h，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。
10、原代细胞收获：7d左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70%～80%时，消化收获。在培养瓶中加入消化酶（消化酶为0.125%Trypsin-EDTA溶液，使用前室温（20～25℃）放置15～25min，每75cm2加入2ml消化酶溶液），消化时间为5～8min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100um无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。
11、原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm2，即（3.75～4.5）×105个cells/T75，按照4.5×105个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养，培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。培养至细胞融合达85%～90%。
二、脂肪MSC鉴定
1、取P3代脂肪MSC，流式检测细胞表面标记，结果见表1。
表1流式细胞仪检测P3代脂肪MSC表面标记物
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明该细胞为脂肪MSC。
三、诱导脂肪MSC分化为神经细胞：传3代的MSC，0.125%Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×104/cm2，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片。待细胞接近80%融合，生长旺盛时再进行诱导分化，分组如表2。
表2诱导脂肪MSC分化为神经细胞的实验分组
四、诱导后神经细胞鉴定
1、形态学观察：倒置显微镜下，动态观察脂肪MSC诱导前后形态学变化。
2、免疫细胞化学染色法（SABC法）检测：
（1）收集诱导后细胞爬片，0.01MPBS（PH=7.2）冲洗，5min×3次，冷丙酮固定10min，PBS冲洗5min×3次；
（2）3%H2O2溶液孵育30min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01MPBS冲洗，5min×3次；
（3）滴加封闭用羊血清（试剂A），37℃孵育30min，吸除多余血清，不洗；
（4）分别滴加小鼠抗NeuN、兔抗β-TubulinⅢ一抗、小鼠抗GFAP，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，5min×3次；
（5）滴加生物素标记的相应的抗小鼠或抗兔二抗（试剂B），37℃孵育1h，0.01MPBS冲洗，5min×3次；
（6）滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素（试剂C），37℃孵育30min，0.01MPBS冲洗，5min×3次；
（7）DAB显色：取蒸馏水1ml，加入试剂盒中A、B、C成分各一滴，混匀后，滴加至上述处理的细胞标本上；室温下显色，镜下控制反应时间。至显色满意时（一般2～10min）加蒸馏水终止反应；
（8）常规脱水透明封片：50%酒精1min，70%酒精1min，80%酒精1min，95%酒精1min，100%酒精Ⅰ5min，100%酒精Ⅱ5min，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，中性树胶封片。
对照实验：以0.01MPBS代替第一抗体，其余步骤相同。
免疫细胞化学法检测诱导前后NeuN、β-TubulinⅢ、GFAP的表达情况，随机抽取4张玻片，200倍视野下随机选取5个视野，分别计算阳性细胞的比例。阳性细胞占总细胞比例以均数±标准差（）表示。采用SPSS11.0软件进行统计分析，实验数据以（）表示，多组比较采用方差分析，两组间率的比较采用χ2检验，P<0.05认为有统计学意义。
3、免疫荧光染色法检测
免疫荧光染色步骤同上，一抗为兔抗β-TubulinⅢ，荧光二抗为Cy3-羊抗兔IgG，阴性对照用PBS代替第一抗体。
免疫荧光染色法检测诱导前后三组β-TubulinⅢ的表达情况，并随机抽取4张玻片，每张玻片200倍视野下随机选取5个视野，计数阳性细胞总数和Hoechst复染的细胞总数，计算β-TubulinⅢ阳性细胞的比例。阳性细胞占总细胞比例以（）表示。采用SPSS11.0软件进行统计分析，实验数据以（）表示，多组比较采用方差分析，两组间率的比较采用χ2检验，P<0.05认为有统计学意义。
五、结果
1、形态学观察
化学诱导组：传代后脂肪MSC贴壁快，细胞增殖旺盛，细胞呈均一的成纤维细胞样形态，如图1所示。预诱导12h后，原来梭形的脂肪间充质干细胞胞体发生收缩，细胞边缘变得不规整，有许多细的突起。预诱导结束时，一部分细胞胞体呈圆形。正式诱导后，细胞胞体进一步收缩，呈圆形、三角形，可见多个突起，而且发出分支，形成圆锥状终末端；有的突起逐渐伸长。5h后细胞形态不再发生明显变化，大部分细胞呈现典型的神经元样形态。诱导后，细胞部分死亡、脱落。继续培养5d后大部分细胞漂浮死亡。
生长因子组：诱导分化培养后，3d内脂肪MSC基本无变化。5～10d部分细胞胞体逐渐增大，胞突变细伸长。2周左右，部分细胞胞体呈圆形，较大，胞体伸出一个、两个或多个突起，突起较长，折光性好，局部区域相邻细胞突起连成网状，约一半的细胞呈现典型的神经细胞形态。细胞存活良好，继续培养2周未见到明显的细胞漂浮、脱落现象。
本发明的诱导培养基组：本发明诱导培养基，诱导1～2d后细胞形态变化明显，细胞胞浆、细胞质以细胞核为中心收缩，细胞变短，体积变小，细胞形成双极或多极的细胞体，部分细胞的细胞质收缩形成细胞突起，细胞形态呈小椭圆形、星型、蝌蚪型、细长条状等，细胞反光增强。3～5d诱导，细胞突起进一步延长和变细，部分细胞伸出多根突起，折光性好，局部区域相邻细胞突起连成网状，大部分细胞呈现典型的神经细胞形态，如图2所示。7d后，细胞状态好，存活时间长，未见到明显的细胞漂浮、脱落现象。
2、免疫细胞化学染色结果
免疫细胞化学染色结果显示，NeuN阳性细胞胞核着色，胞浆着色浅，如图3所示。诱导前三组NeuN均为阴性表达，化学诱导剂诱导后NeuN阳性细胞率为（72.3±2.1）%；生长因子诱导后NeuN阳性细胞率为（39.6±2.8）%；本发明的诱导培养基诱导后NeuN阳性细胞率为（86.6±4.5）%。本发明的诱导培养基诱导分化率高于化学诱导剂和生长因子（P<0.05），差异有统计学意义。
免疫细胞化学染色结果显示，β-TubulinⅢ阳性细胞胞浆着色，呈棕黄色颗粒，细胞核不着色，如图4所示。诱导前三组β-TubulinⅢ均为阴性表达，化学诱导后β-TubulinⅢ阳性细胞率为（73.2±1.3）%；生长因子诱导后β-TubulinⅢ阳性细胞率为（49.6±3.1）%；本发明诱导剂诱导后β-TubulinⅢ阳性细胞率（92.6±2.3）%。本发明的诱导培养基诱导分化率高于化学诱导剂和生长因子（P<0.05），差异有统计学意义。
免疫细胞化学染色结果显示，GFAP阳性细胞胞浆着色，呈棕黄色颗粒，细胞核不着色，如图5所示。诱导前三组GFAP均为阴性表达，化学诱导后GFAP阳性细胞率为（13.3±2.1）%；生长因子诱导后GFAP阳性细胞率为（32.1±1.3）%；本发明诱导后GFAP阳性细胞率（16.6±3.6）%。本发明的诱导培养基诱导脂肪间充质干细胞向星形胶质细胞分化率低于生长因子（P<0.05），差异有统计学意义，略高于化学诱导剂。
3、免疫荧光染色结果
免疫荧光法染色结果显示，β-TubulinⅢ阳性细胞的胞浆呈红色荧光，如图6中a所示，Hoechst33258复染的胞核呈蓝色荧光，如图6中b所示。诱导前三组β-TubulinⅢ均为阴性表达，化学诱导后β-TubulinⅢ阳性细胞率为（73.4±2.1）%；生长因子诱导后β-TubulinⅢ阳性细胞率为（48.5±1.8）%；本发明的诱导培养基诱导后β-TubulinⅢ阳性细胞率为（91.8±1.3）%。本发明的诱导培养基诱导分化率高于化学诱导剂和生长因子（P<0.05），差异有统计学意义。
表3三组诱导结果比较（n=20，）
注P*<0.05相对于生长因子组和化学诱导组，P*△<0.05相对于生长因子组。
综上，如表3所示，用本发明的诱导培养基诱导后NeuN、β-TubulinⅢ阳性细胞率高于化学诱导和生长因子诱导（P<0.05），GFAP阳性细胞率低于生长因子诱导（P<0.05），说明本发明的诱导培养基诱导效率高于化学诱导剂和生长因子，且诱导后细胞主要分化为神经细胞，而非神经胶质细胞。
实施例5采用实施例3制备的诱导培养基，对脐带源间充质干细胞（UC-MSC）进行神经细胞诱导分化实验，步骤如下：
一、脐带MSC的分离培养（组织块培养法）
1、向脐带采集瓶中加入30ml生理盐水，初步洗涤脐带
2、无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中，无菌手术剪将脐带剪成约2cm数段，加入生理盐水洗涤血凝块，直至基本去除血渍洗涤液较清澈。
3、剔除血管：按血管螺旋走式剔除两条动脉，一条静脉。
4、分离华通氏胶：位于羊膜与血管之间的白色***即为华尔通氏胶，用长柄有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中。
5、洗涤红细胞：向无菌平皿中加入10ml注射用水，洗涤胶体1min，共洗涤2次。
6、胶体称重：将洗涤后的华通氏胶移入到50ml离心管中，称重记录。
7、组织匀浆：用无菌长柄手术剪，在离心管中将组织剪切成1mm3左右的组织匀浆块，剪切时间15～20分钟。
8、定容种瓶：根据胶体重量，加入适量脐带MSC专用培养基，定容组织匀浆浓度为0.4g/ml，电动移液器吹打匀浆均匀后，每75cm2接种1ml组织匀浆（即0.4g/75cm2），T75培养瓶中加入15ml脐带MSC无血清培养基（LONZA，00190632），晃动培养瓶混匀后培养。
9、培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，参数：（37±0.5）℃，二氧化碳体积分数为（5±0.2）%。
10、原代培养：原代4～5天半量换液一次，（拟采用平板离心机，在培养瓶中初步离心后，移除半量培养基，加入半量新鲜培养基，重悬浮组织块培养），原代培养14～16天之后，P0代细胞密度达到80%～90%，消化传代。
11、P0代细胞传代：消化酶为0.125%Trypsin-0.01％EDTA溶液，每75cm2加入1～1.5ml消化酶溶液，消化时间为40～60sec，加入无血清培养基2～3ml反复吹打瓶底，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入5ml生理盐水冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，统计细胞总量。
12、洗涤接种传代：离心参数，250g/min，15min，去除上清液后，加入新鲜培养液定容后接种新培养瓶中，传代细胞密度为（6～8）x105/75cm2。
13、细胞培养与传代：P1代后，每周换液2次，每3～4天传代，传代时细胞融合应在80%～90%，传代细胞密度为（6～8）*105/75cm2。
二、脐带MSC的鉴定
（1）取P3代脐带MSC，流式检测细胞表面标记，流式结果如表4。
表4脐带MSC表面标记物的检测
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD105表达大于95%，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2%，证明该细胞为脐带MSC。
三、诱导脐带间充质干细胞分化为神经细胞：传3代的脐带MSC，0.125%Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×104/cm2，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片。待细胞接近80%融合，生长旺盛时再进行诱导分化，分组如表5。
表5诱导脐带MSC分化为神经细胞的实验分组
四、诱导后神经细胞鉴定
方法和步骤同实施例4，对诱导后神经细胞进行鉴定，从形态学观察，免疫细胞化学，免疫荧光检测三方面对比表5中三组诱导剂效果。
五、结果
1、形态学观察：结果同实施例4，诱导后三组细胞形态均向神经细胞方向变化，但化学诱导剂组有较多细胞漂浮死亡，而本发明的诱导培养基组细胞状态好，存活时间长，未见到明显的细胞漂浮、脱落现象。
2、免疫细胞化学染色结果，见表6。
3、免疫荧光染色结果，见表6。
表6三组诱导结果比较（n=20，）
注P*<0.05相对于生长因子组和化学诱导组，P*△<0.05相对于生长因子组
综上，如表6所示，用本发明的诱导培养基诱导脐带MSC后NeuN、β-TubulinⅢ阳性细胞率高于化学诱导和生长因子诱导（P<0.05），GFAP阳性细胞率低于生长因子诱导（P<0.05），说明本发明的诱导培养基诱导效率高于化学诱导剂和生长因子，且诱导后细胞主要分化为神经细胞，而非神经胶质细胞。
Claims (3)
1.一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导剂，包含白藜芦醇、淫羊藿苷、氢化可的松、VEGF、IGF-I、EPO。
2.一种将间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基，其组成成分为：每1000ml所述诱导分化完全培养基中含有白藜芦醇30～50μmol、淫羊藿苷5～10μmol、氢化可的松5～10nmol、VEGF10～20μg、IGF-I5～10μg、EPO2～5μg，余量为人间充质干细胞无血清完全培养基。
3.根据权利要求2所述的诱导培养基，其特征在于：每1000ml所述诱导分化完全培养基中含有白藜芦醇40μmol、淫羊藿苷8μmol、氢化可的松8nmol、VEGF15μg、IGF-I7μg、EPO4μg，余量为人间充质干细胞无血清培养基。
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|---|---|
| CN (1) | CN105062970B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058225A (zh) * | 2017-02-10 | 2017-08-18 | 郑州大学 | 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法 |
| CN109694851A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-30 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 一种人间充质干细胞的诱导组合物、诱导分化培养液及其体外诱导方法和应用 |
| CN109852654A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-06-07 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用 |
| CN111394311A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-10 | 青岛瑞思德生物科技有限公司 | 一种诱导间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的无血清完全培养基 |
| EP4092106A4 (en) * | 2020-01-13 | 2024-03-06 | Qingdao Restore Biotechnology Co Ltd | INDUCER FOR INDUCING MESENCHYMAL STEM CELLS TO DIFFERENTIATE INTO ISLAND CELLS |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103087983A (zh) * | 2011-10-27 | 2013-05-08 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法及应用 |
| CN103215222A (zh) * | 2013-04-19 | 2013-07-24 | 陈云燕 | 一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基及方法 |
| CN104419661A (zh) * | 2013-08-28 | 2015-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 神经干细胞的制备方法 |
| CN104726406A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-24 | 中国医科大学 | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 |
| CN104789531A (zh) * | 2015-03-27 | 2015-07-22 | 安沂华 | 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法 |
-
2015
- 2015-08-25 CN CN201510525294.4A patent/CN105062970B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103087983A (zh) * | 2011-10-27 | 2013-05-08 | 北京清美联创干细胞科技有限公司 | 一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法及应用 |
| CN103215222A (zh) * | 2013-04-19 | 2013-07-24 | 陈云燕 | 一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基及方法 |
| CN104419661A (zh) * | 2013-08-28 | 2015-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 神经干细胞的制备方法 |
| CN104726406A (zh) * | 2015-02-13 | 2015-06-24 | 中国医科大学 | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 |
| CN104789531A (zh) * | 2015-03-27 | 2015-07-22 | 安沂华 | 一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| MING GUAN 等: "Differentiation into neurons of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells", 《EUR.CYTOKINE NETW.》 * |
| XU YONG-TAO 等: "Directional differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into oligodendrocytes induced by the combination of various neurotrophic factors", 《JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH》 * |
| 徐路尧 等: "不同方法诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化", 《苏州大学学报(医学版)》 * |
| 毛项颖 等: "淫羊藿苷介导MAPK信号通路促进间充质干细胞株C3H10T1/2成骨分化的体外研究", 《中西医结合学报》 * |
| 涂怀军 等: "无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
| 钟志坚 等: "***基因修饰脐带间充质干细胞移植颅脑损伤大鼠脑细胞形态及神经功能的恢复", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058225A (zh) * | 2017-02-10 | 2017-08-18 | 郑州大学 | 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法 |
| CN107058225B (zh) * | 2017-02-10 | 2020-06-23 | 郑州大学 | 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法 |
| CN109852654A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-06-07 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用 |
| CN109852654B (zh) * | 2018-12-28 | 2021-02-26 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 能够诱导干细胞分泌细胞因子的组合物及其应用 |
| CN109694851A (zh) * | 2019-01-16 | 2019-04-30 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 一种人间充质干细胞的诱导组合物、诱导分化培养液及其体外诱导方法和应用 |
| EP4092106A4 (en) * | 2020-01-13 | 2024-03-06 | Qingdao Restore Biotechnology Co Ltd | INDUCER FOR INDUCING MESENCHYMAL STEM CELLS TO DIFFERENTIATE INTO ISLAND CELLS |
| CN111394311A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-10 | 青岛瑞思德生物科技有限公司 | 一种诱导间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的无血清完全培养基 |
| WO2021212592A1 (zh) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 青岛瑞思德生物科技有限公司 | 一种诱导间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的无血清完全培养基 |
| CN111394311B (zh) * | 2020-04-20 | 2022-07-01 | 青岛瑞思德生物科技有限公司 | 一种诱导间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的无血清完全培养基 |
| JP2022534332A (ja) * | 2020-04-20 | 2022-07-29 | 青島瑞思徳生物科技有限公司 | 角膜上皮細胞への間葉系幹細胞の分化を誘導する無血清完全培地 |
| JP7239686B2 (ja) | 2020-04-20 | 2023-03-14 | 青島瑞思徳生物科技有限公司 | 角膜上皮細胞への間葉系幹細胞の分化を誘導する無血清完全培地 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN105062970B (zh) | 2017-12-29 |
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